RU2326377C2 - Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и добавка для масс-спектрометрии - Google Patents

Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и добавка для масс-спектрометрии Download PDF

Info

Publication number
RU2326377C2
RU2326377C2 RU2005131004/28A RU2005131004A RU2326377C2 RU 2326377 C2 RU2326377 C2 RU 2326377C2 RU 2005131004/28 A RU2005131004/28 A RU 2005131004/28A RU 2005131004 A RU2005131004 A RU 2005131004A RU 2326377 C2 RU2326377 C2 RU 2326377C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
compound
complex
phosphoric acid
solution
zinc
Prior art date
Application number
RU2005131004/28A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2005131004A (ru
Inventor
Тохру КОИКЕ (JP)
Тохру КОИКЕ
Норио МИНАМИ (JP)
Норио МИНАМИ
Акихико КАВАСАКИ (JP)
Акихико КАВАСАКИ
Original Assignee
НАРД Инститьют, Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by НАРД Инститьют, Лтд filed Critical НАРД Инститьют, Лтд
Publication of RU2005131004A publication Critical patent/RU2005131004A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2326377C2 publication Critical patent/RU2326377C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/16—Phosphorus containing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение касается способа определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, включенного в биологический образец или ему подобный, и добавки для масс-спектрометрии, используемой в данном способе. Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, содержит этапы. Сначала смешивают комплексное соединение, включающее соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и образец в растворителе для получения раствора с последующей регистрацией масс-спектра раствора, затем смешивают комплексное соединение, включающее в себя соединение (III), имеющее другой вид изотопов цинка, и образец в растворителе для получения раствора последующей регистрацией масс-спектра полученного раствора и в заключение определяют молекулярную массу соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, путем сравнения полученных масс-спектров, где соединение (I) это
Figure 00000001
, a R1-R4 - атомы водорода или заместители. Предложенное изобретение достаточно просто в осуществлении. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение касается способа определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, включенного в биологический образец или ему подобный, и добавки для масс-спектрометрии, используемой в данном способе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известны in vivo ферменты, имеющие сериновый, треониновый или тирозиновый остаток при особом участке, таком как активный центр. Ферментная активность данных ферментов регулируется фосфорилированием, т.е. моноэтерификацией фосфатом, или дефосфорилированием гидроксильной группы в данных остатках с помощью фермента, называемого киназа. Известны также ферменты, чья ферментная активность регулируется фосфорилированием или дефосфорилированием азота в лизине, аргинине или гистидине или карбоксильной группы в аспаргиновых кислотах или глутаминовых кислотах.
Одним из примеров метаболических систем, которые регулируются вышеупомянутым фосфорилированием-дефосфорилированием, является система подавления синтеза гликогена и его разложения. Данная метаболическая система представляет собой, главным образом, каскадно-регулируемое фосфорилирование-дефосфорилирование.
Недавние исследования показали, что фосфорилирование-дефосфорилирование играет существенную роль в метаболических системах, связанных с заболеваниями.
Например, показано, что одной из причин канцерогенеза клетки является аномалия в фосфорилировании-дефосфорилировании. В частности, развитие и остановка клеточного цикла регулируются фосфорилированием или дефосфорилированием различных ферментов, т.е. белков. Циклин и циклинзависимая киназа (ЦЗК) являются существенными факторами в фосфорилировании. В случае, когда механизм, касающийся циклина или ЦЗК, ослабляется фосфорилирование или дефосфорилирование могут стать нерегулируемыми, в связи с чем запускается ненормальное размножение клеток.
В добавление к вышесказанному, известны факты о том, что белок киназа С связан с дегрануляцией гистамина, являющейся причиной аллергических нарушений, таких как атопический дерматит и пыльцевая аллергия, и что фосфорилированный тау-протеин является причиной нейрофибриллярного сплетения в мозгу больных болезнью Альцгеймера.
Ввиду вышесказанного, понимание, какие ферменты, т.е. белки, в биологических образцах фосфорилируются или дефосфорилируются, может обеспечить полезные возможности не только при исследовании экспрессии генов в живых тканях клеток и выяснении ферментативной активности клеток, но также при диагностике заболеваний или лечении.
Обычные способы определения фосфорилированных белков или дефосфорилированных белков обладают различными недостатками.
Например, хотя иммунологический анализ фермента является полезным при анализе целевого белкового образца в очень малом количестве, трудно получить антитела целевого белка в достаточном количестве. Кроме того, в случае, когда уровень целевого белка равен нескольким kDa или меньше, невозможно приготовить антитело, которое надежно свяжется с положением в белке, где происходит фосфорилирование.
Предложен способ обнаружения белка, специфически связанного фосфорной кислотой, с использованием фосфорной кислоты, меченной радиоактивным изотопом 32Р. Однако работе с радиоактивными изотопами следует уделять особое внимание и требуется соответствующее руководство и удаление жидких отходов радиоактивных изотопов.
Предложена идея применения двухмерного электрофореза, принимая во внимание тот факт, что электрические заряды дифференцируются между фосфорилированными белками и дефосфорилированнными. Однако очень трудно идентифицировать пятно фосфорилированного или дефосфорилированного белка при анализе образца, полученного из живого организма, так как образец содержит множество белков. Кроме того, использование радиоактивного изотопа для идентификации пятна вызывает вышеупомянутые проблемы.
В документе Morio YASHIRO et al, Preparation and Study of Dinuclear Zinc(II) Complex for the Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in a Diribonucleotide, Journal of the Chemical Society, Chemical communications, pp.1793-1794 (1995), подробно описывается комплекс цинка. Данный комплекс цинка выполняет функцию, в которой два иона цинка действуют на фосфорнокислотную группу в динуклеотиде и разлагают динуклеотид. Однако данная функция комплекса цинка, описанная в документе, является только катализатором. Документ не описывает способность комплекса цинка координационно связываться с фосфорнокислотной группой. Эксперименты, выполненные изобретателями настоящего изобретения, показывают, что константа диссоциации комплекса цинка с фосфорнокислотной группой, вставленной между двух нуклеотидов, то есть фосфорной диэфирной группой, очень велика. Другими словами, комплекс цинка имеет низкую координационную способность по отношению к фосфорному диэфирному компоненту.
Дополнительно, в документе Hidekazu ARII et al, A novel diiron complex as a functional model for hemerythrin, Journal of Inorganic Biochemistry, 82, pp.153-162 (2000), подробно описывается комплекс железа со структурой, аналогичной структуре комплекса цинка. Комплекс железа, однако, представляет собой продукт, синтезированный в качестве модели гемеритрина, то есть белка-носителя, переносящего молекулы кислорода. Как и в случае с вышеупомянутым документом, данный документ не описывает и совсем не предполагает координационную связь комплекса железа с фосфорным моноэфирным компонентом.
Изобретатели настоящего изобретения уже разработали способ определения пептида и т.п., имеющего фосфорнокислотную моноэфирную группу. В данном способе используется комплекс, который специфически координационно связан с анионным заместителем, таким как фосфорнокислотная моноэфирная группа, и сравниваются масс-спектры образцов с и без вышеупомянутого комплекса, таким образом может быть получена информация о соединении, которое связано с фосфорнокислотной моноэфирной группой. То есть, так как величины пиков молекулярных ионов соединения с комплексом и соединения без комплекса различаются между собой в зависимости от существования комплекса, может быть определена молекулярная масса соединения, имеющего фосфорнокислотную моноэфирную группу.
Однако за исключением чистых образцов, т.е. очищенных образцов, когда анализируют образец, включающий в себя множество соединений, детектируемый пик молекулярного иона может не идентифицироваться, даже если диаграмма увеличена. Индикация ионных пиков может меняться в зависимости от распределения изотопов атомов, формирующих соединение. Поэтому индикация пиков молекулярных ионов различна для соединения с комплексом и соединения без комплекса и может быть трудно идентифицировать пики.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При вышеуказанных обстоятельствах задачей настоящего изобретения является обеспечить способ легкого определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, т.е. пептида, сахарида и т.п., даже в образце, включающем в себя множество соединений, таком как биологический образец.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение добавки для масс-спектрометрии, которая может быть использована в вышеуказанном способе.
Чтобы решить вышеуказанные задачи, изобретатели провели дополнительное исследование обнаруженных комплексов металлов, которые демонстрируют высокую связывающую активность по отношению к фосфорнокислотным моноэфирным группам. Они обнаружили, что молекулярная масса соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, легко определяется при обработке множественными комплексными соединениями, координированными изотопами цинка одного вида в образце, для получения их множественных масс-спектров и даьнейшего сравнения данных масс-спектров. В итоге, они завершили настоящее изобретение.
Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, содержит этапы:
(1) смешение комплексного соединения, включающего в себя соединение (I), имеющего один вид изотопов цинка, и образца в растворителе с получением раствора и затем регистрация масс-спектра раствора,
Figure 00000003
[где R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода или заместители];
(2) смешение комплексного соединения, включающего в себя соединение (I), имеющего другой вид изотопов цинка, и образца в растворителе с получением раствора и затем регистрация масс-спектра раствора; и
(3) определение молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, сравнением масс-спектров.
В вышеуказанном способе, когда соединение, содержащее моноэфир фосфорной кислоты, включено в образец, пики молекулярных ионов могут наблюдаться в разных положениях для двух масс-спектров. В случае использования соединений (I), имеющих идентичные базисные скелеты за исключением изотопов цинка, когда сравнивают оба пика молекулярных ионов, положения ионных пиков смещены на величину, получаемую удвоением разницы в молекулярной массе двух используемых изотопов цинка (когда каждая молекула соединений, содержащих моноэфир фосфорной кислоты, имеет множество фосфорнокислотных моноэфирных групп, данную величину получают умножением на число групп), хотя оба пика имеют почти идентичные формы. Следовательно, пики молекулярных ионов соединений, содержащих моноэфир фосфорной кислоты, могут быть легко идентифицированы и одновременно могут быть определены их молекулярные массы.
В комплексном соединении (I) все R от R1 до R4, предпочтительно, представляют собой атомы водорода. Так как структура такого соединения (I) является простейшей, это соединение легко получить, и пики молекулярных ионов являются более упрощенными.
Кроме того, используется добавка для масс-спектрометрии по настоящему изобретению для определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, содержащая: реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее другой вид изотопов цинка;
Figure 00000003
[где R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода или заместители].
В комплексном соединении все группы R от R1 до R4, предпочтительно, представляют собой атомы водорода. Так как структура такого комплексного соединения является простейшей, то и получить такое соединение легко.
Что касается комплексного соединения, предпочтительно, чтобы соединение (I) дополнительно образовывало комплекс с ацетат-ионом. Такое соединение более стабильно и легче сохраняется, чем соединение, не координированное с ацетат-ионом. К тому же, когда комплексное соединение добавляется к образцу, моноэфирная фосфорнокислотная группа может координироваться с комплексным соединением путем обмена местом с ацетат-ионом, следовательно, соединение, содержащее моноэфир фосфорной кислоты, может быть обнаружено так же, как и в случае, когда используется соединение, которое не координируется с ацетат-ионом.
Реагент, предпочтительно, находится в виде соли, так как она имеет высокую стабильность при хранении. Реагент также, предпочтительно, находится в виде раствора, так как он может быть использован в качестве образца для масс-спектрометрии добавлением в раствор образца или добавлением образца в раствор добавки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показан результат 1Н ЯМР комплексного соединения по настоящему изобретению.
На фиг.2 показан результат ИК комплексного соединения по настоящему изобретению.
Фиг.3 представляет собой масс-спектр композитного материала образца и природного цинкового изотопного комплекса; вследствие существования множества изотопов цинка пики усложнены.
Фиг.4 представляет собой масс-спектр композитного материала образца и 64Zn цинкового комплекса. Так как цинк, входящий в комплекс, состоит из одного вида изотопов, пики более простые, чем в случае природного цинкового изотопного комплекса.
Фиг.5 представляет собой масс-спектр композитного материала образца и 68Zn цинкового комплекса; так же, как и на фиг.4, пики более простые, чем в случае природного цинкового изотопного комплекса.
Фиг.6 представляет собой масс-спектр композитного материала образца и 64Zn цинкового комплекса.
Фиг.7 представляет собой масс-спектр композитного материала образца и 68Zn цинкового комплекса. Сравнением фиг.7 с фиг.6 можно определить молекулярную массу соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты.
ЛУЧШАЯ МЕТОДИКА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Первичный признак способа по настоящему изобретению заключается в использовании двух комплексных соединений, включающих в себя изотопы цинка, каждое имеющее разные молекулярные массы, масс-спектры каждого образца, координированного с соответствующим комплексным соединением, сравнивают, таким образом, существование соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, включенного в образец, может быть легко доказано и его молекулярная масса может быть определена.
Известны разные комплексы металлов, способные связываться с фосфорнокислотной группой. Однако не было установлено, что комплексное соединение по настоящему изобретению имеет высокую способность к связыванию с фосфорнокислотной моноэфирной группой. К тому же, изобретатели настоящего изобретения разработали изобретение, в котором комплексное соединение по настоящему изобретению используется в качестве добавки для масс-спектрометрии (добавка для анализа с помощью масс-спектрометрии). Настоящее изобретение улучшает вышеупомянутое изобретение и обеспечивает более легкое доказательство соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и определение его молекулярной массы.
Ниже будут объяснены варианты осуществления настоящего изобретения и его преимущества.
В способе по настоящему изобретению сначала (1) комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, смешивают с образцом в растворителе, получая раствор, и затем записывают масс-спектр раствора.
Figure 00000003
[где R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода или заместители].
Сначала ниже будет объяснено комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка.
В соединении (I) заместители R от R1 до R4 не определены конкретно, поскольку заместители не нарушают координацию соединения (I) с фосфорнокислотной моноэфирной группой. Примерами заместителей являются: С1-С6 алкильная группа с прямой цепью или разветвленной цепью, аминогруппа, гидроксильная группа, карбамоильная группа, С1-С6 алкоксильная группа с прямой цепью или разветвленной цепью, атом галогена, нитрогруппа, группа сульфоновой кислоты, карбоксильная группа, формильная группа, ацильная группа, цианогруппа, аминометильная группа, гидроксиметильная группа и т.п.
Что касается R от R1 до R4, предпочтительно, чтобы они представляли собой атомы водорода. Соединение, в котором R от R1 до R4 представляет собой атомы водорода, может легко быть получено с низкой стоимостью, а полученные пики молекулярных ионов могут быть проще. Кроме того, что касается R от R1 до R4, предпочтительно, чтобы они имели электронно-донорные заместители в 4 или 6 положении пиридинового кольца. Соединение является электрически обогащенным по пиридиновому азоту посредством электронно-донорного заместителя, который введен в соответствующее положение. Таким образом, соединение сильно координируется с цинком, в связи с чем можно легко получить данное соединение. Такое соединение является стабильным.
R от R1 до R4 могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Однако, предпочтительно, когда они идентичны друг другу, главным образом потому, что такое соединение легче синтезировать.
В формуле (I) цинк выбран в качестве координационного металла потому, что цинк сильно координируется с фосфорнокислотной моноэфирной группой.
Комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), означает, что существенной частью в комплексном соединении является соединение (I). Например, с целью дополнительной стабилизации соединения (I) ацетат-ион и т.п. может координироваться с соединением (I), как показано на следующей формуле.
Figure 00000004
Соединение (I) демонстрирует исключительно высокую координационную способность к фосфорнокислотной моноэфирной группе. Следовательно, когда соединение, имеющее фосфорнокислотную моноэфирную группу, присутствует в растворе, быстро происходит взаимный обмен, даже если другие соединения координированы с соединением (I), в связи с чем образуется композитный материал комплексного соединения и соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты.
Природный изотоп цинка имеет молекулярную массу 64, 66, 67, 68 или 70. Комплексное соединение, содержащее один вид изотопа, выбранного среди любого из вышеуказанных, используется в способе (1).
В способе (1) комплексное соединение и образец смешивают в растворителе, получая раствор. Затем, так как соединение (1) демонстрирует исключительно высокую координационную способность к фосфорнокислотной моноэфирной группе, соединение (1) быстро координируется в образце с соединением, содержащим моноэфир фосфорной кислоты, образуя композитный материал. Таким образом, нет особой необходимости нагревать смешанный раствор или тратить время на образование композитного материала. Однако в действительности, раствор может подвергаться обработке, пока это в рамках цели настоящего изобретения. Например, раствор может нагреваться.
Кроме того, чтобы смешать комплексное соединение и образец в растворителе, комплексное соединение и образец могут добавляться в растворитель или образец или его раствор может добавляться в раствор комплексного соединения, или комплексное соединение или его раствор может добавляться в раствор образца.
Используемый в данном способе растворитель особо не ограничен, пока растворитель может растворять комплексное соединение настоящего изобретения и образец в пределах так, что настоящее изобретение может оказывать влияние. Примеры растворителей представляют собой: воду (включая буфер или раствор, содержащий соль иную, чем буфер); спирты, такие как метанол или этанол; ацетонитрил; амид, такой как диметилформамид и диметилацетамид; и их смешанные растворы. Среди них вода или смешанный раствор, приготовленный из воды и водорастворимого органического растворителя (водный растворитель), являются предпочтительными, так как они хороши в растворении комплексного соединения настоящего изобретения, биологических образцов и т.п.
Когда комплексное соединение и образец смешивают в растворителе, получая раствор в способе (1), нет необходимости растворять комплексное соединение и образец полностью. Однако предпочтительно, чтобы они растворились достаточно для того, чтобы комплексное соединение было способно координировать с соединением, содержащим моноэфир фосфорной кислоты, в образце. То есть раствор не должен быть полным раствором, и нерастворенные элементы могут оставаться в некоторых частях.
Далее раствор (смешанный раствор), включающий в себя композитный материал комплексного соединения настоящего изобретения и соединение, содержащее моноэфир фосфорной кислоты, анализируется с помощью масс-спектрометрии. В масс-спектрометрии может быть использован масс-спектрометр, который подходит для детектирования соединения, которое необходимо обнаружить. Так как цель настоящего изобретения заключается, главным образом, в получении молекулярной массы полимерной молекулы, включенной в биологические образцы, MALDI TOF-MAS (времяпролетный масс-спектрометр с матричной лазерной десорбционной ионизацией), предпочтительно используется из-за его способности измерять даже такие гигантские молекулы как белок.
Цель настоящего изобретения состоит, главным образом, в определении молекулярной массы фосфатного моноэтерифицированного пептида. Однако образец не ограничивается вышеуказанным и, например, могут быть использованы композитный материал фосфорилированного пептида и сахарида и фосфорилированный сахарид.
Затем, способ (2) проводят так же, как способ (1). В частности, соединение (I) в способе (2), предпочтительно, то же самое, что в способе (1). Так как формы сравниваемых пиков молекулярных ионов почти идентичны друг другу, идентификация пиков молекулярных ионов будет упрощена. В способе (2) существенно использовать комплексное соединение, связанное с видом изотопов цинка, отличающимся от вида, использованного в способе (1). Если в способах (1) и (2) используется одинаковый вид изотопов, результат настоящего изобретения не может быть достигнут.
Кроме того, вышеупомянутые способы (1) и (2) могут быть выполнены одновременно. То есть вариант осуществления, в котором добавка для масс-спектрометрии, включающая в себя два вида соединений (I), содержащих изотопы цинка, имеющие отличные друг от друга молекулярные массы, добавляется к образцу, и смесь анализируется с помощью масс-спектрометрии, является областью настоящего изобретения. Однако трудно идентифицировать пик молекулярного иона комплекса соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и соединения (I), когда образец имеет множество соединений. Поэтому вариант осуществления, в котором способ (1) выполняется сначала, а затем следует способ (2), является предпочтительным.
Впоследствии, в способе (3) молекулярная масса соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, определяется сравнением масс-спектров, полученных в способах (1) и (2).
Сначала масс-спектры сравнивают, чтобы найти отличающиеся пики. Пики молекулярных ионов соединения (I) или комплексного соединения, содержащего разные изотопы цинка, естественно отличаются. Когда соединение, содержащее моноэфир фосфорной кислоты, включено в образец, то, поскольку соединение (I) координирует с соединением, содержащим моноэфир фосфорной кислоты, почти количественно, образуя композитный материал, величины пиков молекулярных ионов композитного материала различаются в зависимости от разных величин молекулярных масс изотопов цинка.
Легко идентифицировать пик молекулярного иона композитного материала с помощью масс-спектров, полученных в вышеупомянутых способах (1) и (2). Формы обоих пиков молекулярных ионов почти идентичны, поэтому при увеличении обоих пиков для сравнения легко сделать вывод, относятся ли оба пика молекулярных ионов к одному виду соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, или нет. Кроме того, когда в вышеупомянутых способах (1) и (2) используется одинаковое соединение (I), разница молекулярных масс обоих пиков равна величине, полученной многократным суммированием двойной разности молекулярных масс изотопов цинка. Следовательно, оба пика молекулярных ионов легко идентифицировать. Это является результатом того, что два атома цинка координируются с комплексным соединением, используемым в настоящем изобретении, а также того, что комплексное соединение настоящего изобретения координируется почти количественно с фосфорнокислотной моноэфирной группой, присутствующей в образце. Следовательно, разницу в обеих молекулярных массах в некоторой степени можно предвидеть.
Например, когда одинаковое соединение используется как соединение (I) и когда 64Zn и 68Zn используются как изотопы цинка, разница в молекулярной массе композитных материалов фосфорилированного пептида и комплексных соединений согласно способам (1) и (2) представляет собой целое, кратное 8 (величина, полученная путем умножения на 8 числа фосфорнокислотных моноэфирных групп, присутствующих в одной молекуле соединения). Кроме того, по измеренной разности в молекулярной массе можно определить число фосфорнокислотных моноэфирных групп, присутствующих в одной молекуле соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты.
Кроме того, так как в настоящем изобретении используется один вид изотопов цинка, сложность пиков молекулярных ионов, происходящая от использования множества видов изотопов цинка, может быть снижена. Расщепление пиков молекулярных ионов вызывается только изотопами углерода и т.п., что является другой причиной более легкой идентификации пиков молекулярных ионов.
Далее, вычитание молекулярной массы соединения (I) из молекулярной массы, полученной для идентифицированных пиков молекулярных ионов, позволяет определить молекулярную массу соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты. Например, в случае использования соединения, показанного ниже, в качестве соединения (I) (в котором все R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода, и ионным изотопом является 64Zn), когда число фосфорнокислотных моноэфирных групп, связанных с соединением, содержащим моноэфир фосфорной кислоты, равно единице, молекулярная масса соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, может быть определена вычитанием 579 из величины пика молекулярного иона композитного материала. Причина того, почему вычитается не 581 - молекулярная масса соединения (I), показанного ниже, заключается в том, что два положительных иона водорода отщепляются от фосфорнокислотной моноэфирной группы, когда соединение, содержащее моноэфир фосфорной кислоты, координируется с соединением (I), поэтому их атомную массу необходимо добавить.
Figure 00000005
Добавка для масс-спектрометрии по настоящему изобретению используется для определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и содержит реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее другой вид изотопов цинка.
Комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее другой вид изотопов цинка, означает то же, что и выше.
Имеется в виду, что реагент, имеющий комплексное соединение, может быть в виде соли или сольвата, то есть гидратов и подобных комплексных соединений. На противоион, составляющий соль, не накладывают ограничений, пока противоион не имеет мешающего влияния на настоящее изобретение, и предпочтительно использовать противоион, который позволяет реагенту, имеющему комплексное соединение, образовывать кристалл, и который улучшает устойчивость комплексного соединения. Например, перхлорат ион (ClO4 -) является предпочтительным. Кроме того, формы определенного гидрата могут приводить к улучшению устойчивости по отношению к влаге и тому подобному.
Кроме того, добавка для масс-спектрометрии по настоящему изобретению может быть в виде раствора. Когда добавка находится в виде раствора, это удобно, поскольку она может быть добавлена в раствор образца, и образец или его раствор могут быть добавлены непосредственно в раствор. В качестве растворителя, используемого для растворения, может быть использован вышеупомянутый растворитель для смешения комплексного соединения и образца. Кроме того, могут быть добавлены добавки для улучшения устойчивости комплексного соединения.
Включение реагента означает, что два вида реагентов могут быть включены в композицию. Однако, как описано выше, процесс (1) и процесс (2), предпочтительно, проводят один за другим, хотя их можно проводить одновременно. Соответственно, добавки для масс-спектрометрии по настоящему изобретению являются, предпочтительно, набором, имеющим каждый реагент отдельно.
Соединение (1) может быть легко получено по схеме 1.
Схема 1
Figure 00000006
[где R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода или заместители].
В приведенной выше схеме 1 соединение (II) реагирует с соединением, содержащим один вид изотопа цинка, чтобы синтезировать соединение (I). Соединение (II), которое представляет собой исходное соединение, может быть синтезировано по следующей схеме 2. В качестве соединения с одним видом изотопа цинка может быть использован металлический цинк, окись цинка, соль цинка и т.п. Соединение (II) может быть солью.
На приведенной выше схеме 1 цинк легко координирует с соединением (II) при нагревании в водном, доведенном до нейтрального растворе. Однако, поскольку соединения цинка нуждаются в эффективном растворении, гранулы цинка следует тонко измельчить, например, предварительной ультразвуковой обработкой, или просто растворить в соляной кислоте. Определение нейтральности, в данном случае, не означает полностью нейтральный, но почти нейтральный, предпочтительно, pH водного растворителя устанавливают не менее, чем 6,8.
На водный растворитель, используемый в схеме 1, не накладывают ограничения, если он способен растворить соединение (II) и соединение цинка. Водный растворитель может быть чистой водой, дистиллированной водой, водопроводной водой, буферным раствором или смесью, полученной добавлением спирта, амида или ацетонитрила и растворителей, подобных перечисленным выше.
Температура нагрева, предпочтительно, находится в интервале от 30 до 90°С, более предпочтительно, от 50 до 90°С. Реакционный период может быть от 10 минут до нескольких часов. После реакции избыток реагентов удаляют таким способом как фильтрация. Далее целевой продукт получают медленным охлаждением раствора и отделением выпавших кристаллов фильтрацией или обычным способом перекристаллизации. Комплексное соединение может быть стабилизировано координацией с ацетат-ионом.
Соединение (II) может быть получено по схеме 2.
Схема 2
Figure 00000007
[где R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода или заместители].
Схема 2 показывает путь реакции, в которой 2-пиридилметиловую группу, имеющую R от R1 до R4, добавляют последовательно в соединение (III), то есть в 1,3-диамино-2-пропанол, который представляет собой исходное соединение. Соединение (III), используемое в схеме 2, может быть коммерчески доступным. Поскольку соединение (IV) и 2-формилпиридин имеют относительно простые структуры, они могут быть коммерчески доступны или могут быть синтезированы способом, хорошо известным специалистам в данной области. Когда заместители, то есть R от R1 до R4, представляют собой реакционно-способные группы, то заместители могут быть защищены обычными защитными группами, и защитные группы могут быть удалены в подходящий момент.
В схеме 2 сначала соединение (III) и соединение (IV) реагируют друг с другом в реакции конденсации, образуя соединение (V), и затем 2-пиридилметильную группу вводят последовательно, чтобы синтезировать соединение (II). Когда R от R1 до R4 представляют собой одни и те же группы, соединение (II) может быть получено в одну стадию, используя 4 или более эквивалентов 2-формилпиридинового соединения (IV).
В схеме 2 восстановительное аминирование проводят как реакцию конденсации. Растворитель, используемый в восстановительном аминировании, не имеет особых ограничений, если он способен, по существу, растворить соединение (III) и 2-формилпиридиновое соединение, такое как соединение (IV), и не ингибирует аминирование. Например, могут быть использованы в качестве растворителя спирты, такие как метанол, этанол или изопропанол; эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; вода; или смешанный растворитель, содержащий два или более таких компонента.
Восстановительное аминирование может быть проведено с использованием общепринятых восстановительных агентов после конденсации соединения (III) и 2-формилпиридинового соединения, соляная кислота и подобные соединения могут быть добавлены во время конденсации в качестве катализатора. Соль соляной кислоты может быть использована как соединение (III).
Оптимальное условие, касающееся температуры реакции и времени протекания реакции, может быть, если требуется, выбрано в зависимости от вида исходного соединения или других факторов. Например, реакция может быть проведена при температуре реакции от 20 до 80°С и в течение времени реакции от 12 до 100 часов.
После завершения реакции растворитель и т.п. отгоняют при пониженном давлении. Затем добавляют воду и образующуюся смесь экстрагируют водонерастворимым растворителем, и масляную фазу сушат над безводным сульфатом магния или подобным осушителем. После этого растворитель отгоняют при пониженном давлении. Затем остаток очищают хорошо известным способом, таким как колоночная хроматография на силикагеле, и проводят реакции при введении пиридилметила, получая таким образом соединение (II).
Способ получения соединения (II) не ограничен способом, показанным на схеме 2. Например, соединение (II) может быть синтезировано из соединения (III) и галоидного соединения. Способ синтеза соединения (II), в котором все R от R1 до R4 представляют собой атомы водорода, описан в документе M. Suzuki et. al., Bull. Chem. Soc. Jpn., Vol.63, pp.1115-1120 (1990), а способ синтеза соединения (II), в котором все R от R1 до R4 представляют собой метильные группы, введенные в 6 положение (2 положение) описан в документе Y.Hayashi, et. al., J. Am. Chem. Soc., Vol.117, pp.11220-11229 (1995).
Ниже настоящее изобретение будет проиллюстрировано со ссылкой на примеры получения и контрольные примеры, но не ограничивается ими.
ПРИМЕРЫ
Пример получения 1-1: Комплекс цинка (соль) по настоящему изобретению
Figure 00000008
К 65 мл воды добавляли 902 мг (1 ммоль) N,N,N',N'-тетракис[(2-пиридил)метил]-1,3-диамино-2-гидроксипропан (далее обозначается как "ТПАГП") 4-перхлорат 2,5-гидрата и 160 мг (2 ммоль) 64ZnO. Смесь обрабатывали ультразвуком при 50°С для растворения, в то время как 64ZnO диспергировали. К раствору добавляли 1,0 мл 1,0 М водного раствора гидроксида натрия и раствор фильтровали после нагревания в течение 30 минут на водяной бане при 80°С. Затем 2,0 мл 1,0 М водного раствора ацетата добавляли по каплям в перемешиваемый раствор, в то время как раствор нагревали на водяной бане при 80°С. Потом реакционную смесь медленно охлаждали до комнатной температуры, выпавшие бесцветные кристаллы отфильтровывали с помощью стеклянного фильтра и сушили при 50°С и давлении около 10 мм рт.ст. в течение 3 часов, получая 760 мг (89%) целевого продукта. Были получены 1Н ЯМР и ИК-спектры целевого продукта. Результаты показаны на фиг.1 и 2 соответственно.
Пример получения 1-2: Комплекс цинка (соль) по настоящему изобретению.
Figure 00000009
К 10 мл воды добавляли 658 мг (0,73 моль) ТПАГП 4-перхлорат 2,5-гидрата и 100 мг (1,47 ммоль) 68Zn. Смесь обрабатывали ультразвуком при 50°С для растворения, в то время как 68Zn диспергировали. 68Zn подвергали предварительной обработке, во время которой 68Zn заранее растворяли в 5 мл конц. соляной кислоты, затем воду отгоняли при пониженном давлении и 68Zn затем дополнительно сушили с помощью азеотропа с метанолом при пониженном давлении. К раствору добавляли 36,5 мл 0,1 М водного раствора гидроксида натрия и раствор отфильтровывали после нагревания в течение 30 минут на водяной бане при 80°С. Далее водный раствор ацетата натрия (который получали растворением 160 мг ацетата натрия в 5 мл дистиллированной воды) прибавляли по каплям в перемешиваемый раствор, в то время как раствор нагревали на водяной бане при 80°С. Потом реакционную смесь медленно охлаждали до комнатной температуры, выпавшие бесцветные кристаллы отфильтровывали с помощью стеклянного фильтра и сушили при 50°С и давлении около 10 мм рт.ст. в течение 3 часов, получая 440 мг (70%) целевого продукта.
Пример получения 1-3: Комплекс цинка (соль), состоящий из природного изотопа цинка.
К раствору ТПАГП (4,39 ммоль) в этаноле (100 мл) добавляли 10 М водный раствор гидроксида натрия (1,0 экв.) и затем добавляли ацетат цинка (9,66 ммоль, 2,2 экв.). Растворитель отгоняли при пониженном давлении и получали коричневый маслообразный остаток. Остаток растворяли добавлением 10 мл воды. Затем, в то время как остаток нагревали, в него добавляли по каплям 1,0 М раствор перхлората натрия (3,0 экв.) для получения осадка кремово-белых кристаллов. Кристаллы отфильтровывали и сушили при нагревании с образованием 2,99 г (79%) целевого продукта, который представлял собой слегка коричнево-желтый порошок. С помощью 1Н-ЯМР (400 МГц), 13С-ЯМР (100 МГц) и ИК было подтверждено, что полученное соединение представляет собой целевой продукт.
1Н-ЯМР (ДМСО-D6, 400 МГц): δ 2,04 (2Н, дд, J=12,1 и 12,4 Гц, НС-1,3), 2,53 (3Н, с, НС-35), 3,06 (2Н, дд, J=12,1 и 12,3 Гц, НС-1,3), 3,74 (1Н, т, J=10,4 Гц, НС-2), 4,02-4,34 (82Н, м, НС-5,13,20,27), 7,54-7,65 (8Н, м, НС-10,11,18,19,25,26,32,33), 8,06-8,12 (4Н, м, НС-9,17,24,31), 8,58 (4Н, дд, J=16,3 и 16,5 Гц, НС-8,16,23,30);
13С-ЯМР (ДМСО-D6, 100 МГц): δ 58,0 60,1, 62,0, 64,6, 122,7, 124,3, 124,4, 139,9, 140,4, 147,0, 147,2, 154,7, 155,1;
ИК (см-1): νAS (СОО) 1556, ν3 (ClO4) 1090.
Контрольный пример 1
Каждое соединение комплекса цинка (каждое, имеющее 64Zn,68Zn и природный изотоп Zn как составляющий компонент), полученное в вышеупомянутых примерах получения от 1-1 до 1-3, растворяли в дистиллированной воде с получением 1 мМ водного раствора. В качестве образца использовали 1 мМ водный раствор фосфорилированного пептида P60c-src 521-533. Следующая формула показывает структуру фосфорилированного пептида.
Figure 00000010
К каждым 5 мкл 1 мМ водного раствора комплекса цинка добавляли 10 мкл образца, 30 мкл буферного раствора и 5 мкл дистиллированной воды, что дает суммарное количество образца для анализа, равное 50 мкл, и записывали масс-спектры (MALDI TOF-MAS) образцов. На пластинку для образца наносили 0,5 мкл образца для анализа и быстро добавляли к образцу 0,5 мкл матрицы. Образец и матрицу осторожно смешивали пипеткой, чтобы кончик пипетки не коснулся пластинки. После этого образец и матрицу сушили на воздухе приблизительно пять минут и получали масс-спектр. Условия масс-спектрометрии приведены ниже:
MALDI TOF-MAS: autoflex (Brucker Daltonics Inc.);
Матрица: ТГАФ (2,4,6-тригидроксиацетофенон) 40 мг/мл (в ацетонитриле);
Буферный раствор (для растворения образцов): 10 мМ трис-боратного буфера (pH8,0).
На фиг.3, фиг.4 и фиг.5 показаны результаты масс-спектрометрии композитных материалов соединения и изотопов цинка, выбранных из природного изотопа цинка, 64Zn изотопа цинка или 68Zn изотопа цинка, соответственно.
Согласно полученным выше результатам пик молекулярного иона композитного материала, включающего в себя цинк 64Zn, равнялся 2122, и пик молекулярного иона композитного материала, включающего в себя цинк 68Zn, равнялся 2130. Из этого ясно, что образец был монофосфатно-этерифицирован, и число связанных фосфатных групп равнялось единице. При вычитании молекулярной массы (581) комплексного соединения из молекулярной массы композитного соединения, включающего 64Zn, получали величину, равную 1541. Данная величина отличается от величины, показанной для вышеприведенной структурной формулы, поскольку она учитывает, что комплексное соединение координировано с ионизированным (то есть положительный ион водорода элиминирован) соединением, содержащим моноэфир фосфорной кислоты, в пептиде, как показано в следующей формуле. То есть добавление молекулярной массы элиминированного положительного иона водорода, 2, к полученной молекулярной массе дает 1543, что согласуется с молекулярной массой, соответствующей данным.
Figure 00000011
Пик молекулярного иона композитного материала, включающего в себя изотоп природного цинка, является сложным вследствие существования множества видов изотопов цинка. С другой стороны, пик упрощается и проявляется в почти идентичной форме, когда используется один вид изотопов цинка. Следовательно, настоящее изобретение демонстрирует, что пик молекулярного иона легко идентифицировать, даже когда используется смешанный образец такой, как биологический образец.
Контрольный пример 2.
Используя комплексы цинка, полученные в вышеупомянутых примерах получения 1-1 и 1-2 (каждый имеет 64Zn и 68Zn в качестве составляющих компонентов), повторили тот же способ, что и в контрольном примере 1, для получения их масс-спектров. В качестве образца использовали фосфорилированный пептид P60c-scr Substrate II, имеющий следующую структуру. В качестве измерительного прибора использовали Voyager RP type (PE Biosistem Inc)
Figure 00000012
Результаты масс-спектрометрии композитных соединений, включающих в себя изотоп цинка 64Zn и изотоп цинка 68Zn, показаны на фиг.6 и фиг.7, соответственно.
Согласно результатам, ясно видно, что, как и в контрольном примере 1, образец был монофосфатно-этерифицирован и число связанных фосфатных групп равнялось единице. Кроме того, пики обоих молекулярных ионов имеют почти идентичную форму, и было найдено, что молекулярная масса соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, легко определяется, даже когда используется смешанный образец, такой как биологический образец. При вычитании молекулярной массы (581) комплексного соединения из молекулярной массы композитного материала, включающего в себя цинк 64Zn, получена величина, равная 747. Данная величина отличается от величины, показанной для приведенной выше структурной формулы, поскольку учитывается, что моноэфирная фосфорнокислотная группа ионизована, как в случае результата контрольного примера 1. Поэтому добавление молекулярной массы элиминированного положительного иона водорода дает 749.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение обеспечивает способ подтверждения существования соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты (фосфорилированный пептид и т.п.) и легкого определения его молекулярной массы даже в ряду биологических образцов, включающих в себя множество соединений. Таким образом, настоящее изобретение является полезным в диагностике болезней или т.п., когда настоящий способ применяют к биологическим образцам или т.п. Кроме того, добавки для масс-спектрометрии по настоящему изобретению являются очень полезными в промышленном аспекте, так как могут быть использованы для настоящего изобретения.

Claims (8)

1. Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, содержит этапы:
(1) смешение комплексного соединения, включающего в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и образца в растворителе для получения раствора и затем регистрация масс-спектра раствора
Figure 00000013
где R от R1 до R4 представляет собой атомы водорода или заместители
(2) смешение комплексного соединения, включающего в себя соединение (I), имеющего другой вид изотопов цинка, и образца в растворителе для получения раствора и затем регистрация масс-спектра раствора; и
(3) определение молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, сравнением масс-спектров.
2. Способ по п.1, в котором все R от R1 до R4 в комплексном соединении, используемом в способе, представляют собой атомы водорода.
3. Добавка для масс-спектрометрии, используемая для определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, содержит:
реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее один вид изотопов цинка, и реагент, имеющий комплексное соединение, включающее в себя соединение (I), имеющее другой вид изотопов цинка
Figure 00000013
где R от R1 до R4 представляет собой атомы водорода или заместители.
4. Добавка для масс-спектрометрии по п.3, причем все R от R1 до R4 комплексного соединения в реагенте представляют собой атомы водорода.
5. Добавка для масс-спектрометрии по п.3 или 4, причем комплексное соединение дополнительно образует комплекс соединения (I) и ацетатного иона.
6. Добавка для масс-спектрометрии по п.4, причем комплексное соединение дополнительно образует комплекс соединения (I) и ацетатного иона.
7. Добавка для масс-спектрометрии по п.3, причем реагент находится в виде соли.
8. Добавка для масс-спектрометрии по п.3, причем реагент находится в виде раствора.
RU2005131004/28A 2003-03-07 2003-12-24 Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и добавка для масс-спектрометрии RU2326377C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-61939 2003-03-07
JP2003061939 2003-03-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005131004A RU2005131004A (ru) 2006-03-20
RU2326377C2 true RU2326377C2 (ru) 2008-06-10

Family

ID=32958986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005131004/28A RU2326377C2 (ru) 2003-03-07 2003-12-24 Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и добавка для масс-спектрометрии

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7476738B2 (ru)
EP (1) EP1602923B1 (ru)
CN (1) CN100422732C (ru)
AU (1) AU2003296059B2 (ru)
CA (1) CA2518495C (ru)
DE (1) DE60333040D1 (ru)
RU (1) RU2326377C2 (ru)
TW (1) TW200508606A (ru)
WO (1) WO2004079358A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050269267A1 (en) * 2004-03-19 2005-12-08 Perkinelmer Las, Inc. Separations platform based upon electroosmosis-driven planar chromatography
US20080064608A1 (en) * 2004-07-13 2008-03-13 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method Of Detecting Phosphorylation By Spr Using Zinc Chelating Reagent
WO2007067731A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Perkinelmer Las, Inc. Micelle- and microemulsion-assisted planar separations platform for proteomics
WO2007087339A2 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexed analyte quantitation by two-dimensional planar electrochromatography
WO2007127988A2 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Perkinelmer Las, Inc. Detecting phospho-transfer activity

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2172145C (en) * 1994-07-25 2010-09-21 Hans-Peter Josel Metal complexes with a charged linker
WO2000011208A1 (en) * 1998-08-25 2000-03-02 University Of Washington Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures
DE10297577B4 (de) * 2001-12-21 2007-11-22 Tohru Koike Zinkkomplexe, die fähig sind, Substanzen, die anionische Substituenten haben, abzufangen
US7202093B2 (en) * 2003-03-03 2007-04-10 Kabushiki Kaisha Nard Kenkyusho Method for labeling phosphorylated peptides, method for selectively adsorbing phosphorylated peptides, complex compounds used in the methods, process for producing the complex compounds, and raw material compounds for the complex compounds
WO2004078342A1 (ja) 2003-03-04 2004-09-16 Manac Inc. アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEYFARTH L. ET AL. CHEMICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF METAL-BINDING PSEUDOTRIPEPTIDES WITH DIFFERENT FUNCTIONALIZED N-ALRYL RESIDUES. - LETTERS IN PEPTIDE SCIENCE, v.8, №1, p.13-20. *

Also Published As

Publication number Publication date
TWI301889B (ru) 2008-10-11
TW200508606A (en) 2005-03-01
CA2518495C (en) 2011-08-02
RU2005131004A (ru) 2006-03-20
CN1756954A (zh) 2006-04-05
EP1602923B1 (en) 2010-06-16
CN100422732C (zh) 2008-10-01
AU2003296059A1 (en) 2004-09-28
DE60333040D1 (de) 2010-07-29
AU2003296059B2 (en) 2009-02-19
CA2518495A1 (en) 2004-09-16
US7476738B2 (en) 2009-01-13
EP1602923A1 (en) 2005-12-07
WO2004079358A1 (ja) 2004-09-16
US20060183237A1 (en) 2006-08-17
EP1602923A4 (en) 2007-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Raggiaschi et al. Phosphoproteome analysis
Koike et al. Novel properties of cooperative dinuclear zinc (II) ions: The selective recognition of phosphomonoesters and their P− O ester bond cleavage by a new dinuclear zinc (II) cryptate
JP4303595B2 (ja) アニオン性置換基を有する物質を捕捉可能な亜鉛錯体
Schug et al. Noncovalent binding between guanidinium and anionic groups: focus on biological-and synthetic-based arginine/guanidinium interactions with phosph [on] ate and sulf [on] ate residues
JP4453363B2 (ja) アミノ官能性化合物の分析方法及び分析試薬
Xu et al. Biophysical studies of a ruthenium (II) polypyridyl complex binding to DNA and RNA prove that nucleic acid structure has significant effects on binding behaviors
Vékey et al. Distinction of amino acid enantiomers based on the basicity of their dimers
Giampà et al. Maleic anhydride proton sponge as a novel MALDI matrix for the visualization of small molecules (< 250 m/z) in brain tumors by routine MALDI ToF imaging mass spectrometry
Zhao et al. Direct determination of the primary binding site of cisplatin on cytochrome C by mass spectrometry
CA2932844C (en) Excimer forming compounds
CA2517705C (en) Method for labeling phosphorylated peptides, method for selectively adsorbing phosphorylated peptides, complex compounds used in the methods, process for producing the complex compounds, and raw material compounds for the complex compounds
RU2326377C2 (ru) Способ определения молекулярной массы соединения, содержащего моноэфир фосфорной кислоты, и добавка для масс-спектрометрии
Pereira et al. Mechanistic Aspects of Phosphate Diester Cleavage Assisted by Imidazole. A Template Reaction for Obtaining Aryl Phosphoimidazoles
D’Ambrosio et al. Analytical methodologies for the detection and structural characterization of phosphorylated proteins
JP4109621B2 (ja) リン酸モノエステル化合物の分子量を求める方法、およびマススペクトル測定用添加剤
Gao et al. Formation of cyclic acylphosphoramidates in mass spectra of N‐monoalkyloxyphosphoryl amino acids using electrospray ionization tandem mass spectrometry
Schug et al. Using electrospray ionization-mass spectrometry/tandem mass spectrometry and small molecules to study guanidinium–anion interactions
US20110118124A1 (en) Method for improving the properties of a drug lead compound
Whitney Synthesis and Incorporation of Bisguanidine Ligands into a Ruthenium Metal Framework: Novel Receptors for Phosphate Monoester Recognition
Petrillo Design and synthesis of artificial receptors for phosphorylated amino acids
Barbaro et al. Beryllium (II) Complexes of the Kläui Tripodal Ligand Cyclopentadienyltris (diethylphosphito-P) cobaltate (−)
Zhao Investigation into the specificities of deubiquitinases and ubiquitin-like proteases
Li et al. Identification of Binding Sites in Copper (II)-Peptide Complexes Using Infrared Spectroscopy
White Weak intermolecular interactions as binding probes and analytical tools
Tran Quantitative proteome analyses of phosphorylated proteins and alternative splice variants in human cell lines and urine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20141225