RU2231059C1 - Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина - Google Patents
Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2231059C1 RU2231059C1 RU2003120000/15A RU2003120000A RU2231059C1 RU 2231059 C1 RU2231059 C1 RU 2231059C1 RU 2003120000/15 A RU2003120000/15 A RU 2003120000/15A RU 2003120000 A RU2003120000 A RU 2003120000A RU 2231059 C1 RU2231059 C1 RU 2231059C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorbent
- glycosylated hemoglobin
- silica gel
- affinity assay
- glycerylpropylsilane
- Prior art date
Links
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к химии полимеров и может быть использовано в медицине для диагностики сахарного диабета, а именно для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.
Известен сорбент аналогичного назначения - агароза с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК), который используется для определения гликозилированного гемоглобина (Каталог фирмы Glico-Gel Pierce Chemical Company, 1986, p.3-7). Емкость агарозы по лиганду составляет 5-15 мкМ на 1 мл сорбента.
Недостатком сорбента на основе агарозы является то, что кратность использования одной порции сорбента ограничивается 3-6 циклами достоверного количественного определения гликозилированного гемоглобина. Это дорогостоящий сорбент.
Известен сорбент аналогичного назначения - сшитый поливиниловый спирт (носитель) с иммобилизованной м-АФБК, который используется для аффинного определения гликозилированного гемоглобина (Ггб) (Патент РФ № 2093525, МПК С 08 F 30/06, опубл. 20.10.97 г.). Емкость агарозы по лиганду составляет 5-15 мкМ на 1 мл сорбента.
Недостатком сорбента на основе поливинилового спирта также следует считать недостаточное количество достоверных определений Ггб на одной порции сорбента (20-30).
Наиболее близким к предложенному по химическому составу является сорбент на основе кремнезема, содержащий привитые группы м-аминофенилбороновой кислоты, имеющий структурную формулу
(RU 2040963, МПК B 01 J 20/10 от 08.09.1995 г.).
Недостатком указанного сорбента является высокое значение неспецифического связывания белков и гликопротеидов, делающее его низкоэффективным при использовании в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.
Задача изобретения - повышение эффективности сорбента за счет увеличения селективности связывания гликопротеидов.
Поставленная задача решается сорбентом для аффинного определения гликозилированного гемоглобина на основе кремнезема, содержащим иммобилизованную мета-аминофенилбороновую кислоту, в котором в отличие от прототипа в качестве носителя используется пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом, активированный эпихлоргидрином, причем сорбент имеет следующую формулу:
Введение в соответствии с заявленной сущностью в качестве спейсера (мостика) между силикагелем и м-АФБК глицерилпропилсилана и эпихлоргидрина увеличивает гидрофильность сорбента, в результате чего снижается неспецифическая сорбция гликопротеидов, что приводит к повышению селективности определения гликозилированного гемоглобина.
Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина получают следующим образом.
1) Активация эпихлоргидрином пористого силикагеля, модифицированного глицерилпропилсиланом
2) Реакция связывания активированного носителя с м-АФБК
Подтверждением протекания химической реакции между лигандом (м-АБФК) и носителем, активированным эпихлоргидрином, служит результат иодометрического титрования альдегидных групп носителя, получающихся после его окисления периодатом натрия до и после посадки м-АФБК: количество альдегидных групп после связывания м-АФБК на 14, 2±0,6% меньше их количества, полученного для немодифицированного носителя.
Согласно заявленного для получения сорбента использовали силикагель фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированный глицерилпропилсиланом (Л.А.Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985 г., с.60). Носитель представляет собой микрочастицы силикагеля с общей формулой SiO2·H2O, пронизанные порами со средним диаметром 500 ангстрем. Поверхность частиц модифицирована глицерилпропилсиланом за счет реакции между его силанольными группами и поверхностными силанольными группами силикагеля. В результате этой модицикации поверхность носителя теряет сорбционную способность и приобретает поверхностные гидроксильные группы.
Указанное соединение активировали эпихлоргидрином в щелочных условиях для введения на поверхность активных оксирановых групп. Затем проводили связывание с м-АФБК в щелочных условиях за счет реакции аминогруппы м-АФБК с оксирановыми группами, связанными с поверхностью сорбента. Непрореагировавшие оксирановые группы устраняли за счет реакции с моноэтаноламином.
Элементный анализ 30 проб полученного сорбента показал, что содержание бора в нем составляет 0,18±0,04%, что подтверждает его высокую специфическую емкость.
Сущность заявленного изобретения подтверждается примерами.
Пример 1
К 50 мл силикагеля фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированного глицерилпропилсиланом, суспендированного в 50 мл дистиллированной воды добавляли 10 мл эпихлоргидрина и 20 мл 2М NaOH, встряхивали в течение 15-18 часов при комнатной температуре в присутствии 0,1 г NaBH4. Затем активированный носитель промывали 100 объемами дистиллированной воды и 0,1 М карбонатным буфером связывания рН 9,5, после чего добавляли м-АФБК из расчета 20 мг/мл носителя и встряхивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Отмытый от избытка м-АФБК сорбент использовали для количественного определения Ггб. По данным элементного анализа сорбент содержит 0,18±0,6% бора. В прототипе содержание бора по результатам элементного анализа составляет 0,12%.
Пример 2
Для определения гликозилированного гемоглобина полученный сорбент помещали в колонку (1 мл) и отмывали стартовым буфером (0,025 М натрий-фосфатный буфер, рН 8,5). Гемолизат готовили добавлением к одному объему отмытых эритроцитов трех объемов 0,02% раствора азида натрия. На колонку наносили 0,1 мл гемолизата. Для связывания пробы ток буфера останавливали на 15 минут и промывали колонку стартовым буфером для сбора негликозилированного гемоглобина. Гликозилированный гемоглобин элюировали буфером, содержащим 200 мМ сорбитола рН 8,5. Полученные фракции №1 и 2 фотометрировали при 414 нм. Содержание гликозилированного гемоглобина определяли по формуле
где ОП(1) и ОП(2) - оптическая плотность при 414 нм фракций №1 и 2 соответственно;
V1 и V2 - объем фракций №1 и 2, мл.
Кратность достоверных определений на полученном сорбенте составила 45-50. При попытке дальнейшего использования порции сорбента происходило достоверное снижение количества связанного гемоглобина в пробах, вероятно, за счет частичного разрушения сорбента и связанного с этим снижения емкости.
Пример 3
Для определения гликозилированного гемоглобина полученный сорбент помещали в колонку (1 мл) и отмывали стартовым буфером (0,025 М натрий-фосфатный буфер, рН 8,5). Гемолизат готовили добавлением к одному объему отмытых эритроцитов трех объемов 0,02% раствора азида натрия. В гемолизате проводили определение количества гликозилированного гемоглобина на хроматографе AUTO A1 СТМНА-8110 (Kyoto, Kagaku Co, Japan). Результат этого определения считали истинным значением содержания гликозилированной формы в пробе. На колонку с испытуемым сорбентом наносили 0,1 мл гемолизата. Для связывания пробы ток буфера останавливали на 15 минут и промывали колонку стартовым буфером для сбора негликозилированного гемоглобина. Гликозилированный гемоглобин элюировали буфером, содержащим 200 мМ сорбитола рН 8,5. Полученные фракции №1 и 2 фотометрировали при 414 нм. Содержание гликозилированного гемоглобина определяли по формуле
Кратность достоверных определений (дающих результат, отличающийся от результата, полученного с использованием хроматографа, не более чем на 5%) на полученном сорбенте составила 45-50. При попытке дальнейшего использования порции сорбента происходило достоверное снижение количества связанного гемоглобина в пробах, вероятно, за счет частичного разрушения сорбента и связанного с этим снижения емкости.
Пример 4
Определение Ггб проводили аналогично примеру 3 с той разницей, что вместо предложенного сорбента использовали сорбент, приготовленный по прототипу. Количество гемоглобина, определенное в пробах, на 90±15% превышало количество гликогемоглобина, определенное на хроматографе AUTO A1 СТМНА-8110 (Kyoto, Kagaku Co, Japan), что свидетельствует о том, что использование этого сорбента для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина приводит к недостоверным результатам.
Таким образом, заявленный сорбент на основе пористого силикагеля, модифицированного глицерилпропилсиланом и эпихлоргидрином, с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой обеспечивает 45-кратное определение Ггб с высокой точностью, значительно превышающей точность его определения при использовании сорбента по прототипу.
Claims (1)
- Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина на основе кремнезема, содержащий иммобилизованную метааминофенилбороновую кислоту, отличающийся тем, что в качестве носителя используется пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом, активированный эпихлоргидрином, общей формулы
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003120000/15A RU2231059C1 (ru) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003120000/15A RU2231059C1 (ru) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2231059C1 true RU2231059C1 (ru) | 2004-06-20 |
Family
ID=32847070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003120000/15A RU2231059C1 (ru) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2231059C1 (ru) |
-
2003
- 2003-07-01 RU RU2003120000/15A patent/RU2231059C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
E.HAGEMEIER. "Synthesis and application of a boronic acid-substituted silica for high-performance liguid affinity chromatography". - Journal of Chromatoraphy, 1983, v.268, №2, р.291-295. * |
US 4269605 а, 26.05.1981. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tang et al. | A review on advances in methods for modification of paper supports for use in point-of-care testing | |
EP1715948B1 (en) | Chromatographic material for the absorption of proteins at physiological ionic strength | |
Křenková et al. | Immobilized microfluidic enzymatic reactors | |
JP5026070B2 (ja) | ポリマー粒子 | |
US20090149607A1 (en) | Synthetic receptor | |
US20060057631A1 (en) | Nano-structured device for analysis or separation, and its preparation and application | |
JPH051714B2 (ru) | ||
KR910016365A (ko) | 전혈(全血)로부터 혈장 또는 혈청의 분리 및 수집을 위한 방법 및 장치, 및 시약 전달 시스템 | |
JP2009544969A (ja) | 検体を捕捉することが可能なキャピラリー用コーティング | |
JPS6116945B2 (ru) | ||
CN105842214A (zh) | 一种羧甲基赖氨酸荧光印迹材料及其制备方法和应用 | |
EP0332323B1 (en) | Carrier for affinity chromatography immobilized with antibodies and preparation thereof | |
CN112823875B (zh) | 一种苯硼酸固相萃取柱填料及其制备方法 | |
JP2008543980A (ja) | 合成受容体 | |
RU2231059C1 (ru) | Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина | |
Moldoveanu | Solutions and challenges in sample preparation for chromatography | |
JP3377516B2 (ja) | 蛋白質と炭素鎖が結合した担体 | |
JP2009109214A (ja) | 単一粒子測定可能な粒子サイズ分布を持つ機能性粒子およびそれを用いた標的物質の分離方法 | |
JP3189307B2 (ja) | 化学発光検出用充填剤およびそれを用いた分析方法 | |
JP3069292B2 (ja) | カテコール化合物及びバニリル化合物の蛍光検出用固相化試薬および検出方法 | |
RU2093525C1 (ru) | Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина | |
CN110354817A (zh) | 一种基于固定化凝血酶的亲和色谱柱及其制备方法和应用 | |
WO2001003721A1 (en) | Improved assays for detecting human immunodeficiency virus infection | |
JP3551510B2 (ja) | 化学発光検出用組成物およびそれを用いた分析システム | |
RU2192300C1 (ru) | Способ концентрирования и разделения ионов металлов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050702 |