RU2342162C1 - Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method - Google Patents
Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2342162C1 RU2342162C1 RU2007126721/15A RU2007126721A RU2342162C1 RU 2342162 C1 RU2342162 C1 RU 2342162C1 RU 2007126721/15 A RU2007126721/15 A RU 2007126721/15A RU 2007126721 A RU2007126721 A RU 2007126721A RU 2342162 C1 RU2342162 C1 RU 2342162C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- washed
- hours
- collagen
- tissue
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимии и технологии выделения биологических веществ, а также для изготовления биоматериалов, которые применяются в качестве пластического материала при оперативном замещении костных дефектов при деструкции костной ткани, удалении кист, опухолей, а также в качестве носителя активных веществ и лекарственных средств, в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани.The invention relates to medicine, and more specifically to biochemistry and technology for the isolation of biological substances, as well as for the manufacture of biomaterials, which are used as plastic material for the surgical replacement of bone defects in the destruction of bone tissue, removal of cysts, tumors, and also as a carrier of active substances and medicines, in plastic surgery when restoring the volume of an organ or tissue.
Кость является живой тканью, в которой происходит постоянный процесс реорганизации, включающий одновременное разрушение и восстановление костного материала. В ходе нормального процесса, а также при имплантации постороннего материала ремодулируется старая ткань, на ее месте образуется новая ткань. Между количеством перестраиваемой кости и вновь образованной кости постоянно поддерживается равновесие. Этот процесс будет идти легче, если имплантированный материал по своей структуре более близок к обычной кости.Bone is a living tissue in which there is a constant process of reorganization, including the simultaneous destruction and restoration of bone material. During the normal process, as well as during implantation of foreign material, the old tissue is remodulated and a new tissue is formed in its place. Between the amount of bone being reconstructed and the newly formed bone, balance is constantly maintained. This process will go easier if the implanted material is closer in structure to ordinary bone.
По этой причине в настоящее время предпочитают готовить материал заменителя из тканей естественной кости, которая по этическим и практическим причинам должна быть животного происхождения.For this reason, it is currently preferred to prepare substitute material from tissues of natural bone, which for ethical and practical reasons should be of animal origin.
Хорошо известно, что вживлению костного трансплантанта способствует частичная деминерализация. Вслед за этим следуют различные дополнительные шаги, которые предназначены или для полной депротеинизации кости, или для воздействия на природу протеинов, которые остаются связанными в костной основе, или для увеличения этой доли протеинов.It is well known that partial demineralization contributes to the implantation of a bone graft. This is followed by various additional steps, which are intended either for the complete deproteinization of the bone, or to affect the nature of the proteins that remain bound in the bone base, or to increase this proportion of proteins.
Что касается методов, применяемых до сих пор, то можно указать, в частности, на патент US № 4394370, в котором предлагается с помощью глутаральдегидного связывания, обеспечивающего поперечную связь, образовывать губчатую массу плавлением смеси, состоящей из порошка деминерализованной кости человеческого происхождения и разбавленного порошка коллагена.With regard to the methods used so far, it is possible to indicate, in particular, US patent No. 4394370, which proposes using glutaraldehyde binding, providing cross-linking, to form a spongy mass by melting a mixture consisting of demineralized bone powder of human origin and diluted powder collagen.
В патенте US № 4743259 сочетается деминерализация соляной кислотой с обогащением протеинами, осуществляемым на первой части деминерализованной кости с помощью протеинов, экстрагированных из второй части с помощью гуанидина.US Pat. No. 4,743,259 combines demineralization with hydrochloric acid and protein enrichment in the first part of the demineralized bone using proteins extracted from the second part with guanidine.
Более того, в заявке на получение патента FR №2582517 предлагается подвергать обработке обломки кости, взятые у животных, точнее у домашнего скота, путем частичной деминерализации и дубления с помощью глутаральдегида. Элементы кости, которые должен имплантировать хирург, вырезают с приданием нужной формы из костей крупного рогатого скота, предварительно подвергнутых обработке, включающей операцию делипидации или обезжиривания с помощью органического растворителя, такого как этанол, операции деминерализации с помощью средства экстрагирования кальция, такого как соляная кислота, и операции, предусматривающей дубление глутаральдегидом, а также различных операций по промывке.Moreover, in the application for patent FR No. 2582517 it is proposed to treat bone fragments taken from animals, more precisely from livestock, by partial demineralization and tanning with glutaraldehyde. The bone elements to be implanted by the surgeon are cut into shape from the bones of cattle previously subjected to treatment, including the operation of delipidation or degreasing with an organic solvent such as ethanol, the operation of demineralization using a means of extraction of calcium, such as hydrochloric acid, and an operation involving tanning with glutaraldehyde, as well as various washing operations.
Из описания патентов, указанных выше, очевидно, что упоминаемый процесс дубления оказывает благоприятное воздействие на свойства обработанной кости постольку, поскольку он облегчает поперечную связь макромолекулярных цепей. Однако в последнее время обнаружено, что в отличие от высказывавшихся ранее предположений обработка глутаральдегидов не ведет к значительному снижению иммуногенных свойств и, кроме того, приживление имплантированной кости не происходит в той степени, которая была бы желательна. Кроме того, химические соединения типа глутаральдегида имеют тот недостаток, что являются биологически токсичными.From the description of the patents mentioned above, it is obvious that the tanning process mentioned has a beneficial effect on the properties of the treated bone insofar as it facilitates the cross-linking of macromolecular chains. However, it has recently been found that, in contrast to the previously expressed assumptions, the treatment of glutaraldehydes does not lead to a significant decrease in immunogenic properties and, moreover, the implantation of the implanted bone does not occur to the extent that would be desirable. In addition, chemical compounds such as glutaraldehyde have the disadvantage that they are biologically toxic.
Известен способ получения материала для остеопластики из костной ткани природного происхождения, включающий последовательное удаление липидов из природной костной ткани с помощью органического раствора, селективную экстракцию с последующей промывкой и лиофилизацией конечного продукта, отличающийся тем, что селективную экстракцию выполняют с помощью раствора мочевины для денатурирования и удаления антигенных протеинов с сохранением неденатурированного коллагена типа I в природной форме, находящейся в исходной минеральной костной структуре, и полученную структуру направляют на промывку и лиофилизацию (RU №2104703, А61К 35/32, опубл. 20.02.1998).A known method of obtaining material for osteoplasty from bone tissue of natural origin, including sequential removal of lipids from natural bone tissue using an organic solution, selective extraction followed by washing and lyophilization of the final product, characterized in that the selective extraction is performed using a urea solution for denaturing and removing antigenic proteins with the preservation of undenatured collagen type I in the natural form found in the original mineral bone structure, and the resulting structure is sent for washing and lyophilization (RU No. 2104703, A61K 35/32, publ. 02.20.1998).
При этом удаление липидов проводят органическим раствором, содержащим на 1 ч. кости 10 объемов смеси хлороформ/метанол или этанол/дихлорметан при соотношении соответственно 2:3-1:3. Этап деминерализации костной ткани проводят раствором соляной кислоты с молярностью 0,1-1,0 М после обработки удаления липидов. Перед селективной экстракцией осуществляют экстракцию ионным растворителем, в частности, с помощью хлорида натрия.In this case, the removal of lipids is carried out with an organic solution containing 10 volumes of a mixture of chloroform / methanol or ethanol / dichloromethane for 1 hour bone with a ratio of 2: 3-1: 3, respectively. The bone tissue demineralization step is carried out with a hydrochloric acid solution with a molarity of 0.1-1.0 M after the lipid removal treatment. Before selective extraction, extraction is carried out with an ionic solvent, in particular with sodium chloride.
Селективную экстракцию проводят 2 - 10 М раствором мочевины, предпочтительно 5 - 8 М раствором или водным раствором мочевины, содержащим 0,1-0,5 об.% меркаптоэтанола. Промывку проводят с помощью дистиллированной воды при 30-60°С, предпочтительно 45-55°С. Или селективную экстракцию осуществляют сначала с помощью раствора мочевины, имеющего концентрацию между 2 и 10 М, преимущественно между 5 и 8 М, затем, после промывки, с помощью водного раствора мочевины, содержащего меркаптоэтанол в количестве между 0,1 и 0,5 об.% в растворе.Selective extraction is carried out with a 2-10 M urea solution, preferably a 5-8 M solution or an aqueous urea solution containing 0.1-0.5 vol.% Mercaptoethanol. Washing is carried out using distilled water at 30-60 ° C, preferably 45-55 ° C. Or selective extraction is carried out first with a urea solution having a concentration between 2 and 10 M, preferably between 5 and 8 M, then, after washing, with an aqueous urea solution containing mercaptoethanol in an amount between 0.1 and 0.5 vol. % in solution.
Полученный таким способом материал для остеопластики представляет собой соединение, в котором сохранена костная структура природного происхождения, содержащая неденатурированный коллаген типа 1 20-40%, а именно порядка 25-35%. По данным анализа сухого материала он содержит липиды в количестве менее 15%, протеины в количестве между 25 и 45%, кальций в количестве 10-30%, фосфор в количестве 5-20%, содержащие воды в нем ниже 10%, соотношение Са/Р преимущественно находится между 1 и 2,2.The osteoplasty material obtained in this way is a compound in which the bone structure of natural origin is preserved, containing undenatured collagen type 1 20-40%, namely about 25-35%. According to the analysis of dry material, it contains lipids in an amount of less than 15%, proteins in an amount of between 25 and 45%, calcium in an amount of 10-30%, phosphorus in an amount of 5-20%, containing water in it below 10%, Ca / P is preferably between 1 and 2.2.
Материал находится в форме параллелепипедных блоков, усеченных пирамид, пластинок, дисков, или порошка, или порошка, амальгамированного с помощью связующего, которое может быть преимущественно биологического происхождения, такого как фибрин, или синтетического происхождения, такого как, например, синтетический биоразлагаемый полимер.The material is in the form of parallelepiped blocks, truncated pyramids, plates, disks, or powder, or powder, amalgamated with a binder, which can be mainly of biological origin, such as fibrin, or of synthetic origin, such as, for example, a synthetic biodegradable polymer.
Данное изобретение выбрано в качестве прототипа как для способа, так и для материала, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.This invention is selected as a prototype for both the method and the material, since it is closest in its technical solution to the proposed invention.
Недостатками указанного способа является то, что такая обработка хотя и сохраняет костный коллаген 1 типа в природной форме, но не обеспечивает полного освобождения данной ткани от антигенов - неколлагеновых белков, липидов, липопротеидов и других веществ, которые снижают биосовместимость получаемого материала.The disadvantages of this method is that this treatment, although it retains bone collagen type 1 in its natural form, but does not provide complete release of this tissue from antigens - non-collagen proteins, lipids, lipoproteins and other substances that reduce the biocompatibility of the resulting material.
Задачей изобретения является повышение качества получаемого из костной ткани биоматериала, содержащего гидроксиапатит и/или костный коллаген, и получение на его основе материалов для использования в стоматологии, травматологии и ортопедии путем сохранения нативной структуры костного коллагена и пространственной организации костной ткани, необходимой для ее последующей клеточной колонизации, повышения приживляемости таких биоматериалов за счет снижения их антигенных характеристик, повышения биосовместимости и биоинтеграции.The objective of the invention is to improve the quality obtained from bone tissue biomaterial containing hydroxyapatite and / or bone collagen, and obtain materials based on it for use in dentistry, traumatology and orthopedics by preserving the native structure of bone collagen and the spatial organization of bone tissue necessary for its subsequent cellular colonization, increase the survival rate of such biomaterials by reducing their antigenic characteristics, increasing biocompatibility and biointegration.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение сохранного по архитектонике костного биоматериала и чистого костного коллагена, являющихся низкоантигенными материалами, которые могут широко использоваться для получения изделий медицинского назначения, таких как материалы для замещения костных дефектов, а также в качестве носителя биологически активных веществ и клеток, и являться основой для других изделий медицинского назначения.The technical result achieved by using the invention is to obtain architectonically preserved bone biomaterial and pure bone collagen, which are low antigenic materials that can be widely used to obtain medical devices, such as materials for replacing bone defects, and also as a carrier of biologically active substances and cells, and form the basis for other medical devices.
Указанный технический результат в части способа достигается тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,2 до 2,0 см, отмывают нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 24 часов, затем пластины промывают 5-ю объемами воды при 40-80°С (предпочтительно 50-60°С), обрабатывают раствором 0,4 N щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 часов, отмывают проточной водой, обезжиривают в смесях этанол/хлороформ в соотношении 1:2 и 2:1, проводят декальцинацию в 0,4-1 N соляной кислоте, обрабатывают 1,5-3% перекисью водорода в течение 4 часов, отмывают водой очищенной, затем этанолом, высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют.The specified technical result in terms of the method is achieved by the fact that after cleaning, the bone is sawn into plates with a thickness of 0.2 to 2.0 cm, washed with 0.1 M phosphate buffer heated to 65 ° C, pH 5.8-6.0, and digested a solution of activated 0.1-0.4% papain at 65 ° C for 24 hours, then the plates are washed with 5 volumes of water at 40-80 ° C (preferably 50-60 ° C), treated with a solution of 0.4 N alkali at room temperature for 10-24 hours, washed with running water, degreased in ethanol / chloroform mixtures in a ratio of 1: 2 and 2: 1, decalcify in 0.4-1 N hydrochloric acid, treated with 1.5-3% hydrogen peroxide for 4 hours, washed with purified water, then ethanol, dried at room temperature, packaged and sterilized.
В части материала указанный технический результат достигается тем, что в материал для остеопластики и тканевой инженерии, полученный по этому способу, представляет собой соединение, в котором сохранена нативная пространственная организация коллагенового матрикса и минеральная составляющая костной ткани природного происхождения, содержащее 25% коллагена и 75% минерального вещества. По данным анализа сухого этот материала содержит менее 1% неколлагенновых белков.In terms of the material, the indicated technical result is achieved by the fact that the material for osteoplasty and tissue engineering obtained by this method is a compound in which the native spatial organization of the collagen matrix and the mineral component of bone tissue of natural origin, containing 25% collagen and 75%, are preserved mineral matter. According to dry analysis, this material contains less than 1% non-collagen proteins.
Материалом для получения костного коллагена и изделий на его основе может являться губчатая или кортикальная кость человека или позвоночных животных, например свиней, баранов, кур, гусей и т.д. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью, а также высокой устойчивостью к действию коллагеназы. Этот тип коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани организма.The material for obtaining bone collagen and products based on it can be spongy or cortical bone of a person or vertebrate animals, for example pigs, sheep, chickens, geese, etc. This tissue mainly consists of collagen type I and III and is characterized by low solubility, as well as high resistance to collagenase. This type of collagen is most common in medical products implanted in body tissues.
Указанные признаки как для способа, так и для материала существенные и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.These signs for both the method and the material are essential and are interconnected with the formation of a stable set of essential features sufficient to obtain the desired technical result.
Ниже рассматривается техническое существо способа согласно настоящему изобретению и характеристики полученного этим способом материала для остеопластики и тканевой инженерии.Below is considered the technical essence of the method according to the present invention and the characteristics of the material obtained by this method for osteoplasty and tissue engineering.
Технология приготовления заявляемых согласно настоящему способу биоимплантатов требует начальной механической обработки ткани, когда кость очищается от остатков мягких тканей и крови.The preparation technology of the bioimplants claimed in accordance with the present method requires initial mechanical processing of the tissue when the bone is cleansed of the remnants of soft tissues and blood.
Существенным признаком изобретения является порядок обработки кости. После механической обработки ткань распиливают на пластины толщиной не менее 0,2 см и не более 2,0 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при обработке данной ткани растворами. Минимальный размер пластин толщиной от 0,2 см и максимальный 2,0 см определены нами опытным путем. Так, при увеличении толщины пластины возникают трудности с доступностью фермента и других растворов к активным местам субстрата, а также при отмывке таких пластин от применяемых по технологии растворов. При уменьшении толщины пластин возникают серьезные проблемы с сохранением целостности костного коллагена и пространственной структуры костной ткани в процессе обработки материала.An essential feature of the invention is the processing order of the bone. After mechanical processing, the fabric is sawn into wafers with a thickness of at least 0.2 cm and not more than 2.0 cm, since these sizes are the most optimal when processing this fabric with solutions. The minimum size of the plates with a thickness of 0.2 cm and a maximum of 2.0 cm was determined by us empirically. Thus, with an increase in the plate thickness, difficulties arise with the accessibility of the enzyme and other solutions to the active sites of the substrate, as well as with the washing of such plates from the solutions used by technology. When reducing the thickness of the plates, serious problems arise with maintaining the integrity of bone collagen and the spatial structure of bone tissue during processing of the material.
После нарезки ткань промывают 2-кратным объемом нагретого до 65°С 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8 до 6,0. Именно отмывка в нагретом до 65°С буфере предшествует перевариванию ферментом и создает оптимальные условия для последующего действия фермента папаина, существенно сокращая время инкубации с ферментом при данных значениях рН.After cutting, the fabric is washed with a 2-fold volume of 0.1 M phosphate buffer heated to 65 ° C with a pH of 5.8 to 6.0. It is washing in a buffer heated to 65 ° С that precedes digestion by the enzyme and creates optimal conditions for the subsequent action of the papain enzyme, significantly reducing the incubation time with the enzyme at given pH values.
При данных условиях фермент способен эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины костной ткани, тогда как волокна костного коллагена полностью экранированы слоем гидроксиапатита, и поэтому при переваривании в условиях повышения температуры до 65°С костные коллагеновые волокна не подвергаются денатурации и деструкции, сохраняя свою нативную структуру. Это отчетливо видно по выходу в перевар сульфатированных гликозаминогликанов и аминокислот.Under these conditions, the enzyme is able to effectively destroy non-collagen proteins, proteoglycans and glycoproteins of bone tissue, while bone collagen fibers are completely shielded by a layer of hydroxyapatite, and therefore, when digested under conditions of temperature increase to 65 ° C, bone collagen fibers do not undergo denaturation and destruction, preserving their native structure. This is clearly seen by the release of sulfated glycosaminoglycans and amino acids into the digest.
В зависимости от структуры костной ткани и ее толщины берется различная концентрация фермента. Так, при толщине губчатой кости в 0,2 см для переваривания достаточна концентрации 0,1% активированного папаина, а при толщине губчатой кости 2,0 см или в случае обработки кортикальной кости концентрация папаина увеличивается до 0,4%.Depending on the structure of the bone tissue and its thickness, a different concentration of the enzyme is taken. So, with a trabecular bone thickness of 0.2 cm, a concentration of 0.1% activated papain is sufficient for digestion, and with a trabecular bone thickness of 2.0 cm or in the case of cortical bone treatment, the papain concentration increases to 0.4%.
Оптимальное действие папаина на костную ткань при переваривании белков и протеогликанов составляет 24 часа при 65°С. При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг костей в перевар выделяется около 2 г гликозаминогликанов, что практически равно теоретически рассчитанному количеству сГАГ для данного типа ткани (Chvapil М., Physiology of connective tissue., Butterworths, London, 1967, p.67-70).The optimal effect of papain on bone tissue during the digestion of proteins and proteoglycans is 24 hours at 65 ° C. In this case, the maximum amount of non-collagenic proteins and proteoglycans is removed from the bone tissue. We experimentally found that after 24 hours about 2 g of glycosaminoglycans are released from 1 kg of bones into the digestion, which is almost equal to the theoretically calculated amount of sGAG for this type of tissue (Chvapil M., Physiology of connective tissue., Butterworths, London, 1967, p. 67-70).
Отмывку костных пластин после переваривания их ферментом проводят 5-ю объемами проточной воды, нагретой до 40-80°С (предпочтительно 50-60°С). Эта операция позволяет удалить все продукты реакции субстрата с ферментом, сам фермент и основную часть жиров (более 90%).Washing the bone plates after digesting them with an enzyme is carried out with 5 volumes of running water heated to 40-80 ° C (preferably 50-60 ° C). This operation allows you to remove all the reaction products of the substrate with the enzyme, the enzyme itself and the bulk of the fat (more than 90%).
Эффективное разрушение жиров и возможно оставшихся неколлагеновых белков достигается воздействием щелочи на недекальцинированную костную ткань. Обработку костной ткани 0,4 Н NaOH (гидроксидом натрия) проводят в течение от 10 до 24 часов при комнатной температуре. Известно, что щелочь является очень эффективным агентом, разрушающим белковые соединения, а также бактериальные и вирусные частицы, которыми может быть заражена костная ткань. Эта стадия должна проводиться при комнатной температуре (18-20°С), т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры может разрушаться структура как самой коллагеновой молекулы, так и коллагенового матрикса. Как и в случае с ферментом, исходная минеральная костная структура, которая покрывает коллагеновый матрикс кости, не позволяет раствору 0,4 Н щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24-часового воздействия.Effective destruction of fats and possibly remaining non-collagen proteins is achieved by the action of alkali on undecalcified bone tissue. Treatment of bone tissue with 0.4 N NaOH (sodium hydroxide) is carried out for 10 to 24 hours at room temperature. It is known that alkali is a very effective agent that destroys protein compounds, as well as bacterial and viral particles, which can infect bone tissue. This stage should be carried out at room temperature (18-20 ° C), because at lower temperatures, the effectiveness of the action is significantly reduced, and with increasing temperature, the structure of both the collagen molecule itself and the collagen matrix can be destroyed. As in the case of the enzyme, the initial mineral bone structure, which covers the collagen matrix of the bone, does not allow a solution of 0.4 N alkali to actively influence the structure of bone collagen even after 24-hour exposure.
Губчатую кость с размером пластин 0,2-0,5 см обрабатывают в течение 10 часов, так как за это время белковые молекулы, находящиеся на поверхности коллагеновых волокон, полностью разрушаются. Более толстые пластины губчатой кости и фрагменты кортикальной кости требуют 24-часового воздействия щелочи. После этого времени в смывах с ткани белок не обнаруживается.A spongy bone with a plate size of 0.2-0.5 cm is treated for 10 hours, since during this time the protein molecules located on the surface of collagen fibers are completely destroyed. Thicker plates of the cancellous bone and fragments of the cortical bone require a 24-hour exposure to alkali. After this time, no protein is found in the swabs from the tissue.
После обработки щелочью кость отмывают в 5-ти сменах проточной воды и пластины высушивают при комнатной температуре.After treatment with alkali, the bone is washed in 5 shifts of running water and the plates are dried at room temperature.
В отличие от всех известных способов получения биоматериалов из кости, в настоящем способе начальную обработку - отмывку и ферментативное воздействие - ведут при высоких температурах (65°С), но при этом не происходит нарушения коллагеновой молекулы и коллагенового матрикса в целом. Кроме того, к обезжириванию и декальцинации кости по данному способу приступают только после ее обработки ферментом и щелочью постольку, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген благодаря покрывающему костное волокно защитному слою гидроксиапатита остается практически неизмененным.Unlike all known methods for producing biomaterials from bone, in the present method, initial treatment — washing and enzymatic action — is carried out at high temperatures (65 ° C), but there is no violation of the collagen molecule and the collagen matrix as a whole. In addition, degreasing and decalcification of the bone by this method is started only after its treatment with the enzyme and alkali insofar as the main antigens have already been removed from the obtained undecalcified bone, and the bone collagen due to the protective layer of hydroxyapatite covering the bone fiber remains almost unchanged.
В костной ткани содержится значительное количество жиров и их соединений с белками и углеводами. В обработанных ферментом костных пластинах липиды находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления всех оставшихся липидов в способ введена обработка костных пластин в смесях хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1 и 1:2 на стадии, когда основная костная строма уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят по 2 раза по 24 часа в каждой смеси до полного удаления липидов, что оценивается по содержанию жиров в 1 г сухой ткани. Данный этап позволяет обеспечить высвобождение липидов даже из плотной костной ткани (кортикальная кость). После такой обработки их выход из ткани полностью прекращается и содержание в материале не превышает 1%. После обезжиривания костные пластины высушивают и проводят декальцинацию в растворах минеральных кислот. Как правило, тонкие пластины губчатой кости обрабатывают раствором 0,4 Н соляной кислоты (HCl), а более толстые, начиная с 1 см, в 1Н HCl, и процесс продолжается до полного исчезновения в декальцинирующем растворе ионов Са++. Процесс декальцинации костного материала может либо совсем не проводиться, либо степень деминерализации материала может быть строго программирована. Аналитическое исследование способа получения материала без проведения деминерализации показало, что получаемый материал имеет классические показатели костной ткани: 25% коллагена и 75% минерального вещества. При этом не только структурный коллаген не подвергается воздействию, но остается полностью сохраненной пространственная организация коллагенового матрикса и минеральной составляющей костной ткани. Полученный материал отличается от всех материалов, применяемых в настоящее время для остеопластики, как своим составом и эксплуатационными характеристиками, так и полным отсутствием неколлагеновых составляющих и антигенных свойств. Данный материал имеет практически полную сохранность нативной пространственной структуры костной ткани, что в особенности необходимо для хорошей интеграции, биосовместимости и клеточной колонизации. Далее костный материал подвергается обработке 1,5-3% перекисью водорода в течение 4-х часов. Этот этап, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белковых молекул и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, оставшиеся липиды, труднорастворимые соли и т.д. 3% перекисью водорода, как правило, обрабатывают пластины с размером толщины более 1,0 см. После этого полученный костный коллаген отмывают в 5 сменах воды очищенной. затем отмывают этанолом, высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют.Bone tissue contains a significant amount of fat and its compounds with proteins and carbohydrates. In the bone plates treated with the enzyme, lipids are found both in a free state and in the form of compounds with sugars — lipopolysaccharides, which are active antigens and can cause various inflammatory complications. To remove all the remaining lipids, the method introduced the processing of bone plates in mixtures of chloroform and ethyl alcohol in a ratio of 2: 1 and 1: 2 at the stage when the main bone stroma has already been cleared of its other components. Processing in the mixture is carried out 2 times for 24 hours in each mixture until the lipids are completely removed, which is estimated by the fat content in 1 g of dry tissue. This stage allows the release of lipids even from dense bone tissue (cortical bone). After such processing, their exit from the tissue completely stops and the content in the material does not exceed 1%. After degreasing, the bone plates are dried and decalcified in solutions of mineral acids. As a rule, thin plates of the cancellous bone are treated with a solution of 0.4 N hydrochloric acid (HCl), and thicker starting from 1 cm in 1N HCl, and the process continues until the Ca ++ ions completely disappear in the decalcifying solution. The process of decalcification of bone material may either not be conducted at all, or the degree of demineralization of the material can be strictly programmed. An analytical study of the method of obtaining the material without demineralization showed that the material obtained has the classic bone parameters: 25% of collagen and 75% of the mineral substance. Moreover, not only structural collagen is not exposed, but the spatial organization of the collagen matrix and the mineral component of bone tissue remains completely preserved. The obtained material differs from all materials currently used for osteoplasty, both in its composition and operational characteristics, and in the complete absence of non-collagen components and antigenic properties. This material has almost complete preservation of the native spatial structure of bone tissue, which is especially necessary for good integration, biocompatibility and cell colonization. Further, the bone material is treated with 1.5-3% hydrogen peroxide for 4 hours. This stage, firstly, allows you to remove residues of non-collagen protein molecules and, secondly, to destroy a number of other compounds, such as pigments, remaining lipids, sparingly soluble salts, etc. 3% hydrogen peroxide, as a rule, is processed on plates with a thickness of more than 1.0 cm. After that, the obtained bone collagen is washed in 5 shifts of purified water. then washed with ethanol, dried at room temperature, packaged and sterilized.
Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики, принятые для данного типа материалов.The receipt of the material is controlled at each stage of processing and includes the main techniques adopted for this type of material.
Отсутствие протеогликанов определяли по изменению окрашивания субстрата и в растворах спектрофотометрически в присутствии 1,9-диметиленового синего при длине волны 535 нм по методу Farndel.The absence of proteoglycans was determined by changing the staining of the substrate and in solutions spectrophotometrically in the presence of 1.9-dimethylene blue at a wavelength of 535 nm according to the Farndel method.
Выход белка определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах методом определения оксипролина по Кьельдалю.Protein yield was determined spectroscopically at Lowry by the Pharmacopoeia method at a wavelength of 400 nm and the presence of collagen residues in swabs by the Kjeldahl method for determining hydroxyproline.
Наличие ионов кальция в декальцинирующих растворах определяли с помощью качественной реакции на Са2+. Контроль на липиды делали по окраске материала суданом. Сохранность структуры костного коллагена определяли путем исследования гистологических срезов, электронно-микроскопически и методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костного коллагена имеет типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. После высушивания и стерилизации ставили контрольные измерения на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом. Так, на сухой вес материала, полученного по описанному в прототипе способу, определяется 4-5% белка, а по предлагаемому нами способу менее 1%. Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно снизить антигенность материала за счет более полного удаления липидов и неколлагеновых белков по сравнению с прототипом. Следовательно, предлагаемый способ обработки ткани позволяет сохранить нативную структуру материала, повысить его качественные характеристики, снизить антигенность материала и тем самым обеспечить хорошие пластические свойства, биоинтеграцию и биосовместимость.The presence of calcium ions in decalcifying solutions was determined using a qualitative reaction to Ca 2+ . Lipid control was done by staining the material with Sudan. The preservation of the structure of bone collagen was determined by examining histological sections, electron microscopy and scanning microscopy. Using these methods, it was found that the porous-fibrous structure of bone collagen has a typical appearance without any changes or disturbances. After drying and sterilization, control measurements were taken on the content of non-collagen proteins in the material compared to the prototype. So, on the dry weight of the material obtained by the method described in the prototype, 4-5% of the protein is determined, and according to our method, less than 1%. Thus, the proposed method can significantly reduce the antigenicity of the material due to a more complete removal of lipids and non-collagen proteins in comparison with the prototype. Therefore, the proposed method of processing tissue allows you to save the native structure of the material, increase its quality characteristics, reduce the antigenicity of the material and thereby provide good plastic properties, biointegration and biocompatibility.
Краткая технология получения материалаBrief technology for obtaining material
Прошедшую ветеринарный контроль кость свиньи очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см и помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С на 2 часа, буфер сливают, материал снова промывают нагретым буфером и переносят в раствор активированного 0,4% папаина. Инкубацию ведут в течение 24 часов в термостате при 65°С. Затем перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды, нагретой до 70°С, охлаждают до комнатной температуры и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи. Материал отмывают от щелочи, высушивают и дважды обрабатывают сначала в течение 48 часов смесью этанол/хлороформ в соотношении 1:2, а затем в течение последующих 48 часов смесью этанол/хлороформ в соотношении 2:1. Костные пластины снова высушивают и помещают в 1 N соляную кислоту. Смену кислоты ведут до полного исчезновения в декальцинирующем растворе ионов кальция. Кислоту отмывают водой и пластины помещают в 3% перекись водорода на 4 часа. Затем пластины отмывают водой очищенной и этанолом, материал высушивают, упаковывают и стерилизуют.The veterinary control of the pig bone is cleaned of muscles and tendons, sawn into 2.0 cm thick plates and placed in a solution of 0.1 M phosphate buffer with a pH of 5.8-6.0 at 65 ° C for 2 hours, the buffer is drained, material washed again with heated buffer and transferred to a solution of activated 0.4% papain. Incubation is carried out for 24 hours in a thermostat at 65 ° C. Then the digest is drained, the plates are washed with 5 volumes of water heated to 70 ° C, cooled to room temperature and placed in a 0.4 N alkali solution for 24 hours. The material is washed from alkali, dried and treated twice first for 48 hours with an ethanol / chloroform mixture in a ratio of 1: 2, and then for a further 48 hours with an ethanol / chloroform mixture in a ratio of 2: 1. The bone plates are dried again and placed in 1 N hydrochloric acid. The change of acid is carried out until the calcium ions completely disappear in the decalcifying solution. The acid is washed with water and the plates are placed in 3% hydrogen peroxide for 4 hours. Then the plates are washed with purified water and ethanol, the material is dried, packaged and sterilized.
Приведенные выше действия приводят к снижению ангиогенности и сохранности структуры коллагена и костного коллагенового матрикса.The above actions lead to a decrease in the angiogenicity and preservation of the structure of collagen and bone collagen matrix.
После обработки костный коллаген проходит количественный и качественный анализ, как описано выше.After processing, bone collagen undergoes a quantitative and qualitative analysis, as described above.
Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.For a better understanding of the essence of the invention is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1. Донорскую кость человека, прошедшую необходимые анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,2-0,6 см, дважды по 30 минут помещают в раствор нагретого до 65°С 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,15% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Затем надосадок сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают сначала дважды по 4 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1:2), а затем дважды в такую же смесь, но при соотношении 2:1 на 24 часа. Материал высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 4 часов. Затем костные пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом.Example 1. The human donor bone, which has undergone the necessary tests, is mechanically cleaned of muscles and tendons, cut into 0.2-0.6 cm thick plates, placed in a solution of 0.1 M phosphate buffer heated to 65 ° C twice every 30 minutes with pH 5.8-6.0, after which the buffer is drained and the plates are transferred to a solution of activated 0.15% papain at 65 ° C in a thermostat for 24 hours. Then the supernatant is drained, the plates are washed with 5 volumes of water at 60 ° C and placed in a 0.4 N alkali solution for 24 hours at room temperature. The material is washed from alkali and dried. The plates are placed first twice for 4 hours in an ethanol / chloroform mixture (1: 2 ratio), and then twice in the same mixture, but at a 2: 1 ratio for 24 hours. The material is dried and treated with 1.5% hydrogen peroxide for 4 hours. Then the bone plates are washed first with purified water, then with ethanol.
В случае получения костного коллагена материал после обезжиривания в органических растворителях высушивают и проводят его декальцинацию в 0,5 N соляной кислоте. Кислоту отмывают и костные пластины обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 4 часов. Материал снова отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной до 0,8 см. В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В клинических, экспериментальных и научных целях недекальцинированный костный материал и костный коллаген могут быть насыщены биологически активными веществами (сульфатированные гликозаминогликаны, факторы роста - PDGF, IGF, FGF и т.д., а также могут быть использованы в качестве носителей для разных типов клеток - стволовых, эмбриональных, клеток крови и т.д.In the case of obtaining bone collagen, the material after degreasing in organic solvents is dried and decalcified in 0.5 N hydrochloric acid. The acid is washed off and the bone plates are treated with 1.5% hydrogen peroxide for 4 hours. The material is again washed first with purified water, then with ethanol. The material thus treated is dried at room temperature, lyophilized, packaged and sterilized by radiation. Animal bones up to 0.8 cm thick are treated in the same way. At the end of each technological cycle, analytical studies are carried out for the presence of protein, proteoglycans and lipids in the material. The resulting materials are used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology. For clinical, experimental and scientific purposes, non-decalcified bone material and bone collagen can be saturated with biologically active substances (sulfated glycosaminoglycans, growth factors - PDGF, IGF, FGF, etc., and can also be used as carriers for different types of cells - stem, embryonic, blood cells, etc.
Пример 2. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0-2,0 см, помещают дважды по 1 часу в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,3% папаина при 65°С в термостат на 24 часа.Example 2. Passing the necessary veterinary control, the spongy bone of a pig is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into plates with a thickness of 1.0-2.0 cm, placed twice for 1 hour in a solution of 0.1 M phosphate buffer with a pH of 5.8-6 , 0 at 65 ° C, after which the buffer is drained and the plates are transferred to a solution of activated 0.3% papain at 65 ° C in a thermostat for 24 hours.
Перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 70°С, охлаждают и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают сначала на 4 и 24 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1: 2), а затем на следующие 4 и 24 часа в такую же смесь, но при соотношении 2:1. После обезжиривания материал высушивают и либо сразу обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 4 часов, либо проводят его декальцинацию в 1 N соляной кислоте и затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 4 часов с последующей отмывкой от кислоты. Оба вида материала отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Полученный таким образом костный матрикс и костный коллаген разрезают на фрагменты различной формы и размера: кубы, параллепипеды, шайбы, блоки и т.д., высушивают при комнатной температуре или лиофильным способом, упаковывают и стерилизуют радиационным облучением. Аналогично обрабатываются и кости различных животных и человека, когда фрагменты костей имеют толщину свыше 1 см.The digest is drained, the plates are washed with 5 volumes of water at 70 ° C, cooled and placed in a 0.4 N alkali solution for 24 hours at room temperature. The material is washed from alkali and dried. The plates are placed first for 4 and 24 hours in an ethanol / chloroform mixture (1: 2 ratio), and then for the next 4 and 24 hours in the same mixture, but with a 2: 1 ratio. After degreasing, the material is dried and either immediately treated with 3% hydrogen peroxide for 4 hours, or it is decalcified in 1 N hydrochloric acid and then treated with 3% hydrogen peroxide for 4 hours, followed by washing from the acid. Both types of material are washed first with purified water, then with ethanol. The bone matrix and bone collagen obtained in this way are cut into fragments of various shapes and sizes: cubes, parallelepipeds, washers, blocks, etc., dried at room temperature or by freeze drying, packaged and sterilized by radiation. The bones of various animals and humans are similarly processed when bone fragments are more than 1 cm thick.
В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В клинических, экспериментальных и научных целях костный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами (сульфатированные гликозаминогликаны, факторы роста - PDGF, IGF, FGF и т.д.), а также может быть использован в качестве носителя разных типов клеток - стволовых, эмбриональных и т.д.At the end of each technological cycle, analytical studies are carried out for the presence of protein, proteoglycans and lipids in the material. The resulting materials are used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology. For clinical, experimental and scientific purposes, bone collagen can be saturated with biologically active substances (sulfated glycosaminoglycans, growth factors - PDGF, IGF, FGF, etc.), and can also be used as a carrier of different types of cells - stem, embryonic and etc.
Пример 3. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,5-2,0 см, помещают дважды по 1 часу в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,4% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 80°С, охлаждают и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают дважды сначала на 4 и 24 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1:2), а затем дважды на следующие 4 и 24 часа в такую же смесь, но при соотношении 2:1. Как и в предыдущем примере, материал высушивают и либо сразу обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 24 часов - остеоматрикс, либо проводят его декальцинацию в 1 N серной кислоте и только затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 24 часов после отмывки от кислоты - костный коллаген. Оба вида материала отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Полученные таким образом биоматериалы разрезают на фрагменты различной формы и размера: кубы, параллепипеды, шайбы, блоки и т.д., высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатываются и кости различных животных и человека, когда фрагменты костей имеют толщину свыше 1 см. В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии.Example 3. Passing the necessary veterinary control, the pig’s cortical bone is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into plates 1.5-2.0 cm thick, placed twice for 1 hour in a solution of 0.1 M phosphate buffer with a pH of 5.8-6 , 0 at 65 ° C, after which the buffer is drained and the plates are transferred to a solution of activated 0.4% papain at 65 ° C in a thermostat for 24 hours. The digest is drained, the plates are washed with 5 volumes of water at 80 ° C, cooled and placed in a 0.4 N alkali solution for 24 hours at room temperature. The material is washed from alkali and dried. The plates are placed twice first for 4 and 24 hours in an ethanol / chloroform mixture (1: 2 ratio), and then twice for the next 4 and 24 hours in the same mixture, but with a 2: 1 ratio. As in the previous example, the material is dried and either immediately treated with 3% hydrogen peroxide for 24 hours - osteomatrix, or it is decalcified in 1 N sulfuric acid and only then treated with 3% hydrogen peroxide for 24 hours after washing from acid - bone collagen. Both types of material are washed first with purified water, then with ethanol. The biomaterials thus obtained are cut into fragments of various shapes and sizes: cubes, parallelepipeds, washers, blocks, etc., dried at room temperature, packaged and sterilized by radiation. Bones of various animals and humans are processed in a similar manner when bone fragments have a thickness of more than 1 cm. At the end of each technological cycle, analytical studies are carried out for the presence of protein, proteoglycans and lipids in the material. The resulting materials are used to replace bone defects during surgical interventions in dentistry, orthopedics and traumatology.
Пример 4. Донорскую кость человека, прошедшую необходимые анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,5-0,8 см и обрабатывают, как в примере 1 до этапа декальцинации. Затем обезжиренные костные пластины высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 6 часов. Пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной 0,5-1,0 см.Example 4. A human donor bone that has undergone the necessary tests is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into plates 0.5-0.8 cm thick and processed, as in Example 1, before the decalcification step. Fat-free bone plates are then dried and treated with 1.5% hydrogen peroxide for 6 hours. The plates are washed first with purified water, then with ethanol. The material thus treated is dried at room temperature, lyophilized, packaged and sterilized by radiation. The bones of animals 0.5-1.0 cm thick are similarly treated.
В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов.At the end of each technological cycle, analytical studies are carried out for the presence of protein, proteoglycans and lipids in the material.
Пример 5. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую или кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0-2,0 см и затем подвергают обработке, как описано в примере 2 вплоть до этапа декальцинирования. Затем обезжиренные костные пластины высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 6 часов. Пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют спиртом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной 0,5-1,0 см.Example 5. Passing the necessary veterinary control, the spongy or cortical bone of a pig is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into plates with a thickness of 1.0-2.0 cm and then subjected to processing as described in example 2 up to the stage of decalcification. Fat-free bone plates are then dried and treated with 1.5% hydrogen peroxide for 6 hours. The plates are washed first with purified water, then with ethanol. The material thus treated is dried at room temperature, lyophilized, packaged and sterilized with alcohol. The bones of animals 0.5-1.0 cm thick are similarly treated.
Настоящее изобретение промышленно применимо, освоено в лабораторных условиях, результаты которых показывают практическую ценность полученного биоматериала для остеопластики и тканевой инженерии.The present invention is industrially applicable, mastered in the laboratory, the results of which show the practical value of the obtained biomaterial for osteoplasty and tissue engineering.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007126721/15A RU2342162C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007126721/15A RU2342162C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2342162C1 true RU2342162C1 (en) | 2008-12-27 |
Family
ID=40376742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007126721/15A RU2342162C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2342162C1 (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2482882C1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Bioimplant with multifunctional bioactive nanostructured coating |
| RU2504405C1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СТАЛВЕК" | Osteoplastic bioresorbable material for bone defect replacement and method for preparing it |
| RU2508131C2 (en) * | 2012-04-28 | 2014-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Имплантбио" | Hardened biocomposite for bone defect replacement |
| RU2663283C1 (en) * | 2017-10-09 | 2018-08-03 | Общество с ограниченной ответственностью "Дубна-Биофарм" | Method for obtaining material for bioplastic operations and material for bioplastic operations |
| RU2686309C1 (en) * | 2018-11-07 | 2019-04-25 | Владимир Семенович Акатов | Method for producing osteoplastic material from bone tissue |
| RU2721604C1 (en) * | 2019-06-07 | 2020-05-21 | Юрасова Юлия Борисовна | Method for producing osteoplastic biomaterials from bone tissue |
| US10821206B2 (en) | 2015-11-04 | 2020-11-03 | Ilaya Usa Corporation | Human cell-based medicinal products and methods for osteoreparation |
| CN116694234A (en) * | 2023-06-09 | 2023-09-05 | 四川瑞宝生物科技股份有限公司 | Method for rapidly preparing bone gelatin |
| PL441984A1 (en) * | 2022-08-08 | 2024-02-12 | Joanna Barbara Kisała | Method of obtaining a collagen matrix from bones and the collagen matrix obtained by this method and use of the collagen matrix |
-
2005
- 2005-10-27 RU RU2007126721/15A patent/RU2342162C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2482882C1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Bioimplant with multifunctional bioactive nanostructured coating |
| RU2508131C2 (en) * | 2012-04-28 | 2014-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Имплантбио" | Hardened biocomposite for bone defect replacement |
| RU2504405C1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СТАЛВЕК" | Osteoplastic bioresorbable material for bone defect replacement and method for preparing it |
| WO2014058343A1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Общество с ограниченной ответственностью "СТАЛВЕК" | Osteogenic bioresorbable material for the replacement of bone defects and method for producing same |
| US10821206B2 (en) | 2015-11-04 | 2020-11-03 | Ilaya Usa Corporation | Human cell-based medicinal products and methods for osteoreparation |
| RU2663283C1 (en) * | 2017-10-09 | 2018-08-03 | Общество с ограниченной ответственностью "Дубна-Биофарм" | Method for obtaining material for bioplastic operations and material for bioplastic operations |
| RU2686309C1 (en) * | 2018-11-07 | 2019-04-25 | Владимир Семенович Акатов | Method for producing osteoplastic material from bone tissue |
| RU2721604C1 (en) * | 2019-06-07 | 2020-05-21 | Юрасова Юлия Борисовна | Method for producing osteoplastic biomaterials from bone tissue |
| PL441984A1 (en) * | 2022-08-08 | 2024-02-12 | Joanna Barbara Kisała | Method of obtaining a collagen matrix from bones and the collagen matrix obtained by this method and use of the collagen matrix |
| CN116694234A (en) * | 2023-06-09 | 2023-09-05 | 四川瑞宝生物科技股份有限公司 | Method for rapidly preparing bone gelatin |
| CN116694234B (en) * | 2023-06-09 | 2024-04-12 | 四川瑞宝生物科技股份有限公司 | Method for rapidly preparing bone gelatin |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2342162C1 (en) | Method for bone tissue biomaterial obtaining, and material for osteoplasty and tissue engineering obtained by such method | |
| US8241673B2 (en) | Method for producing biomaterials from bone tissue and material used for osteoplasty and tissue engineering | |
| RU2104703C1 (en) | Method of preparing material for osteoplastics and material prepared by this method | |
| JP3643381B2 (en) | Resorbable extracellular matrix for cartilage tissue reconstruction | |
| EP1453434B1 (en) | Tissue repair compositions and methods for their manufacture and use | |
| KR100381741B1 (en) | Collagen product containing collagen of marine origin with a low odor and with improved mechanical properties, and its use in the form of cosmetic or pharmaceutical compositions or products | |
| US7892572B2 (en) | Orthopaedic materials derived from keratin | |
| JP2004528908A (en) | Reinforced base material | |
| RU2721604C1 (en) | Method for producing osteoplastic biomaterials from bone tissue | |
| RU2278679C1 (en) | Material for osteoplasty and method for production thereof | |
| RU2273489C1 (en) | Method for obtaining collagen from bone tissue | |
| RU2782928C1 (en) | Method for producing collagen powder for medical purposes from animal skin | |
| US8685092B2 (en) | Material for osteoplasty and tissue engineering | |
| RU2456003C1 (en) | Method of producing demineralised crushed bone matrix | |
| KR20040048665A (en) | A process of preparing for delayed absorbable bone fixation device | |
| JPH06343687A (en) | Cell-intruding bone repairing material | |
| KR20050023298A (en) | Orthopaedic materials derived from keratin | |
| AU2002324854A1 (en) | Tissue repair compositions and methods for their manufacture and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111028 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20121120 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171028 |