RU2220459C1

RU2220459C1 - Method for modeling uterus body tumor usable for investigating its regional lymph flow bed

Info

Publication number: RU2220459C1
Application number: RU2002116930/14A
Authority: RU
Inventors: Ю.И. Бородин; М.В. Малыгин; В.В. Асташов; И.О. Маринкин; П.М. Ларионов; И.Е. Мичурин; кова Л.В. Треть; Л.В. Третьякова
Original assignee: Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН
Priority date: 2002-06-24
Filing date: 2002-06-24
Publication date: 2003-12-27
Also published as: RU2002116930A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves introducing tumor growth inductor like ascitic Ehrlich carcinoma in concentration of 6,5-7,5•10^-3 tumor cells per 1 ml into uterus horn. EFFECT: excluded toxicosis phenomena; enhanced effectiveness of tumor localization and growth control. 9 dwg

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкогинекологии, и может быть использовано для моделирования злокачественной опухоли тела матки в экспериментальной онкологии. The invention relates to medicine, namely to gynecological oncology, and can be used to model a malignant tumor of the uterus in experimental oncology.

Интерес к проблеме опухолей тела матки связан с увеличением заболеваемости раком этой локализации. С 1970 по 1995гг. заболеваемость раком эндометрия увеличилась на 55%, занимая 1-ое место среди злокачественных опухолей женской половой сферы (Трапезников Н.Н., Аксель Е.М., 1999г.). По сводным данным FIGO, при лечении больных с уже установленным раком эндометрия только около 60% доживают до пятилетнего срока наблюдения, а не менее 30% умирают от рецидивов и метастазов (Бохман Я.В. и соавт., 1992г.). У 25% больных к моменту выявления опухоли имеются регионарные или отдаленные метастазы. Поэтому изучение особенностей метастазирования и реакции лимфатической системы при опухолях тела матки является актуальной задачей современной онкологии. Interest in the problem of uterine body tumors is associated with an increase in the incidence of cancer of this localization. From 1970 to 1995 the incidence of endometrial cancer increased by 55%, occupying the first place among malignant tumors of the female genital area (Trapeznikov NN, Axel EM, 1999). According to FIGO summary data, in the treatment of patients with already established endometrial cancer, only about 60% survive to a five-year follow-up period, and at least 30% die from relapses and metastases (Bohman Y.V. et al., 1992). 25% of patients at the time of detection of a tumor have regional or distant metastases. Therefore, the study of the characteristics of metastasis and the reaction of the lymphatic system in case of tumors of the uterus is an urgent task of modern oncology.

В литературе описаны модели опухолевого процесса тела матки, в основе которых лежит химический канцерогенез. The literature describes models of the tumor process of the uterus, which are based on chemical carcinogenesis.

В исследованиях Чарквиани Л.И. (1964г.) крысам оперативным путем в маточные рожки вводились парафиновые палочки, содержащие 1 мг 9,10-диметил-1,2-бензантроцена. На 5-6 месяц после введения канцерогена в 98% случаев получали опухоли тела матки (цитируется по Багатурия Г.Д., 1978г.). Описанная выше модель обладает некоторыми недостатками. In studies of Charkviani L.I. (1964). Paraffin bacilli containing 1 mg of 9,10-dimethyl-1,2-benzanthrocene were injected into rat uterine horns operatively by means of rats. At 5-6 months after the administration of the carcinogen in 98% of cases, tumors of the uterine body were obtained (cited by Bagaturia GD, 1978). The model described above has some disadvantages.

В исследованиях Чарквиани Л.И. (цитируется по Багатурия Г.Д., 1978г.) использовалось локальное воздействие химического канцерогена. Известно, что перевиваемые опухоли животных являются более отдаленной моделью опухолей человека, чем спонтанные и индуцированные опухоли (Коноплев В.Н., 1960г.). С патогенетической точки зрения, в естественных условиях опухоли тела матки не развиваются под локальным воздействием химического канцерогена, кроме того, нельзя исключить реакцию регионарной лимфатической системы собственно на канцероген, что затрудняет оценку реакции лимфатического региона на локальный опухолевый процесс в матке. Обсуждаемая модель также длительна в воспроизведении и не позволяет контролировать время появления видимой опухоли, что затрудняет ее использование на практике. Результатом нашего исследования явилось создание модели опухоли тела матки для оценки реакции ее лимфатического региона на опухолевый процесс. Нами предлагается моделировать этот процесс путем введения злокачественной недифференцированной асцитной карциномы. За счет этого исключаются явления экзотоксикоза. Также появляется возможность контроля преимущественной локализации и скорости роста путем подбора места инъекции и количества опухолевых клеток. Преимуществом является скорость создания модели, а также возможность постановки массовых экспериментов. Кроме того, перевиваемые опухоли характеризуются относительным постоянством строения и биологических свойств (Караиванова М.Х.,1971г.; Васильева Г.С., 1982г.). In studies of Charkviani L.I. (cited by Bagaturia GD, 1978) the local exposure to a chemical carcinogen was used. It is known that transplanted animal tumors are a more distant model of human tumors than spontaneous and induced tumors (Konoplev V.N., 1960). From a pathogenetic point of view, in vivo uterine body tumors do not develop under the local influence of a chemical carcinogen, in addition, the reaction of the regional lymphatic system itself to a carcinogen cannot be ruled out, which makes it difficult to assess the response of the lymphatic region to a local tumor process in the uterus. The model under discussion is also long in reproduction and does not allow controlling the time of appearance of a visible tumor, which complicates its use in practice. The result of our study was the creation of a model of a tumor in the uterine body to assess the response of its lymphatic region to the tumor process. We propose to model this process by introducing malignant undifferentiated ascites carcinoma. Due to this, the phenomena of exotoxicosis are excluded. It also becomes possible to control the preferential localization and growth rate by selecting the injection site and the number of tumor cells. The advantage is the speed of creating the model, as well as the possibility of staging mass experiments. In addition, transplantable tumors are characterized by relative constancy of structure and biological properties (Karaivanova M.Kh., 1971; Vasilieva G.S., 1982).

Предлагаемый способ моделирования опухоли тела матки состоит в следующем. The proposed method for modeling a tumor of the uterine body is as follows.

Непосредственно перед операцией подготавливают асцит. Мышь с асцитной карциномой Эрлиха умерщвляют под эфирным наркозом на 7 сутки роста опухоли. Переднюю брюшную стенку мыши обрабатывают антисептическим раствором. Производят рассечение кожи, подкожной клетчатки и мышц до слоя брюшины тупоконечными ножницами, предварительно заведя один конец под эти ткани через небольшой поперечный разрез кожи, который выполнен на 0,5-1 см выше лонного сочленения. Брюшину прокалывают инсулиновым шприцом. Потягиванием поршня шприца аспирируют асцит, предотвращая прилипание кишечника к игле путем уменьшения тяги за поршень и вращения шприца по продольной оси. Immediately before the operation, ascites is prepared. A mouse with Ehrlich ascites carcinoma is killed under ether anesthesia on the 7th day of tumor growth. The anterior abdominal wall of the mouse is treated with an antiseptic solution. Cut the skin, subcutaneous tissue and muscles to the peritoneal layer with blunt scissors, having previously brought one end under these tissues through a small transverse skin incision, which is made 0.5-1 cm above the pubic joint. The peritoneum is pierced with an insulin syringe. Siphoning the piston of the syringe, aspirate the ascites, preventing the intestines from sticking to the needle by reducing the thrust of the piston and rotating the syringe along the longitudinal axis.

Аспирированный асцит в количестве 0,5 мл разводят в 5 мл 0,9% раствора NaCl в чашке Петри и тщательно перемешивают. Концентрацию клеток подсчитывают с помощью камеры Горяева по общепринятой методике. Концентрацию клеток доводят до 1,3-1,5•10⁵ кл/мл разведением 0,9% раствором NaCl.Aspirated ascites in an amount of 0.5 ml was diluted in 5 ml of a 0.9% NaCl solution in a Petri dish and mixed thoroughly. The cell concentration is calculated using the Goryaev camera according to the generally accepted method. The cell concentration is adjusted to 1.3-1.5 • 10 ⁵ cells / ml with a dilution of 0.9% NaCl solution.

Белым беспородным мышам-самкам в условиях эфирного наркоза в асептических условиях (удаление шерсти и двукратная обработка дезинфицирующим раствором операционного поля) ножницами проводится лапаротомия. Длина разреза 1 см. Мочевой пузырь, как правило наполненный, выводится в рану и отклоняется кпереди. Осторожным потягиванием за дольки сальника в рану выводятся маточные рога. Правый маточный рог фиксируется мягким пинцетом. В стенку правого маточного рога с помощью инсулинового шприца вводят 0,05 мл полученного асцитного раствора. То есть в стенку маточного рога вводится асцитная карцинома Эрлиха в дозе 6,5-7,5•10³ клеток. Концентрация клеток опухоли Эрлиха в 1 мл выведена опытным путем и должна считаться оптимальной, позволяя, с одной стороны, быть уверенным в том, что опухоль будет индуцирована на 7 сутки, а с другой, что это обеспечит необходимую продолжительность жизни экспериментальным животным. После этого рана трижды обрабатывается антисептическим раствором (фурациллин 1:5000). Матка с ее рогами, мочевой пузырь, доли сальника возвращаются в брюшную полость. Кетгутом 4/0 на атравматической игле тремя одиночными узловыми швами ушивается дефект брюшины. Таким же способом ушивается кожа, операционная рана обрабатывается 2% раствором Н₂O₂. Повязка на рану не накладывается в связи со сложностью ее фиксации и низким риском нагноения раны (выявлено на основании собственного опыта).White outbred female mice under conditions of ethereal anesthesia under aseptic conditions (wool removal and double treatment with a disinfectant solution of the surgical field) are used for laparotomy with scissors. The length of the incision is 1 cm. The bladder, as a rule, is full, is removed into the wound and deviates anteriorly. By carefully pulling the omental segments into the wound, the uterine horns are removed. The right uterine horn is fixed with soft tweezers. 0.05 ml of the obtained ascites solution is injected into the wall of the right uterine horn using an insulin syringe. That is, Ehrlich ascites carcinoma in a dose of 6.5-7.5 • 10 ³ cells is introduced into the wall of the uterine horn. The concentration of Ehrlich tumor cells in 1 ml was removed experimentally and should be considered optimal, allowing, on the one hand, to be sure that the tumor will be induced on the 7th day, and on the other, that this will provide the necessary lifespan for experimental animals. After this, the wound is treated three times with an antiseptic solution (furatsillin 1: 5000). The uterus with its horns, bladder, omentum lobes return to the abdominal cavity. Catgut 4/0 on the atraumatic needle with three single interrupted sutures sutured defect of the peritoneum. The skin is sutured in the same way, the surgical wound is treated with a 2% solution of H ₂ O ₂ . The wound dressing is not applied due to the complexity of its fixation and low risk of suppuration of the wound (identified on the basis of personal experience).

Наблюдение за развитием опухолевого процесса проводилось в течение 12 суток. Observation of the development of the tumor process was carried out for 12 days.

Через 7 суток с момента прививки макроскопически опухолевый узел определяется в области соединения тела и правого рога матки мышей, его размеры составляют 2•2,5 мм (фиг. 1). After 7 days from the moment of inoculation, the macroscopically tumor node is determined in the area of the junction of the body and the right horn of the uterus of mice, its size is 2 • 2.5 mm (Fig. 1).

После умерщвления животных под эфирным наркозом по стандартной методике были изготовлены срединные продольные гистологические срезы с опухолевого узла, толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилин-эозином и по Ван-изон. Микроскопическое исследование гистологических препаратов опухоли (Об. 40•ок. 10, Об. 100•ок. 10) показало, что через 7 суток с момента прививки на ткань матки наблюдаются сплошные поля атипичных клеток опухоли (солидная форма), представляющие собой овальные клетки ("монотонность" опухолевых клеток) (фиг. 2). Клетки опухоли имеют крупные ядра с хорошо выраженными глыбками хроматина и малобазофильной цитоплазмой. Наблюдаются множественные митозы. Клеточный полиморфизм в опухолевой ткани нерезко выражен. В опухоли присутствует незначительное количество стромы (фиг. 6), центральные участки содержат очаги некроза (фиг. 5). After killing the animals under ether anesthesia, the median longitudinal histological sections from the tumor node, 5–7 μm thick, stained with hematoxylin-eosin and Van-ison were prepared according to the standard method. Microscopic examination of histological preparations of the tumor (Vol. 40 • approx. 10, Vol. 100 • approx. 10) showed that 7 days after vaccination on the uterine tissue, continuous fields of atypical tumor cells (solid form), which are oval cells ( "monotony" of tumor cells) (Fig. 2). Tumor cells have large nuclei with well-defined clumps of chromatin and low basophilic cytoplasm. Multiple mitoses are observed. Cellular polymorphism in the tumor tissue is not clearly expressed. A small amount of stroma is present in the tumor (Fig. 6), the central sections contain foci of necrosis (Fig. 5).

Через 12 суток с момента прививки макроскопически размеры опухоли составляют 5,0•5,0 мм, опухолевый узел занимает проксимальную часть правого рога матки и, зачастую, захватывает верхнюю 1/3 тела матки мышей. After 12 days from the moment of inoculation, the macroscopic size of the tumor is 5.0 • 5.0 mm, the tumor node occupies the proximal part of the right uterine horn and, often, captures the upper 1/3 of the uterine body of mice.

При микроскопическом исследовании гистологических срезов опухоли через 12 суток с момента прививки отмечается выраженный клеточный полиморфизм: мелкие клетки с гиперхромными ядрами (1. фиг. 3), увеличение числа ядрышек (2. фиг. 3), смещение ядра к периферии клетки (3. фиг. 2), крупные клетки с большим ядром (4. фиг. 4). Среди клеток опухоли встречаются клетки с патологическими митозами: многополюсный митоз (5. фиг. 3), рассеивание гиперспирализованных хромосом (6. фиг. 3). На фиг. 9 показано опухолевое поле на границе с полостью матки и неизменные железистые структуры на противоположной стороне полости. Microscopic examination of histological sections of the tumor after 12 days from the time of inoculation results in pronounced cell polymorphism: small cells with hyperchromic nuclei (1. Fig. 3), an increase in the number of nucleoli (2. Fig. 3), the displacement of the nucleus to the periphery of the cell (3. Fig. . 2), large cells with a large nucleus (4. Fig. 4). Among tumor cells, there are cells with pathological mitoses: multipolar mitosis (5. Fig. 3), scattering of hyperspiral chromosomes (6. Fig. 3). In FIG. 9 shows a tumor field at the border with the uterine cavity and invariable glandular structures on the opposite side of the cavity.

При микроскопическом исследовании гистологических препаратов опухоли по периферии опухолевого узла нами выявлены артерии различного калибра и дилятация вен матки, стаз крови. Обращает внимание резкое расширение лимфатических капилляров и сосудов (фиг. 4). Microscopic examination of histological preparations of the tumor along the periphery of the tumor node revealed arteries of various sizes and dilatation of uterine veins, blood stasis. A sharp expansion of the lymphatic capillaries and blood vessels draws attention (Fig. 4).

По стандартной методике (метод "полей") нами был произведен анализ ядерно-цитоплазматического и стромально-паренхиматозного соотношений в ткани опухоли. Для анализа клеток и тканей использовалась окулярная тест-система с 25 равноудаленными точками (Автандилов Г.Г., 1990г.). Using a standard technique (the "field" method), we analyzed the nuclear-cytoplasmic and stromal-parenchymal ratios in the tumor tissue. For the analysis of cells and tissues, an ocular test system with 25 equidistant points was used (G. Avtandilov, 1990).

Результаты исследований показали, что в динамике роста опухоли происходит увеличение ядерно-цитоплазматического и стромально-паренхиматозного соотношений. На 7 сутки ядерно-цитоплазматическое соотношение 1,380±0,02, на 12 сутки ядерно-цитоплазматическое соотношение 2,045±0,02, т.е. достоверно увеличивается на 67,48%; стромально-паренхиматозное соотношение на 7 сутки составляет 0,088±0,02, а на 12 сутки 0,181±0,02, т.е. достоверно увеличивается на 48,4%. The research results showed that in the dynamics of tumor growth there is an increase in nuclear-cytoplasmic and stromal-parenchymal ratios. On the 7th day, the nuclear-cytoplasmic ratio of 1.380 ± 0.02, on the 12th day, the nuclear-cytoplasmic ratio of 2.045 ± 0.02, i.e. significantly increases by 67.48%; the stromal-parenchymal ratio on the 7th day is 0.088 ± 0.02, and on the 12th day 0.181 ± 0.02, i.e. significantly increased by 48.4%.

Полученные данные свидетельствуют о тенденции нарастания как клеточного, так и тканевого атипизма. The data obtained indicate a tendency to increase in both cellular and tissue atypism.

Через 14-15 суток с момента прививки макроскопически определяется распространение опухолевого процесса на левый маточный рог. Ткани стенки матки замещаются опухолевыми разрастаниями. Определяются множественные опухолевые узлы в рогах и теле матки (электронная фотография). After 14-15 days from the moment of vaccination, the spread of the tumor process to the left uterine horn is macroscopically determined. Tissue wall tissues are replaced by tumor growths. Multiple tumor nodes in the horns and uterine body are determined (electronic photograph).

Помимо исследования опухолевого узла нами была изучена структурная организация регионарного лимфатического узла (правого подвздошного). Микроскопический анализ гистологических срезов лимфатического узла показал, что в 20% возможно появление метастаза, при этом структурная организация лимфоузла нарушается (изменяются корково-мозговое и паренхиматозно-стромальное соотношения). Через 12 суток при микроскопическом исследовании гистологических срезов регионарного лимфатического узла (правый подвздошный) выявлены скопления атипичных опухолевых клеток в корковом веществе лимфатического узла (различные по размерам клетки с крупными, смещенными к периферии ядрами и малым количеством цитоплазмы) (фиг. 7). По периферии опухолевого поля наблюдается некроз лимфоидной ткани паренхимы. Лимфоидная паренхима фрагментирована (1. фиг. 8), промежуточные корковые синусы расширены (2. фиг. 8). Краевой синус лимфатического узла увеличен в размерах (3. фиг. 8), отмечается разрастание соединительной ткани капсулы узла (4. фиг. 8) и ее лейкоцитарная инфильтрация (5. фиг. 8). In addition to the study of the tumor node, we studied the structural organization of the regional lymph node (right iliac). Microscopic analysis of histological sections of the lymph node showed that metastasis is possible in 20%, while the structural organization of the lymph node is impaired (the cortex and parenchymal-stromal ratios change). After 12 days, microscopic examination of histological sections of the regional lymph node (right iliac) revealed clusters of atypical tumor cells in the cortical substance of the lymph node (cells of different sizes with large nuclei displaced to the periphery and a small amount of cytoplasm) (Fig. 7). On the periphery of the tumor field, necrosis of the lymphoid tissue of the parenchyma is observed. The lymphoid parenchyma is fragmented (1. Fig. 8), the intermediate cortical sinuses are enlarged (2. Fig. 8). The marginal sinus of the lymph node is enlarged (3. Fig. 8), there is an increase in the connective tissue of the capsule of the node (4. Fig. 8) and its leukocyte infiltration (5. Fig. 8).

Анализ доступной литературы показал, что выявленные нами морфологические изменения в матке при прививке опухоли Эрлиха в количестве 6,5-7,5•10³ клеток в большой степени соответствуют описанию солидного (недифференцированного) рака, описанного Бохманом Я.В. в 1972 г. (цитируется по Казаченко В.П. "Рак тела матки").An analysis of the available literature showed that the morphological changes in the uterus that we detected during the inoculation of the Ehrlich tumor in the amount of 6.5-7.5 • 10 ³ cells to a large extent correspond to the description of the solid (undifferentiated) cancer described by Y.V. Bohman in 1972 (cited by Kazachenko VP "Cancer of the uterus").

Литература
1. Багатурия Г.Д. "Лучевой патоморфоз индуцированного рака тела матки", Тбилиси, 1978 г.Literature
1. Bagaturia G.D. "Radiation pathomorphism of induced cancer of the uterus", Tbilisi, 1978

2. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. "Злокачественные новообразования в России в 1997 г." (Статистический сборник), М., 1999 г. 2. Trapeznikov NN, Axel EM "Malignant neoplasms in Russia in 1997" (Statistical Digest), M., 1999.

3. Бохман Я. В. и соавт. "Гормонотерапия рака эндометрия". СПб.: "Гиппократ", 1992г. 3. Bohman, Y. V. et al. "Hormone therapy of endometrial cancer." SPb .: Hippocrates, 1992

4. Казаченко В.П. "Рак тела матки", М.: Медицина, 1983 г. с.114-117. 4. Kazachenko V.P. "Cancer of the uterus", M .: Medicine, 1983, p.114-117.

5. Хмельницкий О. П. "Патоморфологическая диагностика гинекологических заболеваний". СПб.: "Сотис", 1994г. 5. Khmelnitsky O. P. "Pathomorphological diagnosis of gynecological diseases." SPb .: Sotis, 1994

6. Струков А. И. , Серов В.В. "Патологическая анатомия", М.: Медицина, 1995 г. 6. Strukov A. I., Serov V.V. "Pathological anatomy", M .: Medicine, 1995

7. Р.Зюсс, В.Кинцель, Дж.Д.Скрибнер "Рак: эксперименты и гипотезы", М.: "Мир", 1977 г. 7. R. Süss, V. Kintzel, JD Scribner "Cancer: experiments and hypotheses", M .: "Mir", 1977

8. Васильева Г.С. "Биология трансплантируемых опухолей". Алма-Ата, 1982 г. 8. Vasiliev G.S. "Biology of transplanted tumors." Alma-Ata, 1982

9. Коноплев А.Е. Перевиваемые опухоли. В кн. "Модели и методы экспериментальной онкологии" - М., Медгиз, 1960. - С.144-237. 9. Konoplev A.E. Transplanted tumors. In the book. "Models and methods of experimental oncology" - M., Medgiz, 1960. - S.144-237.

10. Караиванова М.Х. К методике первичного отбора противоопухолевых средств. // Вопросы онкологии. - 1971. - Т.17.-2. - С.62-66. 10. Karaivanova M.Kh. To the methodology of the primary selection of antitumor agents. // Questions of oncology. - 1971. - T.17.-2. - S. 62-66.

11. Автандилов Г.Г. "Медицинская морфометрия". - Москва, 1990. С.382. 11. Avtandilov G.G. "Medical morphometry". - Moscow, 1990. P.382.

Claims

A method for modeling a tumor of the uterine body, which consists in introducing a tumor growth inducer into the uterine horn, characterized in that Ehrlich ascites carcinoma is introduced into the uterine horn at a dose of 6.5-7.5 · 10 ³ cells.