RU2311914C2 - Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases - Google Patents
Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2311914C2 RU2311914C2 RU2005116186/15A RU2005116186A RU2311914C2 RU 2311914 C2 RU2311914 C2 RU 2311914C2 RU 2005116186/15 A RU2005116186/15 A RU 2005116186/15A RU 2005116186 A RU2005116186 A RU 2005116186A RU 2311914 C2 RU2311914 C2 RU 2311914C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dialysis
- solution
- retina
- collected
- deionized water
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии.The invention relates to medicine, and more particularly to ophthalmology.
Известно изобретение по патенту РФ №2232586 Офтальмологическое лекарственное средство и способ лечения заболеваний, патологических состояний и повреждений сетчатой оболочки глаза, МКИ 7 А61К 35/44, 38/17, А61F 9/00, A61P 27/02, приоритет от 23.04.2003 г.The invention is known according to the patent of the Russian Federation No. 2232586 Ophthalmic drug and method for the treatment of diseases, pathological conditions and damage to the retina, MKI 7 A61K 35/44, 38/17, A61F 9/00, A61P 27/02, priority from 04/23/2003 .
Изобретение заключается в следующем: офтальмологическое лекарственное средство, включающее препарат сетчатки и фармацевтически приемлемый носитель, заключающееся в том, что оно содержит в качестве препарата сетчатки гликопротеин, выделенный из сетчатки глаза млекопитающих, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку ниже 3,0 и кажущуюся молекулярную массу от 8 до 200 кДа и, возможно, хлористый кальций.The invention consists in the following: an ophthalmic drug comprising a retinal preparation and a pharmaceutically acceptable carrier, which consists in the fact that it contains a retinal glycoprotein isolated from the retina of a mammalian eye, soluble in a saturated solution of ammonium sulfate having an isoelectric point below 3.0 and an apparent molecular weight of from 8 to 200 kDa and possibly calcium chloride.
Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, основная часть регуляторных пептидов выпадает в осадок, в связи с растворением экстрактов ткани в насыщенном растворе сульфата аммония, большая молекулярная масса белков.However, this invention has significant drawbacks: they do not use tissue from the macular region of the neural retina, the majority of regulatory peptides precipitate due to the dissolution of tissue extracts in a saturated solution of ammonium sulfate, and a large molecular weight of proteins.
Известно изобретение по патенту РФ №2073518 Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, МКИ 6 А61К 35/44, А61F 9/00, приоритет от 17.06.93 г.The invention is known according to the patent of the Russian Federation No. 2073518 A tool that restores the function of the retina of the eye, MKI 6 A61K 35/44, A61F 9/00, priority from 06/17/93.
Изобретение заключается в следующем: средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученных из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработки надосадочной жидкости ацетоном.The invention consists in the following: the agent that restores the function of the retina of the eye is a complex of low molecular weight polypeptides obtained from the retina of animals by extraction with a 3% solution of acetic acid with the addition of zinc chloride and treatment of the supernatant with acetone.
Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, высокая концентрация полипептидов в препарате, используется комплекс низкомолекулярных полипептидов, нет высокой степени очистки препарата.However, this invention has significant disadvantages: they do not use tissue of the macular region of the neural retina, a high concentration of polypeptides in the preparation, a complex of low molecular weight polypeptides is used, and there is no high degree of purification of the preparation.
Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют области нейральной сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повысить процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.The technical problem solved by the invention is that they use the areas of the neural retina containing the largest number of biochemically and physiologically active proteins and polypeptides, which allows to increase the percentage of regulatory peptides with biological activity in ultra-low doses, to isolate highly purified polypeptides with low molecular weight .
Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки глаза из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют макулярные области нейральной сетчатки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань сетчатки в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после этого собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,7-0,9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют деионизованной водой в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Наиболее активными концентрациями пептида являются 10-10-10-12 мг/мл.The specified technical problem is solved by the fact that in the method for producing a medicament for treating retinal diseases, macular regions of the neural retina are isolated from freshly enucleated eyes of vertebrate animals, washed in physiological saline-aqueous solution, and retinal tissue is maintained in aqueous-saline solution at 4-7 ° C for 2-4 hours, the tissue extract is centrifuged, the supernatant is collected, it is separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient at pH 3.5-10.0, temperature 4-6 ° С voltage of 500-2000 V for 72-96 hours, after which fractions of acidic proteins are collected, combined, dialyzed to completely remove sucrose and ampholines in dialysis bags with a pore transmission limit of 2-8 kDa at 4-7 ° C for 10- 14 days. The resulting aqueous protein solution is dried by freeze drying until a dry substance is obtained, which is purified by electrophoresis in a 7.5-15% polyacrylamide gel, a low molecular weight fraction Rf = 0.7-0.9 containing a regulatory peptide is collected by elution deionized water from the gel for 2-5 days at 4-7 ° C, the obtained fraction is dialyzed with deionized water in dialysis bags with a pore transmission limit of 2-8 kDa at 4-7 ° C for 7-10 days, a dialyzed solution of the regulatory peptide then re-dried to obtain logo flocculent fine powder, which is then dissolved in physiological saline. The most active peptide concentrations are 10 -10 -10 -12 mg / ml.
Способ характеризуется следующими примерами.The method is characterized by the following examples.
Пример 1.Example 1
Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 730 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2500g 10 мин при Т=20°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1,0-3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,7), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа в течение 10 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10-1-10-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 20°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.Tissue of the macular region of the neural retina is isolated from freshly cattle eyes of cattle at a temperature of 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, washed with aqueous saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 5 mm KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl 2 , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), maintain the tissue of the macular region of the neural retina in a water-salt solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 7 ° C and a pressure of 730 mm Hg .art. for 4 hours, the tissue extract is centrifuged at 2500g for 10 min at T = 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 6 ° C and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of acidic proteins are collected (pH range = 1.0-3.0), combined, dialyzed in dialysis bags with a pore transmission limit of 2 kDa until completely removed sucrose and ampholines for 14 days at T = + 4 ° C, a pressure of 730 mm Hg, then the resulting aqueous solution is white ka freeze-dried on freeze-drying to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flaky fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 7.5% polyacrylamide gel at T = 25 ° C and a pressure of 730 mm RT. Art., collect a low molecular weight fraction (Rf = 0.7) containing the regulatory peptide by eluting with deionized water from the gel for 5 days at T = + 4 ° C, a pressure of 730 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed in dialysis bags with a pore transmission limit of 8 kDa After 10 days at T = + 4 ° C, a pressure of 730 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder, to prepare the drug from the preparation of the regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl per 1 liter of deionized water ), the concentration of regulatory peptides and in the original solution was determined by a colorimetric method using bicinchoninic acid regulatory peptide solutions in concentrations corresponding to 10 -1 -10 -9 mg / ml, prepared by successive dilution in saline 10-fold stock solution with constant shaking after each dilution, at a temperature of 20 ° C and a pressure of 730 mm Hg, then 10 ml of a solution of a regulatory peptide in a concentration corresponding to 10 -9 mg / ml are added to a 100-ml volumetric flask, and then physiologists add solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 5 mm KCl, 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, per 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at at a temperature of 20 ° C, the resulting solution is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 2 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%. Highly purified preparations are obtained after purification by electrophoresis and checked by reverse phase high performance liquid chromatography in a water / acetonitrile gradient on a C8 column: upon detection with a wavelength of 280 nm, a homogeneous preparation elutes from the column with a retention time of 3-4 minutes.
Пример 2.Example 2
Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре 25°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 15 мин при Т=25°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1,0-3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при T=+7°C, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 7 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10-1-10-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре +25°С и давлении 760 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре +25°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.Tissue of the macular region of the neural retina is isolated from freshly enucleated eyes of rats at a temperature of 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, washed with aqueous saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 5 mm KCl, 1 mm HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl 2 , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), maintain the tissue of the macular region of the neural retina in a water-salt solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2, 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0,111 g of CaCl 2, 0.4 g KCl, 0.238 g of HEPES in 1 liter of distilled water) at T = + 4 ° C and a pressure of 760 mm Hg . for 3 hours, the tissue extract is centrifuged at 3000g for 15 minutes at T = 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 4 ° С and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of acidic proteins are collected (pH range = 1.0-3.0), combined, dialyzed in dialysis bags with a pore transmission limit of 8 kDa until completely removed sucrose and ampholines for 10 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, then the resulting aqueous solution is white ka freeze-dried on freeze-drying to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flaky fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in 15% polyacrylamide gel at T = + 25 ° C and a pressure of 760 mm Hg ., collect a low molecular weight fraction (Rf = 0.9) containing the regulatory peptide by eluting with deionized water from the gel for 4 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed in dialysis bags with 2 kDa transmission limit for 7 days at T = + 7 ° C, pressure 760 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder, to prepare the drug from the preparation of the regulatory peptide obtained after electrophoresis, the initial solution of the peptide is prepared by dissolving dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl per 1 liter of deionized water) the concentration of the regulatory peptide in and Khodnev solution was determined by a colorimetric method using bicinchoninic acid regulatory peptide solutions in concentrations corresponding to 10 -1 -10 -9 mg / ml, prepared by successive dilution in saline 10-fold stock solution with constant shaking after each dilution, at + 25 ° C and a pressure of 760 mmHg, and then 100 mL volumetric flask was introduced 10 ml solution of regulatory peptide concentration corresponding to 10 -8 mg / mL, and more was added physiologically th solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM KCl, - 8.75 g NaCl, 0.111 g of CaCl 2, 0.4 g of KCl, in 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at temperature + 25 ° C, the resulting solution is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.
Пример 3.Example 3
Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре +23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 10 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +5°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1,0-3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 5 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 12 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 12,5%-ном полиакриламидном геле при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,8), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 8 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г КС (на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10-1-10-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 23°С и давлении 745 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 23°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1,5 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.7-, 14-, 19-day-old chicken embryos of the tissue of the macular region of the neural retina are isolated from freshly enucleated eyes at a temperature of + 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg, washed in aqueous saline solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water), withstand the tissue of the macular region of the neural retina in water-salt solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 5 mm KCl, 1 mm HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 5 ° C and a pressure of 745 mm Hg for 2 hours, the tissue extract is centrifuged at 3000g for 10 min at T = 23 ° C and a pressure of 745 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 5 ° C and a voltage of 500-2000 V for 72 hours, fractions of acidic proteins are collected (pH range = 1.0-3.0), combined, dialyzed in dialysis bags with a pore transmission limit of 5 kDa until completely removed sucrose and ampholines for 12 days at T = + 5 ° C, pressure 745 mm Hg, then the resulting aqueous solution is white ka freeze-dried in a freeze dryer to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flaky fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 12.5% polyacrylamide gel at T = 23 ° C and a pressure of 745 mm RT. Art., collect a low molecular weight fraction (Rf = 0.8) containing the regulatory peptide by eluting with deionized water from the gel for 2 days at T = + 5 ° C, pressure 745 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed in dialysis bags with a transmission limit of 2 kDa during 8 days at T = + 5 ° C, pressure 745 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flocculent fine powder, to prepare the drug from the preparation of the regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide, dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological saline water (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KS (per 1 liter of deionized water ), the concentration of the regulatory peptide original solution was determined by a colorimetric method using bicinchoninic acid regulatory peptide solutions in concentrations corresponding to 10 -1 -10 -9 mg / ml, prepared by successive dilution in saline 10-fold stock solution with constant shaking after each dilution, at 23 ° C and a pressure of 745 mmHg, and then 100 mL volumetric flask was introduced 10 ml solution of regulatory peptide concentration corresponding to 10 -9 mg / mL, and further added physiologic cue solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM KCl, - 8.75 g NaCl, 0.111 g of CaCl 2, 0.4 g of KCl, in 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at at a temperature of 23 ° C, the resulting solution is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1.5 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.
Пример 4.Example 4
Выделяют из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+6°С и давлении 740 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2000g 15 мин при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1,0-3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=24°С и давлении 740 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,75), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 3 кДа в течение 7 дней при Т=+6°С, давлении 740 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10-1-10-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 24°С и давлении 740 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl2, 0,4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 24°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.Tissue of the macular region of the neural retina is isolated from the freshly enucleated eyes of frogs Xenopus laevis at a temperature of 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, washed with saline (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g of NaCl, 0.111 g of CaCl 2 , 0.4 g of KCl, 0.238 g of HEPES per 1 liter of distilled water), maintain the tissue of the macular region of the neural retina in a water-salt solution (0.15 M NaCl, 1 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM HEPES - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, 0.238 g HEPES per 1 liter of distilled water) at T = + 6 ° C and a pressure of 740 mm Hg .art. for 4 hours, the tissue extract is centrifuged at 2000g for 15 min at T = 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, the supernatant is collected and separated by isoelectric focusing in a sucrose density gradient in the range of pH 3.5-10.0 at a temperature of + 4 ° С and a voltage of 500-2000 V for 96 hours, fractions of acidic proteins are collected (pH range = 1.0-3.0), combined, dialyzed in dialysis bags with a pore transmission limit of 8 kDa until completely removed sucrose and ampholines for 14 days at T = + 6 ° C, pressure 740 mm Hg, then the resulting aqueous solution is white ka freeze-dried on freeze-drying to obtain a dry substance, the lyophilisate, which is a white flaky fine powder, is then fractionated using electrophoresis under native conditions in a 7.5% polyacrylamide gel at T = 24 ° C and a pressure of 740 mm RT. Art., collect a low molecular weight fraction (Rf = 0.75) containing the regulatory peptide by eluting with deionized water from the gel for 4 days at T = + 6 ° C, pressure 740 mm Hg, the resulting fraction is dialyzed in dialysis bags with a transmission limit of 3 kDa during 7 days at T = + 6 ° C, pressure 740 mm Hg, the dialyzed protein solution is then re-dried freeze-dried to obtain a white flaky fine powder, to prepare the drug, from the preparation of the regulatory peptide obtained after electrophoresis, prepare the initial solution of the peptide dissolving the dry lyophilized powder of the regulatory peptide in physiological saline (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 1 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl per 1 liter of deionized water ), the concentration of the regulatory peptide in the initial solution is determined using the colorimetric method using bicinchoninic acid, solutions of the regulatory peptide in concentrations corresponding to 10 -1 -10 -9 mg / ml are prepared by sequential dilution in physiological solution 10 times of the initial solution, with constant shaking after each dilution, at a temperature of 24 ° C and a pressure of 740 mm Hg, then 10 ml of the regulatory peptide solution is added to a 100-ml volumetric flask at a concentration corresponding to 10 mg / ml and then physiologically added th solution (0.15 M NaCl, 1 mm CaCl 2 , 5 mm KCl - 8.75 g NaCl, 0.111 g CaCl 2 , 0.4 g KCl, per 1 liter of deionized pyrogen-free water) to a volume of 100 ml and stirred at a temperature 24 ° C, the resulting solution is poured into vials under sterile conditions, using filters for cold sterilization with a pore size of 0.22 μm, under aseptic conditions of a sterile box and laminar air flow. The final yield of the active peptide is 1 mg from 50 eyes of the crude product, after purification by electrophoresis, peptides with a molecular weight of less than 8 kDa are obtained, the activity of the peptides by biotesting is 125-160%.
Пример 5.Example 5
В качестве экспериментальной модели, отражающей дегенеративные процессы в сетчатке, выбирают культуру заднего отдела глаза крыс. Исследование проводят на крысах линии Wistar, обоего пола, весом 200 г.As an experimental model reflecting degenerative processes in the retina, a culture of the posterior part of the rat eye is chosen. The study was conducted on rats of the Wistar strain, of both sexes, weighing 200 g.
Крыс забивают с помощью эфирного наркоза, из энуклеированных глаз под микроскопическим контролем удаляют микрохирургическим путем переднюю камеру глаза (роговица, хрусталик, жидкость передней камеры глаза и ростовую зону сетчатки с радужкой). Изолированные задние отделы глаз культивируют в питательной среде 199 без добавления сыворотки крови в присутствии препарата регуляторного пептида, выделенного из нейральной сетчатки глаза позвоночных в конечной концентрации, соответствующей 10-10 мг белка/мл. Препарат регуляторного пептида добавляют в питательную среду 199 в соотношении 1:10 (по объему) 1 раз в начале культивирования заднего отдела глаза крыс in vitro.Rats are sacrificed using ether anesthesia, and the anterior chamber of the eye (cornea, lens, anterior chamber fluid and the retinal growth zone with the iris) is removed by microsurgery from enucleated eyes under microscopic control. The isolated posterior parts of the eye are cultured in a nutrient medium 199 without the addition of blood serum in the presence of a regulatory peptide preparation isolated from the neural retina of a vertebral eye in a final concentration corresponding to 10-10 mg of protein / ml. The regulatory peptide preparation is added to the nutrient medium 199 in a ratio of 1:10 (by volume) 1 time at the beginning of the cultivation of the posterior part of the rat eye in vitro.
Культуры инкубируют в стерильных условиях в течение 45-50 часов при температуре 37°С. В качестве контроля изучают задние отделы глаза, культивированные в питательной среде 199, в которую не добавляют препарата. Влияние исследуемого препарата регуляторного пептида, выделенного из нейральной сетчатки, оценивают по морфологическому состоянию тканей заднего отдела глаза крысы. Для каждого культивированного образца проводят сравнительный морфологический анализ состояния четырех тканей, составляющих задний отдел глаза: склеральный отдел, сосудистая оболочка, пигментный эпителий сетчатки, нейральная сетчатка (ганглиозный слой, наружный и внутренний сетчатые слои, наружный и внутренний ядерные слои, слой отростков фоторецепторов).The cultures are incubated under sterile conditions for 45-50 hours at a temperature of 37 ° C. As a control, the posterior parts of the eye, cultured in 199 nutrient medium, into which the drug is not added, are studied. The influence of the studied preparation of the regulatory peptide isolated from the neural retina is evaluated by the morphological state of the tissues of the posterior part of the rat eye. For each cultured sample, a comparative morphological analysis of the state of the four tissues that make up the posterior part of the eye is performed: the scleral part, choroid, retinal pigment epithelium, neural retina (ganglion layer, outer and inner retinal layers, outer and inner nuclear layers, photoreceptor process layer).
При длительном культивировании заднего отдела глаза взрослых особей позвоночных животных in vitro во всех тканях наблюдают развитие деструктивных явлений, в частности, в нейральной сетчатке и пигментном эпителии сетчатки, которые характерны для ряда ретинопатий, а также для пигментного ретинита у человека. В настоящем исследовании на вторые сутки в контрольных культурах наблюдают картину развития дегенеративных процессов во всех тканях заднего отдела глаза. Следует отметить, что среди первых в изучаемых тканях были идентифицированы нарушения адгезивных межклеточных взаимодействий, топографически тесное взаимодействие между тканями нарушается. В контроле наблюдают картину, предшествующую началу разрушения тканей глаза и адгезивных связей между ними. Внутри склеры обнаруживают полости, а в сосудистой оболочке наблюдают разрывы и отслойку от склеральной оболочки.With prolonged cultivation of the posterior part of the eye of adult vertebrates in vitro in all tissues, the development of destructive phenomena is observed, in particular, in the neural retina and retinal pigment epithelium, which are characteristic of a number of retinopathies, as well as pigment retinitis in humans. In the present study, on the second day in control cultures, a picture of the development of degenerative processes in all tissues of the posterior part of the eye is observed. It should be noted that among the first in the studied tissues, violations of adhesive intercellular interactions were identified, topographically close interaction between the tissues is violated. In the control, a picture is observed preceding the onset of destruction of the eye tissues and adhesive bonds between them. Inside the sclera, cavities are detected, and tears and detachment from the scleral membrane are observed in the choroid.
Во всех слоях сетчатки отмечают нарушения межклеточных контактных взаимодействий. Слой отростков фоторецепторов имеет рыхлую структуру, обнаруживают значительное количество сломанных отростков в интерфоторецепторном матриксе. Ширина интерфоторецепторного матрикса варьируется в участках среза и местами очень велика. Происходит также частичное разрушение пигментного эпителия за счет нарушения межклеточных контактов в пределах монослоя. Таким образом, картина состояния тканей заднего отдела глаза крыс в значительной степени отражает состояние, которое характеризуется как начальный этап развития деструкции тканей глаза. Такую картину состояния тканей заднего отдела глаза наблюдают при различных заболеваниях сетчатки у человека, например при дистрофии и пигментном ретините.In all layers of the retina, intercellular contact interactions are noted. The layer of photoreceptor processes has a loose structure; a significant number of broken processes are detected in the interfotoreceptor matrix. The width of the interfotoreceptor matrix varies in the sections of the slice and is very large in places. Partial destruction of the pigment epithelium also occurs due to disruption of intercellular contacts within the monolayer. Thus, the picture of the state of the tissues of the posterior part of the rat eye largely reflects the state, which is characterized as the initial stage of development of the destruction of eye tissue. This picture of the condition of the tissues of the posterior part of the eye is observed with various diseases of the retina in humans, for example, with dystrophy and retinitis pigmentosa.
Добавление в среду культивирования препарата регуляторного пептида, выделенного из нейральной сетчатки глаза, способствует сохранению пространственной организации тканей заднего отдела глаза, сохраняются межтканевые взаимодействия: пигментный эпителий - сетчатка. Кроме того, отмечают достоверное увеличение толщины сосудистой оболочки по сравнению с контролем, что в свою очередь свидетельствует о сосудорасширяющем действии исследуемого регуляторного пептида. Оценку относительной толщины различных слоев сетчатки и сосудистой оболочки после культивирования проводят на полутонких срезах.The addition of a regulatory peptide isolated from the neural retina to the culture medium helps to preserve the spatial organization of the tissues of the posterior part of the eye; interstitial interactions are preserved: pigment epithelium - the retina. In addition, there is a significant increase in the thickness of the choroid compared with the control, which in turn indicates the vasodilating effect of the studied regulatory peptide. Assessment of the relative thickness of the various layers of the retina and choroid after cultivation is carried out on semi-thin sections.
Наблюдают плотное взаимодействие между отростками фоторецепторов и микровиллями клеток пигментного эпителия, что свидетельствует о сохранении в интерфоторецепторном пространстве адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия, играющей принципиальную роль в осуществлении зрительной функции. Отростки большего числа фоторецепторов сохраняют целостность. Эпителиальный слой пигментных клеток не претерпевает разрушений, а упаковка клеток в нем остается более плотной, чем в контроле. Добавление препарата изучаемого регуляторного пептида в культуральную среду способствует увеличению жизнеспособности клеток Мюллеровской глии (р<0,05). Как известно, клетки Мюллера являются потенциальным клеточным резервом при восстановительных и репаративных процессах в сетчатке, возникающих при дегенерациях различного рода. В связи с этим полученные данные приобретают дополнительную значимость в плане использования регуляторного пептида, выделенного из нейральной сетчатки глаза, при нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.A close interaction is observed between the processes of photoreceptors and the microvilli of the pigment epithelial cells, which indicates the preservation of adhesion of retinal cells and pigment epithelium in the interfotoreceptor space, which plays a fundamental role in the implementation of visual function. The processes of a greater number of photoreceptors maintain integrity. The epithelial layer of pigment cells does not undergo destruction, and the packing of cells in it remains denser than in the control. The addition of the studied regulatory peptide preparation to the culture medium enhances the viability of Mueller glia cells (p <0.05). As you know, Mueller cells are a potential cellular reserve in the restoration and reparative processes in the retina arising from various kinds of degeneration. In this regard, the data obtained acquire additional significance in terms of the use of a regulatory peptide isolated from the neural retina in neurodegenerative diseases of the retina.
Таким образом, можно отметить протекторное действие изучаемого регуляторного пептида на состояние тканей заднего отдела глаза крысы при длительном культивировании и, особенно, на наружный ядерный слой сетчатки, и на зону интерфоторецепторного пространства, а также на состояние сосудистой оболочки глаза.Thus, we can note the protective effect of the studied regulatory peptide on the state of the tissues of the posterior part of the rat eye during prolonged cultivation and, especially, on the outer nuclear layer of the retina, and on the zone of interfotoreceptor space, as well as on the state of the choroid of the eye.
Пример 6.Example 6
Пациент Г., жен, 69 лет. Диагноз: ОУ Центральная сенильная хориоретинальная атрофия, начальная стадия, миопия слабой степени. Острота зрения до лечения Vis ОД 0.2 с - 1.5 = 0.7; ОС 0.2 с - 1.5 = 0.8. Поля зрения ОУ сужены на 15-20 град. по сравнению с нормой.Patient G., wives, 69 years old. Diagnosis: OU Central senile chorioretinal atrophy, initial stage, mild myopia. Visual acuity before treatment Vis OD 0.2 s - 1.5 = 0.7; OS 0.2 s - 1.5 = 0.8. The fields of view of the op-amp are narrowed by 15-20 degrees. compared to the norm.
На фоне курса консервативной сосудистой терапии в течение 20 дней прошла курс лечения лекарственным средством, приготовленным как описано в примере 1, инсциллировала по 1 капле 3 раза в сутки в ОД лекарственное средство для лечения сетчатки глаза.Against the background of a course of conservative vascular therapy, a course of treatment with a drug prepared as described in Example 1 was carried out for 20 days, 1 drop 3 times a day was injected into the OD drug for the treatment of the retina of the eye.
При выписке после лечения: Vis ОД 0.2 с - 1.5 = 0.9; ОС - без изменений. Поля зрения ОД соответствуют норме, ОС - сужены на 5-10 град. Отмечена стабильная положительная динамика состояния сетчатки ОД.At discharge after treatment: Vis OD 0.2 s - 1.5 = 0.9; OS - no change. The field of view of the OD is normal, the OS is narrowed by 5-10 degrees. Stable positive dynamics of the state of the retina OD was noted.
Пример 7.Example 7
Пациент Л., жен., 58 лет. Диагноз: ОУ Миопия высокой степени, дегенеративная форма.Patient L., female, 58 years old. Diagnosis: OU Myopia high degree, degenerative form.
Острота зрения до лечения Vis ОУ 0.05 с - 12.0 = 0.2. Поля зрения ОУ сужены на 25-35 град. по сравнению с нормой.Visual acuity before treatment Vis OU 0.05 s - 12.0 = 0.2. The fields of view of the op-amp are narrowed by 25-35 degrees. in comparison with the norm.
На фоне курса консервативной сосудистой терапии в течение 20 дней дополнительно закапывала в ОС лекарственное средство, приготовленное как описано в примере 1, по 1 капле 3 раза в сутки.Against the background of the course of conservative vascular therapy, for 20 days, an additional drug, prepared as described in Example 1, was additionally instilled into the OS, 1 drop 3 times a day.
При выписке после лечения: Vis ОД 0.05 с - 12.0 = 0.3; ОС 0.07 с - 12.0 = 0.4. Поля зрения ОД сужены на 10-15 град., ОС - на 5-10 град., в соответствии с нормой. Стабильная положительная динамика состояния сетчатки ОС.At discharge after treatment: Vis OD 0.05 s - 12.0 = 0.3; OS 0.07 s - 12.0 = 0.4. The visual fields of OD are narrowed by 10-15 degrees, OS - by 5-10 degrees, in accordance with the norm. Stable positive dynamics of the state of the retina of the OS.
Предложенный способ позволяет использовать области нейральной сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью и терапевтическим эффектом в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой. Полученное, таким образом, лекарственное средство способствует расширению полей зрения и улучшению динамики зрительной функции.The proposed method allows the use of areas of the neural retina containing the largest amount of biochemically and physiologically active proteins and polypeptides, to increase the percentage of regulatory peptides with biological activity and therapeutic effect in ultra-low doses, and to isolate highly purified polypeptides with low molecular weight. Thus obtained drug helps to expand the fields of vision and improve the dynamics of visual function.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005116186/15A RU2311914C2 (en) | 2005-05-30 | 2005-05-30 | Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005116186/15A RU2311914C2 (en) | 2005-05-30 | 2005-05-30 | Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005116186A RU2005116186A (en) | 2006-12-10 |
| RU2311914C2 true RU2311914C2 (en) | 2007-12-10 |
Family
ID=37665246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005116186/15A RU2311914C2 (en) | 2005-05-30 | 2005-05-30 | Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2311914C2 (en) |
-
2005
- 2005-05-30 RU RU2005116186/15A patent/RU2311914C2/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005116186A (en) | 2006-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7871646B2 (en) | Use of a human amniotic membrane composition for prophylaxis and treatment of diseases and conditions of the eye and skin | |
| HU195523B (en) | Process for producing fractions of hyaluronic acid and pharmaceutical compositions containing them | |
| JPH05508183A (en) | Hyaluronic acid purification method and fractionation of pure hyaluronic acid for ophthalmology | |
| TW201709916A (en) | Compositions and methods for preventing the proliferation and epithelial-mesenchymal transition of epithelial cells | |
| JP5627642B2 (en) | Pharmaceutical composition for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorders | |
| CN109310731A (en) | The peptide in the extracellular matrix source of cartilage cell | |
| WO2017173905A1 (en) | Polyethylene glycol-modified angiogenesis inhibitor hm-1 and application thereof | |
| US20120142591A1 (en) | Method of treating intraoccular tissue pathologies with nerve growth factor | |
| CN106692949A (en) | Medicine for treating eye diseases and composition of medicine | |
| CN103933548A (en) | Application of lunasin polypeptide in medicine for preventing and treating cataract | |
| RU2315606C2 (en) | Method for preparing medicinal agent for treatment of myopia and eye scleral envelope diseases and vitreoretonopathy | |
| RU2311915C2 (en) | Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina and pigment epithelium and eye vascular envelope | |
| RU2311914C2 (en) | Method for preparing medicinal agent for treatment of eye retina diseases | |
| CN103006706B (en) | Amniotic membrane liposome for ocular surface reconstruction and preparation method and application thereof | |
| RU2766083C1 (en) | Biologically active substance in the form of a bioregulatory composition, exhibiting a supportive and restorative effect on tissues and organs, and pharmacological composition | |
| JP2006523461A (en) | Method for isolating and purifying sheep hyaluronidase | |
| US10568931B2 (en) | Pharmaceutical composition comprising ginseng extracts for prevention and treatment of ophthalmological diseases | |
| RU2716819C1 (en) | Protein-peptide complex and drug preparation agent, which is protein-peptide complex | |
| RU2315607C2 (en) | Method for preparing medicinal agent for cataract treatment | |
| RU2467727C2 (en) | Method of treating wet age-related macular degeneration of retina with using cell transplantation | |
| RU2799330C1 (en) | Protein-peptide agent with a tissue structure-restoring effect used as a substance for pharmaceutical and food products | |
| KR101736342B1 (en) | Pharmaceutical composition comprising giseng extracts for prevention and treatment of ophthalmological diseases | |
| RU2232586C1 (en) | Ophthalmological medicinal agent and method for treatment of retina disease, pathological state and injury | |
| US20240156854A1 (en) | Methylcobalamin ophthalmic preparation and use thereof | |
| CN109789115A (en) | Method for treating eye illness |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20070117 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100531 |