RU2260011C1

RU2260011C1 - Способ получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида

Info

Publication number: RU2260011C1
Application number: RU2004105794/04A
Authority: RU
Inventors: Е.Н. Олсуфьева (RU); Е.Н. Олсуфьева; шова А.Н. Тев (RU); А.Н. Тевяшова; М.Н. Преображенска (RU); М.Н. Преображенская
Original assignee: ОЛСУФЬЕВА Евгения Николаевна; Тевяшова Анна Николаевна; ПРЕОБРАЖЕНСКАЯ Мария Николаевна
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2005-09-10
Also published as: RU2004105794A

Abstract

Изобретение относится к способу получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида. Способ включает гликозилирование карминомицинона 1,4-ди-O-замещенным-N-ацилдаунозамином (2,3,6-тридезокси-3-амино-L-ликсо-гексапиранозой) формулы 3

где R¹=трифторацетил, N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонил, аллилоксикарбонил, R²=ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил, R³=трихлорацетамидил, триалкилсилил, ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил, в присутствии триметилсилилтрифторметансульфоната в смеси безводных апротонных органических растворителей, удаление блокирующих групп и выделение карминомицина в виде основания или гидрохлорида. Гликозил-донор используют в виде смеси α и β изомеров или в виде индивидуальных α или β изомеров. В качестве безводных апротонных органических растворителей используют смеси диоксана с хлороформом, метиленхлоридом, диэтиловым эфиром, ацетоном и тетрагидрофураном. Реакцию проводят в присутствии молекулярных сит, при температуре не выше 10°С, в атмосфере осушенного воздуха или осушенного инертного газа. Удаление защитных групп проводят в присутствии гидроксидов щелочных металлов в водно-органической среде: вода - метанол, вода - диоксан, вода - тетрагидрофуран, вода - ацетон. Способ позволяет увеличить выход карминомицина в 3 раза по сравнению с прототипом. 4 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида.

Карминомицин (формула 1, R=R¹=R²=Н) относится к группе антрациклиновых антибиотиков, зарекомендовавших себя как высокоэффективные противоопухолевые и противолейкозные препараты, широко используемые в клиниках РФ и за рубежом. Антибиотик карминомицин является оригинальным отечественным антибиотиком, который был впервые получен путем биосинтеза в Институте по изысканию антибиотиков АМН СССР. Карминомицин успешно прошел клинические испытания, и был разрешен к применению в СССР и РФ. Карминомицин рекомендован при следующих заболеваниях: саркома мягких тканей (лейкомиосаркома, рабдомиосаркома, липосаркома и др.); ретикулосаркома и лимфосаркома; рак молочной железы и хорионэпителиома матки; острые миелобластные и лимфобластные лейкозы. Антибиотик имеет широкие показания при лечении злокачественных новообразований у взрослых и детей и применяется как индивидуальный препарат, так и в комбинациях с другими лекарственными средствами.

Известен способ биосинтетического получения карминомицина [а.с. "Способ получения карминомицина" №508076 от 11.11.1975 г, а.с. "Способ получения карминомицина" №543257 от 21.09.1976 г.]. Недостатком этого метода является присутствие сопутствующей примеси - 13-дигидрокарминомицина, низкая продуктивность штамма-продуцента Actinomadura carminata по сравнению с продуктивностью штаммов противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы, сложность процесса выделения и очистки.

Известен способ получения карминомицина химическим синтезом [Cassinelli G., Grein A., Masi P., Suarato A., Bemardi L., Arcamone F.Н. Preparation and biological evaluation of 4-0-demethyldaunorubicin (carminomycin I) and its 13-dihydro derivative -Journal of Antibiotics, 31, 178-184, 1978]. Гидролизом гликозидной связи даунорубицина получают агликон дауномицинон (формула 2, R=СН₃) и моносахарид - даунозамин (формула 3, R¹=R²=R³=H). Дауномицинон подвергают деметилированию реакцией с AlCl_з в кипящем хлористом метилене. Полученный с выходом 62% агликон карминомицинон (формула 2, R=H) гликозилируют 2,3,6-тридезокси-3-трифторацетамидо-4-O-трифторацетил-α-L-лмксо-гексапиранозил хлоридом в присутствии трифторметансульфоната серебра в смеси хлористый метилен-диметилформамид. Защищенный гликозид деблокируют 0.13н NaOH, получая карминомицин гидрохлорид с выходом 10% в расчете на дауномицинон. Недостатком описанного химического синтеза является низкий выход - 10% в расчете на дауномицинон, необходимость получения чистого аномера 2,3,6-тридезокси-3-трифторацетамидо-4-O-трифторацетил-α-L-ликсо-гексапиранозил хлорида и его нестабильность.

Техническая задача изобретения - увеличение выхода карминомицина при получении его путем химического синтеза.

Техническая задача решается тем, что предложен способ получения карминомицина или его гидрохлорида, включающий гликозилирование карминомицинона гликозил-донором 1,4-ди-O-замещенным-3-N-ацилдаунозамином в присутствии катализатора в смеси безводных апротонных органических растворителей, удаление блокирующих групп и выделение карминомицина в виде основания или гидрохлорида, при этом в качестве катализатора используется триметилсилилтрифторметансульфонат, в качестве гликозилдонора используется 1,4-ди-O-замещенный-3-N-ацилдаунозамин (2,3,6-тридезокси-3-амино-L-ликсо-гексапираноза),

где R¹=трифторацетил или N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонил или аллилоксикарбонил, преимущественно N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонил или трифторацетил, R²=ацетил или трифторацетил или 4-нитробензоил или аллилоксикарбонил, преимущественно ацетил, R³=трихлорацетамидил или триалкилсилил или ацетил или трифторацетил или 4-нитробензоил или аллилоксикарбонил, преимущественно ацетил, в качестве безводных апротонных органических растворителей используют диоксан-метиленхлорид или диоксан-хлороформ или диоксан-метиленхлорид-диэтиловый эфир или диоксан-ацетон или диоксан-хлороформ-диэтиловый эфир или диоксан-тетрагидрофуран-метиленхлорид, преимущественно диоксан-метиленхлорид, при этом реакция проводится в присутствии молекулярных сит (преимущественно 4Å), удаление блокирующих групп проводят щелочным агентом.

В качестве гликозил-донора используют смесь α и β изомеров или индивидуальные α или β изомеры. Реакцию проводят при пониженной температуре, преимущественно не выше 10°С. Реакцию проводят в атмосфере осушенного воздуха или осушенного инертного газа. Удаление защитных групп проводят в присутствии гидроксидов щелочных металлов в водно-органической среде: вода - метанол или вода - диоксан или вода - тетрагидрофуран или вода - ацетон.

Для защиты 3-амино и 4-O-гидроксильной групп даунозамина используют сочетание блокирующих групп, устойчивых в слабокислых средах. Введение защитных и активирующих групп проводили по стандартным методикам, используемых в химии углеводов [H.M.I.OSBORN, Best Synthetic methods, Carbohydrates, Academic press, 2003; Handbook of Reagents for Organic Synthesis "Activating Agents and Protective Groups", edited by A.J.Pearson, W.J. Roush, JOHN WILEY & SONS, 1999]. Частный случай в виде использования 1,4-ди-O-замещенного-N-ацилдаунозамина, содержащего в положениях 1-O- и 4-O- одну и ту же группу ацильного типа (формула 3, где R²=R³=ацильная группа) преимущественно ацетильную, позволяет упростить синтез гликозил-донора. Используя эти соединения (формула 3, где R²=R³=ацильная группа), также возможна замена активирующей ацильной группы R³ на другую активирующую группу путем ее селективного гидролиза до гидроксильной группы (с сохранением защитных групп R¹, R²), с последующим введением другой активирующей группы (R³) [H.M.I.OSBORN, Best Synthetic methods. Carbohydrates, Academic press, 2003, p.164].

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход карминомицина в 3 раза по сравнению с прототипом.

Вспомогательные средства:

Триметилсилилтрифторметансульфонат, диэтиламин, молекулярные сита 4Å, триэтиламин, 4-(диметиламино)пиридин были коммерческим продуктами фирмы Aldrich (США). N-(9Н-Флуорен-2-илметоксикарбонил)сукцинимид был коммерческим продуктом фирмы Merck (Германия).

Тонкослойную хроматографию осуществляли на пластинках с силикагелем G60 (Merck) в смесях растворителей: петролейный эфир-этилацетат, 1:1 (А); хлороформ-метанол-муравьиная кислота, 20:1:0.1 (Б); хлороформ-метанол-25%-ный водный аммиак, 7:3:0.01 (В); хлороформ-метанол-муравьиная кислота, 7:1:0.1 (Г). Для препаративной очистки использовали колоночную хроматографию на силикагеле Merck G60 с размером частиц 0.040-0.063 mm.

ВЭЖХ проводили на приборе Shimadzu HPLC LC 10 на колонке Diaspher С 18 №1914, элюент: 0.01н Н₃PO₄ - MeCN, pH 2.6, в градиенте ацетонитрила от 10% до 90%, скорость потока 1.1 мл/мин. Регистрация велась на длине волны 254 нм, при температуре 20°С.

Оптическое вращение [α]_D изучали на поляриметре "Perkin - Elmer-241".

Пример 1.

Карминомицин гидрохлорид.

Карминомицинон (0.500 г, 1.30 ммоль) растворяли в смеси сухой хлористый метилен - сухой диоксан (4:1, 375 мл), добавляли 1,4-ди-O-ацетил-3-N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонилдаунозамин (α:β=4:1) (0.706 г, 1.56 ммоль) и молекулярные сита (10 г). Раствор помешивали в токе аргона, охлаждали до -10°С и прибавляли по каплям раствор триметилсилилтрифторметансульфоната (0.35 мл, 1.95 ммоль) в сухом хлористом метилене (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре не выше 10°С в течение 40 мин, затем выливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (150 мл). Органический слой отделяли, промывали водой до рН6, высушивали и упаривали. Остаток растворяли в диоксане (20 мл), приливали 0.2 н NaOH (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при 4°С в атмосфере аргона, затем подкисляли до рН 5 0.5н HCl. Реакционную смесь разбавляли Н₂O и экстрагировали хлороформом агликон (5×70 мл), затем значение рН водной фракции доводили до 7.5 5%-ным раствором К₂СО₃ и экстрагировали хлороформом основание карминомицина (4×50 мл). Органические фракции упаривали до минимального объема. Раствор подкисляли до рН 3.5 0.5н раствором HCl в сухом МеОН и добавляли эфир (30 мл). Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали.

Выход 250 мг (35% в расчете на карминомицинон), R_f(Г) 0.22, R_t 16.20.

Т_пл 185-187°С (с разложением)

¹Н-ЯМР (Py-d₅): 7.835 (d, 1Н, 7.33 Hz, H-1); 7.62 (t, 1H, 7.81 Hz, H-2); 7.325 (d, 1H, 8.30 Hz, H-3); 5.82 (s, 1H, W~7 Hz, Н-1'); 5.35 (m, 1H, H-7); 4.70 (q, 1H, 6.65 Hz, H-5'); 4..50 (s, 1H, W~7 Hz, H-4'); 4.39 (m, 1H, H-3'); 3.60d, 3.42d (2H, 17 Hz, H-10), 2.75 (m, 1H, H-2'); 2.75 (m, 2H, 2H-8); 2.57 (s, 3Н, 3Н-14); 2.80m, 2.45dd, (2H, Jgem 14 Hz, 4.3Hz, 2H-H-2'); 1.43(d, 3H, 6.65 Hz, 3H-6')

λ_max 236, 256, 293, 464, 478, 492, 512, 525 нм (в этаноле)

[α]_D+289° (с 0.15 МеОН)

Образец карминомицина гидрохлорида по своим физико-химическим (Т.пл., R_f, R_t и [α]_D) и спектральным характеристикам (УФ-, ЯМР-спектры) не отличается от стандартного образца, полученного путем биосинтеза на опытной установке ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН.

Пример 2.

Карминомицин гидрохлорид.

Карминомицинон (0.520 г, 1.35 ммоль) растворяли в смеси сухой хлористый метилен - сухой диоксан (4:1, 600 мл), добавляли 1,4-ди-O-ацетил-3-N-трифторацетилдаунозамин (α:β=1:2) (0.531 г, 1.62 ммоль) и молекулярные сита (12 г). Раствор смесь перемешивали в токе аргона, охлаждали до -10°С и прибавляли по каплям раствор триметилсилилтрифторметансульфоната (0.24 мл, 1.35 ммоль) в сухом хлористом метилене (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре не выше 10°С в течение 40 мин, затем выливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (150 мл). Органический слой отделяли, промывали водой до рН 6, высушивали и упаривали. Остаток растворяли в смеси диоксан - МеОН (30 мл, 2:1), охлаждали до 4°С и приливали 0.4 н NaOH (10 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 часов при 4°С атмосфере аргона, затем подкисляли до рН 5 0.5н HCl. Реакционную смесь разбавляли H₂O и экстрагировали хлороформом (2×40 мл). Значение рН водной фракции доводили до 7.5 5%-ным раствором К₂СО₃ и экстрагировали хлороформом (4×30 мл). Органические фракции объединяли, высушивали и упаривали до минимального объема. Раствор подкисляли до рН 3.5 0.5н раствором HCl в сухом МеОН и добавляли эфир (30 мл). Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали.

Выход 230 мг (31% в расчете на карминомицинон), R_f(Г) 0.22, R_t 16.201.

Пример 3.

Карминомицин гидрохлорид.

Синтез ведется аналогично предыдущему примеру, исходя из 100 мг (0.26 ммоль) карминомицинона, 102 мг (0.31 ммоль, 1.2 экв) 1,4-ди-O-ацетил-N-трифторацетилдаунозамина (чистый α-аномер по данным 'Н-ЯМР), 56.5 μl триметилсилилтрифторметансульфоната. Выход гидрохлорида карминомицина - 38 мг (28% в расчете на карминомицинон).

Пример 4.

1,4-Ди-O-ацетил-3-N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонилдаунозамин (α:β=4:1)

Даунозамин гидрохлорид (1.00 г, 5.45 ммоль) растворяли в смеси диоксан - вода (14 мл, 1:1), добавляли Et₃N до рН 8, порциями добавляли сухой Н-(9Н-флуорен-2-илметоксикарбонил)сукцинимид (2.20 г, 6.54 ммоль), поддерживая рН 8 добавлением Et₃N. Реакционную смесь перемешивали 20 часов, добавляли 30 мл воды, частично упаривали диоксан. Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали. Осадок растворяли в этилацетате и добавляли петролейный эфир. Выпавший осадок отфильтровывали, упаривали с пиридином и использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. 3-N-(9-Н-Флуорен-2-илметокси)карбонилдаунозамин [~2 г, R_f=0.75 (В)] растворяли в сухом пиридине (20 мл) и добавляли уксусный ангидрид (1.03 мл, 10.9 ммоль) и каталитическое количество 4-(диметиламино)пиридина (30 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов, добавляли 1 мл метанола, перемешивали в течении 1 часа и упаривали досуха. Остаток растворяли в этилацетате и добавляли петролейный эфир. Выпавший осадок отфильтровывали, высушивали. Выход 1.97 г (80% в расчете на даунозамин). Соотношение аномеров α:β=4:1 определены методом ¹Н-ЯМР - спектроскопии. R_f α ≈R_f β=0.68 (Б).

Пример 5.

1,4-Ди-O-ацетил-3-N-трифторацетилдаунозамин (α:β=1:2), и индивидуальные α- и β-изомеры.

Даунозамин гидрохлорид (4) (1.26 г, 6.87 ммоль) растворяли в сухом МеОН (20 мл), добавляли Et₃N (2.87 мл, 2.6 ммоль) и этиловый эфир трифторуксусной кислоты (1.63 мл, 13.73 ммоль).

Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч, затем упаривали. Остаток растворяли в горячем ацетоне (40 мл), выпавший осадок отфильтровывали. Раствор упаривали, остаток повторно упаривали из сухого пиридина и использовали без дополнительной очистки в следующей стадии. 3-N-Трифторацетилдаунозамин (1.42 г, R_f 0.70, В) растворяли в абсолютном пиридине (30 мл), добавляли Ас₂О (1.8 мл) и каталитическое количество 4-(диметиламино)пиридина (20 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 ч, после чего охлаждали до 0°С и добавляли МеОН (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч, затем упаривали. Остаток делили флэш-хроматографией на силикагеле, петролейный эфир - этилацетат, используя градиент этилацетата от 20% до 50%. Выделяли три фракции: α-аномер, смесь аномеров (α+β) и β-аномер. Для каждой фракции удаляли растворитель, к остатку приливали эфир (40 мл), выпавший осадок отфильтровывали и высушивали. Выход: α-аномер 164 мг R_f(A) 0.62, [α]_D ²⁰-92.8°; смесь аномеров (α+β) 1.23 г; β-аномер 430 мг, R_f (А) 0.53, [α]_D ²⁰-50.4°. Суммарный выход (α+β) 1.82 г (81% в расчете на даунозамин).

Пример 6.

Карминомицинон.

К раствору дауномицинона (2.50 г, 6.28 ммоль) в сухом дихлорэтане (300 мл) добавляли AlCl₃ (2.51 г, 18.84 ммоль). Реакционную смесь кипятили в течение 1.5 ч, затем добавляли свежую порцию AlCl₃ (2.51 г, 18.84 ммоль) и кипятили в течение 1.5 ч, процедуру повторяли еще раз (всего добавляли 8 г AlCl₃), после чего выливали реакционную смесь в воду (400 мл), подкисляли водную фракцию 4н HCl до рН 3. Отделяли водный слой и нагревали его до кипения. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, высушивали. Органическую фракцию высушивали, частично упаривали и оставляли кристаллизоваться сначала при комнатной температуре в течение 4 часов, а затем при 4°С в течение 20 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, объединяли с осадком из водной фракции и высушивали до постоянного веса. Выход 2.05 г (85%), R_f(A) 0.37, R_f(B) 0.47.

Пример 7.

Карминомицин гидрохлорид.

Карминомицинон (2.60 г, 6.77 ммоль) растворяли в смеси сухой хлористый метилен - сухой диоксан (4:1, 1.8 л), добавляли 1,4-ди-O-ацетил-3-N-трифторацетилдаунозамин (α:β=1:2) (2.655 г, 8.12 ммоль) и молекулярные сита (50 г). Раствор смесь перемешивали в токе аргона, охлаждали до -10°С и прибавляли по каплям раствор триметилсилилтрифторметансульфоната (1.20 мл, 6.75 ммоль) в сухом хлористом метилене (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре не выше 10°С в течение 40 мин, затем выливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (700 мл). Органический слой отделяли, промывали водой до рН 6, высушивали и упаривали. Остаток растворяли в смеси диоксан - МеОН (150 мл, 2:1), охлаждали до 4°С и приливали 0.4 н NaOH (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 часов при 4°С атмосфере аргона, затем подкисляли до рН 5 0.5н HCl. Реакционную смесь разбавляли H₃O и экстрагировали хлороформом (3×100 мл). Значение рН водной фракции доводили до 7.5 5%-ным раствором K₂CO₃ и экстрагировали хлороформом (4×100 мл). Органические фракции объединяли, высушивали и упаривали до минимального объема. Раствор подкисляли до рН 3.5 0.5н раствором HCl в сухом МеОН и добавляли эфир (100 мл). Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали.

Выход 1.23 г (33% в расчете на карминомицинон), R_f(Г) 0.22, R_t 16.203.

Способ получения антибиотика карминомицина или его гидрохлорида

R¹=трифторацетил, N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонил, аллилоксикарбонил; R²=ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил; R³=трихлорацетамидил, триалкилсилил, ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил.

Claims

1. Способ получения карминомицина или его гидрохлорида, включающий гликозилирование карминомицинона гликозил-донором 1-,4-O-,3-N-тризамещенным даунозамином в присутствии катализатора в смеси безводных апротонных органических растворителей, удаление блокирующих групп и выделение карминомицина в виде основания или гидрохлорида, отличающийся тем, что в качестве катализатора используют триметилсилилтрифторметансульфонат, в качестве гликозил-донора используют 1,4-ди-O-замещенный-3-N-ацилдаунозамин (2,3,6-тридезокси-3-амино-L-ликсо-гексапираноза),

где R¹ - трифторацетил, N-(9-Н-флуорен-2-илметокси)карбонил, аллилоксикарбонил,

R² - ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил,

R³ - трихлорацетамидил, триалкилсилил, ацетил, трифторацетил, 4-нитробензоил, аллилоксикарбонил,

в качестве безводных апротонных органических растворителей используют диоксан-метиленхлорид, диоксан-хлороформ, диоксан-метиленхлорид-диэтиловый эфир, диоксан-ацетон, диоксан-хлороформ-диэтиловый эфир, диоксан-тетрагидрофуран-метиленхлорид, при этом реакцию проводят в присутствии молекулярных сит, удаление блокирующих групп проводят щелочным агентом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гликозил-донор используют в виде смеси α- и β-изомеров или в виде индивидуальных α- или β-изомеров.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят при температуре не выше 10°С.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят в атмосфере осушенного воздуха или осушенного инертного газа.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление защитных групп проводят в присутствии гидроксидов щелочных металлов в водно-органической среде: вода - метанол, вода - диоксан, вода - тетрагидрофуран, вода - ацетон.