RU2287158C1 - Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors - Google Patents

Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors Download PDF

Info

Publication number
RU2287158C1
RU2287158C1 RU2005121376/15A RU2005121376A RU2287158C1 RU 2287158 C1 RU2287158 C1 RU 2287158C1 RU 2005121376/15 A RU2005121376/15 A RU 2005121376/15A RU 2005121376 A RU2005121376 A RU 2005121376A RU 2287158 C1 RU2287158 C1 RU 2287158C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cetp
dna
risk
disease
pon1
Prior art date
Application number
RU2005121376/15A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ольга Евгеньевна Мустафина (RU)
Ольга Евгеньевна Мустафина
Гюльнар Муратовна Сахаутдинова (RU)
Гюльнар Муратовна Сахаутдинова
Ильси р Авхатовна Туктарова (RU)
Ильсияр Авхатовна Туктарова
Тимур Русланович Насибуллин (RU)
Тимур Русланович Насибуллин
Лира Набиулловна Мингазетдинова (RU)
Лира Набиулловна Мингазетдинова
Original Assignee
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА РОССИИ)
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА РОССИИ), Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) filed Critical Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА РОССИИ)
Priority to RU2005121376/15A priority Critical patent/RU2287158C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2287158C1 publication Critical patent/RU2287158C1/en

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: the present innovation deals with isolating DNA out of lymphocytes of peripheral venous blood due to polymerase chain reaction technique, synthesis of DNA amplification of genes PON1 and CETP fragments within the limits of which polymorphous nucleotide substitutions are localized, carrying out the analysis of polymorphism in the lengths of restriction fragments of amplicons and at detecting genotypes PON*BB and CETP*II one should predict the risk in development of hypertonic disease.
EFFECT: higher accuracy of prediction.
4 ex, 4 tbl

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гипертонической болезни (ГБ).The present invention relates to medicine, namely to cardiology, and can be used to predict the development of hypertension (GB).

ГБ является большой медико-социальной проблемой и тяжким бременем для здравоохранения. ГБ страдает до 20% взрослого населения мира, причем на протяжении нескольких последних десятилетий наблюдается дальнейший рост заболеваемости этой патологией. У больных ГБ велик риск развития таких тяжелых осложнений, как инфаркт миокарда и инсульт.GB is a major medical and social problem and a heavy health burden. GB affects up to 20% of the world's adult population, and over the past few decades there has been a further increase in the incidence of this pathology. In patients with hypertension there is a high risk of developing serious complications such as myocardial infarction and stroke.

Вышеизложенное определяет необходимость разработки способов прогнозирования развития ГБ, что важно для оптимизации профилактики этого заболевания. Профилактику заболевания считают эффективным и экономичным направлением в медицине. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска ГБ с использованием маркеров заболевания.The above determines the need to develop methods for predicting the development of GB, which is important for optimizing the prevention of this disease. Disease prevention is considered an effective and economical direction in medicine. Primary prevention involves the formation of GB risk groups using disease markers.

Применение разработанного способа обеспечит выявление лиц с высоким риском развития ГБ для того, чтобы осуществить мероприятия по профилактике развития данной патологии.Application of the developed method will ensure the identification of individuals with a high risk of developing GB in order to implement measures to prevent the development of this pathology.

Профилактика ГБ имеет неоспоримые преимущества по сравнению с диагностикой на ранних стадиях развития этого заболевания.Prevention of GB has undeniable advantages compared with diagnosis in the early stages of the development of this disease.

Известно, что для диагностики ГБ используют данные о величине артериального давления (АД). В то же время даже на ранних стадиях заболевания АД может быть нормальным или повышенным незначительно. На ранних стадиях заболевания отсутствуют и вторичные изменения в органах (гипертрофия миокарда и сосудистой стенки), которые рассматривают как надежные критерии для диагностики. Предложены способы диагностики ранних стадий заболевания, которые базируются на определении величин АД при физической нагрузке [Davidoff R, Schamroth С., Goldman A., Diamond Т., Cilliers A., Myburgh D. Postexercise blood pressure as a predictor of hypertension // Aviat Space Environ Med. - 1982. - V.53. - 591-594. Franz I. Ergometry in the diagnosis of hypertension // Dtsch Med Wochenschr. - 1987. - V.112. - P.1881. Franz I. Exercise hypertension: bits measurement and evalution //Herz. - 1987. - V.12. P.99-109]. Однако, как оказалось, гипертензивная реакция на одномоментную физическую нагрузку выявляется и у здоровых и у больных практически с одинаковой (соответственно 14,3% и 13,9%) частотой [Вилков В.Г., Невзоров В.П., Шамарин В.М., Деев А.Д., Орлова Л.А., Кузьменкова Л.В. Способ оценки изменений артериального давления при ортостатической пробе // Южно-Российский медицинский журнал. - 1998. - №4. - С.31-37]. Был разработан способ ранней диагностики ГБ, основанный на измерении систолического и диастолического АД и частоте сердечных сокращений при пробе со ступенчато возрастающей субмаксимальной физической нагрузкой [Вилков В.Г. Способ ранней диагностики гипертонической болезни. Роспатент №2102000, 1998. Вилков В.Г. Ранняя диагностика артериальной гипертонии функциональными методами. -М.: «Гайнуллин», 2002. - 96 с.]. Этот способ позволяет проводить диагностику ранних стадий ГБ у лиц при нормальном или пограничном уровне АД в покое и без вторичных изменений органов-мишеней, но с его помощью нельзя прогнозировать риск развития заболевания.It is known that for the diagnosis of GB using data on the value of blood pressure (BP). At the same time, even in the early stages of the disease, blood pressure can be normal or slightly increased. In the early stages of the disease, there are no secondary changes in the organs (myocardial and vascular wall hypertrophy), which are considered as reliable criteria for diagnosis. Methods for diagnosing the early stages of the disease are proposed, which are based on determining blood pressure values during physical activity [Davidoff R, Schamroth C., Goldman A., Diamond T., Cilliers A., Myburgh D. Postexercise blood pressure as a predictor of hypertension // Aviat Space Environ Med. - 1982. - V.53. - 591-594. Franz I. Ergometry in the diagnosis of hypertension // Dtsch Med Wochenschr. - 1987. - V.112. - P.1881. Franz I. Exercise hypertension: bits measurement and evalution // Herz. - 1987. - V.12. P.99-109]. However, as it turned out, a hypertensive reaction to simultaneous physical activity is detected in healthy and in patients with almost the same (respectively 14.3% and 13.9%) frequency [Vilkov V.G., Nevzorov V.P., Shamarin V. M., Deev A.D., Orlova L.A., Kuzmenkova L.V. A method for assessing changes in blood pressure during an orthostatic test // South Russian Medical Journal. - 1998. - No. 4. - S.31-37]. A method for early diagnosis of hypertension was developed, based on the measurement of systolic and diastolic blood pressure and heart rate during a sample with stepwise increasing submaximal physical activity [Vilkov V.G. A method for the early diagnosis of hypertension. Rospatent No. 2102000, 1998. Vilkov V.G. Early diagnosis of arterial hypertension by functional methods. -M.: Gainullin, 2002. - 96 p.]. This method allows the diagnosis of early stages of hypertension in individuals with a normal or borderline blood pressure level at rest and without secondary changes in target organs, but with its help it is impossible to predict the risk of developing the disease.

Выявлено множество факторов риска развития ГБ. Их подразделяют на средовые и наследственно обусловленные (генетические факторы). Прогноз развития заболевания на основе анализа средовых факторов риска весьма затруднен вследствие того, что процесс сбора и интерпретации анамнестических сведений с целью выявления факторов риска является субъективным и определяется личностными особенностями обследуемого и уровнем профессионализма врача. Поэтому он не может быть достаточно объективным и точным. Очевидно, что генетические факторы риска, немодифицируемые на протяжении жизни человека, в большей мере соответствуют задачам составления прогноза риска заболевания.Many risk factors for GB have been identified. They are divided into environmental and hereditarily determined (genetic factors). The prognosis of the development of the disease based on the analysis of environmental risk factors is very difficult due to the fact that the process of collecting and interpreting anamnestic information in order to identify risk factors is subjective and is determined by the personality of the subject and the level of professionalism of the doctor. Therefore, it cannot be sufficiently objective and accurate. Obviously, genetic risk factors that are not modified over the course of a person’s life are more consistent with the tasks of predicting the risk of a disease.

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе способы прогнозирования развития ГБ по генетическим факторам риска не обнаружены.The authors in the medical and patent literature did not find methods for predicting the development of hypertension by genetic risk factors.

В свете современных знаний о многофакторной природе и роли наследственной компоненты в развитии ГБ, разработка способов прогнозирования развития этого заболевания путем типирования пациента по полиморфизмам генов риска является перспективным направлением для оптимизации профилактики самого заболевания еще в раннем возрасте, а также и для целевой профилактики поражений органов-мишеней.In the light of modern knowledge about the multifactorial nature and role of the hereditary component in the development of GB, the development of methods for predicting the development of this disease by typing the patient by polymorphisms of risk genes is a promising direction for optimizing the prevention of the disease itself at an early age, as well as for targeted prevention of organ damage targets.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования развития ГБ по генетическим факторам риска.The objective of the invention was the development of an objective, highly informative method for predicting the development of GB by genetic risk factors.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза. Указанный технический результат достигается тем, что проводят генотипирование индивида по полиморфизмам генов параоксоназы 1 (PON1) и белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР).The technical result when using the invention is to increase the accuracy of the forecast. The indicated technical result is achieved by genotyping an individual by polymorphisms of the genes of paraoxonase 1 (PON1) and the protein carrier of cholesterol esters (CETP).

Для этого выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) амплифицируют фрагмент ДНК, полученный ампликон подвергают воздействию эндонуклеаз рестрикции, после чего проводят электрофорез в 7% полиакриламидном геле, окрашивают гель раствором бромистого этидия, фотографируют при ультрафиолетовом освещении и анализируют результаты электрофореза по числу и размерам рестрикционных фрагментов ДНК. Наличие фрагментов ДНК размером 99 нуклеотидных пар (н.п.) интерпретируют как аллель А, размером 65 н.п. и 34 н.п. - как аллель В гена PON1. Наличие фрагментов ДНК размером 120 н.п. и 76 н.п. интерпретируют как аллель V, размером 65 н.п. и 34 н.п. - как аллель I гена СЕТР.To do this, DNA is isolated from peripheral venous blood lymphocytes, a DNA fragment is amplified by polymerase chain reaction of DNA synthesis (PCR), the resulting amplicon is subjected to restriction endonucleases, then electrophoresis is carried out in 7% polyacrylamide gel, the gel is stained with ethidium bromide solution and photographed under ultraviolet light and analyze the results of electrophoresis by the number and size of restriction DNA fragments. The presence of DNA fragments of 99 nucleotide pairs (np) in size is interpreted as allele A, 65 np in size. and 34 n.p. - as the B allele of the PON1 gene. The presence of DNA fragments of 120 n.p. and 76 n.p. interpreted as the allele V, size 65 N. p. and 34 n.p. - as an allele of the CETP gene.

При выявлении генотипов PON1*BB и СЕТР*II прогнозируют высокий риск развития ГБ у обследуемого.When the PON1 * BB and CETP * II genotypes are identified, a high risk of developing GB in the subject is predicted.

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют 0.5 М раствор ЭДТА. При заборе крови к 0.5 мл консерванта добавляют 5 мл крови и хорошо перемешивают. Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C.The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).DNA is isolated from peripheral blood lymphocytes. As a preservative, a 0.5 M EDTA solution is used. During blood sampling, 5 ml of blood is added to 0.5 ml of preservative and mixed well. To obtain DNA of the required degree of purity and sufficient molecular weight, the method of isolating DNA from blood by phenol-chloroform extraction, described by Matthew (Mathew CC The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker JM, NY, L, is used .: Human Press .; - 1984. - V.2. - P.31-34).

Получение фракции клеточных ядер осуществляется следующим образом.Obtaining a fraction of cell nuclei is as follows.

1. Цельная венозная кровь (5 мл) в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляется 45 мл охлажденного лизирующего буфера (0.32 М сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-HCl, рН 7.6).1. Whole venous blood (5 ml) in a test tube with a preservative is thoroughly mixed and poured into a 100 ml centrifuge glass, 45 ml of chilled lysis buffer (0.32 M sucrose; 5 mM MgCl 2 ; 1% Triton X-100; 10 mM Tris-HCl, pH 7.6).

2. Смесь инкубируется 5 мин во льду и центрифугируется при 2500 g и температуре 4°С 15 мин.2. The mixture is incubated for 5 minutes in ice and centrifuged at 2500 g and a temperature of 4 ° C for 15 minutes.

3. Надосадочная жидкость сливается, осадок ресуспендируется в 3 мл буфера (рН 8.0), содержащего 10-20 мМ трис-HCl, 2.5 мМ ЭДТА, 0.5% SDS и 100 мкг/мл протеиназы К.3. The supernatant is drained, the precipitate is resuspended in 3 ml of buffer (pH 8.0) containing 10-20 mm Tris-HCl, 2.5 mm EDTA, 0.5% SDS and 100 μg / ml proteinase K.

4. Смесь инкубируется при температуре 56°С в течение 10-16 часов.4. The mixture is incubated at a temperature of 56 ° C for 10-16 hours.

Из полученного лизата экстрагируется ДНК в следующем порядке.DNA is extracted from the resulting lysate in the following order.

1. Для депротеинизации к лизату добавляется 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трис-HCl (рН 7.8).1. For deproteinization, 0.5 ml of 5M sodium perchlorate and 8 ml of phenol saturated with 1M Tris-HCl (pH 7.8) are added to the lysate.

2. Смесь центрифугируется при 1500 g в течение 10 мин.2. The mixture is centrifuged at 1500 g for 10 minutes.

3. Отбирается водная фаза, содержащая ДНК, РНК и неденатурированные белки.3. Selected aqueous phase containing DNA, RNA and undenatured proteins.

4. Отобранная фаза обрабатывается смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - только хлороформом.4. The selected phase is treated with a phenol-chloroform mixture (1: 1), and then only with chloroform.

5. ДНК осаждается двумя объемами 96% этанола.5. DNA is precipitated in two volumes of 96% ethanol.

6. Образовавшийся осадок ДНК промывается 70% этанолом, подсушивается на воздухе и растворяется в 1,5 мл деионизированной воды; полученный раствор ДНК хранится при - 20°С.6. The resulting DNA precipitate is washed with 70% ethanol, dried in air and dissolved in 1.5 ml of deionized water; the resulting DNA solution is stored at - 20 ° C.

Выход ДНК составляет 50-100 мкг на 1 мл образца крови.The DNA yield is 50-100 μg per 1 ml of a blood sample.

В дальнейшем полученная ДНК используется в качестве матрицы для ПЦР, в результате которой амплифицируются нужные фрагменты в области экзона 6 гена PON1 и в области экзона 14 гена СЕТР.Subsequently, the obtained DNA is used as a template for PCR, as a result of which the desired fragments are amplified in the exon 6 region of the PON1 gene and in the exon region 14 of the CETP gene.

Праймеры для типирования по полиморфизму Gln192Arg гена PON1 представляют собой специфические последовательности олигонуклеотидов 5'-TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3' и 5'-CACGCTAAACCCAAATACA ТСТС-3' и соответствуют таковым, приведенным в работе Гумберта с соавт. [Humbert R., Adier D., Disteche C. et al. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. // Nat. Genet. - 1993. - V.3. - P.73-76]. Праймеры для типирования по полиморфизму Val421Ile гена СЕТР представляют собой специфические последовательности олигонуклеотидов 5'-TTGTGGGTCACTTCTGTGCTC-3' и 5'-GAAATGGGAAGCTCTGTC AGC-3' и соответствуют таковым, приведенным в работе Рамсботтома с соавт. [Ramsbottom D., O'Neill A., Sexton D.M. et al. The cholesteryl ester transfer protein (CETP) locus as a candidate gene in abdominal aortic aneurysm. // Clinical. Genetics. - 1997. - V.51. - P.241-245].The primers for typing according to the Gln192Arg polymorphism of the PON1 gene are specific sequences of 5'-TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3 'and 5'-CACGCTAAACCCAAATACA TTCS-3' oligonucleotides and correspond to those cited by Humbert et al. [Humbert R., Adier D., Disteche C. et al. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. // Nat. Genet. - 1993. - V.3. - P.73-76]. The primers for typing the CETP gene Val421Ile polymorphism are specific sequences of 5'-TTGTGGGTCACTTCTGTGCTC-3 'and 5'-GAAATGGGAAGCTCTGTC AGC-3' oligonucleotides and correspond to those cited by Ramsbottom et al. [Ramsbottom D., O'Neill A., Sexton D.M. et al. The cholesteryl ester transfer protein (CETP) locus as a candidate gene in abdominal aortic aneurysm. // Clinical. Genetics. - 1997 .-- V.51. - P.241-245].

Нуклеотидная замена, являющаяся причиной полиморфизма Gln192Arg в экзоне 6 гена PON1, выявляется рестрикцией полученного ПЦР-продукта ферментом AlwI. Нуклеотидная замена, лежащая в основе полиморфизма Val421Ile в экзоне 14 гена СЕТР, выявляется рестрикцией ПЦР-продукта ферментом FokI.The nucleotide substitution that causes Gln192Arg polymorphism in exon 6 of the PON1 gene is detected by restriction of the resulting PCR product to AlwI. The nucleotide substitution underlying Val421Ile polymorphism in exon 14 of the CETP gene is detected by restriction of the PCR product by the FokI enzyme.

Состав реакционной смеси (25 мкл) для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dGTP, dCTP, dTTP, буфер для ПЦР (67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4 0.01% Tween-20). Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 20 секунд, 68°С - 25 секунд, 72°С - 30 секунд. После 30-го цикла проводят инкубацию при 72°С в течение 7 минут.The composition of the reaction mixture (25 μl) for PCR is as follows: 0.1-1 μg of genomic DNA, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each of the deoxynucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCTP, dTTP, PCR buffer (67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl 2 , 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 0.01% Tween-20). The resulting mixture is heated for 2 minutes at 94 ° C, add 5 units of thermophilic DNA polymerase, 20-30 μl of mineral oil. Amplification mode: 30 cycles with the following parameters: 94 ° C - 20 seconds, 68 ° C - 25 seconds, 72 ° C - 30 seconds. After the 30th cycle, incubation is carried out at 72 ° C for 7 minutes.

ПЦР-продукты подвергаются рестрикции и электрофорезу в вертикальном 7% полиакриламидном геле. Для этого 7 мкл ПЦР-продукта смешивается с 5 ед. фермента, смесь выдерживается при 37°С в течение 10 часов. Электрофорез проводится при постоянном напряжении 10 вольт/см в ТВЕ-буфере (0.089 М трис; 0.089 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, рН 8.0). Пробы, перед тем как нанести на гель, смешиваются в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксилен-цианол и 15% фикол. После окончания электрофореза для детекции результатов гель окрашивается раствором бромистого этидия в течение 10 минут, затем помещается на УФ-фильтр трансиллюминатора и фотографируется.PCR products are subjected to restriction and electrophoresis in a vertical 7% polyacrylamide gel. For this, 7 μl of the PCR product is mixed with 5 units. enzyme, the mixture is aged at 37 ° C for 10 hours. Electrophoresis is carried out at a constant voltage of 10 volts / cm in a TBE buffer (0.089 M tris; 0.089 M boric acid; 0.002 M EDTA, pH 8.0). Before applying to the gel, the samples are mixed in a 5: 1 ratio with a paint containing 0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene-cyanol and 15% ficol. After electrophoresis to detect the results, the gel is stained with ethidium bromide solution for 10 minutes, then placed on a UV transilluminator filter and photographed.

Размер и число фрагментов ДНК после рестрикции, фракционированных с помощью электрофореза, являются критериями для идентификации генотипа. В отношении полиморфизма гена PON1 наличие фрагмента ДНК размером 99 н.п. соответствует генотипу АА (гомозигота по отсутствию вариабельного сайта рестрикции), наличие фрагментов 99 н.п., 65 н.п. и 34 н.п. - генотипу АВ (гетерозигота по отсутствию и наличию сайта рестрикции), наличие фрагментов 65 н.п. и 34 н.п.- генотипу ВВ (гомозигота по наличию сайта рестрикции). В отношении полиморфизма гена СЕТР присутствие на электрофореграмме фрагментов ДНК размером 120 н.п.позволяет идентифицировать генотип W (гомозигота по отсутствию сайта рестрикции), фрагментов 120 н.п., 63 н.п. и 50 н.п. - генотип IV (гетерозигота), фрагментов 63 н.п. и 50 н.п. - генотипа II (гомозигота по наличию сайта рестрикции).The size and number of DNA fragments after restriction fractionated by electrophoresis are criteria for identifying the genotype. With respect to PON1 gene polymorphism, the presence of a 99 np DNA fragment corresponds to the AA genotype (homozygous for the absence of a variable restriction site), the presence of fragments 99 n.p., 65 n.p. and 34 n.p. - AB genotype (heterozygous for the absence and presence of a restriction site), the presence of fragments of 65 n.p. and 34 n.p. to the BB genotype (homozygous for the presence of a restriction site). With respect to the CETP gene polymorphism, the presence of 120 np DNA fragments on the electrophoregram allows us to identify the W genotype (homozygous for the absence of a restriction site), 120 np fragments, 63 np and 50 n.p. - genotype IV (heterozygote), fragments 63 n.a. and 50 n.p. - genotype II (homozygous for the presence of a restriction site).

В качестве контроля обследовали группу здоровых мужчин, проживающих на территории республики Башкортостан (99 человек), у которых отсутствовали признаки сердечно-сосудистых заболеваний. В качестве конкретных примеров обследовано в целом 86 мужчин, больных ГБ, в возрасте от 25 до 65 лет, с длительностью заболевания более года. Средний возраст больных составил 46.37±10.45. Диагноз ГБ устанавливался на основании критериев Комитета экспертов ВОЗ (1997), обследование проводилось на базе Республиканского кардиологического диспансера города Уфы в отделении артериальной гипертензии. Контрольная группа и группа больных были сформированы из этнических татар, проживающих в Башкортостане.As a control, a group of healthy men living in the Republic of Bashkortostan (99 people) who did not have signs of cardiovascular disease was examined. As specific examples, a total of 86 men with GB were examined, aged 25 to 65 years, with a disease duration of more than a year. The average age of the patients was 46.37 ± 10.45. The diagnosis of GB was established on the basis of the criteria of the WHO Expert Committee (1997), the examination was conducted on the basis of the Republican Cardiology Dispensary in the city of Ufa in the department of arterial hypertension. The control group and the group of patients were formed from ethnic Tatars living in Bashkortostan.

Вычисление показателя относительного риска развития ГБ проводилось на основании расчета показателя соотношения шансов (odds ratio - OR), по формулеThe calculation of the relative risk of GB development was carried out on the basis of the calculation of the odds ratio indicator (odds ratio - OR), according to the formula

OR=(a+0.5)(d+0.5)/(b+0.5)(c+0.5),OR = (a + 0.5) (d + 0.5) / (b + 0.5) (c + 0.5),

где а - частота генотипа в выборке больных;where a is the frequency of the genotype in a sample of patients;

b - частота генотипа в контрольной выборке;b - genotype frequency in the control sample;

с=1-а - сумма частот остальных генотипов в выборке больных;c = 1-a is the sum of the frequencies of the remaining genotypes in the patient sample;

d=1-b - сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке.d = 1-b is the sum of the frequencies of the remaining genotypes in the control sample.

Параметр 0.5 в представленной формуле используется в том случае, когда одно из чисел а, b, с, d равняется нулю или оказывается меньше трех. Высокий риск развития заболевания констатируют при OR>1.The parameter 0.5 in the presented formula is used in the case when one of the numbers a, b, c, d is zero or is less than three. A high risk of developing the disease is noted for OR> 1.

Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма Gln192Arg в экзоне 6 гена PON1 и полиморфизма Val421Ile в экзоне 14 гена СЕТР представлены в табл.1, 2 и 3.The results of molecular genetic analysis of Gln192Arg polymorphism in exon 6 of the PON1 gene and Val421Ile polymorphism in exon 14 of the CETP gene are presented in Tables 1, 2, and 3.

При сравнении группы больных ГБ и контрольной группы нашли, что различия между ними состоят в том, что в группе больных выше частота генотипа PON*BB (18.60% против 8.08%, Р=0.047) (табл.1). Более того, в группе больных с отягощенным по ССЗ семейным анамнезом (наличие ИБС, ГБ, инсульта у родственников первой степени родства) достоверно чаще встречается генотип PON*BB (28.13% относительно 8.08% в контрольной группе, Р=0.006) и аллель PON*B (46.88% против 31.82%, Р=0.035). Очевидно, что повышенный относительный риск развития ГБ ассоциирован с генотипом PON*BB (OR=2.60, CIOR 1.08-7.08), кроме того, он сравнительно выше у лиц с отягощенной по ГБ наследственностью (OR=4.45, CIOR 1.38-14.51).When comparing the group of patients with GB and the control group, they found that the differences between them are that in the group of patients the frequency of the PON * BB genotype is higher (18.60% versus 8.08%, P = 0.047) (Table 1). Moreover, in the group of patients with a family history of CVD (history of coronary heart disease, hypertension, stroke in relatives of the first degree of kinship), the PON * BB genotype (28.13% versus 8.08% in the control group, P = 0.006) and the PON * allele were significantly more frequent B (46.88% vs 31.82%, P = 0.035). Obviously, the increased relative risk of developing GB is associated with the PON * BB genotype (OR = 2.60, CI OR 1.08-7.08), in addition, it is relatively higher in individuals with heredity burdened by GB (OR = 4.45, CI OR 1.38-14.51) .

В группе больных ГБ по сравнению с контрольной группой повышена частота генотипа СЕТР*II (57.47% против 42.31%, Р=0.042) и понижена частота генотипа CETP*VI (33.33% против 50.96%, Р=0.019) (табл.2). Таким образом, повышенный риск ГБ ассоциирован с генотипом СЕТР*II (OR=1.84, CIOR 0.99-3.42), пониженный риск - с генотипом CETP*VI (OR=0.48, CIOR 0.26-0.90).In the group of patients with hypertension compared with the control group, the frequency of the CETP * II genotype was increased (57.47% versus 42.31%, P = 0.042) and the frequency of the CETP * VI genotype was decreased (33.33% versus 50.96%, P = 0.019) (Table 2). Thus, an increased risk of GB is associated with the CETP * II genotype (OR = 1.84, CI OR 0.99-3.42), and a lower risk is associated with the CETP * VI genotype (OR = 0.48, CI OR 0.26-0.90).

Среди больных ГБ в сравнении с группой контроля повышена частота сочетания генотипов PON1*BB и CETP*II (15.12% относительно 2.22% в контрольной группе, Р=0.002). Сочетание генотипов PON1*BB и СЕТР*II маркирует повышенный риск ГБ (OR=7.83; CIOR 1.71-35.85). Таким образом, наблюдается аддитивность эффектов генотипов PON*BB и СЕТР*II, т.е. относительный риск заболевания по сочетанию генотипов выше, чем по каждому генотипу в отдельности (табл.3).Among patients with hypertension, in comparison with the control group, the frequency of combination of the PON1 * BB and CETP * II genotypes was increased (15.12% versus 2.22% in the control group, P = 0.002). The combination of the PON1 * BB and CETP * II genotypes marks an increased risk of GB (OR = 7.83; CI OR 1.71-35.85). Thus, additivity of the effects of the PON * BB and CETP * II genotypes is observed, i.e. the relative risk of the disease in the combination of genotypes is higher than for each genotype individually (Table 3).

В плане сравнения полученных нами результатов с данными других авторов можно отметить следующее. В популяциях немцев, хорватов, жителей Южной Америки, японцев, индусов обнаружена ассоциация с ишемической болезнью сердца (ИБС) аллеля PON1*B [Gardemann A., Philipp M., Hess К. et al. The paraoxonase Leu-Met54 and Gln-Arg191 gene polymorphisms are not associated with the risk of coronary heart disease. // Atherosclerosis. - 2000. - V.152. - P.421-431. Pati N., Pati U. Paraoxonase gene polymorphism and coronary artery disease in Indian subjects. // Inter. J. Cardiology. - 1998. - V.66. - P.165-168. Sanghera D., Saha N., Aston C.E. et al. Genetic polymorphism of paraoxonase and the risk of coronary heart disease. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1997. - V.17. - P.1067-1073. Sen-Banerjee S., Siles S., Campos H. Tobacco smoking modifies association between Gln-Arg192 polymorphism of human paraoxonase gene and risk of myocardial infarction. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2000. - V.20. - Р.2120-2126]. Показано, что в популяции немцев у носителей аллеля PON1*В повышен риск ИМ в возрасте до 62 лет [Gardemann A., Philipp M., Hess К. et al. The paraoxonase Leu-Met54 and Gln-Arg191 gene polymorphisms are not associated with the risk of coronary heart disease. // Atherosclerosis. - 2000. - V.152. - P.421-431]. В популяции японцев аллель PON1*B ассоциирован также с коронарным ангиоспазмом, ишемическим инсультом [Imai Y., Morita H., Kurihara H. et al. Evidence for association between paraoxonase gene polymorphisms and atherosclerotic diseases. // Atherosclerosis. - 2000. - V.149. - P.435-442. Ito Т., Yasue H., Yoshimira S. et. al. Paraoxonase gene Gln192Arg (Q192R) polymorphism is associated with coronary artery spasm. // Hum. Genet. - 2002. - V.110. - P.89-94. Ueno Т., Shimazaki E., Okamoto A. et al. Polymorphism of paraoxonase in patients with cerebrovascular disease and coronary artery disease in Japanese population. // 11 th International Symposium on Atherosclerosis. 1997. - P.83]. Согласно результатам проведенных мета-анализов, аллель PON1*B связан с повышенным риском ИБС, причем в присутствии других факторов риска (диабет, табакокурение, возраст) показатель относительного риска по этому аллелю возрастает [Durrington P.N., Mackness В., Mackness M.I. Paraoxonase and atherosclerosis. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2001. - V.21. - P.473-480. Mackness В., Davies G., Turkic W., Lee E. et al. Paraoxonase Status in Coronary Heart Disease. Are Activity and Concentration More Important Than Genotype? // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2001. - V.21. - P.1451-1457].In terms of comparing our results with those of other authors, the following can be noted. In populations of Germans, Croats, South Americans, Japanese, and Indians, an association with coronary heart disease (CHD) of the PON1 * B allele was found [Gardemann A., Philipp M., Hess K. et al. The paraoxonase Leu-Met54 and Gln-Arg191 gene polymorphisms are not associated with the risk of coronary heart disease. // Atherosclerosis. - 2000. - V.152. - P.421-431. Pati N., Pati U. Paraoxonase gene polymorphism and coronary artery disease in Indian subjects. // Inter. J. Cardiology. - 1998. - V.66. - P.165-168. Sanghera D., Saha N., Aston C.E. et al. Genetic polymorphism of paraoxonase and the risk of coronary heart disease. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1997. - V.17. - P.1067-1073. Sen-Banerjee S., Siles S., Campos H. Tobacco smoking modifies association between Gln-Arg192 polymorphism of human paraoxonase gene and risk of myocardial infarction. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2000. - V.20. - R.2120-2126]. It has been shown that in the German population of carriers of the PON1 * B allele, the risk of myocardial infarction is up to 62 years of age [Gardemann A., Philipp M., Hess K. et al. The paraoxonase Leu-Met54 and Gln-Arg191 gene polymorphisms are not associated with the risk of coronary heart disease. // Atherosclerosis. - 2000. - V.152. - P.421-431]. In the Japanese population, the PON1 * B allele is also associated with coronary angiospasm, ischemic stroke [Imai Y., Morita H., Kurihara H. et al. Evidence for association between paraoxonase gene polymorphisms and atherosclerotic diseases. // Atherosclerosis. - 2000. - V.149. - P. 435-442. Ito T., Yasue H., Yoshimira S. et. al. Paraoxonase gene Gln192Arg (Q192R) polymorphism is associated with coronary artery spasm. // Hum. Genet. - 2002. - V.110. - P.89-94. Ueno T., Shimazaki E., Okamoto A. et al. Polymorphism of paraoxonase in patients with cerebrovascular disease and coronary artery disease in Japanese population. // 11 th International Symposium on Atherosclerosis. 1997. - P.83]. According to the results of meta-analyzes, the PON1 * B allele is associated with an increased risk of coronary heart disease, and in the presence of other risk factors (diabetes, tobacco smoking, age), the relative risk indicator for this allele increases [Durrington P.N., Mackness B., Mackness M.I. Paraoxonase and atherosclerosis. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2001. - V.21. - P. 473-480. Mackness B., Davies G., Turkic W., Lee E. et al. Paraoxonase Status in Coronary Heart Disease. Are Activity and Concentration More Important Than Genotype? // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2001. - V.21. - P.1451-1457].

Согласно данным литературы, полиморфизм гена СЕТР оказывает влияние на липидный метаболизм, риск развития сердечно-сосудистых заболеваний в популяциях французов, датчан, японцев, исландцев [Agerholm-Larsen В., Nordestgaard B.G., Steffensen R. et. al. Elevated HDL cholesterol is a risk factor for ischemic heart disease in white women when caused by a common mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene. // Circulation. - 2000. - V.101. - P.1907-1912. Bruce С., Sharp D.S., Tall A.R. Relationship of HDL and coronary heart disease to a common amino acid polymorphism in the cholesteryl ester transfer protein in men with and without hypertriglyceridemia. // J. Lipid Research. - 1998. - V.39. - Р.1071-1078. Delanef L.F., Benlian P., Guerassimenco O. et. al. A common Ile405Val mutation in the cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene associated with longevity. //11th International Symposium on Atherosclerosis. 1997. Abst. P.65. Gudnason V., Thormar K., Humphries S.E. Interaction of the cholesteryl ester transfer protein 1405 V polymorphism with alcohol consumption in smoking and non-smoking healthy men, and the effect on plasma HDL cholesterol and apoAl concentration. // Clin. Genet. - 1997. - V.51. - P.15-21].According to the literature, the CETP gene polymorphism affects lipid metabolism, the risk of developing cardiovascular diseases in populations of French, Danes, Japanese, and Icelanders [Agerholm-Larsen B., Nordestgaard BG, Steffensen R. et. al. Elevated HDL cholesterol is a risk factor for ischemic heart disease in white women when caused by a common mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene. // Circulation. - 2000. - V.101. - P.1907-1912. Bruce S., Sharp DS, Tall AR Relationship of HDL and coronary heart disease to a common amino acid polymorphism in the cholesteryl ester transfer protein in men with and without hypertriglyceridemia. // J. Lipid Research. - 1998. - V.39. - P.1071-1078. Delanef LF, Benlian P., Guerassimenco O. et. al. A common Ile405 Val mutation in the cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene associated with longevity. // 11 th International Symposium on Atherosclerosis. 1997. Abst. P.65. Gudnason V., Thormar K., Humphries SE Interaction of the cholesteryl ester transfer protein 1405 V polymorphism with alcohol consumption in smoking and non-smoking healthy men, and the effect on plasma HDL cholesterol and apoAl concentration. // Clin. Genet. - 1997 .-- V.51. - P.15-21].

Полученные нами результаты о значимости полиморфизмов генов PON1 и CETP в развитии ГБ характеризуются научной новизной и приоритетны.Our results on the significance of polymorphisms of the PON1 and CETP genes in the development of GB are characterized by scientific novelty and priority.

Индивидам, обладающим генотипом PON*BB-CETP*II, мы могли бы рекомендовать контроль факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, коррекцию образа жизни путем проведения профилактических мероприятий, что позволило бы существенно понизить риск ГБ.For individuals with the PON * BB-CETP * II genotype, we could recommend control of cardiovascular disease risk factors, lifestyle correction through preventive measures, which would significantly reduce the risk of hypertension.

Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска, т.е. путем типирования полиморфизма Gln192Arg гена PON и полиморфизма Val421Ile гена CETP, иллюстрируется на следующих конкретных примерах.A method for predicting the development of hypertension by genetic risk factors, i.e. by typing the Gln192Arg polymorphism of the PON gene and the Val421Ile polymorphism of the CETP gene, is illustrated by the following specific examples.

Пример 1. Больной Б., возраст на момент обследования составил 42 года, вес - 89 кг, рост - 1.68 м, индекс массы тела (ИМТ) - 32, АД - 150/95 мм рт. ст. Жалобы на нарушение сна, периодически возникающие головные боли, тошноту, снижение умственной работоспособности, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с подъемом артериального давления (АД). Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 35 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. По результатам электро- и эхокардиографического исследования обнаружена гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна отмечены признаки гипертонической ангиопатии.Example 1. Patient B., age at the time of the examination was 42 years old, weight - 89 kg, height - 1.68 m, body mass index (BMI) - 32, blood pressure - 150/95 mm RT. Art. Complaints of sleep disturbance, recurring headaches, nausea, decreased mental performance, palpitations, pain in the heart area associated with a rise in blood pressure (BP). The diagnosis of GB was first made at the age of 35. A burdened family history of GB was revealed. According to the results of electro- and echocardiographic studies, hypertrophy of the left ventricle of the heart, diastolic dysfunction of the left ventricle were detected. When examining the fundus, signs of hypertensive angiopathy were noted.

Для молекулярно-генетического тестирования у больного забрали 6 мл венозной крови, выделили ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов РОN1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, в 25 мкл реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и затем электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*ВВ и СЕТР*II.For molecular genetic testing, 6 ml of venous blood was taken from the patient, DNA was isolated, PCR amplification of fragments of the PON1 and CETP genes, within which polymorphic nucleotide substitutions were localized, was performed in 25 μl of the reaction mixture containing approximately 0.1-1 μg of genomic DNA, 5 units Taq polymerase, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate in 25 μl of a single PCR buffer. After amplicon restriction with endonucleases, electrophoresis of DNA fragments was carried out at a constant voltage of 250-300 volts. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide solution for 10 minutes and then the electrophoregram was analyzed under ultraviolet light on a transilluminator filter. In the study, the genotypes PON * BB and CETP * II were established.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.Conclusion: taking into account the burdened family history, the observed patient had to conduct a genetic analysis at an early age, which would determine the high risk of developing this pathological condition and take preventive measures in time to prevent the development of the disease.

Пример 2. Больной И., возраст на момент обследования составил 47 лет, вес - 77 кг, рост - 1.7 м, ИМТ - 27, АД - 160/95 мм рт. ст. Жалобы на периодически возникающие головные боли, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с физическими нагрузками или подъемом АД. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 38 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. При электро- и эхокардиографическом исследованиях признаки гипертрофии левого желудочка отсутствуют. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.Example 2. Patient I., the age at the time of the examination was 47 years old, weight - 77 kg, height - 1.7 m, BMI - 27, blood pressure - 160/95 mm RT. Art. Complaints of recurring headaches, palpitations, pain in the heart area associated with physical exertion or a rise in blood pressure. First diagnosed with GB at the age of 38 years. A burdened family history of GB was revealed. With electro- and echocardiographic studies, there are no signs of left ventricular hypertrophy. An examination of the fundus revealed signs of hypertensive angiopathy.

Для проведения молекулярно-генетического тестирования у больного забрали 6 мл венозной крови, из которой была выделена ДНК, методом ПЦР проведена амплификация фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и проанализировали электрофореграмму при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.To conduct molecular genetic testing, 6 ml of venous blood from which DNA was isolated was taken from the patient; PCR amplification of PON1 and CETP genes was carried out in a reaction mixture containing about 0.1-1 μg of genomic DNA, 5 units. Taq polymerase, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate in 25 μl of a single PCR buffer. After amplicon restriction with endonucleases, electrophoresis of DNA fragments was carried out at a constant voltage of 250-300 volts. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide solution for 10 minutes and the electrophoregram was analyzed under ultraviolet light on a transilluminator filter. The study established the genotypes PON * BB and CETP * II.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.Conclusion: taking into account the burdened family history, the observed patient had to conduct a genetic analysis at an early age, which would determine the high risk of developing this pathological condition and take preventive measures in time to prevent the development of the disease.

Пример 3. Больной Ф., возраст на момент обследования составил 58 лет, вес - 65 кг, рост - 1.63 м, ИМТ - 24, АД - 160/95 мм рт. ст. Жалобы на головные боли, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с подъемом АД. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 33 лет. При электро- и эхокардиографическом исследовании выявлена гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.Example 3. Patient F., age at the time of the examination was 58 years old, weight - 65 kg, height - 1.63 m, BMI - 24, blood pressure - 160/95 mm RT. Art. Complaints of headaches, palpitations, pains in the region of the heart associated with a rise in blood pressure. First diagnosed with GB at the age of 33 years. An electro- and echocardiographic study revealed hypertrophy of the left ventricle of the heart, diastolic dysfunction of the left ventricle. An examination of the fundus revealed signs of hypertensive angiopathy.

При молекулярно-генетическом тестировании у больного забрали 6 мл венозной крови для выделения ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.During molecular genetic testing, 6 ml of venous blood was taken from the patient for DNA extraction, PCR amplification of PON1 and CETP genes was carried out in a reaction mixture containing about 0.1-1 μg of genomic DNA, 5 units. Taq polymerase, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate in 25 μl of a single PCR buffer. After amplicon restriction with endonucleases, electrophoresis of DNA fragments was carried out at a constant voltage of 250-300 volts. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide solution for 10 minutes and the electrophoregram was analyzed under ultraviolet light on a transilluminator filter. The study established the genotypes PON * BB and CETP * II.

Вывод: молекулярно-генетический анализ в раннем возрасте позволил бы определить высокий риск развития ГБ и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.Conclusion: molecular genetic analysis at an early age would determine the high risk of developing GB and take timely preventive measures to prevent the development of the disease.

Пример 4.Example 4

Больной Г., возраст на момент обследования составил 55 лет, вес - 69 кг, рост - 1.74 м, ИМТ - 26, АД - 150/95 мм рт. ст. Жалобы на нарушение сна, периодически возникающие головные боли, тошноту, снижение умственной работоспособности, сердцебиение, боли в области сердца. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 47 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. При электро- и эхокардиографическом исследовании выявлены гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.Patient G., age at the time of the examination was 55 years old, weight - 69 kg, height - 1.74 m, BMI - 26, blood pressure - 150/95 mm RT. Art. Complaints of sleep disturbance, recurring headaches, nausea, decreased mental performance, palpitations, pain in the heart. First diagnosed with GB at the age of 47 years. A burdened family history of GB was revealed. An electro- and echocardiographic study revealed hypertrophy of the left ventricle of the heart, diastolic dysfunction of the left ventricle. An examination of the fundus revealed signs of hypertensive angiopathy.

При молекулярно-генетическом тестировании у больного забрали 6 мл венозной крови, из которой выделили ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.During molecular genetic testing, 6 ml of venous blood was taken from the patient, from which DNA was isolated, PCR amplification of PON1 and CETP genes was carried out in a reaction mixture containing about 0.1-1 μg of genomic DNA, 5 units. Taq polymerase, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate in 25 μl of a single PCR buffer. After amplicon restriction with endonucleases, electrophoresis of DNA fragments was carried out at a constant voltage of 250-300 volts. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide solution for 10 minutes and the electrophoregram was analyzed under ultraviolet light on a transilluminator filter. The study established the genotypes PON * BB and CETP * II.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения заболевания.Conclusion: given the burdened family history, the observed patient had to have a genetic analysis at an early age, which would determine the high risk of developing this pathological condition and take preventive measures in time to prevent the disease.

Таким образом, предложенный способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать развитие ГБ.Thus, the proposed method is modern and allows with a high degree of reliability to predict the development of GB.

Таблица 1Table 1 Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма Gln192Arg гена PONI в группах больных гипертонической болезнью и практически здоровых лиц (контроль)The results of molecular genetic analysis of the Glon192Arg polymorphism of the PONI gene in groups of patients with hypertension and practically healthy individuals (control) Аллель или генотипAllele or genotype КонтрольThe control БольныеSick РR OR(CI)OR (CI) ni n i pi±sp, % (CI)p i ± s p ,% (CI) ni n i pi±sp, % (CI)p i ± s p ,% (CI) АллельAllele АBUT 135135 68.18±3.31
(61.20-74.60)
68.18 ± 3.31
(61.20-74.60)
106106 61.63±3.71
(53.92-68.93)
61.63 ± 3.71
(53.92-68.93)
0.1920.192 nsns
ВAT 6363 31.82±3.31
(25.39-38.79)
31.82 ± 3.31
(25.39-38.79)
6666 38.37±3.71
(31.07-46.08)
38.37 ± 3.71
(July 31-46, 08)
nsns
ГенотипGenotype ААAA 4444 44.44±4.99
(34.45-54.77)
44.44 ± 4.99
(34.45-54.77)
3636 41.86±5.32
(31.30-52.99)
41.86 ± 5.32
(31.30-52.99)
0.7670.767 nsns
АВAB 4747 47.47±5.02
(37.34-57.76)
47.47 ± 5.02
(37.34-57.76)
3434 39.53±5.27
(29.15-50.66)
39.53 ± 5.27
(29.15-50.66)
0.3010.301 nsns
ВВBB 88 8.08±2.74
(3.55-15.30)
8.08 ± 2.74
(3.55-15.30)
1616 18.60±4.19
(11.02-28.45)
18.60 ± 4.19
(11.02-28.45)
0.0470.047 2.60(0.90-7.08)2.60 (0.90-7.08)
Примечания: ni - численность, рi - частота встречаемости генотипа (аллеля); spi - ошибка частоты; CI (confidence interval) - 95% доверительный интервал; р - оценка достоверности различий по двустороннему критерию Фишера, OR (odds ratio) - показатель относительного риска, ns (no statistical) - OR не отличается от 1Notes: n i is the number, p i is the frequency of occurrence of the genotype (allele); s pi - frequency error; CI (confidence interval) - 95% confidence interval; p - assessment of the significance of differences according to the bilateral Fisher criterion, OR (odds ratio) - indicator of relative risk, ns (no statistical) - OR does not differ from 1

Таблица 2table 2 Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма Val421Ile гена СЕТР в группах больных гипертонической болезнью и практически здоровых лиц (контроль)The results of molecular genetic analysis of Val421Ile polymorphism of the CETP gene in groups of patients with hypertension and practically healthy individuals (control) Аллель или генотипAllele or genotype КонтрольThe control Больные ЭГEG patients РR OR(CI)OR (CI) ni n i pi±sp, % (CI)p i ± s p ,% (CI) ni n i pi±sp, % (CI)p i ± s p ,% (CI) АллельAllele VV 6767 32.21±3.24
(25.91-39.02)
32.21 ± 3.24
(25.91-39.02)
4545 25.86±3.32
(19.53-33.03)
25.86 ± 3.32
(19.53-33.03)
0.1780.178 nsns
II 141141 67.79±3.24
(60.98-74.08)
67.79 ± 3.24
(60.98-74.08)
129129 74.14±3.32
(66.97-80.47)
74.14 ± 3.32
(66.97-80.47)
nsns
ГенотипGenotype VVVv 77 6.73±2.46
(2.75-13.38)
6.73 ± 2.46
(2.75-13.38)
88 9.20±3.10
(4.05-17.32)
9.20 ± 3.10
(4.05-17.32)
0.5950.595 nsns
VIVI 5353 50.96±4.90
(40.97-60.90)
50.96 ± 4.90
(40.97-60.90)
2929th 33.33±5.05
(23.58-44.25)
33.33 ± 5.05
(23.58-44.25)
0.0190.019 0.48
(0.26-0.90)
0.48
(0.26-0.90)
IIII 4444 42.31±4.84
(32.68-52.39)
42.31 ± 4.84
(32.68-52.39)
50fifty 57.47±5.30
(46.41-68.01)
57.47 ± 5.30
(46.41-68.01)
0.0420.042 1.84
(0.99-3.42)
1.84
(0.99-3.42)
Обозначения те же, что и в табл.1Designations are the same as in table 1

Таблица 3Table 3 Сравнительный анализ распределений частот генотипов по сочетаниям полиморфизмов Glnl92Arg гена PON1 и Val421Ile гена СЕТР в группах больных гипертонической болезнью и практически здоровых лиц (контроль)Comparative analysis of frequency distributions of genotypes by combinations of Glnl92Arg polymorphisms of the PON1 gene and Val421Ile of the CETP gene in groups of patients with hypertension and practically healthy individuals (control) ГенотипGenotype КонтрольThe control БольныеSick РR OR(CI)OR (CI) СЕТРSETR PON1Pon1 ni n i pi±sp, % (CI)p i ± s p ,% (CI) ni n i pi±Sp, % (CI)p i ± S p ,% (CI) VVVv ААAA 1one 1.1±1.1
(0.03-6.04)
1.1 ± 1.1
(0.03-6.04)
00 00 0.9980.998 nsns
АВAB 4four 4.4±2.2
(1.22-10.99)
4.4 ± 2.2
(1.22-10.99)
77 8.1±2.9
(3.33-16.05)
8.1 ± 2.9
(3.33-16.05)
0.3630.363 nsns
ВВBB 1one 1.1±1.1
(0.03-6.04)
1.1 ± 1.1
(0.03-6.04)
1one 1.2±1.2
(0.03-6.31)
1.2 ± 1.2
(0.03-6.31)
0.9980.998 nsns
VIVI ААAA 1616 17.8±4.03
(10.52-27.26)
17.8 ± 4.03
(10.52-27.26)
1717 19.8±4.3
(11.96-29.75)
19.8 ± 4.3
(11.96-29.75)
0.8470.847 nsns
АВAB 2323 25.6±4.6
(16.94-35.84)
25.6 ± 4.6
(16.94-35.84)
99 10.5±3.3
(4.89-18.94)
10.5 ± 3.3
(4.89-18.94)
0.0110.011 0.34(0.14-0.79)0.34 (0.14-0.79)
ВВBB 33 3.3±1.89
(0.69-9.43)
3.3 ± 1.89
(0.69-9.43)
22 2.3±1.6
(0.28-8.15)
2.3 ± 1.6
(0.28-8.15)
0.9880.988 nsns
IIII ААAA 2424 26.7±4.7
(17.89-37.03)
26.7 ± 4.7
(17.89-37.03)
1919 22.1±4.5
(13.86-32.33)
22.1 ± 4.5
(13.86-32.33)
0.4890.489 nsns
АВAB 1616 17.8±4.03
(10.52-27.26)
17.8 ± 4.03
(10.52-27.26)
18eighteen 20.9±4.39
(12.90-31.05)
20.9 ± 4.39
(12.90-31.05)
0.7030.703 nsns
ВВBB 22 2.2±1.6
(0.27-7.8)
2.2 ± 1.6
(0.27-7.8)
1313 15.1±3.9
(8.30-24.46)
15.1 ± 3.9
(8.30-24.46)
0.00240.0024 7.83(1.71-35.85)7.83 (1.71-35.85)
Обозначения те же, что и в табл.1Designations are the same as in table 1

Таблица 4Table 4 Способ прогнозирования развития гипертонической болезни путем типирования полиморфизма Gln192Arg гена PON и полиморфизма Val421Ile гена СЕТРA method for predicting the development of hypertension by typing the PON gene Gln192Arg polymorphism and the CETP gene Val421Ile polymorphism ГеныGenes ГенотипыGenotypes OR(CI)OR (CI) ПрогнозForecast PON1-СЕТРPON1-SETR ВВ-IIBB-II 7.83
(1.71-35.85)
7.83
(1.71-35.85)
Высокий риск гипертонической болезниHigh risk of hypertension
AB-VIAB-VI 0.34
(0.14-0.79)
0.34
(0.14-0.79)
Низкий риск гипертонической болезниLow risk of hypertension

Claims (1)

Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска, характеризующийся тем, что производят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипов PON*BB и СЕТР*II прогнозирует высокий риск развития гипертонической болезни у обследуемого.A method for predicting the development of hypertension by genetic risk factors, characterized in that DNA is extracted from peripheral venous blood lymphocytes, amplification of PON1 and CETP gene fragments within which polymorphic nucleotide substitutions are localized, by polymerase chain reaction of DNA synthesis and when PON genotypes are detected * BB and CETP * II predicts a high risk of hypertension in the subject.
RU2005121376/15A 2005-07-07 2005-07-07 Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors RU2287158C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005121376/15A RU2287158C1 (en) 2005-07-07 2005-07-07 Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005121376/15A RU2287158C1 (en) 2005-07-07 2005-07-07 Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2287158C1 true RU2287158C1 (en) 2006-11-10

Family

ID=37500866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005121376/15A RU2287158C1 (en) 2005-07-07 2005-07-07 Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2287158C1 (en)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2449285C1 (en) * 2010-10-19 2012-04-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Читинская государственная медицинская академия Росздрава Method of predicting risk of arterial hypertension development in patients with primary osteoarthrosis
RU2456608C1 (en) * 2011-03-15 2012-07-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" Method for prediction of risk of hypertension in males
RU2482491C2 (en) * 2007-11-30 2013-05-20 Дженентек, Инк. Vegf polymorphism and antiangiogenesis therapy
RU2557944C1 (en) * 2014-05-07 2015-07-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method of predicting level of arterial pressure in women in late pregnancy
RU2565407C1 (en) * 2014-12-18 2015-10-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for predicting risk of stage iii hypertensive disease
RU2580310C1 (en) * 2014-12-17 2016-04-10 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method of predicting the risk of developing hypertension in individuals who have family history
RU2598745C2 (en) * 2014-12-17 2016-09-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for prediction of risk of stage iii hypertensive disease in patients with hypertension with metabolic syndrome
RU2624480C1 (en) * 2016-12-23 2017-07-04 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for prediction of risk of essential hypertension development based on matrix metal proteinase genes combinations
RU2664428C1 (en) * 2017-12-12 2018-08-17 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for predicting risk of developing essential hypertension in women based on genetic factors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAMSBOTTOM D. et al., The cholesterol ester transfer protein (CETP) locus as a candidate gene in abdominal aortic aneurism, Clin. Genet., 1997, Apr. 51(4), 241-245. *
UENO Т., et al., Paraoxonase 1 polimorphism Leu-Met 55 is associated with cerebral infarction in Japanse population, Med. Sci. Monit, 2003, Jun. 9(6), 208-212. *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2482491C2 (en) * 2007-11-30 2013-05-20 Дженентек, Инк. Vegf polymorphism and antiangiogenesis therapy
RU2449285C1 (en) * 2010-10-19 2012-04-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Читинская государственная медицинская академия Росздрава Method of predicting risk of arterial hypertension development in patients with primary osteoarthrosis
RU2456608C1 (en) * 2011-03-15 2012-07-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" Method for prediction of risk of hypertension in males
RU2557944C1 (en) * 2014-05-07 2015-07-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method of predicting level of arterial pressure in women in late pregnancy
RU2580310C1 (en) * 2014-12-17 2016-04-10 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method of predicting the risk of developing hypertension in individuals who have family history
RU2598745C2 (en) * 2014-12-17 2016-09-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for prediction of risk of stage iii hypertensive disease in patients with hypertension with metabolic syndrome
RU2565407C1 (en) * 2014-12-18 2015-10-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for predicting risk of stage iii hypertensive disease
RU2624480C1 (en) * 2016-12-23 2017-07-04 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for prediction of risk of essential hypertension development based on matrix metal proteinase genes combinations
RU2664428C1 (en) * 2017-12-12 2018-08-17 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Method for predicting risk of developing essential hypertension in women based on genetic factors

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2287158C1 (en) Method for predicting the dvelopment for hypertonic disease according to genetic risk factors
CN107254531B (en) Genetic biomarker for auxiliary diagnosis of early colorectal cancer and application thereof
RU2376372C2 (en) Method for genetic diagnostics of susceptibility to cardiovascular diseases
RU2014101169A (en) Markers of thromboembolic disease
KR20100058421A (en) Transcriptomic biomarkers for individual risk assessment in new onset heart failure
CN111676283B (en) Application of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphism related to occurrence of high altitude pulmonary edema
CN111560428B (en) Application of substance for detecting single nucleotide polymorphism of mitochondrial DNA rs3937033
ES2340459B1 (en) METHOD FOR DIAGNOSING OR DETERMINING THE GENETIC PREDISPOSITION TO DEVELOP HYPERTROPHIC MIOCARDIOPATIA.
RU2458131C1 (en) Test system for mutation detection in human fumarylacetoacetate hydrolase and alpha-1-antitrypsin genes
RU2469096C2 (en) Method for detection of genetic predisposition to developing myocarial infarction in individuals with no clinical implications of ischemic heart disease
Oh et al. Association between common genetic variants of α2A-, α2B-, and α2C-adrenergic receptors and ischemic stroke
EP3359682B1 (en) Method for diagnosing hepatic fibrosis based on bacterial profile and diversity
RU2657821C1 (en) Method for detecting early physiological cardiac malfunction in children in conditions of contamination with phenol
US8445208B2 (en) Multivariate analysis involving genetic polymorphisms related to mediators of inflammatory response for prediction of outcome of critcally ill patients
RU2809444C1 (en) METHOD OF PREDICTING RISK OF DEVELOPING CHRONIC HEART FAILURE IN MEN WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS BASED ON GENOTYPING OF rs4932143 POLYMORPHISM OF ANPEP GENE
RU2825056C1 (en) Method for predicting development of pulmonary hypertension in pleural empyema
US20130109015A1 (en) Single Nucleotide Polymorphisms Associated with Left Ventricular Hypertrophy and Use Thereof
RU2821764C1 (en) METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF DEVELOPING ISCHEMIC HEART DISEASE IN MEN WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS BASED ON GENOTYPING POLYMORPHISM rs16931366 OF ITPR2 GENE
RU2772359C1 (en) Method for predicting the development of various degrees of severity of chronic heart failure
US20150232933A1 (en) Methods for evaluating pathologic conditions using extracellular rna
RU2688208C1 (en) Method for prediction of development of type 2 diabetes mellitus in bashkortostan population
RU2780505C1 (en) Method for predicting the risk of gastric ulcer development based on genetic analysis
RU2828572C1 (en) METHOD FOR PREDICTING RISK OF DEVELOPING DIABETIC DISTAL POLYNEUROPATHY IN PEOPLE OF CENTRAL RUSSIA WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS BASED ON GENOTYPING OF HSF1 GENE rs12542298 POLYMORPHISM
Said et al. Association between AXIN1 gene polymorphisms (wnt signaling pathway gene) and nephropathy induced by diabetes and hypertension in the Egyptian population
JP7101358B1 (en) A method for detecting the risk of developing liver disease and a kit for detecting the risk of developing liver disease.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20070708