RU2311915C2

RU2311915C2 - Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina and pigment epithelium and eye vascular envelope

Info

Publication number: RU2311915C2
Application number: RU2005116189/15A
Authority: RU
Inventors: Игорь Александрович Ямсков (RU); Игорь Александрович Ямсков; Виктори Петровна Ямскова (RU); Виктория Петровна Ямскова; Анатолий Васильевич Наговицын (RU); Анатолий Васильевич Наговицын; Михаил Сергеевич Краснов (RU); Михаил Сергеевич Краснов
Original assignee: Игорь Александрович Ямсков; Виктория Петровна Ямскова; Анатолий Васильевич Наговицын; Михаил Сергеевич Краснов
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2007-12-10
Also published as: RU2005116189A

Abstract

FIELD: medicine, ophthalmology.

SUBSTANCE: method involves isolation of macular region of retina pigment epithelium from freshly enucleated eye of vertebrate animals, its washing out in physiological solution, holding pigment epithelium tissue in aqueous-saline solution at 4-7⁰C for 2-4 h followed by centrifugation. Supernatant liquid is collected, its components are separated by isoelectrofocusing method in sucrose gradient density at pH 3.5-10.0. Fractions of basic proteins are collected and sucrose and ampholines are removed by dialysis. Prepared protein solution is dried and purified by electrophoresis on 7.5-15% polyacrylamide gel. Then low-molecular fraction with value Rf = 0.4-0.9 is eluted with deionized water in dialysis sacs with penetration limit of pores 2-8 kDa, and prepared regulatory peptide is dried and dissolved in physiological aqueous-saline solution. Invention provides enhancing percent yield of regulatory peptides possessing the biological activity in superlow doses, and isolation of highly purified polypeptides of low molecular mass.

EFFECT: improved preparing method of medicinal agent.

6 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии.The invention relates to medicine, and more particularly to ophthalmology.

Известно изобретение по патенту РФ №2232586 - офтальмологическое лекарственное средство и способ лечения заболеваний, патологических состояний и повреждений сетчатой оболочки глаза МКИ 7 А61К 35/44, 38/17, А61F 9/00, A61P 27/02, приоритет от 23.04.2003.The invention is known according to the patent of the Russian Federation No. 2232586 - an ophthalmic drug and method for treating diseases, pathological conditions and damage to the retina of the eye MKI 7 A61K 35/44, 38/17, A61F 9/00, A61P 27/02, priority from 04/23/2003.

Изобретение заключается в следующем: офтальмологическое лекарственное средство, включающее препарат сетчатки и фармацевтически приемлемый носитель, заключающееся в том, что оно содержит в качестве препарата сетчатки гликопротеин, выделенный из сетчатки глаза млекопитающих, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку ниже 3,0 и кажущуюся молекулярную массу от 8 до 200 кДа и, возможно, хлористый кальций.The invention consists in the following: an ophthalmic drug comprising a retinal preparation and a pharmaceutically acceptable carrier, which consists in the fact that it contains a retinal glycoprotein isolated from the retina of a mammalian eye, soluble in a saturated solution of ammonium sulfate having an isoelectric point below 3.0 and an apparent molecular weight of from 8 to 200 kDa and possibly calcium chloride.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, основная часть регуляторных пептидов выпадает в осадок в связи с растворением экстрактов ткани в насыщенном растворе сульфата аммония, большая молекулярная масса белков.However, this invention has significant drawbacks: they do not use tissue from the macular region of the neural retina, the majority of regulatory peptides precipitate due to the dissolution of tissue extracts in a saturated solution of ammonium sulfate, and a large molecular weight of proteins.

Известно изобретение по патенту РФ №2073518 - средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза МКИ 6 А61К 35/44, А61F 9/00, приоритет от 17.06.93.The invention is known according to the patent of the Russian Federation No. 2073518 - a means of restoring the function of the retina of the eye MKI 6 A61K 35/44, A61F 9/00, priority from 06/17/93.

Изобретение заключается в следующем: средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученных из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработки надосадочной жидкости ацетоном.The invention consists in the following: the agent that restores the function of the retina of the eye is a complex of low molecular weight polypeptides obtained from the retina of animals by extraction with a 3% solution of acetic acid with the addition of zinc chloride and treatment of the supernatant with acetone.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, высокая концентрация полипептидов в препарате, используется комплекс низкомолекулярных полипептидов, нет высокой степени очистки препарата.However, this invention has significant disadvantages: they do not use tissue of the macular region of the neural retina, a high concentration of polypeptides in the preparation, a complex of low molecular weight polypeptides is used, and there is no high degree of purification of the preparation.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют области пигментного эпителия сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повысить процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.The technical problem solved by the invention is that they use the areas of retinal pigment epithelium containing the largest number of biochemically and physiologically active proteins and polypeptides, which allows to increase the yield of regulatory peptides with biological activity in ultra-low doses, to isolate highly purified polypeptides with low molecular weight mass.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, также сосудистой оболочки глаза из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют макулярные области ткани пигментного эпителия сетчатки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань пигментного эпителия в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после этого собирают фракции основных белков рН 8,5-9,5, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,4-0,9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют деионизованной водой в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа в течение 7-10 дней при 4-7°С, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Полученный при этом раствор разбавляют до концентрации 10^-10-10^-12 мг/мл и разливают во флаконы путем холодной стерилизации с использованием мембранных фильтров.The specified technical problem is solved by the fact that in the method for producing a medicament for treating diseases of the retina and pigment epithelium of the eye, as well as the choroid from freshly enucleated eyes of vertebrate animals, the macular regions of the tissue of the retinal pigment epithelium are isolated, washed in aqueous saline, and the pigment tissue is maintained epithelium in a water-salt solution at 4-7 ° C for 2-4 hours, centrifuged tissue extract, collect the supernatant, separate it by the method and zoelectrofocusing in the sucrose density gradient at pH 3.5-10.0, temperature 4-6 ° C and voltage 500-2000 V for 72-96 hours, after which fractions of basic proteins pH 8.5-9.5 are collected, combined they are dialyzed to complete removal of sucrose and ampholines in dialysis bags with a pore transmission limit of 2-8 kDa at 4-7 ° C for 10-14 days. The resulting aqueous protein solution is dried by freeze drying to obtain a dry substance, which is purified by electrophoresis in a 7.5-15% polyacrylamide gel, a low molecular weight fraction Rf = 0.4-0.9 containing a regulatory peptide is collected by elution deionized water from the gel for 2-5 days at 4-7 ° C, the resulting fraction is dialyzed with deionized water in dialysis bags with a pore transmission limit of 2-8 kDa for 7-10 days at 4-7 ° C, a dialyzed solution of the regulatory peptide then re-freeze-dried to irradiation of a white flocculent fine powder, which is then dissolved in physiological saline. The resulting solution is diluted to a concentration of 10 ^-10 -10 ^-12 mg / ml and poured into vials by cold sterilization using membrane filters.

Способ характеризуется следующими примерами.The method is characterized by the following examples.

Пример 1.Example 1

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 730 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2500g 10 мин при Т=20°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН 9,5), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов диализных мешках с пределом пропускания пор 2 кДа в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания не ниже 2 кДа в течение 10 дней при T=+4⁰C, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 20°С, полученный раствор с концентрацией 10^-10 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.Tissue of the macular region of retinal pigment epithelium is isolated from freshly cattle eyes of cattle at a temperature of 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, washed with saline (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mm HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl ₂ , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), withstand the tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium in aqueous saline (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 7 ° C and a pressure of 730 mm Hg .art. for 4 hours, the tissue extract is centrifuged at 2500g for 10 min at T = 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 6 ° C and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of the main proteins are collected (pH 9.5), combined, dialyzed until the sucrose and ampholines are completely removed from the dialysis bags with a pore transmission limit of 2 kDa for 14 days at T = + 4 ° C, pressure 730 mm Hg, then the resulting aqueous solution of protein lyophil o dried by freeze drying to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flaky fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 7.5% polyacrylamide gel at T = 25 ° C and a pressure of 730 mm Hg ., a low molecular weight fraction (Rf = 0.9) containing the regulatory peptide is collected by eluting with deionized water from the gel for 5 days at T = + 4 ° C, a pressure of 730 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed against deionized water in dialysis bags with skipped limit I below 2 kDa for 10 days at T = + 4 ⁰ C, a pressure of 730 mmHg, otdializovanny protein solution then re-freeze-dried to obtain a white flaky fine powder for the manufacture of a medicament of a preparation regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide by dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl per 1 liter of deionized water), concentration p the regulatory peptide in the initial solution is determined using the colorimetric method using bicinchoninic acid, solutions of the regulatory peptide in concentrations corresponding to 10 ^-1 -10 ^-9 mg / ml are prepared by sequential dilution in physiological solution 10 times the initial solution, with constant shaking after each dilution, at a temperature of 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, then 10 ml of a solution of the regulatory peptide was added to a 100-ml volumetric flask at a concentration corresponding to 10 ^-9 mg / ml, and then added physiological saline (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, per 1 liter of deionized pyrogen-free water) is added to a volume of 100 ml and stirred at at a temperature of 20 ° C, the resulting solution with a concentration of 10 ^-10 mg / ml is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 2 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%. Highly purified preparations are obtained after purification by electrophoresis and checked by reverse phase high performance liquid chromatography in a water / acetonitrile gradient on a C8 column: upon detection with a wavelength of 280 nm, a homogeneous preparation elutes from the column with a retention time of 3-4 minutes.

Пример 2.Example 2

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 25°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 15 мин при Т=25°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН 8,5), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания 8 кДа в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,6), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 8 кДа в течение 7 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре +25°С и давлении 760 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре +25°С, полученный раствор в концентрации 10^-9 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.Tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium was isolated from freshly enucleated eyes of rats at a temperature of 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, washed with saline water (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl ₂ , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), maintain the tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium in saline water (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 4 ° C and a pressure of 760 mm Hg. for 3 hours, the tissue extract is centrifuged at 3000g for 15 minutes at T = 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 4 ° C and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of basic proteins (pH 8.5) are collected, combined, dialyzed until the sucrose and ampholines are completely removed in dialysis bags with a transmission limit of 8 kDa for 10 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, then the resulting aqueous protein solution is lyophilic dried by freeze drying to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flocculent fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 15% polyacrylamide gel at T = + 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, the low molecular weight fraction (Rf = 0.6) containing the regulatory peptide is collected by eluting with deionized water from the gel for 4 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, the obtained fraction is dialyzed against deionized water in dialysis bags with a limit of transmission 8 kDa for 7 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder for the preparation of a drug, from the preparation of the regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepared the initial solution of the peptide, dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological water-salt solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl per 1 l deionized water), regulatory of the peptide in the initial solution is determined using the colorimetric method using bicinchoninic acid, solutions of the regulatory peptide in concentrations corresponding to 10 ^-1 -10 ^-9 mg / ml are prepared by sequential dilution in physiological solution 10 times of the initial solution, with constant shaking after each dilution, at a temperature of + 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, then 10 ml of a solution of the regulatory peptide was added to a 100-ml volumetric flask at a concentration corresponding to 10 ^-8 mg / ml, and then physio logical solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 5 mm KCl, 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, per 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at a temperature + 25 ° C, the resulting solution at a concentration of 10 ^-9 mg / ml is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.

Пример 3.Example 3

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре +23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 10 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +5°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции основных белков (рН 10,0), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 5 кДа в течение 12 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 12,5%-ном полиакриламидном геле при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,8), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 8 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 23°С и давлении 745 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 23°С, полученный раствор в концентрации 10^-10 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1,5 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.From the freshly enucleated eyes of 7-, 14-, 19-day-old chicken embryos of the tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium are isolated at a temperature of + 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg, they are washed in saline aqueous saline (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water), withstand the tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium in saline aqueous solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 5 ° C and a pressure of 745 mm Hg for 2 hours, the tissue extract is centrifuged at 3000g for 10 min at T = 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 5 ° C and a voltage of 500-2000 V for 72 hours, fractions of the main proteins are collected (pH 10.0), combined, dialyzed until the sucrose and ampholines are completely removed in dialysis bags with a pore transmission limit of 5 kDa for 12 days at T = + 5 ° C, pressure 745 mm Hg, then the resulting aqueous solution of lyophi protein It is dried on a freeze dryer to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flocculent fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 12.5% polyacrylamide gel at T = 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg ., a low molecular weight fraction (Rf = 0.8) containing the regulatory peptide is collected by eluting with deionized water from the gel for 4 days at T = + 5 ° C, a pressure of 745 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed against deionized water in dialysis bags with a pass limit 2 kDa for 8 days at T = + 5 ° C, a pressure of 745 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder for the preparation of a drug from a regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide by dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological aqueous salt solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl per 1 l of deionized water), concentration of regulation iterated peptide in the original solution was determined by a colorimetric method using bicinchoninic acid regulatory peptide solutions in concentrations corresponding to 10 ^-1 -10 ^-9 mg / ml, prepared by successive dilution in saline 10-fold stock solution with constant shaking after each dilution, at a temperature of 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg, then 10 ml of a solution of the regulatory peptide was added to a 100-ml volumetric flask at a concentration corresponding to 10 ^-9 mg / ml, and then isiological solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, 1 l deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at a temperature 23 ° C, the resulting solution at a concentration of 10 ^-10 mg / ml is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1.5 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.

Пример 4.Example 4

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., промывают их в солевом водном физиологическом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области пигментного эпителия сетчатки в солевом водном растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+6°С и давлении 740 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2000g 15 мин при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции основных белков (рН=9,0), объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа в течение 14 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,4), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 3 кДа в течение 7 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., затем в 100-мл мерную колбу вносили 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 24°С, полученный раствор в концентрации 10^-9 мг/мл разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.Tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium is isolated from the freshly enucleated eyes of frogs Xenopus laevis at a temperature of 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, washed with saline aqueous physiological solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl ₂ , 5 mM KCl, 1 mm HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl ₂ , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), withstand the tissue of the macular region of the retinal pigment epithelium in saline water (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl _2, 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0,111 g of CaCl _2, 0.4 g KCl, 0.238 g of HEPES in 1 liter of distilled water) at T = + 6 ° C and a pressure of 740 mm Hg . for 4 hours, the tissue extract is centrifuged at 2000g for 15 min at T = 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 4 ° C and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of the main proteins are collected (pH = 9.0), combined, dialyzed until the sucrose and ampholines are completely removed in dialysis bags with a pore transmission limit of 8 kDa for 14 days at T = + 6 ° C, pressure 740 mm Hg, then the resulting aqueous solution of lyophil protein It is dried on a freeze dryer to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flocculent fine powder, is further fractionated by electrophoresis under native conditions in a 7.5% polyacrylamide gel at T = 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg ., a low molecular weight fraction (Rf = 0.4) containing the regulatory peptide is collected by eluting with deionized water from the gel for 4 days at T = + 4 ° C, pressure 740 mm Hg, the obtained fraction is dialyzed against deionized water in dialysis bags with a pass limit 3 kDa for 7 days at T = + 6 ° C, pressure 740 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder for the preparation of a drug from a regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide by dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological aqueous salt solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl per 1 l of deionized water), regular concentration ornogo peptide in the original solution was determined by a colorimetric method using bicinchoninic acid regulatory peptide solutions in concentrations corresponding to 10 ^-1 -10 ^-9 mg / ml, prepared by successive dilution in saline 10-fold stock solution with constant shaking after each dilution, at a temperature of 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, then 10 ml of a solution of the regulatory peptide was added to a 100-ml volumetric flask at a concentration corresponding to 10 ^-8 mg / ml, and then fi a physiological solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl ₂ , 5 mm KCl, 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl ₂ , 0.4 g KCl, per 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at a temperature 24 ° C, the resulting solution at a concentration of 10 ^-9 mg / ml is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.

Пример 5.Example 5

В качестве экспериментальной модели, отражающей дегенеративные процессы в сетчатке и в сосудистой оболочке, используют культуру заднего отдела глаза крыс. Исследование проводят на крысах линии Wistar, обоего пола, весом 200 г.As an experimental model reflecting degenerative processes in the retina and in the choroid, a rat posterior eye culture is used. The study was conducted on rats of the Wistar strain, of both sexes, weighing 200 g.

Крыс забивают с помощью эфирного наркоза, из энуклеированных глаз под микроскопическим контролем удаляют микрохирургическим путем переднюю камеру глаза (роговица, хрусталик, жидкость передней камеры глаза и ростовую зону сетчатки с радужкой). Изолированные задние отделы глаз культивируют в питательной среде 199 без добавления сыворотки крови в присутствии препарата регуляторного пептида, выделенного из ретинального пигментного эпителия глаза позвоночных в конечной концентрации, соответствующей 10^-10 мг белка/мл. Препарат регуляторного пептида добавляют в питательную среду 199 в соотношении 1:10 (по объему) 1 раз в начале культивирования заднего отдела глаза крыс in vitro.Rats are sacrificed using ether anesthesia, and the anterior chamber of the eye (cornea, lens, anterior chamber fluid and the retinal growth zone with the iris) is removed by microsurgery from enucleated eyes under microscopic control. The isolated posterior parts of the eyes were cultured in a nutrient medium 199 without the addition of blood serum in the presence of a regulatory peptide preparation isolated from a retinal pigment epithelium of the vertebral eye in a final concentration corresponding to ^10-10 mg of protein / ml. The regulatory peptide preparation is added to the nutrient medium 199 in a ratio of 1:10 (by volume) 1 time at the beginning of in vitro cultivation of the posterior part of the rat eye.

Культуры инкубируют в стерильных условиях в течение 45-50 часов при температуре 37°С. В качестве контроля изучают задние отделы глаза, культивированные в питательной среде 199, в которую не добавляют препарат. Влияние исследуемого препарата регуляторного пептида, выделенного из ретинального пигментного эпителия, оценивают по морфологическому состоянию тканей заднего отдела глаза крысы. Для каждого культивированного образца проводят сравнительный морфологический анализ состояния четырех тканей, составляющих задний отдел глаза: склеральный отдел, сосудистая оболочка, пигментный эпителий сетчатки, нейральная сетчатка (ганглиозный слой, наружный и внутренний сетчатые слои, наружный и внутренний ядерные слои, слой отростков фоторецепторов).The cultures are incubated under sterile conditions for 45-50 hours at a temperature of 37 ° C. As a control, the posterior parts of the eye, cultured in 199 nutrient medium, into which the drug is not added, are studied. The influence of the studied preparation of the regulatory peptide isolated from the retinal pigment epithelium is evaluated by the morphological state of the tissues of the posterior part of the rat eye. For each cultured sample, a comparative morphological analysis of the state of the four tissues that make up the posterior part of the eye is performed: the scleral part, choroid, retinal pigment epithelium, neural retina (ganglion layer, outer and inner retinal layers, outer and inner nuclear layers, photoreceptor process layer).

При длительном культивировании заднего отдела глаза взрослых особей позвоночных животных in vitro во всех тканях наблюдают развитие деструктивных явлений, в частности в нейральной сетчатке и пигментном эпителии сетчатки, которые характерны для ряда ретинопатий, а также для пигментного ретинита у человека. В настоящем исследовании на вторые сутки в контрольных культурах наблюдают картину развития дегенеративных процессов во всех тканях заднего отдела глаза. Следует отметить, что среди первых в изучаемых тканях идентифицируют нарушения адгезивных межклеточных взаимодействий, топографически тесное взаимодействие между тканями нарушается. В контроле наблюдают картину, предшествующую началу разрушения тканей глаза и адгезивных связей между ними. Внутри склеры обнаруживают полости, а в сосудистой оболочке наблюдают разрывы и отслоение от склеральной оболочки.With prolonged cultivation of the posterior part of the eye of adult vertebrates in vitro in all tissues, the development of destructive phenomena is observed, in particular in the neural retina and retinal pigment epithelium, which are characteristic of a number of retinopathies, as well as pigment retinitis in humans. In the present study, on the second day in control cultures, a picture of the development of degenerative processes in all tissues of the posterior part of the eye is observed. It should be noted that among the first in the studied tissues, violations of adhesive intercellular interactions are identified, topographically close interaction between the tissues is violated. In the control, a picture is observed preceding the onset of destruction of the eye tissues and adhesive bonds between them. Inside the sclera, cavities are detected, and tears and exfoliation from the scleral membrane are observed in the choroid.

Во всех слоях сетчатки отмечают нарушения межклеточных контактных взаимодействий. Слой отростков фоторецепторов имеет рыхлую структуру, обнаруживают значительное количество сломанных отростков в интерфоторецепторном матриксе. Ширина интерфоторецепторного матрикса варьирует в участках среза и местами очень велика. Происходит также частичное разрушение пигментного эпителия за счет нарушения межклеточных контактов в пределах монослоя. Таким образом, картина состояния тканей заднего отдела глаза крыс в значительной степени отражает состояние, которое характеризуется как начальный этап развития деструкции тканей глаза. Такую картину состояния тканей заднего отдела глаза наблюдают при различных заболеваниях сетчатки у человека, например при дистрофии и пигментном ретините.In all layers of the retina, intercellular contact interactions are noted. The layer of photoreceptor processes has a loose structure; a significant number of broken processes are detected in the interfotoreceptor matrix. The width of the interfotoreceptor matrix varies in the sections of the slice and is very large in places. Partial destruction of the pigment epithelium also occurs due to disruption of intercellular contacts within the monolayer. Thus, the picture of the state of the tissues of the posterior part of the rat eye largely reflects the state, which is characterized as the initial stage of development of the destruction of eye tissue. This picture of the condition of the tissues of the posterior part of the eye is observed with various diseases of the retina in humans, for example, with dystrophy and retinitis pigmentosa.

Добавление в среду культивирования препарата регуляторного пептида, выделенного из пигментного эпителия глаза, способствует сохранению пространственной организации тканей заднего отдела глаза, сохраняются межтканевые взаимодействия: сосудистая оболочка - мембрана Бруха - пигментный эпителий - сетчатка. Наблюдают максимальную сохранность пигментного эпителия сетчатки по сравнению с контролем. Кроме того, отмечают достоверное уменьшение толщины сосудистой оболочки по сравнению с контролем, что, в свою очередь, свидетельствует о сосудосуживающем действии исследуемого регуляторного пептида. Оценку относительной толщины различных слоев сетчатки и сосудистой оболочки после культивирования проводят на полутонких срезах.The addition of a regulatory peptide isolated from the pigment epithelium of the eye to the culture medium helps to preserve the spatial organization of the tissues of the posterior part of the eye, interstitial interactions remain: the choroid - Bruch's membrane - pigment epithelium - retina. The maximum retention of retinal pigment epithelium is observed in comparison with the control. In addition, there is a significant decrease in the thickness of the choroid compared with the control, which, in turn, indicates a vasoconstrictor effect of the studied regulatory peptide. Assessment of the relative thickness of the various layers of the retina and choroid after cultivation is carried out on semi-thin sections.

Наблюдают плотное взаимодействие между отростками фоторецепторов и микровиллями клеток пигментного эпителия, что свидетельствует о сохранении в интерфоторецепторном пространстве адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия, играющей принципиальную роль в осуществлении зрительной функции. Отростки большего числа фоторецепторов сохраняют целостность. Эпителиальный слой пигментных клеток не претерпевает разрушений, а упаковка клеток в нем остается более плотной, чем в контроле. Помимо этого гранулы меланина в слое пигментного эпителия располагаются более компактно на базальной стороне клеток, а также в микровиллях по сравнению с контролем, где наблюдают смещение пигментных гранул на апикальную сторону клеток, которые, в свою очередь, теряют или втягивают микровилли, о чем можно свидетельствовать по отсутствию пигмента в соответствующей области. Эти данные указывают на то, что изучаемый регуляторный пептид, выделенный из пигментного эпителия глаза, способствует стабилизации дифференцировки клеток пигментного эпителия. Следует отметить, что добавление препарата изучаемого регуляторного пептида в культуральную среду способствует увеличению жизнеспособности клеток Мюллеровской глии, а также увеличению жизнеспособности биполяров во внутреннем ядерном слое сетчатки примерно на 10% (р<0,05). Как известно, биполярные клетки играют ведущую роль в проведении зрительного сигнала от фоторецепторов к ганглиозным клеткам, кроме того, биполяры и клетки Мюллера являются потенциальным клеточным резервом при восстановительных и репаративных процессах в сетчатке, возникающих при дегенерациях различного рода. В связи с этим полученные данные приобретают дополнительную значимость в плане использования регуляторного пептида, выделенного из пигментного эпителия глаза, при нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.A close interaction is observed between the processes of photoreceptors and the microvilli of the pigment epithelial cells, which indicates the preservation of adhesion of retinal cells and pigment epithelium in the interfotoreceptor space, which plays a fundamental role in the implementation of visual function. The processes of a greater number of photoreceptors maintain integrity. The epithelial layer of pigment cells does not undergo destruction, and the packing of cells in it remains denser than in the control. In addition, the melanin granules in the pigment epithelium layer are more compact on the basal side of the cells, as well as in the microvilli as compared to the control, where the pigment granules are shifted to the apical side of the cells, which, in turn, lose or retract the microvilli, as evidenced by by the absence of pigment in the corresponding area. These data indicate that the studied regulatory peptide isolated from the pigment epithelium of the eye helps to stabilize the differentiation of pigment epithelial cells. It should be noted that the addition of the preparation of the studied regulatory peptide to the culture medium increases the viability of Mueller glia cells, as well as increases the viability of bipolar cells in the inner nuclear layer of the retina by about 10% (p <0.05). As you know, bipolar cells play a leading role in conducting the visual signal from photoreceptors to ganglion cells, in addition, bipolar cells and Mueller cells are a potential cellular reserve in the recovery and reparative processes in the retina arising from various kinds of degeneration. In this regard, the data obtained acquire additional significance in terms of the use of a regulatory peptide isolated from the pigment epithelium of the eye in neurodegenerative diseases of the retina.

Таким образом, можно отметить протекторное действие изучаемого регуляторного пептида на состояние тканей заднего отдела глаза крысы при длительном культивировании и особенно на внутренний ядерный слой сетчатки, и на зону интерфоторецепторного пространства, а также на состояние сосудистой оболочки глаза.Thus, we can note the protective effect of the studied regulatory peptide on the state of the tissues of the posterior part of the rat eye during prolonged cultivation, and especially on the inner nuclear layer of the retina, and on the zone of interfotoreceptor space, as well as on the state of the choroid.

Пример 6.Example 6

Пациент К. 12 лет. Диагноз: Тапеторетинальная абиотрофия, 3 стадии. Острота зрения до лечения Vis ОУ 0.3 н/к, поля зрения сужены на 10 град. от точки фиксации.Patient K., 12 years old. Diagnosis: tapetoretinal abiotrophy, 3 stages. Visual acuity before treatment Vis OU 0.3 n / a, visual fields are narrowed by 10 degrees. from the fixation point.

На фоне курса консервативного лечения в течение 20 дней прошла курс лечения лекарственным средством, приготовленным, как описано в примере 1, инсциллировала в ОД по 1 капле 3 раза в день лекарственное средство для лечения заболеваний сетчатки и пигментного эпителия глаза, а также сосудистой оболочки глаза.Against the background of a course of conservative treatment, for 20 days she underwent a course of treatment with a drug prepared as described in Example 1, injected into the drug OD 1 drop 3 times a day, a drug for the treatment of diseases of the retina and pigment epithelium of the eye, as well as the choroid.

При выписке после лечения: Vis ОД 0.4 н/к, поля зрения сужены на 30 град. от точки фиксации; ОС 0.3 н/к, поля зрения сужены на 15 град. от точки фиксации. Отмечена стабильная положительная динамика состояния сетчатки ОД.At discharge after treatment: Vis OD 0.4 n / a, visual fields are narrowed by 30 degrees. from the fixation point; OS 0.3 n / a, visual fields are narrowed by 15 degrees. from the fixation point. Stable positive dynamics of the state of the retina OD was noted.

Предложенный способ позволяет использовать области пигментного эпителия сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой. Полученное, таким образом, лекарственное средство способствует стабильной положительной динамике состояния сетчатки и расширению полей зрения.The proposed method allows the use of areas of retinal pigment epithelium containing the largest number of biochemically and physiologically active proteins and polypeptides, to increase the yield of regulatory peptides with biological activity in ultra-low doses, and to isolate highly purified polypeptides with low molecular weight. Thus obtained drug promotes stable positive dynamics of the state of the retina and the expansion of the field of view.

Claims

A method of obtaining a medicinal product for the treatment of diseases of the retina and pigment epithelium of the eye, as well as the choroid of the eye, characterized in that the macular region of the retinal pigment epithelium is isolated from freshly enucleated eyes of vertebrates, washed in saline water-saline, and the pigment epithelium tissue is kept in water -salt solution at 4-7 ° C for 2-4 hours, tissue extract is centrifuged, the supernatant is collected, it is separated by isoelectric focusing in deg ente density of sucrose at pH 3.5-10.0, temperature 4-6 ° C and voltage 500-2000 V for 72-96 hours, fractions of the main proteins are collected at pH 8.5-9.5, and sucrose is removed from them and ampholines by dialysis in dialysis bags with a transmission limit of 2-8 kDa for 10-14 days at 4-7 ° C, the resulting protein solution is dried and purified by electrophoresis in a 7.5-15% polyacrylamide gel, followed by by elution of a low molecular weight fraction with Rf = 0.4-0.9 with deionized water from gel in dialysis bags, with a pore transmission limit of 2-8 kDa for 7-10 days at 4-7 ° С, drying the resulting regulatory peptide and dissolving it in physiological saline.