RU2278679C1 - Material for osteoplasty and method for production thereof - Google Patents
Material for osteoplasty and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2278679C1 RU2278679C1 RU2005111065/15A RU2005111065A RU2278679C1 RU 2278679 C1 RU2278679 C1 RU 2278679C1 RU 2005111065/15 A RU2005111065/15 A RU 2005111065/15A RU 2005111065 A RU2005111065 A RU 2005111065A RU 2278679 C1 RU2278679 C1 RU 2278679C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- solution
- hours
- treated
- collagen
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а более конкретно к способам получения материалов для остеопластики, которые применяются в качестве остеозамещающих средств при оперативном замещении костных дефектов (любого рода деструкции костной ткани, при удалении из костной ткани кист и опухолей и т.д.), а также в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани и в качестве носителя биологически активных веществ, лекарственных средств и клеток.The invention relates to medicine and the medical industry, and more particularly to methods for producing materials for osteoplasty, which are used as osteoplastic agents for the surgical replacement of bone defects (any kind of destruction of bone tissue, removal of cysts and tumors from bone tissue, etc.) as well as in plastic surgery when restoring the volume of an organ or tissue and as a carrier of biologically active substances, drugs and cells.
Известен способ получения материала для остеопластики, включающий очистку, распиливание костной ткани, обезжиривание, обработку раствором мочевины, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию (Патент РФ 2104703 С1, 20.02.98), который является ближайшим аналогом заявленного изобретения.A known method of obtaining material for osteoplasty, including cleaning, sawing bone tissue, degreasing, processing with a solution of urea, washing, drying, packaging and sterilization (RF Patent 2104703 C1, 02/20/98), which is the closest analogue of the claimed invention.
Недостатком указанного способа является то, что экстракцию неколлагеновых белков мочевиной проводят после удаления жира и частичной деминерализации костной ткани, что приводит к частичному разрушению коллагена и деструкции минерального остова костной ткани. При этом часть жиров и неколлагеновых белков остается, что повышает антигенность получаемого целевого продукта и снижает его биосовместимость, а частичная потеря минеральной части костной ткани после деминерализации значительно уменьшает ее механические и прочностные свойства.The disadvantage of this method is that the extraction of non-collagenic proteins with urea is carried out after removal of fat and partial demineralization of bone tissue, which leads to partial destruction of collagen and destruction of the mineral skeleton of bone tissue. At the same time, part of the fats and non-collagen proteins remains, which increases the antigenicity of the obtained target product and reduces its biocompatibility, and the partial loss of the mineral part of the bone tissue after demineralization significantly reduces its mechanical and strength properties.
Кроме того, процесс приживления данного костного материала для остеопластики, его адаптация к окружающим тканям костного дефекта, пролиферация и миграция клеток в строму материала довольно длительны, так как в зоне дефекта, при заболеваниях и повреждениях соединительной ткани значительно снижается уровень сГАГ, отвечающих за адаптацию материала и адгезию клеток.In addition, the process of engraftment of this bone material for osteoplasty, its adaptation to the surrounding tissues of the bone defect, proliferation and migration of cells into the stroma of the material is quite long, since the level of sGAG responsible for the adaptation of the material is significantly reduced in the defect zone, with diseases and damage to the connective tissue and cell adhesion.
Задачей изобретения в части способа получения материала для остеопластики является повышение качества очистки костной ткани от жиров и неколлагеновых белков с целью снижения его антигенности, повышения биосовместимости, механических и прочностных свойств целевого продукта, а также ускорение процессов репарации и остеоинтеграции, сокращение сроков лечения и реабилитации за счет дополнительного насыщения сГАГ.The objective of the invention in terms of the method of obtaining material for osteoplasty is to improve the quality of cleaning bone tissue from fats and non-collagen proteins in order to reduce its antigenicity, increase biocompatibility, mechanical and strength properties of the target product, as well as accelerate the process of repair and osseointegration, reduce the time of treatment and rehabilitation for due to additional saturation sGAG.
Технический результат, согласно изобретению, достигается в части способа тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, обрабатывают 2% раствором щелочи в течение 10-24 часов при комнатной температуре, отмывают, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 10-24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, обезжиривают в течение 24 часов, в смеси этанол: хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 10-16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают деионизованной водой и насыщают сГАГ от 800 до 1500 мкг/см3, отмывают буфер, высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.The technical result according to the invention is achieved in part of the method by the fact that after cleaning, the bone is sawn into plates with a thickness of 0.1 to 2.0 cm, treated with a 2% alkali solution for 10-24 hours at room temperature, washed, treated with 6 M urea solution for 10-24 hours, then 3% hydrogen peroxide for 10-16 hours, degreased for 24 hours, in a mixture of ethanol: chloroform in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, treated with a mixture of solution 1% ammonia: 1% ethanol in a ratio of 1: 1 for 10-16 hours, change the target to a new one at least 2 times, washed with deionized water and saturated with sGAG from 800 to 1500 μg / cm 3 , washed with buffer, dried, packed and sterilized by radiation.
Новым в способе получения материала для остеопластики с целью сохранности структуры недеминерализованного коллагена костной ткани, снижения антигенности и повышения биосовместимости является проведение обработки подготовленной костной ткани в виде пластин раствором 2% щелочи в течение 10-24 часов, отмывания деионизованной водой, раствором 6 М мочевины, отмывание деионизованной водой и обработки 3% перекисью водорода перед обезжириванием, при этом не происходит разрушения коллагена I и III типа и деструкции минерального остова костной ткани, а также окончательного удаления резидуальных белков и жира после обезжиривания смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 10-16 часов, со сменой раствора на новый не менее 2 раз. Насыщение целевого продукта сГАГ обусловлено их стимулирующим влиянием на процессы остеорепарации и способностью повышать биосовместимость целевого продукта.A new way to obtain material for osteoplasty with the aim of preserving the structure of non-demineralized collagen of bone tissue, reducing antigenicity and increasing biocompatibility is to treat the prepared bone tissue in the form of plates with a solution of 2% alkali for 10-24 hours, wash with deionized water, a solution of 6 M urea, washing with deionized water and treating with 3% hydrogen peroxide before degreasing, without collapse of type I and III collagen and destruction of the mineral skeleton of bone tissue and as well as the final removal of residual protein and fat after degreasing solution with 1% ammonia, 1% ethanol in 1: 1 ratio for 10-16 hours, with a change to a new solution for at least 2 times. The saturation of the target product sGAG due to their stimulating effect on the processes of osteoreparation and the ability to increase the biocompatibility of the target product.
СГАГ являются сложными полисахаридами и входят в состав протеогликанов. В свою очередь, протеогликаны, являясь одним из основных компонентов межклеточного матрикса костной ткани, представляют сложные соединения полисахаридов с белком. Полисахариды, входящие в их состав, это линейные полимеры, построенные из разных дисахаридных субъединиц, образованных уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуроновой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой). Именно эти полисахаридные цепи называются гликозаминогликанами (ГАГ). По меньшей мере один из сахаров в дисахариде имеет отрицательно заряженную карбоксильную или сульфатную группу. Зрелая костная ткань содержит такие (сГАГ), как хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется главным образом активироваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами. Важным признаком изобретения является насыщение костного материала сГАГ.SAGH are complex polysaccharides and are part of proteoglycans. In turn, proteoglycans, being one of the main components of the intercellular matrix of bone tissue, represent complex compounds of polysaccharides with protein. The polysaccharides in their composition are linear polymers constructed from different disaccharide subunits formed by uronic acids (glucuronic, galacturonic and iduronic), N-acetylhexosamines (N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine) and neutral saccharides (galactose and galactose) . These polysaccharide chains are called glycosaminoglycans (GAGs). At least one of the sugars in the disaccharide has a negatively charged carboxyl or sulfate group. Mature bone tissue (sGAG) contains chondroitin-4 and chondroitin-6-sulfates, dermatan sulfate and keratan sulfate. The biosynthesis of proteoglycans in bone tissue is carried out mainly by activated osteoblasts and to a small extent mature osteocytes. An important feature of the invention is the saturation of bone material sGAG.
Экспериментально установлено, что сГАГ способны аффинно связываться с коллагеном, что значительно повышает функциональную активность материала и его биосовместимость.It has been experimentally established that sGAGs are capable of affinity binding to collagen, which significantly increases the functional activity of the material and its biocompatibility.
Сырьем для получения материала для остеопластики может являться губчатая или кортикальная кость человека или позвоночных животных, птиц. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью и высокой устойчивостью к действию коллагеназы и других протеолитических ферментов. Этот вид коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани.The raw material for obtaining material for osteoplasty can be spongy or cortical bone of a person or vertebrates, birds. This tissue mainly consists of collagen type I and III and is characterized by low solubility and high resistance to collagenase and other proteolytic enzymes. This type of collagen is the most common in medical products implanted in tissues.
Сохранность структуры недеминерализованного коллагена костной ткани в основном обусловлена способами его получения.The preservation of the structure of non-demineralized collagen of bone tissue is mainly due to the methods of its preparation.
Способ получения материала для остеопластики, согласно изобретению, осуществляется следующим образом.A method of obtaining material for osteoplasty, according to the invention, is as follows.
Свежая косная ткань механически очищается от остатков мышц, сухожилий и прочее.Fresh inert tissue is mechanically cleansed of the remnants of muscles, tendons and more.
Получение костного материала путем измельчения и обработкой ферментами и перекисью водорода приводит к деструкции костного коллагена как в результате механической и термической обработки, так и результате ферментативного разрушения связей коллагена и минеральной части (Пат. РФ 2155025 от 14.12.1999 г.). При этом снижается возможность эффективного связывания коллагена и биологически активных веществ, таких, например, как сГАГ.Obtaining bone material by grinding and treatment with enzymes and hydrogen peroxide leads to the destruction of bone collagen as a result of mechanical and thermal processing, and as a result of enzymatic destruction of the bonds of collagen and the mineral part (Pat. RF 2155025 from 12/14/1999). This reduces the possibility of effective binding of collagen and biologically active substances, such as, for example, sGAG.
Природный костный минерал является уникальным многокомпонентным соединением солей и их комплексов. Помимо основного минерала гидроксиапатита в состав костного минерала входят карбонаты, фосфаты и микроэлементы.Natural bone mineral is a unique multicomponent compound of salts and their complexes. In addition to the main mineral, hydroxyapatite, the bone mineral also contains carbonates, phosphates, and trace elements.
Полученные искусственным путем гидроксиапатиты только приближены к структуре гидроксиапатита костной ткани и в настоящее время не могут полностью соответствовать природному костному минералу. В большинстве способов при получении костного материала коллаген или деминерализованная кость смешиваются с искусственным гидроксиапатитом или солями кальция (напр., Pat. US 5425770 от 20.06.1995 г. Piez K.et al).Artificially produced hydroxyapatites are only close to the structure of bone hydroxyapatite and currently cannot fully correspond to the natural bone mineral. In most methods, when producing bone material, collagen or demineralized bone is mixed with artificial hydroxyapatite or calcium salts (e.g., Pat. US 5425770 dated 06/20/1995 by Piez K.et al).
Согласно изобретению, в состав материала вводятся сГАГ: их содержание в соединительной ткани с возрастом, при заболеваниях и повреждениях снижается.According to the invention, sGAG is introduced into the composition of the material: their content in connective tissue decreases with age, with diseases and injuries.
Изобретение не исключает возможности применения сГАГ из различных источников, применения их смесей или применения тканеспецифических сГАГ. Так, при заполнении дефектов костной ткани в пародонтологии в состав материала включают сГАГ, выделенные из трахей животных или человека. При заполнении дефектов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии в состав материала могут входить сГАГ из костной ткани или сГАГ, выделенные из роговиц как сами по себе, так и в виде смеси.The invention does not exclude the possibility of using sHAG from various sources, the use of mixtures thereof or the use of tissue-specific sHAGs. So, when filling defects in bone tissue in periodontics, the composition of the material includes sGAG isolated from animal or human trachea. When filling defects in maxillofacial surgery and dentistry, the composition of the material may include sGAG from bone tissue or sGAG isolated from the cornea, either alone or as a mixture.
Применение костной ткани в качестве остеозамещающего материала имеет неоспоримые преимущества перед искусственными и обусловлено ее более высоким сродством с костной тканью по своей структуре и составу. Процессы синтеза и ремоделирования костной ткани как в физиологических условиях, так и при репарации идут значительно быстрее, если материал имеет биологическое происхождение.The use of bone tissue as an osteoplastic material has undeniable advantages over artificial ones and is due to its higher affinity for bone tissue in its structure and composition. The processes of synthesis and remodeling of bone tissue both under physiological conditions and during repair are much faster if the material is of biological origin.
Технология приготовления биосовместимого материала для костной пластики, согласно изобретению, требует начальной механической обработки ткани, когда кость очищается от остатков мягких тканей и прочего.The technology for preparing a biocompatible material for bone grafting, according to the invention, requires initial mechanical processing of the tissue when the bone is cleansed of the remnants of soft tissues and other things.
После механической обработки ткань распиливают на пластины толщиной не менее 0,1 см и не более 2,0 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при последующей обработке данной ткани растворами.After machining, the fabric is sawn into wafers with a thickness of at least 0.1 cm and not more than 2.0 cm, since these sizes are most optimal for subsequent processing of this fabric with solutions.
Минимальный размер пластин толщиной от 0,1 см и максимальный 2,0 см определены нами опытным путем. При увеличении толщины пластины возникают трудности при отмывке таких пластин от применяемых по технологии растворов. При уменьшении толщины пластин имеются серьезные проблемы с сохранением целостности костной ткани в процессе ее обработки.The minimum size of the plates with a thickness of 0.1 cm and a maximum of 2.0 cm was determined by us empirically. With an increase in the plate thickness, difficulties arise when washing such plates from solutions used in technology. When reducing the thickness of the plates, there are serious problems with maintaining the integrity of the bone tissue during its processing.
После нарезки костную ткань промывают и помещают в 2% раствор щелочи, например в раствор гидроксида натрия (NaOH) от 10 до 24 часов.After cutting, the bone tissue is washed and placed in a 2% alkali solution, for example in a solution of sodium hydroxide (NaOH) from 10 to 24 hours.
В нативном состоянии волокна костного коллагена "защищены" от действия щелочи слоем гидроксиапатита и поэтому при обработке щелочью коллагеновые волокна не подвергаются деструкции и сохраняют свою структуру. В то же время щелочь способна эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины, так как обработка ткани щелочью резко снижает антигенные свойства получаемого материала, не оказывает влияния на структуру коллагена и что особенно важно эффективно удаляет вирусы и прионные белки.In the native state, bone collagen fibers are “protected” from the action of alkali by a layer of hydroxyapatite, and therefore, when treated with alkali, collagen fibers do not undergo degradation and retain their structure. At the same time, alkali is capable of effectively destroying non-collagen proteins, proteoglycans and glycoproteins, since treatment of the tissue with alkali sharply reduces the antigenic properties of the resulting material, does not affect the structure of collagen, and it is especially important to effectively remove viruses and prion proteins.
В зависимости от структуры костной ткани и ее толщины время обработки в щелочи может быть различно и варьирует от 10 до 24 часов. Так, например, при толщине пластины из губчатой кости в 0,1 см для обработки достаточно времени 10 часов, а при толщине пластины из губчатой кости 2,0 см или в случае обработки кортикальной кости время обработки увеличивается до 24 часов.Depending on the structure of the bone tissue and its thickness, the processing time in alkali can be different and varies from 10 to 24 hours. So, for example, when the thickness of the cancellous bone plate is 0.1 cm, processing time is sufficient for 10 hours, and when the thickness of the cancellous bone plate is 2.0 cm or in the case of cortical bone treatment, the processing time increases to 24 hours.
При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг костной ткани в раствор выделяется около 7% неколлагеновых белков, что практически равно теоретически рассчитанному количеству (8%) для данного типа ткани (Wendel, M., Sommarin, Y., and Heinegard, D.J. Cell Biol., 1998, 141, 839-847).In this case, the maximum amount of non-collagenic proteins and proteoglycans is removed from the bone tissue. We experimentally found that after 24 hours from 1 kg of bone tissue about 7% of non-collagen proteins are released into the solution, which is almost equal to the theoretically calculated amount (8%) for this type of tissue (Wendel, M., Sommarin, Y., and Heinegard, DJ Cell Biol., 1998, 141, 839-847).
Минеральная составляющая кости не позволяет раствору щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24 часового воздействия. Эта стадия должна проводится при комнатной температуре - 18°С, т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры структура коллагена может разрушаться.The mineral component of the bone does not allow the alkali solution to actively influence the structure of bone collagen even after 24 hours of exposure. This stage should be carried out at room temperature - 18 ° C, because at lower temperatures, the effectiveness of the action is significantly reduced, and with increasing temperature, the collagen structure can be destroyed.
Отмывку костных пластин после обработки их щелочью проводят 5-ю объемами деионизованной воды. Деионизованная вода (полученная например на установке "Millipore") способствует лучшей отмывке материала от неорганических и органических соединений и снижению содержания катионов и анионов солей металлов и органических примесей и фрагментов. Время отмывки 24 часа.Washing the bone plates after treatment with alkali is carried out with 5 volumes of deionized water. Deionized water (obtained for example at the Millipore installation) promotes better washing of the material from inorganic and organic compounds and a decrease in the content of cations and anions of metal salts and organic impurities and fragments. Washing time 24 hours.
Эта операция оказывается достаточной и позволяет отмыть все продукты реакции и удалить саму щелочь.This operation is sufficient and allows you to wash all reaction products and remove the alkali itself.
Окончательное разрушение неколлагеновых белков достигается после обработки костной ткани 6 М раствором мочевины. При этом корректно удаляются оставшиеся в костной ткани белки (1% от теоретически рассчитанного) и протеогликаны, которые обуславливают основные антигенные свойства ткани.The final destruction of non-collagen proteins is achieved after processing the bone tissue with a 6 M urea solution. In this case, the remaining proteins in the bone tissue (1% of theoretically calculated) and proteoglycans, which determine the main antigenic properties of the tissue, are correctly removed.
Обработку костной ткани 6 М раствором мочевины проводят в течение от 10 до 24 часов при комнатной температуре. Мочевина - наиболее эффективный агент, разрушающий белки, находящиеся на поверхности эндостакостной структуры.Bone tissue is treated with a 6 M urea solution for 10 to 24 hours at room temperature. Urea is the most effective agent that destroys proteins located on the surface of the endostasis structure.
Например, губчатую кость с размером пластин 0,1 см обрабатывают в течение 10 часов, так как за это время белковые молекулы, находящиеся на поверхности коллагеновых волокон, полностью разрушаются, а более толстые пластины и кортикальную кость обрабатывают в течение 24 часов, после этого времени белок в смывах не обнаруживается. Обработку материала проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность растворов к местам их воздействия.For example, a cancellous bone with a plate size of 0.1 cm is treated for 10 hours, since during this time the protein molecules located on the surface of collagen fibers are completely destroyed, and thicker plates and cortical bone are treated for 24 hours, after this time no protein is found in the swabs. The processing of the material is carried out with stirring on a magnetic stirrer, which allows for better accessibility of solutions to their places of influence.
После обработки мочевиной пластины отмывают деионизованной водой в 5-ти сменах в течение 24 часов и затем обрабатывают раствором перекиси водорода и продолжают обработку 3% перекисью водорода в течение от 10 до 16 часов.After treatment with urea, the plates are washed with deionized water in 5 shifts for 24 hours and then treated with a solution of hydrogen peroxide and the treatment with 3% hydrogen peroxide is continued for 10 to 16 hours.
Такая обработка, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белков и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, липиды, труднорастворимые соли и т.д. Данный эффект очевиден при обработке пластин с максимальным размером толщины 2,0 см в течение 16 часов и при толщине пластин 0,1 см в течение 10 часов. Для лучшей доступности раствора такую обработку также следует проводить на магнитной мешалке. После воздействия перекиси водорода костные пластинки отмывают деионизованной водой, затем этанолом и высушивают при комнатной температуре.This treatment, firstly, allows you to remove residues of non-collagenic proteins and, secondly, to destroy a number of other compounds, such as pigments, lipids, sparingly soluble salts, etc. This effect is obvious when processing plates with a maximum thickness of 2.0 cm for 16 hours and with a plate thickness of 0.1 cm for 10 hours. For better availability of the solution, such processing should also be carried out on a magnetic stirrer. After exposure to hydrogen peroxide, the bone plates are washed with deionized water, then with ethanol and dried at room temperature.
В отличие от всех известных способов получения костного материала в настоящем способе к обезжириванию приступают только после обработки кости щелочью и мочевиной, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген, благодаря покрывающему практически каждое костное волокно защитному слою гидроксиапатита, остается практически не измененным.In contrast to all known methods for producing bone material, in the present method, degreasing is started only after treatment of the bone with alkali and urea, since the main antigens have already been removed from the obtained non-calcined bone, and the bone collagen, due to the protective layer of hydroxyapatite covering almost every bone fiber, remains practically non-existent. modified.
В костной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В обработанных ферментом костных пластинах липиды находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления липидов в способ введена обработка костных пластин в смеси хлороформа и этанола в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, на стадии, когда основная строма материала уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят 24 часа, что определяется по количеству содержания липидов на 1 г ткани по сухому весу. Материал обрабатывают в смеси не менее 24 часов, поскольку за это время липиды выходят из плотной части ткани (кортикальная кость).Bone tissue contains a significant amount of lipids and their compounds with proteins and carbohydrates. In the bone plates treated with the enzyme, lipids are both in a free state and in the form of compounds with sugars — lipopolysaccharides, which are active antigens and can cause various inflammatory complications. Namely, to remove lipids, the method includes processing bone plates in a mixture of chloroform and ethanol in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, at the stage when the main stroma of the material is already cleared of its other components. Processing in the mixture is carried out 24 hours, which is determined by the amount of lipid content per 1 g of tissue by dry weight. The material is treated in a mixture for at least 24 hours, since during this time the lipids leave the dense part of the tissue (cortical bone).
Для удаления резидуальных белков и других органических остатков в способ обработки введена обработка пластин раствором смеси 1% аммиака: 1% этанола в соотношении 1:1 с временем обработки от 10 до 16 часов. Время обработки обусловлено толщиной пластин.To remove residual proteins and other organic residues, the processing method includes processing the plates with a solution of a mixture of 1% ammonia: 1% ethanol in a ratio of 1: 1 with a processing time of 10 to 16 hours. Processing time is determined by the thickness of the plates.
При толщине пластин 0,1 см время обработки составляет 10 часов, что оптимально для выхода возможного остатка белка из пластин. При толщине пластин в 2,0 см прекращение выхода резидуальных белков наблюдали через 16 часов.With a plate thickness of 0.1 cm, the processing time is 10 hours, which is optimal for the release of a possible protein residue from the plates. With a plate thickness of 2.0 cm, the termination of the yield of residual proteins was observed after 16 hours.
Данный раствор выбран экспериментально и специально для удаления резидуальных белков и является уникальным для их удаления из любой соединительной ткани. Ранее показано, что наиболее эффективным способом такие остаточные белки и другие примеси эффективно удаляются низкоконцентрированными растворами. Примером такого раствора является смесь 1% аммиака и 1% этанола. После 2-кратной обработки смесью аммиака и этанола в тот же свежий раствор добавляют порошок сГАГ в концентрации от 800 до 1500 мкг/см3.This solution was chosen experimentally and specifically for the removal of residual proteins and is unique for their removal from any connective tissue. It was previously shown that in the most efficient way, such residual proteins and other impurities are effectively removed by low concentrated solutions. An example of such a solution is a mixture of 1% ammonia and 1% ethanol. After a 2-fold treatment with a mixture of ammonia and ethanol, sGAG powder is added to the same fresh solution at a concentration of from 800 to 1500 μg / cm 3 .
СГАГ получают по способу, описанному в Патенте РФ №2162331, из различных источников - трахеи, кости или роговицы. Насыщение ведут в течение 24 часов.SAGH is obtained by the method described in the Patent of the Russian Federation No. 2162331, from various sources - trachea, bone or cornea. Saturation is carried out within 24 hours.
Насыщение пластин из костной ткани сГАГ проводят на магнитной мешалке для их лучшей доступности к строме костного коллагена.Saturation of bone tissue plates with sGAG is carried out on a magnetic stirrer for their better accessibility to bone collagen stroma.
Концентрация сГАГ менее 800 мкг/см3 материала не оказывает выраженного стимулирующего эффекта на процесс репарации костного дефекта, а концентрация более 1500 мкг/г материала может вызывать аллергическую реакцию.The concentration of sGAG less than 800 μg / cm 3 of material does not have a pronounced stimulating effect on the repair process of the bone defect, and a concentration of more than 1500 μg / g of material can cause an allergic reaction.
Насыщение пластин сГАГ проводят при комнатной температуре. Время насыщения определяется опытным путем по исчезновению сГАГ из раствора. Обычно это время не превышает 24 часов.Saturation of the sGAG plates is carried out at room temperature. The saturation time is determined empirically by the disappearance of sGAG from the solution. Usually this time does not exceed 24 hours.
После процесса насыщения раствор сливают, промывают водой деионизованной, а пластины высушивают, нарезают на куски необходимого размера или готовят на его основе гранулы, гели или крошку. После этого материал фасуют и стерилизуют.After the saturation process, the solution is drained, washed with deionized water, and the plates are dried, cut into pieces of the required size, or granules, gels or crumbs are prepared on its basis. After that, the material is packed and sterilized.
Краткая технология получения материала.Brief technology for obtaining material.
Прошедшую ветеринарный контроль кость свиньи, очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см и помещают в раствор 2% щелочи при комнатной температуре в течение 24 часов, отмывают, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 16 часов, обезжиривают в течение 24 часов в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз и насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см3 в течение 24 часов, высушивают, нарезают как необходимо, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.The veterinary control of the pig’s bone is cleaned of muscles and tendons, sawn into 2.0 cm thick plates and placed in a solution of 2% alkali at room temperature for 24 hours, washed, treated with 6 M urea solution for 24 hours, then 3% hydrogen peroxide for 16 hours, degreased for 24 hours in a mixture of ethanol and chloroform in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, treated with a mixture of a solution of 1% ammonia: 1% ethanol in a ratio of 1: 1 for 16 hours, change the solution to a new one at least 2 times and saturate the sul by flated glycosaminoglycans from 800 to 1500 μg / cm 3 for 24 hours, dried, cut as necessary, Packed and sterilized by radiation.
Приведенные выше действия приводят к сохранности структуры коллагена и минерального компонента кости, а также к снижению антигенности полученного материала.The above actions lead to the preservation of the structure of collagen and the mineral component of the bone, as well as to a decrease in the antigenicity of the obtained material.
Технический результат в части материала для остеопластики достигается тем, что он содержит недеминерализованный коллаген костной ткани, сГАГ и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:The technical result in terms of material for osteoplasty is achieved in that it contains non-demineralized collagen of bone tissue, sGAG and water in the following ratio of components, wt.%:
Материал для остеопластики, согласно изобретению, содержит недеминерализованный коллаген из костной ткани от 97 до 99%, что является оптимальным для замещения костного дефекта и соответствует составу природной костной ткани.The material for osteoplasty according to the invention contains non-demineralized collagen from bone tissue from 97 to 99%, which is optimal for replacing a bone defect and corresponds to the composition of natural bone tissue.
Материал для остеопластики, согласно изобретению, насыщен сГАГ от 0,08 до 1,5%, что является оптимальным для достижения стимулирующего эффекта.The material for osteoplasty according to the invention is saturated with sHAG from 0.08 to 1.5%, which is optimal to achieve a stimulating effect.
При концентрации менее 0,08% стимулирующий и защитный эффект будет минимальным, а концентрация выше 1,5% может вызвать нежелательные побочные эффекты.At a concentration of less than 0.08%, the stimulating and protective effect will be minimal, and a concentration above 1.5% can cause unwanted side effects.
Материал для остеопластики свободен от белков, протеогликанов и жиров, что делает его неантигенным и биосовместимым.The material for osteoplasty is free of proteins, proteoglycans and fats, which makes it non-antigenic and biocompatible.
Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики оценки его характеристик, принятые для данного типа материалов.The receipt of the material is controlled at each stage of processing and includes the basic methods for evaluating its characteristics adopted for this type of material.
Выход белка по стадиям обработки определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах методом определения оксипролина по Кьельдалю.The protein yield from the processing steps was determined by the Lowry pharmacopoeia method spectroscopically at a wavelength of 400 nm and the presence of collagen residues in the swabs using the Kjeldahl method for determining hydroxyproline.
Отсутствие протеогликанов на стадии после обработки перекисью водорода определяли спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.The absence of proteoglycans in the stage after treatment with hydrogen peroxide was determined spectrophotometrically by staining with 1.9-dimethylene blue at a wavelength of 535 nm according to the Farndel method.
Контроль на липиды после обезжиривания делали по окраске Суданом.Lipid control after degreasing was done by Sudan staining.
После высушивания и стерилизации ставили контрольные измерения на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом.After drying and sterilization, control measurements were taken on the content of non-collagen proteins in the material compared to the prototype.
Сохранность структуры стромы костного материала определяли путем исследования гистологических срезов, электронно-микроскопически и методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костной ткани и отдельные волокна коллагена имеют типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. Минеральный компонент расположен над поверхностью коллагеновых волокон в виде сферических образований вдоль их длины.The preservation of the structure of the stroma of bone material was determined by examining histological sections, electron microscopy and scanning microscopy. Using these methods, it was found that the porous-fibrous structure of bone tissue and individual collagen fibers have a typical appearance without any changes or disturbances. The mineral component is located above the surface of collagen fibers in the form of spherical formations along their length.
Снижение антигенности материала доказывается иммунологическим методом путем иммунизации животных - крыс породы Вистар (10 животных опытных, 10 контрольных). Из опытных образцов материала, изготовленного по предлагаемому способу, готовили водно-солевые экстракты, которые смешивали с неполным адьювантом Фрейнда. Аналогичные экстракты готовили и из контрольных образцов, изготовленных по способу, описанному в прототипе.The decrease in antigenicity of the material is proved by the immunological method by immunization of animals - Wistar rats (10 experimental animals, 10 control). From the experimental samples of the material manufactured by the proposed method, water-salt extracts were prepared, which were mixed with Freund's incomplete adjuvant. Similar extracts were prepared from control samples made by the method described in the prototype.
Животных иммунизировали по схеме, описанной в "Лабораторная иммунология". М. 1980. Через 1,5 мес. животных выводили из эксперимента и определяли титр антител методом преципитации и методом Кунса-Уэллера путем непрямой иммунофлюоресценции на флюоромикроскопе Оптон, для чего материал резали на криостате и помещали срезы на стекло, наносили антисыворотку в различных разведениях и меченные флюоресцеином антикроличьи Ig овцы, инкубировали в течение 15-30 мин и тщательно отмывали фосфатным буфером, заключали в глицерин и просматривали в микроскопе, через отсекающий фильтр при длине волны 440 нм.Animals were immunized according to the scheme described in Laboratory Immunology. M. 1980. After 1.5 months. animals were removed from the experiment and the antibody titer was determined by the precipitation method and the Koons-Weller method by indirect immunofluorescence on an Opton fluoromicroscope, for which the material was cut on a cryostat and placed on glass, the antiserum was applied in various dilutions and the rabbit Ig labeled with fluorescein was incubated for 15 sheep, incubated 15 -30 min and washed thoroughly with phosphate buffer, enclosed in glycerol and looked through a microscope through a cut-off filter at a wavelength of 440 nm.
Результаты этих исследований приведены в таблице.The results of these studies are shown in the table.
Таким образом видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала и таким образом повысить его биосовместимость и уменьшить число послеоперационных осложнений при применении данного материала в хирургической практике.Thus, it is seen that the proposed method of processing tissue allows to reduce the antigenicity of the material and thus increase its biocompatibility and reduce the number of postoperative complications when using this material in surgical practice.
При использовании материала для остеопластики, согласно изобретению, ускоряются процессы репарации и остеоинтеграции, обеспечивается сокращение сроков на всех этапах лечения и реабилитации пациентов. Материал для остеопластики не антигенен. стерилен и прост в использовании. Материал является естественным матриксом для ориентированной миграции клеток, совместим с большинством биологически активных и лекарственных средств. Применение биоматериала для остеопластики, согласно изобретению, значительно снижает число осложнений особенно при длительном нахождении такого имплантата в организме.When using material for osteoplasty, according to the invention, the processes of repair and osseointegration are accelerated, the time is reduced at all stages of treatment and rehabilitation of patients. The material for osteoplasty is not antigenic. sterile and easy to use. The material is a natural matrix for oriented cell migration, compatible with most biologically active and medicinal products. The use of biomaterial for osteoplasty, according to the invention, significantly reduces the number of complications, especially with prolonged exposure of such an implant in the body.
Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.For a better understanding of the essence of the invention is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1.Example 1
Донорскую кость человека, прошедшую необходимые контрольные анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,1 см, помещают в 2% раствор щелочи на 10 часов при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 10 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 10 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 10 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз и насыщают сГАГ 800 мкг/см3, отмывают высушивают, нарезают на блоки или полоски, фасуют и стерилизуют радиационным облучением при следующем соотношении компонентов, мас.%: недеминерализованный коллаген из донорской костной ткани человека - 97%, сГАГ - 0,08% и остальное - вода деионизованная.The human donor bone, which passed the necessary control analyzes, is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into 0.1 cm thick plates, placed in a 2% alkali solution for 10 hours at room temperature, washed with 5 volumes of deionized water for 10 hours, treated with 6 M solution of urea for 10 hours, washed with 5 volumes of deionized water for 24 hours, then 3% hydrogen peroxide for 10 hours, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in the ratio 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, treated laugh Sue 1% ammonia and 1% ethanol in a ratio of 1: 1 for 10 hours, change the solution to a new one at least 2 times and saturate sGAG 800 μg / cm 3 , wash, dry, cut into blocks or strips, pack and sterilize with radiation when the following ratio of components, wt.%: non-demineralized collagen from human donor bone tissue - 97%, sGAG - 0.08% and the rest is deionized water.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть носителем клеток (стволовых, эмбриональных и других видов клеток).The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology, and maxillofacial surgery. For experimental and scientific purposes, the material can be saturated with biologically active substances, and can also be a carrier of cells (stem, embryonic and other types of cells).
Пример 2.Example 2
Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0 см, помещают в 2% раствор щелочи на 1 6 часов при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 18 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 16 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 14 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 12 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, насыщают сГАГ 1000 мкг/см3, отмывают, высушивают, нарезают на блоки, полоски, готовят крошку или гранулируют, фасуют и стерилизуют радиационным облучением, при следующем соотношении компонентов, мас.%: недеминерализованный коллаген из губчатой кости свиньи - 98%, сГАГ - 1,2% и остальное - вода деионизованная.The pig’s spongy bone that has passed the necessary veterinary control is mechanically cleaned of muscles and tendons, cut into 1.0 cm thick plates, placed in a 2% alkali solution for 1-6 hours at room temperature, washed with 5 volumes of deionized water for 18 hours, treated with 6 M urea solution for 16 hours, washed with 5 volumes of deionized water for 24 hours, then 3% hydrogen peroxide for 14 hours, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in the ratio 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, treat the mixture w 1% ammonia and 1% ethanol at a ratio of 1: 1 for 12 hours and changing the solution to a new at least 2 times, saturated sGAG 1000 mcg / cm 3, washed, dried, cut into block, strip, preparing a crumb or granulated, Packed and sterilized by radiation exposure, with the following ratio of components, wt.%: non-demineralized collagen from pig spongy bone - 98%, sGAG - 1.2% and the rest is deionized water.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии. При необходимости материал может быть использован в качестве основы при изготовлении изделий для офтальмохирургии. В экспериментальных и научных целях костный материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть использован в качестве носителя клеток.The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and maxillofacial surgery. If necessary, the material can be used as a basis in the manufacture of products for ophthalmic surgery. For experimental and scientific purposes, bone material can be saturated with biologically active substances, and can also be used as a carrier of cells.
Пример 3.Example 3
Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см, помещают в 2% раствор щелочи на 24 часа при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 24 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 16 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, насыщают сГАГ 1500 мкг/см3, отмывают, высушивают разрезают на блоки, фасуют и стерилизуют радиационным облучением, при следующем соотношении, мас.%: недеминерализованный коллаген кортикальной кости свиньи - 99%, сГАГ - 1,5% и вода деионизованная - остальное.The pig that has passed the necessary veterinary control is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into 2.0 cm thick plates, placed in a 2% alkali solution for 24 hours at room temperature, washed with 5 volumes of deionized water for 24 hours, treated with a 6 M solution urea for 24 hours, washed with 5 volumes of deionized water for 24 hours, then 3% hydrogen peroxide for 16 hours, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in the ratio 1: 2, changing the solution to a new one at least 2 times, treated with cm with 1% ammonia and 1% ethanol in a ratio of 1: 1 for 16 hours, change the solution to a new one at least 2 times, saturate the sGAG with 1500 μg / cm 3 , wash, dry, cut into blocks, pack and sterilize with radiation, in the next ratio, wt.%: non-demineralized collagen of pig cortical bone - 99%, sGAG - 1.5% and deionized water - the rest.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии, травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть носителем клеток (стволовых, эмтриональных и других видов клеток).The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics, traumatology and maxillofacial surgery. For experimental and scientific purposes, the material can be saturated with biologically active substances, and can also be a carrier of cells (stem, emtrionny and other types of cells).
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005111065/15A RU2278679C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Material for osteoplasty and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005111065/15A RU2278679C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Material for osteoplasty and method for production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2278679C1 true RU2278679C1 (en) | 2006-06-27 |
Family
ID=36714620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005111065/15A RU2278679C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Material for osteoplasty and method for production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2278679C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10821206B2 (en) | 2015-11-04 | 2020-11-03 | Ilaya Usa Corporation | Human cell-based medicinal products and methods for osteoreparation |
| CN115945442A (en) * | 2022-12-19 | 2023-04-11 | 南京龙德生物科技有限公司 | Hydrogen peroxide soaking and flushing process for bone tissues |
-
2005
- 2005-04-15 RU RU2005111065/15A patent/RU2278679C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10821206B2 (en) | 2015-11-04 | 2020-11-03 | Ilaya Usa Corporation | Human cell-based medicinal products and methods for osteoreparation |
| CN115945442A (en) * | 2022-12-19 | 2023-04-11 | 南京龙德生物科技有限公司 | Hydrogen peroxide soaking and flushing process for bone tissues |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0771206B1 (en) | Hard tissue stimulating agent | |
| JP3643381B2 (en) | Resorbable extracellular matrix for cartilage tissue reconstruction | |
| JP3101739B2 (en) | Method for producing a material for osteoplasty from natural bone tissue and material obtained thereby | |
| JP6328861B2 (en) | Collagen sponge | |
| US8241673B2 (en) | Method for producing biomaterials from bone tissue and material used for osteoplasty and tissue engineering | |
| RU2342162C1 (en) | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method | |
| PT1856272E (en) | Manufactured product using and collagen solution manufacturing method and collagen separation method of animal tissue | |
| KR101918908B1 (en) | Absorbent crosslinked form stable membrane | |
| JP7538037B2 (en) | Dry Implant Compositions and Aqueous Injectable Implant Formulations | |
| US20130220365A1 (en) | Method for Producing a Bone Transplant Material, and Bone Transplant Material Produced by Same | |
| RU2278679C1 (en) | Material for osteoplasty and method for production thereof | |
| RU2721604C1 (en) | Method for producing osteoplastic biomaterials from bone tissue | |
| JP7467509B2 (en) | Injectable aqueous implant formulations containing ascorbic acid | |
| RU2278655C1 (en) | Method for production of biocompatible dental material | |
| KR101455837B1 (en) | Process for preparing resorbable barrier membrane for guided tissue regeneration | |
| DE2625289A1 (en) | PROCESS FOR MANUFACTURING A STERILE COLLAGEN PRODUCT WITH FELT OR. FLEECE-LIKE FIBER STRUCTURE | |
| CN110279892A (en) | A kind of bone renovating material and its preparation method and application | |
| RU2273489C1 (en) | Method for obtaining collagen from bone tissue | |
| WO1996012509A1 (en) | Process for inactivating and eliminating the organic matrix from animal bone for heterotopic xenografts | |
| RU2456003C1 (en) | Method of producing demineralised crushed bone matrix | |
| RU2234289C2 (en) | Method for preparing biomaterial for application in ophthalmology | |
| RU2197974C1 (en) | Biocompositional material used in substituting osseous defects | |
| CN111359020A (en) | Soft tissue repair material and preparation method and application thereof | |
| RU2708639C1 (en) | Technology of making an implant for bone tissue replacement | |
| BRPI1102869A2 (en) | Method of using the intraarticular bacterial cellulose membrane on a patellar surface |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070416 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20100810 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110416 |