RU2274656C1 - Способ получения высокоочищенного рекомбинантного полипептида со свойствами фактора некроза опухолей альфа человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии и может быть использовано в медико-биологической промышленности. Предложен способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) человека, предусматривающий культивирование штамма - продуцента E.coli SG20050/pTNF311Δ, разрушение клеток ультразвуком, извлечение целевого белка и 3-стадийную хроматографическую очистку продукта на DEAE-целлюлозе в линейном градиенте NaCl при рН 8,0, на гидроксилапатите в линейном градиенте К-фосфата при рН 8,0 и на гидроксилапатите в линейном градиенте К-фосфата при рН 6,7. Получаемый предложенным способом рекомбинантный ФНО-альфа отличается пониженным содержанием примесных белков, нуклеиновых кислот и особенно липополисахаридов, что обеспечивает возможность его непосредственного медицинского использования. 2 табл., 5 ил.

Description

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой способ выделения и ультраочистки физиологически активного рекомбинантного полипептида со свойствами фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) человека, полученного генно-инженерным способом, с целью разработки на его основе медицинского препарата.

ФНО-альфа продуцируется в организме активированными макрофагами и представляет собой полипептид, состоящий из 157 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 17000 Да. В процессе исследования его свойств in vitro было показано, что он способен вызывать лизис опухолевых клеток различных линий и не действует на нормальные клетки организма, а также играет ключевую роль в иммунной и воспалительной реакциях организма [1-3].

Глубокие и широкомасштабные исследования ФНО-альфа, как и других физиологически активных эукариотических белков, стали возможны благодаря технике рекомбинантных ДНК, позволившей нарабатывать этот полипептид в больших количествах путем микробиологического синтеза в клетках Е.coli, трансформированных плазмидой, несущей ген ФНО-альфа человека. В настоящее время во всем мире проводятся клинические испытания препаратов на основе рекомбинантного ФНО-альфа в качестве противоопухолевого средства и средства для лечения тяжелых вирусных инфекций (псориаз, гепатит В) [4-6].

Одной из основных проблем при разработке способа получения рекомбинантного ФНО-альфа является увеличение выхода целевого белка из исходного клеточного экстракта. Эта задача биотехнологами успешно решается. Известен способ получения рекомбинантого ФНО-альфа, обеспечивающий 63%-ный выход от его содержания в исходном экстракте клеток штамма-продуцента [7].

При создании медицинских препаратов на основе рекомбинантного ФНО-альфа человека крайне важной является чистота получаемой путем микробиологического синтеза субстанции. Содержание ДНК, липополисахаридов (ЛПС) и бактериальных примесных белков в рекомбинантных белках, используемых в медицине, крайне нежелательно и строго нормируется: содержание ДНК должно быть не более 100 пг/мг белка, а содержание ЛПС и белков штамма-продуцента не более 200 нг/мг белка [8, 9]. Чем ниже указанные параметры, тем препарат менее токсичен, а, следовательно, более эффективен.

Известны способы для эффективной очистки рекомбинантного ФНО-альфа, в которых используют аффинную хроматографию на колонке с моноклональными антителами [10, 11]. Данные о выходе продукта отсутствуют. Недостатки этих способов следующие: сложность и высокая стоимость получения иммунного сорбента, трудность масштабирования процесса, необходимость дополнительного контроля целевого продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.

Известен способ получения и очистки рекомбинантного полипептида со свойствами ФНО-альфа человека, основанный на использовании штамма Е. coli SG20050, трансформированного плазмидой pTNF31Δ, несущей ген ФНО-альфа под контролем промоторов ранней области бактериофага Т7, обеспечивающих конститутивный синтез целевого белка [12]. Согласно данному способу разрушение клеток штамма-продуцента проводят ультразвуком в жестком режиме - 4 цикла озвучивания по 5 мин, допуская нагрев обрабатываемой биомассы до 50°С. Такой режим способствует глубокому разрушению клеток и клеточных структур и выходу в раствор всех компонентов клетки: в том числе нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), (ЛПС) и сопутствующих клеточных белков, от которых необходимо очистить целевой белок как можно более тщательно. Большое количество указанных примесей в субстанции ФНО-альфа, получаемой по указанной технологии, делает проблему очистки рекомбинантного полипептида трудноразрешимой. В способе используют четыре различных сорбента: нейтральный Н-γ-гель, анионообменник - QAE-γ-гель, катионообменник - Р-γ-гель и сефадекс G-25, что делает процедуру очистки многоступенчатой и достаточно трудоемкой. В качестве буферной системы при хроматографии на Р-γ-геле используют дорогой реактив - лимонную кислоту (о.с.ч.). Кроме того, для осветления клеточного экстракта согласно предложенному способу требуется специальное дорогостоящее оборудование - импортная ультрафильтрационная установка. Выход ФНО-альфа невысок и составляет всего 47% от содержания его в клеточном экстракте. Степень чистоты препарата оценивали только по данным электрофореза, содержание примесей ЛПС, клеточных нуклеиновых кислот и белков, а также пирогенность препарата не определяли.

Наиболее близким по достигаемому эффекту и технической сущности является способ [13; прототип]. Согласно способу-прототипу биомассу клеток Е. coli SG20050/pTNF311Δ, выращенную стандартным способом в L-бульоне и собранную центрифугированием, суспендируют и подвергают обработке ультразвуком в более мягких условиях (5-6 раз по 1 мин с интервалами между обработками, равными 1 мин). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием и проводят хроматографическую очистку целевого продукта на двух доступных коммерческих сорбентах: ДЕАЕ-целлюлозе и гидроксилапатите. Для этого супернатант наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52 и промывают буфером А (20мМ трис-HCl, 0,5 мМ ЭДТА рН 7,5-7,7), белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,15 М в буфере А. Элюированный с колонки раствор ФНО-альфа при концентрации NaCl 0,07-0,08 М разбавляют двумя объемами буфера А и наносят на колонку с гидроксилапатитом, которую промывают буфером В (0,05 М К-фосфат рН 6,8-7,0), белки элюируют линейным градиентом концентраций К-фосфата от 0,05 до 0,33 М. Раствор ФНО-альфа, элюированный с колонки при концентрации К-фосфата 0,28-0,30 М, имеет чистоту около 87%. Продукт диализуют против буфера А и подвергают повторной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52, как описано выше.

Препарат ФНО-альфа, элюированный с сорбента при концентрации NaCl 0,07 -0,08 М, имеет чистоту около 95%. Выход электрофоретически гомогенного препарата ФНО-альфа составляет 50-60% от содержания в исходном клеточном экстракте. При содержании целевого белка в продуценте в количестве 24% от суммы клеточных белков удельная продуктивность составляет 8,6 мг из 1 г клеток. Содержание примесных белков штамма-продуцента в конечном продукте, определенное методом ИФА [9], составляет около, но не более 200 нг/мг ФНО-альфа; содержание примесей ДНК, определенное методом молекулярной гибридизации [15], составляет не более 100 пг/мг ФНО-альфа; содержание ЛПС, определенное химико-ферментативным методом [14], около 200 нг/мг ФНО-альфа.

Технология по способу-прототипу эффективна, обеспечивает достаточно высокий выход целевого белка (50-60%). Однако чистота продукта, охарактеризованная по показателям качества, предъявляемым к медицинским препаратам, полученным путем микробиологического синтеза (содержание примесных белков клеток штамма-продуцента, нуклеиновые кислоты, ЛПС), находится на пределе допустимого.

Технической задачей изобретения является разработка способа получения ультрачистого препарата физиологически активного рекомбинантного полипептида со свойствами ФНО-альфа с пониженным содержанием примесных компонентов, пригодного для использования в медицине, при сохранении стабильно высокого выхода целевого продукта из биомассы штамма-продуцента.

Поставленная задача решается путем использования в способе штамма Е.coli SG20050, трансформированного плазмидой pTNF311Δ, кодирующей полипептид ФНО-альфа человека с 5-ой по 157 аминокислоту под контролем двух промоторов ранней области фага Т7 [12] в совокупности с очисткой целевого полипептида путем дезинтеграции клеток ультразвуком, отделения клеточного дебриса центрифугированием, дополнительного извлечения целевого белка промывкой клеточного дебриса буфером, трех последовательных стадий хроматографической очистки экстрагированных белков на диэтиламиноэтилцеллюлозе при рН 8,0 и на гидроксилапатите при рН 8,0 и затем при рН 6,75. Повышение величины рН до 8,0 при нанесении клеточного экстракта на диэтиламиноэтилцеллюлозу обеспечивает более прочное связывание ФНО-альфа с носителем и исключает его частичную потерю при нанесении и промывке колонки.

Сущность способа заключается в следующем.

Биомассу клеток E.coli SG20050/pTNF311Δ, выращенную в качалочных колбах или в ферментере в L-бульоне и собранную центрифугированием, суспендируют в буфере для разрушения (25 мМ трис-HCl, рН 8,0±0,1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSP) в соотношении 7 мл буфера на 1 г биомассы. Затем суспензию помещают в ледяную баню и подвергают обработке ультразвуком (установка УЗДН-2Т) при частоте 22 кГц 5 раз по 1 мин с интервалом по 1 мин для охлаждения смеси (температура не должна превышать 8±2°С). Клеточный дебрис, собранный центрифугированием в течение 50 мин при 16000 об/мин (центрифуга J2-21, ротор JA-20, температура 4±2°С), промывают буфером для разрушения, затем разделяют фазы центрифугированием, как описано выше. Объединенные супернатанты наносят на колонку с DEAE-целлюлозой DE-52 (из расчета 8-11 мг белка на 1 мл сорбента). Колонку промывают буфером А (25 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0±0,1) и белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,15 М в буфере А. ФНО-альфа, элюированный с колонки при концентрации NaCl 0,045-0,07 М, разбавляют двумя объемами буфера Б (10 мМ КН₂РО₄, рН 8,0±0,1) и наносят на колонку с гидроксилапатитом (из расчета 6±2 мг белка на 1 мл сорбента). Колонку промывают буфером Б и белки элюируют линейным градиентом концентрации калий-фосфата от 0,01 до 0,30 М, рН 8,0±0,1. ФНО-альфа, элюированный с колонки при концентрации калий-фосфата 0,17-0,24 М, имеет чистоту 90%. Продукт диализуют против буфера В (10 мМ КН₂PO₄, рН 6,7±0,1) и подвергают повторной хроматографии на гидроксилапатите (нагрузка на носитель 4±1 мг белка на 1 мл сорбента). Колонку промывают буфером В и белки элюируют линейным градиентом концентрации калий-фосфата от 0,01 до 0,40 М, рН 6,7±0,1. ФНО-альфа, элюированный с колонки при концентрации 0,19-0,23 М калий-фосфата, имеет чистоту 97-100%. Полученный продукт, содержащий при анализе одну белковую фракцию с молекулярным весом 16,7±0,3 кДа, диализуют против буфера Д (10 мМ KH₂PO₄, pH 7,2±0,1).

Данные шести препаративных опытов по выделению рекомбинантного ФНО-α приведены в табл.1

Таблица 1
Сводная таблица экспериментальных данных по препаративному выделению рекомбинантного ФНО-α человека
Стадия	Измеряемый показатель		Образец препарата, полученного по предлагаемому способу
			№1	№2	№3	№4	№5	№6	Среднее по 6-ти опытам
			Количество использованной биомассы, г
			10,0	10,2	10,1	10,1	10,2	10,0	10,1
Экстракция	Общий белок	мг/мл	8,4	9,77	17,3	15,0	9,9	5,5
		мг	630	1328,7	1228,3	1065,0	1356,3	750
	ФНО-α	чистота, %	27	20	30	30	25	33	27,5
		мг	170,0	265,7	368,2	319,5	339	240,0
		выход, %	100	100	100	100	100	100	100
Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе	Общий белок	мг/мл	0,6	1,02	2,0	1,79	1,865	0,45
		мг	178,8	164,2	684,0	521,8	270	152,1
	ФНО-α	Чистота, %	60,0	89	48,0	50,0	90	90,0	71,2
		мг	107,3	146,14	328,3	260,9	243	136,9
		выход, %	63,1	55	89,2	81,7	71,7	57,0	69,6
Хроматография на ГАП (рН 8,0) и диализ	Общий белок	мг/мл	2,6	1,076	3,8	3,35	2,1	2,3
		мг	135,2	137,7	334,4	247,9	210	140,3
	ФНО-α	чистота, %	80,0	95	82,0	87,0	96	98,0	89,7
		мг	108,2	130,8	274,2	215,6	202	137,5
		выход, %	63,6	49,2	74,5	67,5	59,6	57,3	62,0
Хроматография на ГАП (pH 6,7) и диализ	Общий белок	мг/мл	2,15	1,1	2,65	2,84	2,45	2,27
		мг	103,2	110	260,0	194,5	198,5	140,7
	ФНО-α	чистота, %	97,0	98	98,5	100,0	98	98,0	98,2
		мг	101,1	107,8	256	194,5	194,5	137,9
		выход, %	59,5	41	69,5	61,0	57,4	57,5	57,6
		Выход ФНО-α/г биомассы	10,1	10,8	25,3	19,4	19,4	13,8	16,5

Согласно представленным данным средний выход препарата ФНО-альфа составляет 57,6% от содержания в исходном клеточном экстракте, что не ниже, чем в способе, прототипе (56% - данные описания к патенту 2144958), или 16,5 мг/г биомассы при содержании в экстракте 20-30%, что в 1,9 раза выше, чем в способе-прототипе.

Полученные по предлагаемому способу препараты рекомбинантного ФНО-альфа человека имеют высокую электрофоретическую чистоту - 97-100%. После гель-электрофореза в полностью денатурирующих условиях в геле при окраске Кумасси ярко-голубым G250 в хлорной кислоте в геле обнаруживается единственная полоса, соответствующая молекулярной массе 16700 Да при нагрузке 8,3 мкг/мм² поверхности кармана или 25 мкг на лунку с площадью сечения 3 мм² (фиг.2А). При окрашивании белков нитратом серебра в условиях, позволяющих выявить 0,05 мкг в полосе (или 1% примесных белков), в геле также обнаруживается единственная полоса, соответствующая ФНО-альфа (фиг.2Б). Нагрузка на гель при окрашивании серебром составляет 1,7 мкг белка на мм² или 5 мкг/лунку.

Иммуноблот препарата с моноклональными антителами к ФНО-альфа обнаруживает не более 3% димерной формы ФНО-альфа (фиг.3), а в некоторых препаратах не обнаруживает димеров, что соответствует предъявляемым требованиям к чистоте рекомбинантного белка для медицинского применения [8, 9].

Содержание примесных ДНК, определенное методом молекулярной гибридизации с ³²Р-меченой суммарной ДНК, выделенной из штамма-продуцента ФНО-альфа, проведенное согласно [15], составляет в среднем 45 пг/мг белка против 80 пг/мг белка в способе-прототипе (табл.2, фиг.4).

Определенное химико-ферментативным методом содержание примесей ЛПС [14] в препаратах ФНО-альфа, полученных по заявляемому способу, в 5 раз ниже, чем в способе-прототипе, и составляет в среднем 30 нг/мг (против 160 нг/мг белка в прототипе), см. табл.2.

Содержание примесей белков штамма-продуцента в конечном продукте, определенное методом иммуно-ферментного анализа [9], составляет в среднем по шести экспериментам 111 нг/мг ФНО-альфа против 127 нг/мг по способу-прототипу.

Испытания биологических свойств рекомбинантного ФНО-альфа человека, полученного заявляемым способом, проведенные на культуре клеток L929, показали, что препарат ФНО-альфа оказывает выраженное лизирующее действие на злокачественные клетки, а его удельная активность достигает величины 3,0×10⁷ ед/мг белка.

Таким образом, физико-химические характеристики и биологическая активность конечного продукта указывают на то, что рекомбинантный ФНО-альфа, полученный заявляемым способом, пригоден как для научных исследований, так и для исследований в медицине.

Новым по сравнению со способом-прототипом признаком является дополнительное извлечение ФНО-альфа из клеточного дебриса путем промывки осадка буфером, повышение рН до 8,0 при нанесении экстракта на ДЕАЕ-целлюлозу 52, что позволяет исключить потери целевого белка при нанесении на анионообменник и повысить степень очистки продукта, и две последовательные хроматографии на гидроксилапатите при различных рН (8,0, затем 6,7). Совокупность этих признаков позволяет получить высокоочищенный препарат рекомбинантного ФНО-альфа человека с уменьшенным по сравнению со способом-прототипом содержанием примесей бактериальных белков, липополисахаридов и ДНК при стабильно высоком выходе целевого цитокина.

Использование промывки клеточного дебриса, полученного после центрифугирования разрушенных ультразвуком клеток, позволяет на 8-10% увеличить извлечение рекомбинантного белка, что становится выгодным при масштабировании процесса. Повышение концентрации трис-HCl до 50 мМ и величины рН до 8,0 в буфере для разрушения биомассы позволяет исключить потерю рекомбинантного ФНО-альфа в процессе нанесения на ДЕАЕ-целлюлозу DE 52. Две последующие стадии хроматографической очистки проводят на гидроксилапатите. Этот носитель был синтезирован в лаборатории по известному методу Тизелиуса [16]. По способности разделять ФНО-альфа и белки клеток штамма-продуцента синтезированный носитель не уступал дорогостоящим образцам фирмы «Биорад», что исключает зависимость от поставок импортного гидроксилапатита. Кроме того, стоимость синтезированного гидроксилапатита во много раз ниже стоимости импортного носителя.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать высокоочищенный рекомбинантный ФНО-альфа человека с пониженным содержанием примесей бактериальных ЛПС и ДНК при стабильно высоком выходе целевого цитокина.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений.

Фиг.1. Электрофоретический анализ белков, полученных в процессе очистки ФНО-альфа, в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях.

1 - клеточный экстракт;

2 - целевая фракция с ДЭАЭ-целлюлозы;

3 - целевая фракция с гидроксилапатита (рН 8,0);

4 - целевая фракция с гидроксилапатита (рН 6,7).

Фиг.2. Электрофоретический анализ чистоты ФНО-альфа, выделенного по предлагаемому способу, в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях.

А - окраска Кумасси ярко-голубым G250 в хлорной кислоте.

Б - окраска серебром.

Цифрами под рисунком указано количество ФНО-альфа, внесенное в лунку.

Фиг.3. Взаимодействие ФНО-альфа с моноклональными антителами к ФНО-альфа (иммуноблот).

Очищенный белок фракционировали в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях и выявляли окрашиванием Кумасси ярко-голубым G250 в хлорной кислоте (А) или моноклональными антителами после предварительного переноса белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану (Б).

Фиг 4. Определение примесных ДНК в четырех образцах ФНО-альфа. Анализ проводили методом молекулярной гибридизации с ³²Р-меченой суммарной ДНК, выделенной из штамма-продуцента ФНО-альфа, по МУК 4.1/4.2.588-96, стр.15. В стандартном ряду ДНК брали следующее количество ДНК на пятно: 2 нг, 0,4 нг, 80 пг, 16 пг, 3,2 пг, 0,64 пг, 0 пг.

Фиг.5. Электрофоретический анализ белков, экстрагированных из биомассы Е. coli SG 20050/pTNF311Δ, в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях.

1 - белки клеточного экстракта;

2 - белки, дополнительно экстрагированные из клеточного дебриса.

Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже.

Пример 1. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного человеческого ФНО-альфа

10 г клеток E.coli SG20050/pTNF311Δ суспендируют в 70 мл буфера для разрушения (25 мМ трис-HCI, рН 8±0,1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSP) до гомогенного состояния. Затем суспензию помещают в ледяную баню и подвергают обработке ультразвуком (установка УЗДН-2Т) при частоте 22 кГц и амплитуде 17±2 мкм 5 раз по 1 мин с интервалом по 1 мин для охлаждения смеси (температура не должна превышать 8±2°С). Клеточный экстракт отделяют центрифугированием при 16000 об/мин в течение 50 мин (центрифуга J2-21, ротор JA-20, температура 4±2°С). Для большего извлечения ФНО-альфа из биомассы проводят повторное суспендирование клеточного дебриса в 70 мл того же буфера с последующим центрифугированием в описанных выше условиях. Объединенные супернатанты наносят на колонку с DEAE-целлюлозой DE-52 (объем 140 мл), уравновешенную буфером А (25 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8±0,1). Колонку промывают буфером А до отсутствия оптической плотности при длине волны 280 нм на выходе из колонки, затем элюируют белки линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,15 моль/л в буфере А (объем градиента 1300±50 мл). Собирают фракции объемом 10±0,5 мл и анализируют содержащиеся в них белки методом гель-электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Леммли [17]. ФНО-альфа обычно элюируется с колонки при концентрациях NaCl 0,045-0,07 моль/л. Фракции, содержащие ФНО-альфа, объединяют (суммарный объем 270±30), разбавляют буфером Б (10 мМ КН₂PO₄, рН 8±0,1) и наносят на колонку с гидроксилапатитом (объемом 60 мл), синтезированным по методу Тизелиуса и др. [16], уравновешенную буфером Б. Колонку промывают буфером Б до отсутствия оптической плотности при длине волны 280 нм на выходе из колонки, затем элюируют белки линейным градиентом концентрации калий-фосфата от 0,01 до 0,30 моль/л, рН 8,0±0,1. Собирают фракции объемом 5 мл и анализируют электрофорезом, как указано выше. ФНО-альфа обычно элюируется при концентрации калий-фосфата 0,17-0,24 моль/л. Фракции с содержанием ФНО-альфа 80% и более объединяют (объем объединенных фракций 90±10 мл) и диализуют против 2 л буфера В (10 мМ КН₂PO₄, рН 6,7±0,1) в течение ночи (14-17 ч) при температуре +4°С. Затем раствор ФНО-альфа наносят на колонку с гидроксилапатитом (объемом 50 мл), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В до отсутствия оптической плотности при длине волны 280 нм на выходе из колонки, затем элюируют белки линейным градиентом концентрации калий-фосфата от 0,01 до 0,4 моль/л, рН 6,7±0,1. Объем градиента 700 мл, элюат собирают фракциями объемом 4±0,5 мл. ФНО-альфа обычно элюируется при концентрации калий-фосфата 0,19-0,23 моль/л. Фракции, содержащие при анализе одну белковую фракцию с молекулярным весом 16,7±0,3 кДа, объединяют, диализом переводят в буфер Д (10 мМ КН₂PO₄, рН 7,2±0,1) и стерилизуют ультрафильтрацией, используя мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Электрофоретический анализ ФНО-α по стадиям очистки представлен на фиг.1.

Средний относительный выход ФНО-α составляет 57,6% от содержания его в грубом экстракте клеток или 165 мг из 10 г биомассы (16,5 мг из 1 г биомассы).

Чистоту и гомогенность препаратов ФНО-альфа (субстанция) определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле. Препарат электрофоретически гомогенен при нагрузке 8,3 мкг/мм² или 25 мкг на лунку при окрашивании Кумасси ярко-голубым G-250 (фиг 2А). При окрашивании нитратом серебра дополнительных полос не выявляется при нагрузке на гель 5 мкг на лунку (фиг 2Б). Содержание мономерной формы ФНО-альфа с молекулярной массой 16,7±0,3 кДа в редуцирующих условиях при окрашивании составляло не менее 97%.

При отсутствии в препарате ФНО-альфа примесей чужеродных белков картина иммуноблотинга совпадала с электрофореграммой (фиг.3).

Удельная цитотоксическая активность препаратов на клетках L929 составляет (1,85-3,3)х10⁷ ед.акт./мг белка. Содержание примесных белков E.coli составляет 90-140 нг/мг белка (в среднем 111 нг/мг), содержание примесей ДНК -45 пг/мг препарата (фиг.4) и содержание ЛПС 30 нг/мг препарата. Данные по шести опытам приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная характеристика качества препаратов ФНО-альфа, полученных по предлагаемому способу и способу-прототипу (в квадратных скобках указаны значения показателей, приведенные в способе-прототипе)
Характеристика препарата	Образец препарата, полученного по предлагаемому способу
	№1	№2	№3	№4	№5	№6	среднее значение
Примесь белков Е. coli, нг/мг [127]	140,0	118	110	110	100,0	90,0	111
Примесь ДНК Е. coli, пг/мг [80]	80,0	80	40	20	20	20,0	45
Примесь ЛПС, нг/мг [160)	40	20	40	20			30
Чистота (СВВ G250), % [более 95]	97,0	98,0	98,5	100,0	98,0	98,0	98,2
Чистота (окраска серебром), % [не более 2% примесных белков)	Единственная полоса мономера						Единственная полоса мономера
Удельная активность, ед/мг [2×107]	3,3×107	2,5×107	1,85×107	2,5×107	2,0×107	3,0×107	2,5×107

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что в препаратах ФНО-альфа, полученных заявляемым способом, содержание примесных клеточных белков E.coli в среднем составляет 111 нг/мг белка против 127 нг/мг в способе-прототипе; содержание примесей ДНК - 45 пг/мг препарата против 80 пг/мг в способе-прототипе (в 1,7 раза ниже), а содержание ЛПС в 5 раз ниже, чем в прототипе (30 нг/мг против 160 нг/мг).

Пример 2. Исследование зависимости извлечения ФНО-альфа от дополнительной экстракции клеточного осадка.

Биомассу штамма-продуцента суспендируют в буфере и обрабатывают ультразвуком, как описано в примере 1. Клеточный дебрис отделяют центрифугированием, супернатант собирают и определяют в нем содержание белка и процентное содержание ФНО-альфа. Клеточный дебрис тщательно ресуспендируют в том же буфере в объеме 70 мл. Суспензию центрифугируют в тех же условиях, что и в примере 1. В полученном супернатанте определяют содержание белка и процентное содержание ФНО-альфа. По данным электрофоретического анализа относительное содержание ФНО-альфа в обоих супернатантах составляет 20-25% (фиг.5). Повторная экстракция позволяет увеличить выход рекомбинантного белка при экстракции на 8-10%. Супернатанты объединяют и передают на следующую стадию.

Таким образом, в ходе экспериментов показано, что высокоочищенный рекомбинантный ФНО-альфа человека с пониженным содержанием примесей бактериальных ЛПС, ДНК и, частично, белков, может быть получен из штамма Е.Coli SG 20050, трансформированного плазмидой pTNF311Δ, кодирующей полипептид ФНО-альфа человека с 5 по 157 аминокислоту, путем дезинтеграции клеток ультразвуком, отделения клеточного дебриса центрифугированием, дополнительного извлечения целевого белка промывкой клеточного дебриса буфером, трех последовательных стадий хроматографической очистки экстрагированных белков на диэтиламиноэтилцеллюлозе при рН 8,0 и на гидроксилапатите при рН 8,0 и затем при рН 6,7. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет:

- повысить на 8-10% извлечение целевого белка из клеток продуцента;

- исключить потери целевого белка при нанесении на ДЕАЕ-целлюлозу за счет повышения рН до 8,0;

- повысить эффективность очистки на гидроксилапатите за счет проведения хроматографии при рН 8,0, затем при рН 6,7;

- исключить из процесса дорогостоящий импортный носитель - гидроксилапатит и использовать вместо него синтезированный в лаборатории по известному методу Тизелиуса.

При этом сохраняется высокий выход продукта и увеличивается чистота ФНО-альфа.

Литература

1. Недоспасов С.А., Турецкая Р.Л., Шахов А.Н. //Итоги науки и техники. Иммунология. 1988. №22. С.91.

2. Кетлинский С.А., Белова А.А. и др. //Успехи современной биологии. 1989. №107. Вып.1. С.79-91.

3. Tracty K.J. //The cytokine Handbook ed. A. Thomson. 1994. Academic. Press. P. 289-304.

4. Kemeny N. Childs В., Larchian N. et al. //Cancer. 1990. V. 66. N 4. Р.659-663.

5. Takematsu H., Ozawa H., Yoshimura Т. et al. //British. J. Dermatology. 1991. V.124. N.2. P.209-210.

6. Sheron N, Lau J.Y.N., Daniels H.M et al. //Lancet. 1990. V.336. P.321-322.

7. Патент SU №1630602, кл. С 12 N 37/02, опубл. БИ №7 за 1991 г.

8. РФ 42-28-9-89. Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методом генетической инженерии. Москва. 1988.

9. ВФ 42-226 ВС-89. Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 (полуфабрикат).

10. Nakamura S., Masegi S., Fukuoka M. et al. //Agrical. Biol. Chem. 1991. N1. P.53-57.

11. Афанасьев В.М., Хлебников B.C. //Препаратив. хроматогр. физ. актив. веществ на полимерных сорбентах: Тез. Докл. 1 Всес. симп. Ленинград. 11-13 окт. 1988 - Л. 1988. С.21.

12. Тихонов Р.В., Якимов С.А., Коробко В.Г., Вульфсон Ф.Н. //Биоорган. химия. 1996. №3. С.163-167.

13. Патент РФ №2144958, кл. С 12 N 15/28, опубл. БИ №3 за 2000 г.

14. Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М. //ЖМЭИ. 1999. №5. С.109-112.

15. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96. Минздрав России. M. 1998.

16. Tiselius A., Hjerten S., Levine O. // Arch Biochem. Biophys. 1956. V. 65. P. 132.

17. Laemmli U.K. //Nature (London). 1970. V. 227. Р. 680-685.

Claims (1)

1. Способ получения высокоочищенного рекомбинантного полипептида со свойствами фактора некроза опухолей альфа человека, включающий культивирование штамма - продуцента E.coli SG 20050/pTNF311Δ, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонках с сорбентами, отличающийся тем, что целевой белок дополнительно извлекают промывкой клеточного дебриса буфером для разрушения клеток, а хроматографическую очистку продукта проводят последовательно на DEAE-целлюлозе в линейном градиенте NaCl при рН 8,0±0,1 и дважды на гидроксилапатите в линейном градиенте К-фосфата, сначала при рН 8,0±0,1, а затем при рН 6,7±0,1.

Images