RU2321589C2

RU2321589C2 - Способ получения бромида 1-гексадецил-r(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана-иммуномодулятора с противоопухолевыми, бактериостатическими и антиагрегантными свойствами

Info

Publication number: RU2321589C2
Application number: RU2005126337/04A
Authority: RU
Inventors: Константин Александрович Аникиенко (RU); Константин Александрович Аникиенко; Дмитрий Игоревич Панков (RU); Дмитрий Игоревич Панков; Алевтина Сергеевна Полезина (RU); Алевтина Сергеевна Полезина; Ирина Леонидовна Михалева (RU); Ирина Леонидовна Михалева; Михаил Валентинович Киселевский (RU); Михаил Валентинович Киселевский; Наталь Юрьевна Анисимова (RU); Наталья Юрьевна Анисимова; Федор Витальевич Доненко (RU); Федор Витальевич Доненко; нский В чеслав Станиславович Добр (RU); Вячеслав Станиславович Добрянский; ков Виктор Станиславович Пол (RU); Виктор Станиславович Поляков; Владимир Алексеевич Мельников (RU); Владимир Алексеевич Мельников
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2008-04-10
Also published as: RU2005126337A

Abstract

В настоящем изобретении описывается способ получения бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана, представленного следующей формулой:

заключающийся в том, что хлорид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана вводят в реакцию ионного обмена с бромистоводородной кислотой или ее неорганической солью (например, бромидом натрия или бромидом калия) в воде. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана является иммунотропным средством, которое оказывает многостороннее влияние на иммунный статус человека, проявляя при этом противоопухолевое, бактериостатическое и антиагрегантное действия. Целью настоящего изобретения является способ получения нового синтетического низкомолекулярного препарата, обладающего выраженным стимулирующим действием на систему противоопухолевого иммунитета, не уступающего, а по возможности превосходящего по эффективности современные отечественные и зарубежные препараты - иммуномодуляторы, которые являются природными высокомолекулярными биологически активными веществами и которые получают с помощью методов генной инженерии. 8 ил., 6 табл.

Description

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (далее вещество I) относится к кватернатам оптически активных бициклических аминоспиртов и может быть использован в медицине в качестве химио- и радиопротектора в сочетании с химио- и лучевой терапией для улучшения качества жизни больных и уменьшения интервалов между курсами специфического лечения рака, при хирургическом лечении химиорезистентных форм рака (рак легкого, пищевода, желудка и т.д.) в качестве стимулятора противоопухолевого иммунитета у больных в послеоперационном периоде; для профилактики онкологических заболеваний у лиц с высоким фактором риска (генетическая предрасположенность к раку, профессиональные факторы и т.д.) на фоне мониторинга противоопухолевых составляющих иммунитета; при лечении иммунодефицитов и хронических инфекций различной природы; в качестве антикоагулянта у больных с повышенной свертываемостью крови для профилактики тромбообразования; в лабораторной практике: в качестве активатора натуральных киллеров и индуктора цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухолей, интерферонов и т.д.).

В качестве аналогов вещества I могут рассматриваться иммуномодуляторы цитокиновой природы с противоопухолевой активностью. К таким соединениям относятся препараты интерлейкина-2 (Ронколейкин, Россия, и Пролейкин, Голландия) и интерферона (Реоферон, Россия, Интрон-А, США). Эти препараты при воздействии в терапевтических дозах могут вызывать побочные реакции в виде лихорадки, снижения уровня артериального давления, почечной и дыхательной недостаточности (Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. / Под ред. В.Т.ДеВита, С.Хеллмана, С.А.Розенберга. - М.: Медицина, 2002. - Д.Дж.Шварцентрубер. Биологические методы лечения интерлейкином-2: клиническое применение, с.247-262; К.А.Фун. Биологические методы лечения интерфероном-α и -β: клиническое применение с.382-390; X.Р.Кесада. Биологические методы лечения интерфероном-γ, с.452-460). Побочные эффекты этих рекомбинантных пептидов требуют проведения длительных (до 18 ч ) инфузий или подкожных введений, при которых происходит потеря до 30% активности действующего начала (Справочник для иммунотерапии для практического врача. / Под ред. А.С.Симбирцева. - С. - Пб.: Диалог, 2002. - В.К.Козлов. Ронколейкин: биологическая активность, иммунокорригирующая эффективность и клиническое применение). Кроме того, эти препараты при длительном применении вызывают образование антител, что снижает их эффективность (G. Sarna et al. A comparative study of intravenous versus intralymphatic interleukin-2, with assessment of effects of interleukin-2 on both peripheral blood and thoracic-duct lymph. JT. Immunother, 1994. - №15 - P.140-146). Рекомбинантные цитокины требуют особых условий хранения и транспортирования и не могут храниться в водных растворах. Известны также иммуномодуляторы небелковой природы (ликопид, полиоксидоний, иммунофан, неовир), которые используются для коррекции иммунного статуса у онкологических больных, однако их противоопухолевое действие не установлено (Добрица В.И, Ботерашвили Н.М., Добрица Е.В. Современные иммуномодуляторы для клинического применения. Руководство для врачей. - С. - Пб.: Политехника, 2001-251 с.; Справочник для иммунотерапии для практического врача. / Под ред. А.С.Симбирцева. - С. - Пб.: Диалог, 2002. - А.А.Старченко. Общая характеристика иммунотропных препаратов, с.100-151).

Вещество I в отличие от рекомбинантных цитокиновых противоопухолевых препаратов характеризуется низкой токсичностью и в дозах, в тысячи раз превышающих терапевтические, не оказывает токсического действия на системы жизнеобеспечения у лабораторных животных. Вещество I не вызывает гипертермических реакций у животных, не оказывает аллергезирующего действия и не обладает кумулятивным эффектом. Препарат высоко стабилен в водных растворах, не требует особых условий транспортирования и хранения, сохраняет свою биологическую активность в растворах не менее 3 лет. Вещество I наряду с иммуномодулирующим действием обладает противоопухолевой и бактериостатической активностью. Вещество I хотя и является синтетическим соединением с низкой молекулярной массой, наиболее близким по спектру биологической активности для него является рекомбинантный пептид ИЛ-2, который может рассматриваться в качестве его прототипа.

Препарат представляет собой индивидуальное органическое вещество - бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикпо[2.2.2]октана, см. формулу

Способ получения. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) получают по реакции обмена аниона между хлоридом 1-гексадецил R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (II) и бромистоводородной кислотой (III)

Схема 1

или ее неорганической солью (IV) в воде при комнатной температуре по схемам 1 и 2.

Схема 2

По окончании реакции продукт I отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.

Необходимый для получения продукта I по схемам 1 и 2 хлорид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (II) получают кватернизацией R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (V) хлористым цетилом (IV) по схеме 3

Схема 3

при нагревании в органическом растворителе (например, в изопропаноле или этаноле). По окончании реакции продукт II отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) имеет R-абсолютную конфигурацию хирального центра, и поэтому исходным веществом для его получения является R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ол (V).

Исходное вещество - R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ол (V) выделяют при расщеплении RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) через диастереомерные соли с хиральной кислотой (например, с R(-)- или S(+)-энантиомерами миндальной кислоты) в органическом растворителе (например, в ацетоне или метилэтилкетоне). При использовании для расщепления RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) в качестве хирального расщепляющего реагента кислого характера R(-)-миндальной кислоты (VIII) по схеме 4 происходит преимущественная кристаллизация R(-)·R(-) - диастереомерной соли (IX), которую отфильтровывают и очищают от второй S(+)·R(-)-диастереомерной соли (X) кристаллизацией.

Схема 4

Разложение диастереомерных солей производится в следующем порядке (схема 5). В начале из водного раствора диастереомерной соли действием разбавленной соляной кислоты регенерируют хиральный реагент (VIII), извлекая его эфиром. Затем из водного кислого раствора действием твердого едкого кали выделяют R(-)-энантиомер 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (V), который отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.

Схема 5

Используемые для получения бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) RS(±)-3-азабицикло[2.2.2]октан-3-ол, хлористый гексадецил, R(-)- и S(+)-миндальные кислоты, бромистоводородная кислота и ее неорганические соли являются доступными реагентами органического синтеза.

Следует отметить, что так как хлористый гексадецил более доступен, чем бромистый гексадецил, предлагаемый способ получения бромида 1-гексадецил- R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) более экономически выгоден, R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) более экономически выгоден, чем способ получения вещества I прямым алкилированием R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола бромистым гексадецилом.

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) представляет собой мелкокристаллическое химически и оптически стабильное вещество с температурой плавления T_пл=228-230°С и удельным вращением

(с 1.5, 50% С₂Н₅ОН),

(с 1.5, С₅Н₅-СН₃ОН, 1:1). Вещество растворимо в воде, метаноле, этаноле, хлороформе, пиридине, диметилсульфоксиде.

Пример 1. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана.

К раствору 7,8 г (0,02 моля) хлорида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана в 50 мл воды добавляют раствор 2,6 г (0,025 моля) бромида натрия в 25 мл воды. Происходит быстрое выпадение белого осадка, который отфильтровывают, промывают водой, сушат и перекристаллизовывают из воды, а затем из изопропанола. Получают 7,8 г (90,2%) бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана в виде мелкокристаллического вещества с Т_пл 229,1°С,

(с 1.5, 50% С₂Н₅ОН),

(с 1.5, 96% C₂H₅OH),

(с 1.5, С₂Н₅N-СН₃ОН, 1:1).

Найдено, %: С 64,05; H 11,18; N 3.06; Br 18.72. C₂₃H₄₆BrNO.

Вычислено, %: С 63,87; Н 30,72; N 3.24; Br 18,47.

Пример 2. Бромид 1-гексадецид-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2] октана.

К раствору 7,8 г (0,02 моля) хлорида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана в 50 мл воды добавляют раствор 18,9 мл 10%-ной бромистоводородной кислоты (0,025 моля). Происходит быстрое выпадение белого осадка, который отфильтровывают, промывают водой, сушат и перекристаллизовывают из воды, а затем из изопропанола. Получают 7,7 г (88,6%) бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана в виде мелкокристаллического вещества с Т_пл 229,3°С,

(с 1.5, 96% С₂Н₅ОН),

(с 1.5, С₂Н₅N-СН₃ОН, 1:1).

Найдено, %: С 64,01; H 11,04; N 3.10; Br 18.68. C₂₃H₄₆BrNO.

Вычислено, %: С 63,87; Н 10,72; N 3.24; Br 18.47.

Пример 3. Хлорид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2] октана.

Раствор 12,7 г (0,1 моля) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 33,2 мл (28,7 г, 0,11 моля) хлористого цетила в 50 мл изопропанола нагревают в колбе с обратным холодильником в течение 24 ч. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат. Перекристаллизовывают из изопропанола. Получают 34,3 г (88,4%) хлорида 1-гексацедил-R(-)-3-окси-1-азабицикло[2.2.2]октана в виде белого порошка с Т_пл 94,5°С и

(с 2, H₂O),

(с 2, С₅Н₅N-СН₃ОН, 1:1).

Найдено, %: С 70,98, Н 12,16; N 3,45; Cl 9,22; 9,30.

С₂₃Н₄₆ Cl NO.

Вычислено, %: С 71,19; Н 11,95; N 3,61; Cl 9,14.

Пример 4. R(-)- и S(+)-энантиомеры 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (расщепление RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола R(-)- и S(+)-миндальными кислотами).

К раствору 30,4 г (0,2 моля) R(-)- миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 25,4 г (0,2 моля) RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Перемешивание продолжают до полного растворения 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×30 мл) и сушат. Получают 27,8 г кристаллов с Т_пл 111,8-112,3°С и

(с 3, Н₂О), которые растирают в порошок и перекристаллизовывают из 1200 мл ацетона. Через 12 ч отфильтровывают 21,4 г (-)·(-) - соли с

(с 3, H₂O). Вторую кристаллизацию проводят из 1000 мл ацетона. Через 12 ч выделяют 19,0 г (68,0%) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл =120,8°С,

(с 3, Н₂О). Последующая кристаллизация не приводит к изменению Т_пл и [α]_D соли.

Найдено, %: С 65,11; Н 7,52; N 4,89. С₇Н₁₃NO·С₇Н₈O₃.

Вычислено, %: С 64,54; Н 7,58; N 5,05.

К 50, 4 мл 6%-ной соляной кислоты (0,085 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,0 г (0,068 моля) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. После полного растворения соли R(-)-миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл).

Эфирные экстракты промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан - ацетон (5:1). Получают 9,8 г R(-)-миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл=133,2°С,

(с 3, Н₂О).

К водному слою, оставшемуся после отделения R(-)-миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 24,7 г (0,44 моля) твердого едкого кали. Всплывший осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола. Получают 7,9 г (91,3%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл=222,3°С,

(с 2, 1 н. СН₃СО₂Н).

Первый ацетоновый маточный раствор, полученный после отделения 27,8 г (-)·(-)- соли, упаривают на водяной бане, и из остатка действием 6%-ной соляной кислоты выделяют 14,4 г R(-)-миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл=133,4°С (из смеси гептан - ацетон (5:1)),

(с 3, H₂O), a затем действием едкого кали 11,6 г 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+)-энантиомером, Т_пл=222,5°С (из толуола),

(с 2, 1 н. СН₃СО₂Н, о.ч. 85,7%).

К раствору 13,9 г (0,091 моля) S(+)-миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 11,6 г (0,091 моля 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+)-энантиомером с

(с 2,1 н. СН₃СО₂Н). Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×20 мл) и сушат. Получают 21,9 г (+)·(+)- соли с

(с 3, Н₂О). Последующая кристаллизация приводит к 19,4 г (82,0%) S(+)-манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл=121,0°С,

(с 3, Н₂О).

К 51,5 мл 6%-ной соляной кислоты (0,087 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,4 г (0,069 моля) S(+)-манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, S(+)-миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл). Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан - ацетон (5:1). Получают 10,0 г S(+)-миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл=131,1°С,

(c 3, H₂O).

К водному слою, оставшемуся после отделения S(+)-миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 25,2 г (0,45 моля) твердого едкого кали. Всплывшее вещество отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола. Получают 8,1 г (91,7%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл=222,4°С,

(с 2,1 н. СН₃СО₂Н).

Таким образом, при расщеплении 25,4 г RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола получают 7,9 г (62,2%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 8,1 г (63,8%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола.

Цель патентуемой разработки: способ получения нового синтетического низкомолекулярного препарата, обладающего выраженным стимулирующим действием на систему противоопухолевого иммунитета, не уступающего, а по возможности превосходящего по эффективности современные отечественные и зарубежные препараты - иммуномодуляторы, которые являются природными высокомолекулярными биологически-активными веществами, полученными с помощью методов генной инженерии.

Была проведена оценка токсической и биологической активности вещества I.

Опенка испытаний вещества I на острую токсичность.

Результаты проведенных испытаний показали отсутствие половых различий в чувствительности животных к токсическому действию вещества I. Категории доз острой токсичности препарата для мышей и крыс представлены в таблице 1.

Таблица 1
Категория доз	Мыши		Крысы
Категория доз	подкожно	перорально	подкожно	перорально
ЛД₁₆, мг/кг	330,0	202,0	230,0	470,0
ЛД₅₀, мг/кг	488,9 (360,1÷663,6)	416,2 (283,6÷610,8)	420,2 (264,1÷668,4)	753,5 (505,9÷1122,0)
ЛД₈₄, мг/кг	690,0	860,0	760,0	1200

В соответствии с табуляцией классов токсичности (Саноцкий И. В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия), М., 1970, стр.16) вещество I относится к классу «малотоксичных» веществ.

Влияние вещества I на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров

На фиг. 1.1., 1.2, 1.3 и 1.4 показано стимулирующее действие вещества I на продукцию цитокинов интерлейкина-1β (ИЛ-1β), интерферона-α (ИФН-α), интерлейкина-2 (ИЛ-2), фактора некроза опухоли (ФНО-α) мононуклеарными клетками здоровых доноров, выделенных из периферической крови согласно методике [Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. / Под ред. В.В.Меньшикова: Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии». - М.: Медицина, 1987. - с.307].

Количественное определение цитокинов в супернатанте мононуклеарных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10^-4-10^-8 М), по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И. Клиническая лабораторная диагностика, №2, 2000. - с.20-23], проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента [«Иммунология» под ред. У.Пола в 3-х т. - М.: Мир, 1989, т.3, гл.28, с.260, Ed.W.Paul «Fundamental Immunology» - Raven Press, N.Y., 1984].

Соотношение клеток-мишеней и клеток-эффекторов 1:10; контроль - с добавлением физиологического раствора хлорида натрия (0,9% NaCl). Результаты, представленные на фиг.1.1, 1.2, 1.3, 1.4, свидетельствуют о стимулирующем влиянии вещества I на продукцию мононуклеарными клетками цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИФН-α и ФНО-α, обладающих иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами. Этот эффект выражен наиболее ярко при действующей концентрации вещества I в супернатанте в диапазоне 10^-4-10^-7 М.

Влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

На фиг.2 показано стимулирующее влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров, выделенных согласно методике [«Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике.» под ред. В.В.Меньшикова, Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии» - М.: Медицина, 1987, с.307].

Количественное определение цитотоксической активности естественных киллерных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10^-4-10^-8 М) (контроль - с 0,9% NaCl), проводили с использованием МТТ-колориметрического теста по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И. Клиническая лабораторная диагностика, №2, 2000, с.20-23].

Наиболее оптимальные соотношения «опухолевая клетка / естественная киллерная клетка» - 1:10 и 1:5, при которых цитотоксическая активность МНК совместно инкубированных с тестируемым препаратом достигает наибольшего значения.

Максимальный, стабильно воспроизводимый эффект повышения противоопухолевой активности естественных киллеров отмечается при воздействии на МНК вещества I в диапазоне концентраций 10^-4-10^-6М.

Вещество I не оказывает прямого цитотоксического воздействия на изолированные мононуклеарные клетки крови и опухолевые клетки.

Изучение противоопухолевой активности вещества I

Исследование противоопухолевого эффекта проводили на мышах линии СВА и гибридах F1 весом 20-25 г. Животные содержались согласно «Правилам доклинических испытаний фармакологических препаратов» (PD 64-126-91).

Клетки опухоли Эрлиха вводили внутрибрюшинно (ip), а меланомы В 16 - подкожно (sc) в дозе 2 млн./мышь. Опытные и контрольные группы состояли из 6-10 животных. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Действие тестируемых образцов сравнивали с эффектом препарата Пролейкин, Голландия (ИЛ-2). Наблюдение осуществлялось в течение 1 мес. после трансплантации опухоли. Оценку состояния животных производили визуально. Динамику роста опухолевой массы оценивали по весу животных.

Изучение противоопухолевой активности вещества I в отношении опухоли Эрлиха проводили на мышах линии СВА в дозе 0,05 мг/кг, а Пролейкин в дозе 10 000 МЕ/мышь. Тестируемые вещества вводили за 3-е сут. до и на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 17, 18 и 20 сут. после трансплантации опухоли. В контрольной группе на 15-е сут. осталась жива одна особь из 6. В группе мышей, получавших вещество I в указанной дозе, погибло 3 из 7 мышей. Среди животных, получавших Пролейкин, к 20 сут. погибло 2 из 6 особей.

Таблица 2
Количество выживших мышей с привитой опухолью Эрлиха
Время, сут.	14	15	16	19	20	22	25	26	Выжило
Контроль	6/0	6/1	5/2	3/2	1/0	1/0	1/0	1/0	1
Пролейкин	6/1	5/0	5/0	5/1	4/0	4/0	4/0	4/0	4
Вещество I	7/2	5/1	4/0	4/0	4/0	4/0	4/0	4/0	4

Динамика роста опухоли у животных, леченных препаратом Пролейкин и веществом I, была достоверно меньше по сравнению с контрольной группой.

Вещество I оказывало тормозящее влияние на динамику роста опухоли меланомы В-16 у мышей гибридов F1 и увеличивал продолжительность их жизни. В частности, в дозе 0,005 мг/кг отмечено торможение опухолевого роста на 80%. Гибель животных в контрольной группе наступала на 19 сут., в то время как мыши, получавшие вещество I в указанной дозе, оставались живы до 25 сут. (см. фиг.3.1 и 3.2).

Таким образом, вещество I в дозах 0,05-0,005 мг/кг оказывает сходное цитостатическое действие по сравнению с препаратом Пролейкин при испытании на мышах с привитыми опухолями и вызывает стимуляцию противоопухолевого иммунитета.

Противоопухолевую активность также изучали на мышах-самцах линии СВА, которым подкожно перевивали аденокарциному яичников СаО-1. Опухоль была получена на потомстве мышей-самок линии СВА, которым во время беременности вводили эстрогены. Опухоль по гистологическому строению, клиническому течению и даже антигенному строению близка к раку яичника человека (БЭБиМ. - 2000 г., N 129, стр.456-459). Опухолевые клетки перевивали в количестве 1 млн. клеток / мышь.

Лечение осуществляли по схеме.

Мышам (30 штук) через 24 часа после перевивки опухолевых клеток начинали вводить разведенное в физиологическом растворе вещество I подкожно в 0.2 мл в нечетные дни (1-й, 3-й, 5-й и т.д.). Всего 7 введений. В контрольной группе животным вводили в этом же режиме физиологический раствор (растворитель препарата) (20 штук). Препарат вводили в трех дозах: 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг.

Оценку действия препарата на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста опухоли. Расчет объема опухоли осуществляли по формуле

V=ав²(усл.ед).

Объем опухоли измеряли на 10, 12 и 15 дни после перевивки. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3
Общие характеристики животных и влияния вещества I на рост аденокарциномы яичников СаО-1
Название группы	Число животных	(Исходный) Средний вес¹	Первое измерение опухоли (усл.ед)²	Третье измерение опухоли (усл.ед)²
Контроль с физ. раствор.	20	(28,7+1,3) 28,9 и 31.2	3110±237	8342±770
группа 0,005 мг/кг	10	(27,6±1.1) 29.7 и 30.2	1998±244	5663±708
группа 0,05 мг/кг	10	(28,4±0,6) 29.5 и 30.7	1789±250	4882±673
группа 0,5 мг/кг	10	(28,3±0,8) 29.6 и 30.8	1545±183	5039±523
1 - в скобках указан исходный средний вес животных в группе, а вне скобок на 10 и 15 дни после трансплантации в граммазх. 2 - измерения объема опухали проводили на 10 и 15 дни после трансплантации.

Вещество I замедляет рост аденокарциномы яичников СаО-1. Торможение роста опухоли на 10-й день измерения составило 42%, 45%, 52%, на 12-й день 43%, 49%, 45%, а на 15-й день 32%, 42%, 40% для режимов 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг соответственно. Данный эффект является пограничным эффектом для цитостатиков. Токсического действия препарата не обнаружено.

Приведенные выше примеры свидетельствуют о выраженной противоопухолевой активности вещества I.

Изучение влияния вещества I на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкопитов крови здоровых доноров.

Данное исследование проводилось в 2 этапа: изучение влияния препарата на бактерицидную активность нейтрофилов и воздействие вещества I на способность нейтрофилов к захвату частиц латекса.

Для выделения нейтрофилов из венозной крови здорового донора получали лейкоконцентрат по методике [Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией профессора А.И.Карпищенко. - Санкт -Петербург: Интермедика, 2002. - 408 с.]. Его разводили физиологическим раствором (рН=7,2) до концентрации 5×10⁴ лейкоцитарных клеток в 1 мкл. Полученную суспензию по 180 мкл разливали в лунки 24-луночной плашки Falcon, получая, таким образом, 4 параллельных ряда по 6 лунок. Затем в лунки добавляли вещество I в различной концентрации действующего вещества (10^-3-10^-7 М) по 20 мкл, в последние в ряду лунки вносили 0,9% раствора хлорида натрия в качестве контроля.

Для изучения бактерицидной активности клеток вносили во все лунки по 10 мкл взвеси суточной агаровой дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae (2×10¹¹ кл/мл). Описанные манипуляции проводились с соблюдением условий стерильности.

Планшет с клетками термостатировали в течение 6 часов при 37°С. Далее удаляли пипеткой супернатант из лунок, из осадка готовили тонкие мазки, которые фиксировали в смеси Никифорова (5-10 мин) и окрашивали по Романовскому - Гимзе [В.С.Ронин, Г.М.Старобинец, Н.Л.Утевский / Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований. - М.: Медицина, 1977, 335 с.].

Учет результатов проводили следующим образом: при микроскопировании окрашенных мазков учитывают 100 нейтрофилов, в которых подсчитывают количество клеток с признаками фагоцитоза.

Поглотительную способность фагоцитов оценивают с помощью фагоцитарного показателя. Фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов. Результаты исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4
Влияние на бактерицидную активность нейтрофилов крови человека вещества i
Действующая концентрация вещества I	Номер опыта
	1		2
	Среднее значение	Доверительный интервал	Среднее значение	Доверительный интервал
10^-4	64,8	5,8	70,2	2,4
10^-5	54,5	5,5	51,0	1,4
10^-6	45,0	5,5	41,8	0,5
10^-7	38,0	5,0	41,5	1,0
10^-8	32,0	3,3	39,3	1,9
Контроль	33,0	5,5	41,0	2,4

Из данных таблицы 4 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I достоверно повышает способность нейтрофилов к поглощению микроорганизмов по сравнению с контролем.

Кроме того, было проведено исследование влияния изучаемого препарата на способность нейтрофилов к захвату опсонизированных частиц латекса. Для этого в лунки с фагоцитами, активированными изучаемым препаратом, вносили по 10 мкл взвеси опсонизированных частиц латекса в физиологическом растворе (концентрация частиц составляла 5000 в 1 мл). Фагоциты инкубировали с латексом в течение 8 ч. Результаты проведенного теста представлены в таблице 5.

Таблица 5
Влияние вещества I на способность нейтрофилов фагоцитировать частицы латекса
Действующая концентрация вещества I	Фагоцитарный показатель, %								Р
	Номер опытной пробы							Среднее значение
	1	2	3	4	5	6	7	Среднее значение
10^-4	92	60	90	60	100	100	80	83	0,0006
10^-5	45	45	50	50	60	65	43	51	0,0356
10^-6	80	40	30	30	20	30	35	38	0,2362
10^-7	60	40	10	20	20	40	41	33	0,3535
10^-8	30	30	0	0	20	25	48	22	0,3262
10^-9	30	40	0	0	15	20	32	20	0,2705
Контроль	50	80	0	0	10	40	18	28

Из данных статистической обработки результатов таблиц 4 и 5 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I в действующих концентрациях 10^-4-10^-5 М достоверно повышает фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивая ФП по сравнению с контролем.

Бактериостатическая активность вещества I

В проведенной серии экспериментов была исследована чувствительность к веществу I штаммов микроорганизмов, выделенных из патологического материала от больных (экссудат, транссудат, кровь, моча, содержимое толстого кишечника, раневое отделяемое, слизь из зева) в послеоперационный период, и с предметов, окружающих больного в этот период - из воздуха, с предметов ухода за больными, с перевязочного материала, смывы с рук (санитарная группа микроорганизмов).

Видовой состав используемых штаммов бактериальных культур определялся исходя из того, что до недавнего времени основной причиной возникновения инфекций у больных являлись грамотрицательные бактерии, в частности псевдомонады, кишечная палочка, а в настоящее время все возрастающую отрицательную роль играют грамположительные бактерии (мецитиллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка, энтерококки и др.). Эти бактериальные штаммы характеризуются антибиотикорезистентностью к широкому спектру химиопрепаратов.

Бактериостатическое воздействие вещества I на рост штаммов микроорганизмов определяли согласно луночно-диффузной методике [В.S.Reisner, Gl. Woods, R.В.Thomson - Specium Processing in Manual of Clinical Microbiology - Washington, 1999, 64-104; Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. - Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. - 1999]

Таблица 6
Бактериостатическая активность вещества I по отношению к микроорганизмам - возбудителям внутрибольничных инфекций (ВБИ) и микроорганизмам санитарной группы
Степень разведения препарата, М	Группа ВБИ					Санитарная группа
Степень разведения препарата, М	Ent. Faecalis	St. Aureus	Ent. Epidcrmidis	Е. coli	Cl. aeruginosae	Е.coli	Ent. Faecalis	St. Epidermidis	Micr. Geminis
10^-3	++	++	-	-					-
10^-4	+	-	++	++
10^-5	+	-	+	-	-	++	+	+
10^-6	++	-	-	+	-	+	+	+	-
10^-7	++	-	-	+	-	+	+	-	++
10^-8	+	-	+	+	-	+	+	-	-
10^-9	+	-	+	-	-	+	+	+	++
10^-10	+	-	+	-	-	+	+	++	-
10^-11	+	-	-	++	-	+	+	++	++
10^-12	+	-	-	+	-	++	+	++	+
10^-13	-	-	-	+	-	+	+	-	-
++ штамм, чувствительный к действию тестируемого препарата + штамм, умеренно чувствительный к действию тестируемого препарата - штамм, устойчивый к действию тестируемого препарата

Вещество I характеризуется высокой бактериостатической активностью и широким спектром действия по отношению к большинству исследованных штаммов микроорганизмов.

Антитромбоцитагрегирующее действие вещества I

Вещество I оказывает активное антитромбоцитагрегирующее действие. Оно снижает агрегацию, вызываемую адреналином, АДФ и практически на 100% тормозит агрегацию, индуцируемую фактором агрегации тромбоцитов (ФАТ) и тромбином (см. фиг.4). Индекс антитромбоцитагрегирующей активности вещества I по тромбину и ФАТ равен 1×10^-11 М, что относит препарат к разряду активных антагонистов ФАТ.

Таким образом, к преимуществам вещества I можно отнести высокую иммуномодулирующую и противоопухолевую активность, бактерицидное и антиагрегантное действие, низкую токсичность, высокую стабильность в водных растворах, простую технологию получения.

Claims

Способ получения бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана,

заключающийся в том, что хлорид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана вводят в реакцию ионного обмена с бромистоводородной кислотой или ее неорганической солью (например, бромидом натрия или бромидом калия) в воде, образующийся продукт фильтруют и очищают перекристаллизацией.