RU2278655C1 - Method for production of biocompatible dental material - Google Patents
Method for production of biocompatible dental material Download PDFInfo
- Publication number
- RU2278655C1 RU2278655C1 RU2005111015/15A RU2005111015A RU2278655C1 RU 2278655 C1 RU2278655 C1 RU 2278655C1 RU 2005111015/15 A RU2005111015/15 A RU 2005111015/15A RU 2005111015 A RU2005111015 A RU 2005111015A RU 2278655 C1 RU2278655 C1 RU 2278655C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- solution
- collagen
- washed
- treated
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а более конкретно к стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано для изготовления биоматериалов, которые применяются в качестве остеозамещающих средств при оперативном замещении костных дефектов (любого рода деструкция костной ткани, при удалении из костной ткани кист и опухолей и т.д.), а также в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани и в качестве носителя биологически активных веществ, лекарственных средств.The invention relates to medicine, and more particularly to dentistry and maxillofacial surgery, and can be used for the manufacture of biomaterials, which are used as osteoplastic agents for the surgical replacement of bone defects (any kind of destruction of bone tissue, when cysts and tumors are removed from bone tissue etc.), as well as in plastic surgery when restoring the volume of an organ or tissue and as a carrier of biologically active substances, drugs.
Наиболее близким по решению технической задачи является способ получения биосовместимого материала для стоматологии, включающий механическую очистку кости, обезжиривание, отмывание, измельчение кости до костной крошки размером от 7 до 700 мкм, обработку перекисью водорода, отмывание, высушивание, смешивание с коллагеном и сульфатированными гликозаминогликанами (RU 2155025 С1, 1999).The closest to solving the technical problem is a method for producing a biocompatible material for dentistry, including mechanical cleaning of the bone, degreasing, washing, grinding the bone to bone chips with a size of 7 to 700 μm, processing with hydrogen peroxide, washing, drying, mixing with collagen and sulfated glycosaminoglycans ( RU 2155025 C1, 1999).
Недостатком указанного способа является то, что экстракцию неколлагеновых белков проводят после ферментной обработки и удаления жира и температурной обработки, что приводит к денатурации и разрушению коллагена костной ткани. При этом часть фермента и неколлагеновых белков остается в материале, что повышает антигенность получаемого продукта и снижает его биосовместимость. Потеря минеральной части костной ткани при кипячении значительно уменьшает ее механические свойства (прочность).The disadvantage of this method is that the extraction of non-collagen proteins is carried out after enzymatic treatment and removal of fat and heat treatment, which leads to denaturation and destruction of collagen of bone tissue. At the same time, part of the enzyme and non-collagen proteins remains in the material, which increases the antigenicity of the resulting product and reduces its biocompatibility. The loss of the mineral part of the bone tissue during boiling significantly reduces its mechanical properties (strength).
Технической задачей изобретения является создание способа получения биосовместимого материала для стоматологии с целью повышения степени очистки костной ткани от неколлагеновых белков, липидов, протеогликанов и солей, сохранности структуры костного коллагена и минерального компонента костной ткани, что позволяет заполнять и удерживать объем костного дефекта, минерального компонента костной ткани, повышение биосовместимости и стимуляции остеорапарации за счет насыщения ее сульфатированными гликозаминогликанами (сГАГ).An object of the invention is to provide a method for producing a biocompatible material for dentistry in order to increase the degree of purification of bone tissue from non-collagen proteins, lipids, proteoglycans and salts, preserving the structure of bone collagen and the mineral component of bone tissue, which allows filling and maintaining the volume of the bone defect, the mineral component of bone tissue, increased biocompatibility and stimulation of osteoraparation due to its saturation with sulfated glycosaminoglycans (sGAG).
Технический результат согласно изобретению достигается тем, что что до обезжиривания кость размельчают до костной крошки размером от 70 до 400 мкм, обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи в течение 10-24 часов при комнатной температуре, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 часов, затем обрабатывают в смеси раствора 1% аммиака: 1% этанола в течение 10-16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают, обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, отмывают, обезжиривают в смеси этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают крошку и смешивают ее с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см3, при следующем соотношении компонентов мас.%:The technical result according to the invention is achieved by the fact that before degreasing, the bone is crushed to bone chips from 70 to 400 microns in size, treated with a solution of 0.4 N. alkali for 10-24 hours at room temperature, washed with deionized water, re-treated with a solution of 0.4 N. alkalis at room temperature for 10-24 hours, then treated in a mixture of a solution of 1% ammonia: 1% ethanol for 10-16 hours, change the solution to a new one at least 2 times, washed, treated with 3% hydrogen peroxide for 10- 16 hours, washed, degreased in a mixture of ethanol: chloroform in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least two times, washed with deionized water, dried crumbs and mixed it with a collagen solution isolated from sclera of farm animals in a ratio of 2: 3 volume parts saturated with sulfated gly by cosaminoglycans from 800 to 1500 μg / cm 3 , with the following ratio of components wt.%:
Сырьем для получения биосовместимого материала для стоматологии может являться губчатая или кортикальная кость человека и позвоночных животных. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью и высокой устойчивостью к действию коллагеназы. Этот вид коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани. Входящий в состав костной ткани минеральный компонент - гидроксиапатит - инкрустирует коллагеновые волокна и придает костной ткани уникальные прочностные характеристики. Полученные искусственным путем гидроксиапатиты только приближены к структуре гидроксиапатита костной ткани и в настоящее время не могут полностью соответствовать природному костному минералу.Raw materials for biocompatible material for dentistry can be spongy or cortical bone of humans and vertebrates. This tissue mainly consists of collagen type I and III and is characterized by low solubility and high resistance to collagenase. This type of collagen is the most common in medical products implanted in tissues. The mineral component that is part of the bone tissue - hydroxyapatite - encrusts collagen fibers and gives the bone tissue unique strength characteristics. Artificially produced hydroxyapatites are only close to the structure of bone hydroxyapatite and currently cannot fully correspond to the natural bone mineral.
В качестве источника растворимого коллагена используют коллаген типа I, выделенный из склеры с/х животных, постольку поскольку он эффективно связывает недеминерализованный костный коллаген в целевом продукте.As a source of soluble collagen, type I collagen isolated from animal sclera is used, insofar as it effectively binds non-demineralized bone collagen in the target product.
Существенным признаком изобретения является насыщение материала сГАГ.An essential feature of the invention is the saturation of the sGAG material.
Введение в материал сГАГ обусловлено их стимулирующим влиянием на процессы остеорепарации и способностью повышать биосовместимость биоматериалов (Иванов С.Ю., Ларионов Е.В. Новое в стоматологии. М. 1999. вып.2., Биосовместимость. М., 1999, стр.295-312).The introduction of sGAG into the material is due to their stimulating effect on the processes of osteoreparation and the ability to increase the biocompatibility of biomaterials (Ivanov S.Yu., Larionov E.V. New in dentistry. M. 1999. issue 2., Biocompatibility. M., 1999, p. 295-312).
СГАГ являются сложными полисахаридами и входят в состав протеогликанов. В свою очередь протеогликаны, являясь одним из основных компонентов межклеточного матрикса костной ткани, представляют из себя сложные соединения полисахаридов с белком. Полисахариды, входящие в их состав, - это линейные полимеры построенные из разных дисахаридных субъединиц, образованных уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуроновой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой). Именно эти полисахаридные цепи называются гликозаминогликанами (ГАГ). По меньшей мере один из сахаров в дисахариде имеет отрицательно заряженную карбоксильную или сульфатную группу. Зрелая костная ткань содержит в основном сульфатарованные гликозаминогликаны (сГАГ), такие как хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется, главным образом, активироваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами.SAGH are complex polysaccharides and are part of proteoglycans. In turn, proteoglycans, being one of the main components of the intercellular matrix of bone tissue, are complex compounds of polysaccharides with protein. The polysaccharides in their composition are linear polymers built from different disaccharide subunits formed by uronic acids (glucuronic, galacturonic and iduronic), N-acetylhexosamines (N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine) and neutral saccharides (galactose and galactose) . These polysaccharide chains are called glycosaminoglycans (GAGs). At least one of the sugars in the disaccharide has a negatively charged carboxyl or sulfate group. Mature bone tissue contains mainly sulfated glycosaminoglycans (sGAGs) such as chondroitin-4 and chondroitin-6-sulfates, dermatan sulfate and keratan sulfate. The biosynthesis of proteoglycans in bone tissue is carried out mainly by activated osteoblasts and, to a small extent, mature osteocytes.
Согласно изобретению в состав материала могут вводится сГАГ, выделенные, например, из глаз свиней, трахеи или тканеспецифические костные сГАГ, постольку поскольку их качественный и количественный состав в разных биологических тканях различен (Methods in Molecular Biology, Vol.171, Proteoglycan Protocols. lozzo, R.V., ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001), а функциональная роль в различных отделах соединительной ткани сходна. Экспериментально было установлено, что сГАГ способны аффинно связываться с коллагеном, что значительно повышает функциональную активность материала и его биосовместимость (Scott, J.E. Proteoglycan-fibrillar collagen interactions. Biochem. J; 1988, 252, 313-323).According to the invention, sGAG isolated, for example, from the eyes of pigs, trachea or tissue-specific bone sGAGs can be introduced into the material, insofar as their qualitative and quantitative composition in different biological tissues is different (Methods in Molecular Biology, Vol. 171, Proteoglycan Protocols. Lozzo, RV, ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001), and the functional role in different parts of the connective tissue is similar. It has been experimentally established that sGAGs are capable of affinity binding to collagen, which significantly increases the functional activity of the material and its biocompatibility (Scott, J.E. Proteoglycan-fibrillar collagen interactions. Biochem. J; 1988, 252, 313-323).
Для насыщения костной крошки и связывания коллагена, выделенного из склеры с/х животных, могут быть применены сГАГ из различных источников, их смеси или тканеспецифические костные сГАГ. Так при заполнения дефектов костной ткани в пародонтологии в состав материала включают сГАГ, выделенные из трахей животных или человека. При заполнении дефектов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии в состав материала могут входить сГАГ из костной ткани или сГАГ, выделенные из роговиц как сами по себе, так и в виде смеси.To saturate bone chips and to bind collagen isolated from the sclera of agricultural animals, sGAG from various sources, their mixtures or tissue-specific bone sGAGs can be used. So when filling defects in bone tissue in periodontology, the composition of the material includes sGAG isolated from trachea of animals or humans. When filling defects in maxillofacial surgery and dentistry, the composition of the material may include sGAG from bone tissue or sGAG isolated from the cornea, either alone or as a mixture.
Для осуществления способа берется свежая костная ткань, которая механически очищается от остатков мышц, сухожилий и крови.To implement the method, fresh bone tissue is taken, which is mechanically cleansed of the remnants of muscles, tendons and blood.
После механической обработки ткань сразу распиливают до крошки пилой с определенной толщиной и числом зубьев. Размер крошки предпочтительно от 70 до 400 мкм, поскольку эти размеры являются оптимальными при последующей обработке данной ткани растворами и получении конечного продукта.After machining, the fabric is immediately sawn to crumbs with a saw with a certain thickness and number of teeth. The size of the crumb is preferably from 70 to 400 microns, since these sizes are optimal during subsequent processing of this fabric with solutions and obtaining the final product.
Минимальный размер крошки определен в 70 мкм, так как в этом случае она не вымывается из костного дефекта, а при размере более 400 мкм затрудняется получение конечного продукта.The minimum size of the crumb is determined to be 70 μm, since in this case it is not washed out of the bone defect, and with a size of more than 400 μm, the final product is difficult to obtain.
После нарезки крошку помещают в 0,4 н. раствор щелочи, например в раствор гидроксида натрия (NaOH) от 10 до 24 часов при комнатной температуре.After cutting, the crumb is placed in 0.4 N. alkali solution, for example in a solution of sodium hydroxide (NaOH) from 10 to 24 hours at room temperature.
В нативном состоянии волокна костного коллагена " защищены " от действия щелочи слоем гидроксиапатита, и поэтому при обработке щелочью коллагеновые волокна не подвергаются деструкции и сохраняют свою структуру. В то же время щелочь способна эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины. Показано, что обработка ткани щелочью резко снижает антигенные свойства получаемого материала, не оказывает влияния на структуру коллагена и, что особенно важно, эффективно удаляет вирусы и прионные белки.In the native state, bone collagen fibers are "protected" from alkali by a layer of hydroxyapatite, and therefore, when treated with alkali, collagen fibers do not undergo degradation and retain their structure. At the same time, alkali is able to effectively destroy non-collagen proteins, proteoglycans and glycoproteins. It has been shown that treatment of tissue with alkali sharply reduces the antigenic properties of the resulting material, does not affect the structure of collagen and, most importantly, effectively removes viruses and prion proteins.
В зависимости от структуры костной крошки и ее размеров время обработки в щелочи может быть различно и варьирует от 10 до 24 часов. Так для крошки из губчатой кости достаточно обработки в течение 10 часов, а при обработке кортикальной кости время обработки увеличивается до 24 часов.Depending on the structure of the bone crumb and its size, the processing time in alkali can be different and varies from 10 to 24 hours. So for spongy bone crumbs, processing for 10 hours is enough, and when processing cortical bone, the processing time increases to 24 hours.
При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг крошки в раствор выделяется около 7% неколлагеновых белков, что практически равно теоретически рассчитанному количеству (8%) для данного типа ткани (Wendel, М., Sommarin, Y., and Heinegerd, D.J. Cell Biol., 1998, 141, 839-847).In this case, the maximum amount of non-collagenic proteins and proteoglycans is removed from the bone tissue. We experimentally found that after 24 hours from 1 kg of crumbs about 7% of non-collagen proteins are released into the solution, which is almost equal to the theoretically calculated amount (8%) for this type of tissue (Wendel, M., Sommarin, Y., and Heinegerd, DJ Cell Biol., 1998, 141, 839-847).
Минеральная составляющая кости не позволяет раствору щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24-часового воздействия. Эта стадия должна проводится при комнатной температуре, т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры структура коллагена может разрушаться.The mineral component of the bone does not allow the alkaline solution to actively influence the structure of bone collagen even after 24-hour exposure. This stage should be carried out at room temperature, as at lower temperatures, the effectiveness of the action is significantly reduced, and with increasing temperature, the collagen structure can be destroyed.
Отмывку крошки после обработки щелочью проводят 5-ю объемами деионизованной воды. Деионизованная вода (полученная, например, на установке "Millipore") способствует лучшей отмывке материала от неорганических и органических соединений и снижению содержания катионов и анионов солей металлов и органических примесей и фрагментов.Washing the chips after treatment with alkali is carried out with 5 volumes of deionized water. Deionized water (obtained, for example, at the Millipore installation) promotes better washing of the material from inorganic and organic compounds and a decrease in the content of cations and anions of metal salts and organic impurities and fragments.
Эта операция оказывается достаточной и позволяет отмыть все продукты реакции и удалить саму щелочь.This operation is sufficient and allows you to wash all reaction products and remove the alkali itself.
Окончательное разрушение неколлагеновых белков достигается после повторной обработки 0,4 н. щелочью при комнатной температуре. При этом удаляются оставшиеся в костной ткани белки (1% от теоретически рассчитанного) и протеогликаны, которые обуславливают основные антигенные свойства ткани. После обработки щелочью крошку отмывают деионизованной водой в течение ночи.The final destruction of non-collagen proteins is achieved after repeated processing of 0.4 N. alkali at room temperature. In this case, the remaining proteins in the bone tissue (1% of theoretically calculated) and proteoglycans, which determine the main antigenic properties of the tissue, are removed. After treatment with alkali, the chips are washed with deionized water overnight.
Для окончательного и надежного удаления резидуальных (остаточных) белков и других органических остатков в способ обработки введена обработка крошки в смеси 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 с временем обработки от 10 до 16 часов, меняя раствор на новый не менее двух раз. Время обработки обусловлено качеством крошки - исходным материалом может быть губчатая или из кортикальная кость с/х животных или человека.For the final and reliable removal of residual (residual) proteins and other organic residues, the processing method includes processing the crumbs in a mixture of 1% ammonia and 1% ethanol in a ratio of 1: 1 with a processing time of 10 to 16 hours, changing the solution to a new one of at least two time. The processing time is determined by the quality of the crumbs - the source material may be spongy or cortical bone from agricultural animals or humans.
Для крошки из губчатой ткани время обработки составляет 10 часов, что оптимально для выхода возможного остатка белка из костной крошки. Для костной крошки из кортикальной кости прекращение выхода резидуальных белков наблюдали через 16 часов.For spongy crumbs, the processing time is 10 hours, which is optimal for the release of a possible protein residue from bone crumbs. For bone crumb from the cortical bone, the cessation of the residual proteins was observed after 16 hours.
Данный раствор отработан экспериментально и специально для удаления резидуальных белков и является уникальным для их удаления из любой соединительной ткани. Ранее показано, что наиболее эффективным способом такие остаточные белки и другие примеси эффективно удаляются низкоконцентрированными растворами. Примером такого раствора является смесь аммиака и этанола, взятых в небольших концентрациях.This solution was tested experimentally and specifically to remove residual proteins and is unique to remove them from any connective tissue. It was previously shown that in the most efficient way, such residual proteins and other impurities are effectively removed by low concentrated solutions. An example of such a solution is a mixture of ammonia and ethanol, taken in small concentrations.
Обработку материала растворами проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность растворов к местам их воздействия.The processing of the material with solutions is carried out with stirring on a magnetic stirrer, which allows for better accessibility of solutions to the places of their impact.
После обработки в смеси 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 костную крошку отмывают деионизованной водой в 5-ти сменах и затем обрабатывают раствором 3% перекиси водорода в течение 10 до 16 часов.After processing in a mixture of 1% ammonia and 1% ethanol in a 1: 1 ratio, bone chips are washed with deionized water in 5 shifts and then treated with a solution of 3% hydrogen peroxide for 10 to 16 hours.
Такая обработка, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белков и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, липиды, труднорастворимые соли и т.д. Данный эффект очевиден при обработке крошки из кортикальной кости в течение 16 часов и крошки из губчатой кости в течение 10 часов. Для лучшей доступности раствора такую обработку также следует проводить на магнитной мешалке. После воздействия перекиси водорода костную крошку отмывают деионизованной водой.This treatment, firstly, allows you to remove residues of non-collagenic proteins and, secondly, to destroy a number of other compounds, such as pigments, lipids, sparingly soluble salts, etc. This effect is evident when treating cortical bone chips for 16 hours and cancellous bone chips for 10 hours. For better availability of the solution, such processing should also be carried out on a magnetic stirrer. After exposure to hydrogen peroxide, bone chips are washed with deionized water.
В отличие от всех известных способов получения биосовместимого костного материала в способе согласно изобретению к обезжириванию приступают только после обработки кости щелочью и перекисью водорода, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген благодаря покрывающему практически каждое костное волокно защитному слою гидроксиапатита остается практически не измененным.Unlike all known methods for producing biocompatible bone material in the method according to the invention, degreasing is started only after treatment of the bone with alkali and hydrogen peroxide, since the main antigens have already been removed from the obtained non-calcined bone and the bone collagen, due to the protective layer of hydroxyapatite covering almost every bone fiber, remains practically not changed.
В костной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В известном способе обработанные ферментом костные пластины содержат липиды, которые находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления липидов согласно изобретению в способ введена обработка костной крошки в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:2 на стадии, когда основная строма материала уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят 24 часа, что определяется по количеству содержания липидов на 1 г ткани по сухому весу. Материал обрабатывают в смеси не менее 24 часов, поскольку за это время липиды выходят из плотной части ткани (кортикальная кость). При необходимости обработку делают повторно до полного выхода липидов из ткани.Bone tissue contains a significant amount of lipids and their compounds with proteins and carbohydrates. In the known method, enzyme-treated bone plates contain lipids, which are both in a free state and in the form of compounds with sugars — lipopolysaccharides, which are active antigens and can cause various inflammatory complications. Namely, to remove the lipids of the invention, the method includes treating bone crumbs in a mixture of chloroform and ethyl alcohol in a 1: 2 ratio at the stage when the main stroma of the material has already been cleared of its other components. Processing in the mixture is carried out 24 hours, which is determined by the amount of lipid content per 1 g of tissue by dry weight. The material is treated in a mixture for at least 24 hours, since during this time the lipids leave the dense part of the tissue (cortical bone). If necessary, the treatment is repeated until the lipids exit the tissue completely.
После обезжиривания костную крошку отмывают деионизованной водой и высушивают.After degreasing, the bone chips are washed with deionized water and dried.
Для получения биосовместимого материала для стоматологии применяют коллаген, выделенный из склеры с/х животных, например из склер свиней, коллаген, выделенный путем кислотно-щелочного гидролиза (Коллаген и его применение в медицине. М.: Медицина, 1976 г., с.50-53), и готовят из него раствор с концентрацией коллагена от 1 до 2%.To obtain a biocompatible material for dentistry, collagen isolated from animal sclera, for example, from pig sclera, is used, collagen isolated by acid-base hydrolysis (Collagen and its use in medicine. M: Medicine, 1976, p. 50 -53), and a solution is prepared from it with a collagen concentration of 1 to 2%.
Высушенную крошку смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер с/х животных, в соотношении 2 объемных части крошки к 3 объемным частям коллагена и сразу добавляют сГАГ.The dried crumb is mixed with a solution of collagen isolated from animal sclera in a ratio of 2 volume parts of crumbs to 3 volume parts of collagen and sGAG is immediately added.
Для получения биосовместимого материала для стоматологии согласно изобретению применяют сГАГ, выделенные например, из трахеи, кости или роговицы (RU 2162331).To obtain a biocompatible material for dentistry according to the invention, sGAG is used, isolated, for example, from the trachea, bone or cornea (RU 2162331).
Насыщение с ГАГ проводят при постоянном помешивании для их лучшей доступности ко всему объему раствора.Saturation with GAG is carried out with constant stirring for their best accessibility to the entire volume of the solution.
Концентрация сГАГ менее 800 мкг/см3 материала не оказывает выраженного стимулирующего эффекта на процесс репарации костного дефекта, а концентрация более 1500 мкг/см3 материала может вызывать аллергическую реакцию.A concentration of sGAG of less than 800 μg / cm 3 of material does not have a pronounced stimulating effect on the repair process of the bone defect, and a concentration of more than 1500 μg / cm 3 of material can cause an allergic reaction.
Насыщение раствора сГАГ проводят при комнатной температуре. По окончании насыщения из полученного материала готовят гели, порошки, гранулы или блоки криогенным способом. После этого материал фасуют и стерилизуют.Saturation of the sGAG solution is carried out at room temperature. At the end of saturation, gels, powders, granules or blocks are prepared from the material obtained in a cryogenic manner. After that, the material is packed and sterilized.
Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики оценки его характеристик, принятые для данного типа материалов.The receipt of the material is controlled at each stage of processing and includes the basic methods for evaluating its characteristics adopted for this type of material.
Выход белка на стадии обработки щелочью после отмывки водой определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах крошки методом определения оксипролина по Кьельдалю.The protein yield at the alkali treatment stage after washing with water was determined using the Lowry pharmacopoeia method spectroscopically at a wavelength of 400 nm and the presence of collagen residues in the washings of crumbs by the Kjeldahl method of determination of hydroxyproline.
Отсутствие протеогликанов на стадии после обработки перекисью водорода определяли спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.The absence of proteoglycans in the stage after treatment with hydrogen peroxide was determined spectrophotometrically by staining with 1.9-dimethylene blue at a wavelength of 535 nm according to the Farndel method.
Контроль на липиды после обезжиривания делали по окраске суданом.Lipid control after degreasing was done by Sudan staining.
Сохранность структуры стромы костной крошки определяли методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костной ткани и отдельные волокна коллагена имеют типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. Минеральный компонент расположен над поверхностью коллагеновых волокон в виде сферических образований вдоль их длины.The preservation of the structure of bone stroma stroma was determined by scanning microscopy. Using these methods, it was found that the porous-fibrous structure of bone tissue and individual collagen fibers have a typical appearance without any changes or disturbances. The mineral component is located above the surface of collagen fibers in the form of spherical formations along their length.
Снижение антигенности и повышение биосовместимости определяли путем контрольных измерений на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом.The decrease in antigenicity and increased biocompatibility was determined by control measurements on the content of non-collagen proteins in the material compared to the prototype.
Исследования проводили на стадии после обработки - для прототипа (контрольные образцы) после обработки ферментом папаином, а для предлагаемого способа после обработки щелочью.The studies were carried out at the post-treatment stage - for the prototype (control samples) after treatment with papain enzyme, and for the proposed method after treatment with alkali.
Для этого костную крошку взвешивали и инкубировали в течение ночи при 37°С в термостате. После этого делали заборы из вытяжки и следовали материалы на наличие не коллагеновых белков с помощью тест-системы Bio-Rad Protein Assey на спектрофотометре Heλios Thermo Spectronic при длине волны 750 нм.For this, bone crumbs were weighed and incubated overnight at 37 ° C in a thermostat. After that, fences were drawn from the hood and materials for the presence of non-collagen proteins were followed using the Bio-Rad Protein Assey test system on a Heλios Thermo Spectronic spectrophotometer at a wavelength of 750 nm.
Полученные данные сведены в таблицу.The data obtained are summarized in a table.
Так в материале, полученном по способу, описанному в прототипе, определяется в 4-5 раз больше неколлагеновых белков по сравнению с предлагаемым способом. Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить антигенность материала по уровню снижения белка в 2-4 раза по сравнению с прототипом.So in the material obtained by the method described in the prototype, 4-5 times more non-collagen proteins are determined in comparison with the proposed method. Thus, the proposed method allows to reduce the antigenicity of the material by the level of protein reduction in 2-4 times compared with the prototype.
Повышение биосовместимости материала доказывается методом имплантации под кожу экспериментальных животных по правилам ГОСТ Р ИСО 10993 и устойчивости к биологическим тканям и жидкостям в соответствии с МУ 25.1-001-86 (п.5.11) по методу №6 в растворе кровезаменителя в непрерывном режиме.The increase in biocompatibility of the material is proved by implantation under the skin of experimental animals according to the rules of GOST R ISO 10993 and resistance to biological tissues and fluids in accordance with MU 25.1-001-86 (clause 5.11) according to method No. 6 in a blood substitute solution in a continuous mode.
Для чего экспериментальным животным-крысам породы Вистар под кожу имплантировали гранулированный материал полученный по предлагаемому способу (опытные животные) и по способу описанному в прототипе (контрольные животные).Why experimental animals-rats of the Wistar breed implanted under the skin granular material obtained by the proposed method (experimental animals) and by the method described in the prototype (control animals).
Через 1,5-2 мес животных выводили из эксперимента и делали гистологические срезы, которые изучали на микроскопе "Leika" Германия.After 1.5-2 months, the animals were removed from the experiment and histological sections were made, which were studied using a Leika Germany microscope.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что на препаратах опытных образцов вокруг имплантатов формируется незначительная фиброзная капсула, материал фрагментирован, явления воспаления и отторжения отсутствуют.The conducted experimental studies showed that insignificant fibrous capsule is formed around the implants on the samples of the experimental samples, the material is fragmented, there are no inflammation and rejection phenomena.
В контрольных образцах у нескольких животных в зоне имплантации на 7-14 сутки после операции отмечалась гиперемия и отечность. Гистологические исследования выявили развитие воспаления в зоне имплантата со скоплением клеток воспалительного ряда.In control samples of several animals in the implantation zone on 7-14 days after surgery, hyperemia and swelling were noted. Histological studies revealed the development of inflammation in the implant area with an accumulation of inflammatory cells.
Таким образом, видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала и, таким образом, повысить его биосовместимость.Thus, it is seen that the proposed method of processing tissue allows to reduce the antigenicity of the material and, thus, increase its biocompatibility.
Предлагаемый способ обработки ткани позволяет сохранить его структуру и повысить его качественные характеристики за счет повышения биосовместимости материала. Введение в материал коллагена, выделенного из склеры сельскохозяйственных животных и сГАГ, придает ему дополнительные остеорепаративные свойства и повышает его биосовместимость.The proposed method of processing tissue allows you to save its structure and improve its quality characteristics by increasing the biocompatibility of the material. The introduction into the material of collagen isolated from the sclera of farm animals and sGAG gives it additional osteoreparative properties and increases its biocompatibility.
Краткая технология получения материала.Brief technology for obtaining material.
Прошедшую ветеринарный контроль губчатую кость свиньи очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 10-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 10-16 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают крошку раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают водой деионизованной, затем 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси раствора этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных, в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см3.Passed veterinary control, the pig spongy bone is cleaned of muscles and tendons, sawn to 10-400 microns in size, the crumb is treated at room temperature for 10-16 hours with a solution of 0.4 N. alkali, washed with deionized water, re-treat the crumb with a solution of 0.4 N. alkalis, washed with deionized water, treated with a mixture of a solution of 1% ammonia and 1% ethanol in a ratio of 1: 1 for 10 hours, changed the solution to a new one at least 2 times, washed with deionized water, then 3% hydrogen peroxide for 10-16 hours , washed with deionized water, degreased in a mixture of a solution of ethanol and chloroform in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least twice, washed with deionized water, dried, mixed with a solution of collagen isolated from sclera of farm animals, in a ratio of 2: 3 volume parts , saturated with sulfated glycosaminoglycans from 800 to 1500 μg / cm 3 .
Приведенные выше действия приводят к сохранности структуры коллагена и минерального компонента кости, а также к снижению антигенности полученного материала.The above actions lead to the preservation of the structure of collagen and the mineral component of the bone, as well as to a decrease in the antigenicity of the obtained material.
Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.For a better understanding of the essence of the invention is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1.Example 1
Донорскую губчатую кость человека, прошедшую необходимые контрольные анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 10 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно при комнатной температуре в течение 10 часов обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака: и 1% этанола в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 10 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают при комнатной температуре, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 800 мкг/см3 при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 97%; коллаген из склеры с/х животных - 1%; сГАГ - 0,08% и остальное вода деионизованная.The human donor cancellous bone, which has passed the necessary control tests, is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn to a crumb of 70-400 microns in size, the crumb is treated at room temperature for 10 hours with a solution of 0.4 N. alkali, washed with deionized water, repeatedly at room temperature for 10 hours, treated with a solution of 0.4 N. alkalis, washed with deionized water, treated with a mixture of a solution of 1% ammonia: and 1% ethanol for 10 hours, changed the solution to a new one at least two times, then treated with 3% hydrogen peroxide for 10 hours, washed with deionized water, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in a ratio of 1: 2, changing the solution to a new one at least twice, washed with deionized water, dried at room temperature, mixed with a collagen solution isolated from sclera of farm animals in a ratio of 2: 3 volume parts, saturated with sul fatty glycosaminoglycans 800 μg / cm 3 in the following ratio: non-demineralized collagen from bone - 97%; collagen from the sclera of agricultural animals - 1%; sGAG - 0.08% and the rest is deionized water.
Полученную смесь выдерживают в течение 16 часов, после чего готовят из нее гранулы криогенным способом.The resulting mixture was incubated for 16 hours, after which granules were prepared from it in a cryogenic manner.
Проводят контроли на наличие белка и липидов.Controls for the presence of protein and lipids.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами.The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology, and maxillofacial surgery. For experimental and scientific purposes, the material may be saturated with biologically active substances.
Пример 2.Example 2
Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 12 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в течение 12 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 12 часов, обезжиривают в смеси раствора этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 1000 мкг/см3, при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 98%; коллаген из склеры с/х животных - 1,5%; сГАГ - 1% и вода деионизованная остальное.The pig’s spongy bone that has passed the necessary veterinary control is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn to a crumb of 70-400 microns in size, the crumb is treated at room temperature for 12 hours with a solution of 0.4 N. alkali, washed with deionized water, re-treated with a solution of 0.4 N. alkalis, washed with deionized water, treated with a mixture of a solution of 1% ammonia and 1% ethanol for 12 hours, changed the solution to a new one at least twice, then treated with 3% hydrogen peroxide for 12 hours, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in the ratio 1: 2, changing the solution to a new one at least two times, washed with deionized water, dried, mixed with a collagen solution isolated from the sclera of farm animals in a ratio of 2: 3 volume parts, saturated with 1000 µg / cm 3 of sulfated glycosaminoglycans, p In the following ratio: non-demineralized collagen from bone - 98%; collagen from the sclera of agricultural animals - 1.5%; sGAG - 1% and the rest is deionized water.
Полученный гелевый раствор расфасовывают в шприцы, стерилизуют.The resulting gel solution is packaged in syringes, sterilized.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях костный материал может быть насыщен биологически активными веществами.The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology, and maxillofacial surgery. For experimental and scientific purposes, bone material can be saturated with biologically active substances.
Пример 3.Example 3
Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 24 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, в течение 24 часов при комнатной температуре отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 16 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают при комнатной температуре, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 1500 мкг/см3, при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 99%; коллаген из склеры с/х животных - 2%; сГАГ - 1,5% и вода деионизованная остальное, затем готовят блоки криогенным методом, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.Passing the necessary veterinary control, the pig’s cortical bone is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn to a crumb of 70-400 microns in size, the crumb is treated at room temperature for 24 hours with a solution of 0.4 N. alkali, washed with deionized water, re-treated with a solution of 0.4 N. alkalis, within 24 hours at room temperature, washed with deionized water, treated with a mixture of a solution of 1% ammonia and 1% ethanol for 16 hours, changed the solution to a new one at least twice, washed with deionized water, then treated with 3% hydrogen peroxide for 16 hours, washed with deionized water, degreased in a mixture of ethanol and chloroform in the ratio 1: 2, changing the solution to a new one at least twice, washed with deionized water, dried at room temperature, mixed with a solution of collagen isolated from sclera villages farm animals in a ratio of 2: 3 parts by volume, saturated with sulfated glycosaminoglycans 1500 μg / cm 3 , with the following ratio: non-demineralized collagen from bone - 99%; collagen from the sclera of agricultural animals - 2%; sGAG - 1.5% and the rest of the water is deionized, then the blocks are prepared by the cryogenic method, Packed and sterilized by radiation.
Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В экспериментальных и научных целях костный недеминерализованный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами.The material is used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology. For experimental and scientific purposes, bone non-demineralized collagen can be saturated with biologically active substances.
Использование предлагаемого способа позволяет получить насыщенный сГАГ, высококачественный и низкоантигенный материал для стоматологии с сохранной органической (коллаген костной ткани) и минеральной (гидроксиапатит костной ткани) структурой.Using the proposed method allows to obtain saturated sGAG, high-quality and low antigenic material for dentistry with preserved organic (collagen of bone tissue) and mineral (hydroxyapatite bone tissue) structure.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005111015/15A RU2278655C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Method for production of biocompatible dental material |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005111015/15A RU2278655C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Method for production of biocompatible dental material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2278655C1 true RU2278655C1 (en) | 2006-06-27 |
Family
ID=36714616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005111015/15A RU2278655C1 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Method for production of biocompatible dental material |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2278655C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2456003C1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-07-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Method of producing demineralised crushed bone matrix |
| RU2642634C1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-01-25 | Общество с ограниченной ответственностью "ВестИнТех" | Method of bone processing for producing hydroxyapatite |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
-
2005
- 2005-04-15 RU RU2005111015/15A patent/RU2278655C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2456003C1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-07-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Method of producing demineralised crushed bone matrix |
| RU2642634C1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-01-25 | Общество с ограниченной ответственностью "ВестИнТех" | Method of bone processing for producing hydroxyapatite |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
| RU2759517C9 (en) * | 2021-04-02 | 2022-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2153877C2 (en) | Agent stimulating regeneration of solid tissue | |
| RU2640865C2 (en) | Method for manufacturing formated product from cross-linked hyaluronic acid | |
| RU2683286C2 (en) | Method for crosslift of hyaluronic acid, method for preparation of injection hydrogel, hydrogel and use thereof | |
| KR20200032103A (en) | Silk-hyaluronic acid based tissue filler and method of using the same | |
| JPH0751512B2 (en) | Wound healing agent | |
| JP2004536624A (en) | Novel biopolymer obtained by solid state irradiation in unsaturated gas atmosphere | |
| EP1941916B1 (en) | Method for producing biomaterials from a bone tissue and the thus obtained material used for osteoplasty and tissue engineering | |
| JP2017537764A (en) | Collagen sponge | |
| KR101886413B1 (en) | Manufacturing method of soft tissue filler composition based on hyaluronic acid | |
| EP3666278A1 (en) | Method for the manufacture and use of a bionic hydrogel composition for medical applications | |
| RU2342162C1 (en) | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method | |
| Ma et al. | Cross-linking effects of carbodiimide, oxidized chitosan oligosaccharide and glutaraldehyde on acellular dermal matrix of basa fish (Pangasius bocourti) | |
| TW201927277A (en) | Dried implant composition and injectable aqueous implant formulation | |
| Hwang et al. | Effect of extracellular matrix membrane on bone formation in a rabbit tibial defect model | |
| RU2278655C1 (en) | Method for production of biocompatible dental material | |
| JP7467509B2 (en) | Injectable aqueous implant formulations containing ascorbic acid | |
| DE2625289A1 (en) | PROCESS FOR MANUFACTURING A STERILE COLLAGEN PRODUCT WITH FELT OR. FLEECE-LIKE FIBER STRUCTURE | |
| RU2278679C1 (en) | Material for osteoplasty and method for production thereof | |
| Nitipir et al. | Hybrid collagen-NaCMC matrices loaded with mefenamic acid for wound healing | |
| DE102008013091B4 (en) | Method of making collagen material, collagen material | |
| KR102157742B1 (en) | Method for preparing hydrogel for preventing surgical adhesions, hydrogel, film and porous material using the same | |
| RU2509554C1 (en) | Implant and biomaterial coating solution | |
| RU2433828C1 (en) | Injection heterogenic biopolymer hydrogel for substitutional and regenerative surgery and method of its obtaining | |
| RU2273489C1 (en) | Method for obtaining collagen from bone tissue | |
| RU2456003C1 (en) | Method of producing demineralised crushed bone matrix |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070416 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20100810 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110416 |