RU2194754C2 - Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его - Google Patents
Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его Download PDFInfo
- Publication number
- RU2194754C2 RU2194754C2 RU96119259/13A RU96119259A RU2194754C2 RU 2194754 C2 RU2194754 C2 RU 2194754C2 RU 96119259/13 A RU96119259/13 A RU 96119259/13A RU 96119259 A RU96119259 A RU 96119259A RU 2194754 C2 RU2194754 C2 RU 2194754C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- protein
- sindbis
- fusion
- cells
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 102
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 28
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 52
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 29
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 claims description 27
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 16
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 41
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 16
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 16
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 9
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 7
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 7
- 241000711466 Murine hepatitis virus Species 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 5
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100024239 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710122496 Sphingosine-1-phosphate lyase 1 Proteins 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- -1 thiol disulfide Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000009133 cooperative interaction Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007446 host cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000000803 paradoxical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- CRUSHRATSSNWSB-UHFFFAOYSA-N phenyl-sulfanylidene-sulfidoazanium Chemical compound [S-][N+](=S)C1=CC=CC=C1 CRUSHRATSSNWSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при производстве вакцин. Получен неинфекционный мутированный вирус Синдбис (Синдбис E1-SER62), в котором в белке Е1 в положении 62 консервативная аминокислота цистеин заменена серином. Данная мутация находится в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность. Фрагмент рекомбинантной ДНК, представляющей собой последовательность мутированного неинфекционного вируса Синдбис, встроен в плазмиду, которую амплифицируют в E.coli., и полученной в результате РНК трансфецируют клетки млекопитающих. Последние продуцируют вышеописанный вирус. Изобретение обеспечивает безопасность вирусов, используемых в качестве вакцин. 2 с.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.
Description
Изобретение относится к области вирусологии, иммунологии и химии белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым противовирусным средствам и новым способам получения вакцин.
Описание предшествующего уровня техники
Вирусы представляют собой сложные трехмерные структуры, которые служат в качестве систем переноса генетического материала. Вирусы содержат РНК- или ДНК-геном, "упакованный" в оболочку, состоящую из белка или комбинации белков, ассоциированных с липидсодержащим мембранным бислоем.
Вирусы представляют собой сложные трехмерные структуры, которые служат в качестве систем переноса генетического материала. Вирусы содержат РНК- или ДНК-геном, "упакованный" в оболочку, состоящую из белка или комбинации белков, ассоциированных с липидсодержащим мембранным бислоем.
Для воспроизведения вируса в природе вирусный геном реплицируется в соответствующей клетке-хозяине путем разрушения биохимического аппарата этой клетки. Такой процесс инфицирования часто приводит к гибели клетки-хозяина и проявляется, в целом, как заболевание хозяина, растения или животного. Результатом процесса инфицирования является высвобождение из инфицированной клетки или ткани от сотен до тысяч новых дочерних вирусных частиц, способных инфицировать другие клетки или ткани хозяина. Генетический материал клетки защищен от деструктивного воздействия внешних агентов посредством окружающей его оболочки. Однако, хотя эта оболочка и должна препятствовать деградации вирусного генома под действием факторов окружающей среды, она, тем не менее, должна также подвергаться дезинтеграции для высвобождения генетического материала вируса при его инфицировании клетки-хозяина.
До настоящего времени не было разработано сколько-нибудь эффективных способов ингибирования распространения определенных вирусов. Кроме того, до сих пор не было также получено эффективного способа обеспечения безопасности вирусов, используемых в качестве вакцин. Поэтому настоящее изобретение позволяет разрешить проблемы, с которыми долгое время сталкивались исследователи в этой области.
Краткое описание изобретения
В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции, рассматриваемой в нижеприведенной заявке, и содержащей неинфекционный мутированный вирус, который может быть использован для получения вакцины.
В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции, рассматриваемой в нижеприведенной заявке, и содержащей неинфекционный мутированный вирус, который может быть использован для получения вакцины.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантной плазмиде, адаптированной для экспрессии в клетках млекопитающих и содержащей ДНК, кодирующую неинфекционный мутированный вирус, а также регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этой ДНК в клетке.
В следующем варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к вирус-ассоциированной тиолредуктазной/протеинизомеразной активности.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования распространения вирусной инфекции, включающему в себя стадию контактирования указанного вируса с соединением, которое ингибирует тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в этом вирусе.
В еще одном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к противовирусному средству, ингибирующему распространение вирусной инфекции, где указанное противовирусное средство ингибирует тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразнуго активность в этом вирусе.
Эти и другие аспекты, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего описания предпочтительных вариантов его осуществления, приведенных в целях раскрытия изобретения.
Краткое описание чертежей
Для лучшего понимания существа изобретения, а также его отличительных признаков, целей и преимуществ ниже приводится более подробное описание изобретения, кратко изложенное выше и проиллюстрированное прилагаемыми чертежами. Эти чертежи являются частью настоящего описания. Однако, при этом, следует отметить, что прилагаемые рисунки лишь иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.
Для лучшего понимания существа изобретения, а также его отличительных признаков, целей и преимуществ ниже приводится более подробное описание изобретения, кратко изложенное выше и проиллюстрированное прилагаемыми чертежами. Эти чертежи являются частью настоящего описания. Однако, при этом, следует отметить, что прилагаемые рисунки лишь иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.
На фиг. 1 проиллюстрирована одна стадия слияния извне (FFWO) в клетках ВНК при рН 5,3 в присутствии 2-меркал-тоэтанола (2-МЕ). Комплексы "вирус-клетка" подвергали воздействию среды для слияния (при низком рН), содержащей различные концентрации восстановителя 2-МЕ, как описано ниже. Слияние оценивали в соответствии с нижеприведенным описанием.
На фиг. 2 проиллюстрирована зависимость множественности заражения (M01) от двухстадийного FFWO в клетках ВНК, обработанных 2-МЕ. Комплексы "вирус-клетка" обрабатывали средой для слияния с низким рН, содержащей 0,05 нМ 2-МЕ (квадраты) и не содержащей 2-МЕ (треугольники), в течение 5 минут, после чего среду доводили до нейтрального рН и оценивали на слияние, как описано ниже.
На фиг. 3 проиллюстрировано прямое действие DTNB на инфекционность вируса Синдбис. Вирус подвергали воздействию 1 мМ DTNB в течение различных периодов времени, а оставшийся инфекционный вирус титровали на монослоях ВНК. Концентрацию инфекционного вируса выражали как процентное содержание от необработанного контроля.
На фиг. 4 показаны конформационные изменения в Е1 в процессе трансмембранного проникновения вируса Синдбис и слияние мембран (вирусной и клеточной), индуцированное низким рН. Как видно из фиг. 4А, гликопротеин в зрелом вирионе имеет функциональный и структурный домены, которые ответственны за слияние мембран и целостность оболочки соответственно. На фиг. 4В показано, что конформационные изменения, индуцированные взаимодействием рецептор-вирус или экспонированием средой с низким рН, демаскируют критические дисульфидные мостики, способствуя тем самым перестановке дисульфидных мостиков.
На фиг. 4С показано, что восстановление критических дисульфидных мостиков, ответственное за поддержание белок-белковых ассоциаций оболочки, разрушает жесткую икасаэдрическую решетку белка, что приводит к последующему слиянию оболочки с клеточной мембраной (черные квадратики обозначают пептид слияния).
На фиг. 5 показан мутант El-ser62 вируса Синдбис. Клетки были помечены 35S-метионином/цистеина через 5 ч после инфицирования, и вытеснение метки проводят через 0 (дорожка 1), 5 (дорожка 2), 10 (дорожка 3), 20 (дорожка 4) мин в присутствии циклогексимида. Клеточный лизат подвергали иммунопреципитации с использованием антисыворотки, продуцированной против очищенного вируса. Ser62 продуцирует вирусные белки PE1, E1, E2 и С, и белок РЕ2 превращается в Е2. На электронной микрофотографии изображены вирионы, концентрированные из среды трансфецированных клеток, и очищенные путем центрифугирования в градиенте плотности. Содержание белков радиоактивного мутантного вируса показано на дорожке 5.
На фиг. 6 проиллюстрировано действие тиол-блокирущего агента DTNB на инфицирование клеток моделью коронавируса, вирусом мышиного гепатита (MHV).
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении с использованием мембраносодержащего вируса Синдбис (прототип альфа-вирусов) было показано, что этот вирус имеет в качестве компонента одного из своих двух гликопротеинов, ассоциированных с мембраной-оболочкой, белковый домен, который, по своей структуре и функции, гомологичен белкам, имеющим известную тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность. Настоящее изобретение также показало, что модель коронавируса (вирус мышиного гепатита) имеет такой же механизм инфицирования, как и вышеописанный вирус Синдбис, и что этот механизм используется другими вирусами для инфицирования клеток.
В настоящем изобретении с использованием мембраносодержащего вируса Синдбис (прототип альфа-вирусов) было показано, что этот вирус имеет в качестве компонента одного из своих двух гликопротеинов, ассоциированных с мембраной-оболочкой, белковый домен, который, по своей структуре и функции, гомологичен белкам, имеющим известную тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность. Настоящее изобретение также показало, что модель коронавируса (вирус мышиного гепатита) имеет такой же механизм инфицирования, как и вышеописанный вирус Синдбис, и что этот механизм используется другими вирусами для инфицирования клеток.
Поверхностные белки многих вирусов животных содержат комплексные дисульфидные мостики, которые могут стабилизировать частицы и которые должны разрушаться для того, чтобы происходил процесс инфицирования и высвобождения вирусного генома. С помощью настоящего изобретения был идентифицирован механизм, который объясняет основной процесс, протекающий при инфицировании хозяина вирусом. Полученные уникальные и ранее не описанные данные иллюстрируют новую стратегию борьбы с вирусными инфекциями и новые способы получения вакцин.
Настоящее изобретение показало, что сам вирус обладает способностью восстанавливать свои дисульфидные мостики после связывания с соответствующим рецептором клетки-хозяина. Взаимодействие вирусного структурного белка с рецептором хозяина инициирует конформационные изменения в вирусном белке, стимулируя тем самым явление восстановления.
Настоящее изобретение показало, что тиол-дисульфидный обмен имеет решающее значение для инфицирования клеток альфа- и коронавирусов. В случае альфа-вирусов, такое восстановление осуществляет посредством тиолредуктазной/дисульфидизомеразной активности, присутствующей в самом вирусе. Многие вирусы (включая ВИЧ) содержат дисульфидные мостики, которые, как было показано, играют важную роль в структуре и сборке вируса. От этих дисульфидных мостиков зависит структурная целостность вируса, и для осуществления процесса инфицирования хозяина указанные дисульфидные мостики должны быть разрушены. В настоящем изобретении предлагается новый способ получения неинфекционного вируса, который может быть использован в качестве вакцины, а именно, получение мутантного вируса. По сравнению с другими вакцинами мутантные вирусы настоящего изобретения имеют то преимущество, что они не требуют инактивации путем химической или физической обработки. Поэтому они представляются иммунной системе антигенами, которые являются более идентичными антигенам, присутствующим в инфекционном вирионе. В настоящей заявке также описаны способы идентификации химических соединений, которые способны ингибировать эндогенную тиолредуктазную активность и которые тем самым могут служить в качестве лекарственного средства, предотвращающего распространение вирусной инфекции. Вирус-ассоциированная тиолредуктаза является гомологичной известным ферментам этого типа. Таким образом, соединения, обладающие способностью блокировать действие одного из этих ферментов в одном вирусе, будут блокировать активность такого фермента в других вирусах.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей неинфекционный мутированный вирус, который может быть использован для получения вакцины. Таким вирусом является, в основном, мутированный вирус, полученный путем замещения консервативной цисетиновой аминокислоты другой аминокислотой. При этом следует отметить, что в способах и композициях настоящего изобретения цистеин может быть замещен лишь очень небольшим числом аминокислот. Так, например, в композициях настоящего изобретения конкретная цистеиновая аминокислота замещается серином. Для создания мутантных вирусов настоящего изобретения предпочтительно, чтобы замещаемыми аминокислотами были консервативные цистеины, которые находятся в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность.
В способах настоящего изобретения для получения нужной композиции может быть использован любой известный вирус. Мутированным вирусом является предпочтительно мутант вируса, выбранного из группы альфа-вирусов и коронавирусов. Характерным представителем альфа-вирусов является вирус Синдбис, а характерным представителем коронавируса является вирус мышиного гепатита. Характерным примером мутированного вируса Синдбис является мутант El-Ser62.
Настоящее изобретение относится к новым плазмидам адаптированным для экспрессии в клетках, и содержащим рекомбинантную ДНК, кодирующую неинфекционный мутированный вирус и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии указанной ДНК в этих клетках. Плазмиды настоящего изобретения могут быть адаптированы для экспрессии в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых или клетках млекопитающих. Типичными примерами дрожжей являются Saccaromyces, Pichia и Kluyveromyces. Типичными примерами бактериальных клеток являются E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. Типичными примерами клеток млекопитающих являются клетки BHK-21, Vero, Hela и клетки яичника китайского хомячка (CНО).
Плазмида настоящего изобретения содержит мутированный вирус настоящего изобретения. Таким вирусом является, предпочтительно, альфа-вирус или коронавирус. В качестве типичного примера мутированного альфа-вируса может служить мутированный вирус Синдбис. Конкретным характерным примером мутированного вируса Сандбис является мутант El-Ser62.
Настоящее изобретение также относится к новым трансфепированным клеткам. Характерными примерами трансфецированных клеток являются трансфецированные клетки, содержащие плазмиду, определенную в п.5 формулы изобретения, и трансфецированные клетки, содержащие плазмиду, определенную в п.12 формулы изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к неинфекционным мутированным вирусам, продуцированным трансфецированными клетками настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования распространения вирусной инфекции, включающему в себя стадию контактирования указанного вируса с соединением, ингибирующим тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в указанном вирусе. В настоящем описании также рассматривается противовирусное средство, ингибирующее распространение вирусной инфекции, а в частности, ингибирующее тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в указанном вирусе. В соответствии с описанием настоящего изобретения любой средний специалист может легко получить дополнительные соединения, ингибирующие тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в соответствующем вирусе.
Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.
Пример 1. Клетки, вирусы и среды
Клетки BHK-21 культивировали при 37oС в минимальной поддерживающей среде Игла (МЕМ), в которую были добавлены 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO), бульон с 5% триптозофосфатом, и 2 мМ L-глутамина. Теплоустойчивый вирус Синдбис (SHVR), первоначально полученный E. Pfeffer-korn (Darmouth Medical College) пассировали при низкой множественности, а затем титровали на клетках BHK-21, как описано Renz и Brown (J. Virol. 19: 775-781 (1976)).
Клетки BHK-21 культивировали при 37oС в минимальной поддерживающей среде Игла (МЕМ), в которую были добавлены 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO), бульон с 5% триптозофосфатом, и 2 мМ L-глутамина. Теплоустойчивый вирус Синдбис (SHVR), первоначально полученный E. Pfeffer-korn (Darmouth Medical College) пассировали при низкой множественности, а затем титровали на клетках BHK-21, как описано Renz и Brown (J. Virol. 19: 775-781 (1976)).
Пример 2. Слияние извне (FFWO), опосредованное вирусом Синдбис
Вариации опосредованного вирусом Синдбис FFWO получали при 1000 БОЕ SVHR на клетку для монослоев ВНК при 4oС в течение 60 минут. Затем вирусный инокулят заменяли средой для слияния (37oC), состоящей из минимальной поддерживающей среды (МЕМ) Игла без бикарбоната, 10 мМ ME [2(N-морфолино)этансульфоновой кислоты] и 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты) (рН 5, 3) в отсутствии или в присутствии различных концентраций меркаптоэтанола (2-МЕ). После 5-часового инкубирования при 37oС слияние оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа по следующей шкале: - слияние отсутствует; + наблюдается менее, чем 25% слитых клеток; ++ имеет место 25% слитых клеток (короче говоря, FFWO при низком рН было индуцировано при адсорбции до 50% слитых клеток); +++ означает 50-95% слитых клеток; ++++ означает более чем 95% слитых клеток. Степень слияния вычисляли по формуле 1-(число клеток/число ядер). FFWO в две рН-стадии индуцировали, как описано выше, за исключением того, что использовали различные множественности заражения SVHR, а среда для слияния содержала 0.05 нМ 2-МЕ. После 5-минутного инкубирования в среде для слияния с низким рН комплексы "вирус-клетка" возвращали в ростовую среду. После 1-часового инкубирования при 37oС монослои были сфотографированы при фазово-контрастном освещении и оценены, как описано выше.
Вариации опосредованного вирусом Синдбис FFWO получали при 1000 БОЕ SVHR на клетку для монослоев ВНК при 4oС в течение 60 минут. Затем вирусный инокулят заменяли средой для слияния (37oC), состоящей из минимальной поддерживающей среды (МЕМ) Игла без бикарбоната, 10 мМ ME [2(N-морфолино)этансульфоновой кислоты] и 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты) (рН 5, 3) в отсутствии или в присутствии различных концентраций меркаптоэтанола (2-МЕ). После 5-часового инкубирования при 37oС слияние оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа по следующей шкале: - слияние отсутствует; + наблюдается менее, чем 25% слитых клеток; ++ имеет место 25% слитых клеток (короче говоря, FFWO при низком рН было индуцировано при адсорбции до 50% слитых клеток); +++ означает 50-95% слитых клеток; ++++ означает более чем 95% слитых клеток. Степень слияния вычисляли по формуле 1-(число клеток/число ядер). FFWO в две рН-стадии индуцировали, как описано выше, за исключением того, что использовали различные множественности заражения SVHR, а среда для слияния содержала 0.05 нМ 2-МЕ. После 5-минутного инкубирования в среде для слияния с низким рН комплексы "вирус-клетка" возвращали в ростовую среду. После 1-часового инкубирования при 37oС монослои были сфотографированы при фазово-контрастном освещении и оценены, как описано выше.
Пример 3. Лекарственные средства
DTNB солюбилизировали в бессывороточной среде МЕМ. Как показал анализ, проведенный путем включения [3Н] уридина в ТСА-осажденную РНК (ТСА-трихлоруксусная кислота), с последующим его вытеснением трипановым синим или поглощением нейтрального красного, DTNB при концентрациях вплоть до 5 мМ не оказывает какого-либо заметного воздействия на жизнеспособность клетки. Прямое действие DTNB на инфекционность вируса Синдбис определяли путем инкубирования этого реагента с вирусом в течение различных интервалов времени, с последующим прекращением инкубирования путем серийного разведения в фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 3% детальную телячью сыворотку, и титрования на клетках ВНК стандартным методом бляшек, как описано Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).
DTNB солюбилизировали в бессывороточной среде МЕМ. Как показал анализ, проведенный путем включения [3Н] уридина в ТСА-осажденную РНК (ТСА-трихлоруксусная кислота), с последующим его вытеснением трипановым синим или поглощением нейтрального красного, DTNB при концентрациях вплоть до 5 мМ не оказывает какого-либо заметного воздействия на жизнеспособность клетки. Прямое действие DTNB на инфекционность вируса Синдбис определяли путем инкубирования этого реагента с вирусом в течение различных интервалов времени, с последующим прекращением инкубирования путем серийного разведения в фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 3% детальную телячью сыворотку, и титрования на клетках ВНК стандартным методом бляшек, как описано Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).
Пример 4. Анализ на проникновение вируса
Синтез вирусной РНК оценивали путем определения включения [3H] уридина в ТСА-осажденный материал в клетках ВНК, обработанных за 90 мин до инфицирования 4 микрограммами дактиномицина на 1 мл и выдерживаемых все это время в дактиномицине. Монослои равного числа клеток ВНК обрабатывали 1 мМ DTNB в течение 30 мин при 37oС в трех различных временных вариантах по отношению к 1-часовой адсорбции 5 БОЕ SVHR на клетку при 4oС. После адсорбции все монослои промывали бессывороточной МЕМ и инкубировали при 37oС для осуществления проникновения адсорбированного вируса. 30-минутную DTNB-обработку проводили либо непосредственно до адсорбции, либо в процессе проникновения вируса при 37oС, либо сразу после периода проникновения. После DTNB-обработки монослои промывали. Через 90 мин после периода проникновения, добавляли [3H] уридин (10 мкКи/мл), и через 5 ч монослои подвергали лизису путем добавления додецилсульфата натрия и преципитации с использованием 10%-ной охлажденной льдом ТСА, после чего подсчитывали радиоактивность. Проникновение вируса оценивали по образованию бляшек на монослоях ВНК, которые были экспонированы 1 мМ DTNB в течение 60 мин в условиях обработки, описанных выше. Образование бляшек оценивали, как описано выше Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).
Синтез вирусной РНК оценивали путем определения включения [3H] уридина в ТСА-осажденный материал в клетках ВНК, обработанных за 90 мин до инфицирования 4 микрограммами дактиномицина на 1 мл и выдерживаемых все это время в дактиномицине. Монослои равного числа клеток ВНК обрабатывали 1 мМ DTNB в течение 30 мин при 37oС в трех различных временных вариантах по отношению к 1-часовой адсорбции 5 БОЕ SVHR на клетку при 4oС. После адсорбции все монослои промывали бессывороточной МЕМ и инкубировали при 37oС для осуществления проникновения адсорбированного вируса. 30-минутную DTNB-обработку проводили либо непосредственно до адсорбции, либо в процессе проникновения вируса при 37oС, либо сразу после периода проникновения. После DTNB-обработки монослои промывали. Через 90 мин после периода проникновения, добавляли [3H] уридин (10 мкКи/мл), и через 5 ч монослои подвергали лизису путем добавления додецилсульфата натрия и преципитации с использованием 10%-ной охлажденной льдом ТСА, после чего подсчитывали радиоактивность. Проникновение вируса оценивали по образованию бляшек на монослоях ВНК, которые были экспонированы 1 мМ DTNB в течение 60 мин в условиях обработки, описанных выше. Образование бляшек оценивали, как описано выше Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).
Пример 5. FFWO при низком рН
Скорость FFWO, опосредованного вирусом Синдбис, зависит от рН среды, в которую возвращают клетки после их экспонирования средой С низким рН (Edwards & Brown, J. Cen, Virol., 67: 377-380 (1966)). Слияние протекает тем быстрее, чем выше значения рН, и не происходит при пороговом низком рН 5,3, а поэтому для создания условий для слияния необходимо возвращение в нейтральную среду. Аналогичным образом реакции тиолдисульфидного обмена являются рН-зависимыми, то есть, рН непосредственно влияет на скорость реакции, являющейся эффективной лишь в нейтральных или щелочных условиях, как было показано Fееner и др. (J. Biol. Chem. 265: 18780-18785 (1990)). В случае, если восстановление критических вирусных дисульфидных мостиков необходимо для разрушения ригидной решетчатой структуры оболочки белка перед осуществлением слияния мембран, то это слияние может быть блокировано при низком рН.
Скорость FFWO, опосредованного вирусом Синдбис, зависит от рН среды, в которую возвращают клетки после их экспонирования средой С низким рН (Edwards & Brown, J. Cen, Virol., 67: 377-380 (1966)). Слияние протекает тем быстрее, чем выше значения рН, и не происходит при пороговом низком рН 5,3, а поэтому для создания условий для слияния необходимо возвращение в нейтральную среду. Аналогичным образом реакции тиолдисульфидного обмена являются рН-зависимыми, то есть, рН непосредственно влияет на скорость реакции, являющейся эффективной лишь в нейтральных или щелочных условиях, как было показано Fееner и др. (J. Biol. Chem. 265: 18780-18785 (1990)). В случае, если восстановление критических вирусных дисульфидных мостиков необходимо для разрушения ригидной решетчатой структуры оболочки белка перед осуществлением слияния мембран, то это слияние может быть блокировано при низком рН.
Для иллюстрации роли указанного явления восстановления в SV - опосредованном (SV-вирус Синдбис) FFWO клеток ВНК была сделана попытка осуществления слияния при низком рН в присутствии восстановителя 2-МЕ. В отличие от DTT и цистеина, 2-МЕ является эффективным восстановителем при рН 5,0 и выше (Torchinskii, Sulfhydryl and Disulfide Groups of Proteins, Plenum Publishing, N.Y. 1974). Было обнаружено, что обработка 2-МЕ в различных концентрациях широкого диапазона индуцирует FFWO при рН 5,3, хотя этот диапазон концентраций варьировался. 2-МЕ-индуцированное слияние при низком рН является высокочувствительным к ряду факторов, включая число пассажей клеток, и степень конфлюэнтности монослоев, которые не играют решающей роли в процессах слияния после возвращения в среду с нейтральным рН. Обработка монослоев восстановителем 2-МE в отсутствии вируса и инкубирование комплексов "вирус-клетка" при рН 5,3 в отсутствии 2-МЕ не индуцировали слияния. Тот факт, что для индуцирования FFWO требуются исключительно небольшие концентрации восстановителя, позволяет предположить, что восстановленные нужные дисульфидные мостики являются в высокой степени растянутыми. Высокие концентрации 2-МЕ не стимулируют слияния, возможно, из-за того, что вирусная оболочка разрушается перед тем, как происходит слияние. Описанное SV-опосредованное-FFWO, происходящее при низком рН и в присутствии низких концентраций 2-МЕ, обусловлено восстановлением нужных вирусных дисульфидных мостиков, играющих важную роль для слияния клетки с вирусом. Кроме того, это явление может объяснить необходимость для FFWO возвращения в среду с нейтральным рН.
Пример 6. Влияние 2-МЕ на множественность заражения, необходимую для FFWO
2-МЕ-индуцирование слияния при низком рН означает, что эффективность индуцируемого вирусом Синдбис (SV) FFWO зависит от события восстановления.
2-МЕ-индуцирование слияния при низком рН означает, что эффективность индуцируемого вирусом Синдбис (SV) FFWO зависит от события восстановления.
На фиг. 2 показано влияние 2-МE на множественность заражения, требуемую для типичного SV-опосредованного FFWO. Восстановитель, в случае, если он присутствует в течение кратковременного экспонирования комплекса "вирус-клетка" средой с низким рН, проводимого в процессе FFWO, повышает эффективность слияния после возвращения в среду с нейтральным рН. Оптимальное слияние в 2-МЕ-обработанных монослоях получали уже при множественности заражения 100 БОЕ/кл., тогда как при отсутствии 2-МЕ-обработки обычно требовалась множественность заражения от 500 до 100 БОЕ/кл.
Требование высокой множественности заражения для FFWO должно частично коррелировать с частотой, с которой прикрепляющиеся вирионы образуют множественные контакты с клетками, то есть, это требование должно коррелировать со стерическими возможностями для осуществления слияния "клетка-вирус-клетка". Если осуществление такого слияния зависит от тиолдисульфидной реакции обмена, то требование высокой множественности заражения может также коррелировать с частотой, с которой нужные вирусные дисульфидные мостики ассоциируются с соответствующими тиоловыми донорами. Увеличение доступности тиолов, обусловленное введением экзогенного восстановителя 2-МЕ, должно приводить к снижению числа вирионов, требуемых для продуцирования максимального уровня слияния клеток. Этот вывод подтверждается тем, что для максимального слияния после кратковременной обработки 2-МЕ требуется более низкая множественность заражения.
Пример 7. Тиолдисульфидные обменные реакции, протекающие во время проникновения вируса Синдбис в клетки ВНК.
Настоящее изобретение показало, что для слияния мембран во время проникновения вируса требуется восстановление дисульфидных мостиковых связей в ригидной решетке белка оболочки. DTNB является мембранонепроницаемым сульфгидрил-блокирующим реагентом, который ковалентно модифицирует сульфгидрил посредством тиолдисульфидной обменной реакции. Поскольку этот реагент не оказывает непосредственного воздействия на инфекционность вируса Синдбис (фиг. 3) или на жизнеспособность клеток ВНК, то DTNB представляет собой наилучший реагент для иллюстрации тиолдисульфидных обменных реакций, происходящих в плазматической мембране во время проникновения вируса Синдбис.
Пример 8. Влияние DTNB на проникновение вируса
Влияние DTNB на проникновение вируса при низкой множественности инфекции оценивали путем введения [3H] на в вирусную РНК при тех условиях обработки, как описано в примере 4 и табл. 1. В присутствии дактиномицина клетки ВНК обрабатывали в течение 30 мин 1 мМ DTNB, либо до адсорбции вируса при 4oС, либо во время проникновения вируса при 37oС, либо сразу после проникновения вируса. В каждом случае, через 5 ч после периода проникновения, вирусную РНК исследовали путем измерения включения [3H] уридина в ТСА-осажденный материал. DTNB-oбpaбoткa клеток до инфицирования оказывала незначительное ингибирующее действие на синтез вирусной РНК, а обработка во время проникновения вируса ингибировала продуцирование РНК приблизительно на 40% от контрольных уровней. Снижение синтеза РНК, наблюдаемое при обработке до инфицирования, вероятно, обусловлено невозможностью удаления всего лекарственного средства до инфицирования. DTNB-обработка после начального периода проникновения имела ограниченное ингибирующее действие. Однако подавление синтеза РНК после этой обработки может быть обусловлено тем фактом, что инфицирование вирусом Синдбис увеличивает проницаемость клеток, открывая тем самым некоторым мембранонепроницаемым реагентам прямой доступ к цитоплазме, где они могут оказывать вторичное действие.
Влияние DTNB на проникновение вируса при низкой множественности инфекции оценивали путем введения [3H] на в вирусную РНК при тех условиях обработки, как описано в примере 4 и табл. 1. В присутствии дактиномицина клетки ВНК обрабатывали в течение 30 мин 1 мМ DTNB, либо до адсорбции вируса при 4oС, либо во время проникновения вируса при 37oС, либо сразу после проникновения вируса. В каждом случае, через 5 ч после периода проникновения, вирусную РНК исследовали путем измерения включения [3H] уридина в ТСА-осажденный материал. DTNB-oбpaбoткa клеток до инфицирования оказывала незначительное ингибирующее действие на синтез вирусной РНК, а обработка во время проникновения вируса ингибировала продуцирование РНК приблизительно на 40% от контрольных уровней. Снижение синтеза РНК, наблюдаемое при обработке до инфицирования, вероятно, обусловлено невозможностью удаления всего лекарственного средства до инфицирования. DTNB-обработка после начального периода проникновения имела ограниченное ингибирующее действие. Однако подавление синтеза РНК после этой обработки может быть обусловлено тем фактом, что инфицирование вирусом Синдбис увеличивает проницаемость клеток, открывая тем самым некоторым мембранонепроницаемым реагентам прямой доступ к цитоплазме, где они могут оказывать вторичное действие.
Действие DTNB на проникновение вируса Синдбис было также определено путем оценки образования бляшек, как показано в табл. 1. В экспериментах, проиллюстрированных в табл. 1, вирус был адсорбирован на равное число клеток ВНК в течение одного часа при 4oС, где указанные клетки помещали в теплую среду МЕМ и инкубировали при 37oС для осуществления проникновения вируса. Клетки обрабатывали в течение 30 мин (А) или 60 мин (В) 1 мМ DTNB в указанное выше время. Затем монослои промывали для удаления лекарственного средства, после чего снова инкубировали при 37oС в среде, не содержащей DTNB. Результаты выражали как средние значения по пяти независимым экспериментам ± среднеквадратическое отклонение. Через 5 ч после нагревания клеток до 37oС для инициации проникновения вируса проводили анализ на полную вирусную РНК. Монослои покрывали агарозой и окрашивали нейтральным красным через 48 ч после инфицирования.
Предварительная обработка клеток DTNB приводит к слабому ингибированию образования бляшек, а обработка клеток в период инфицирования ингибирует образование бляшек приблизительно на 46% от уровня необработанного контроля. Аналогично указанному выше, снижение образования бляшек, наблюдаемое в случае DTNB-обработки монослоев до осуществления инфицирования, вероятно, обусловлено невозможностью удалить весь реагент до инфицирования. DTNB-обработка после инфицирования не оказывала ингибирующего действия на образование бляшек, что свидетельствует о том, что подавление уровней РНК путем DTNB-обработки после инфицирования не является результатом прямого воздействия DTNB на проникновение вируса. Хотя это и парадоксально, но немного большее число бляшек, обнаруженных в клеточных культурах, обработанных после инфицирования, оказалось в высокой степени репродуцируемыми.
Интересно отметить, что проникновение вируса Синдбис наиболее эффективно ингибируется DTNB в том случае, когда этот реагент присутствует во время инфицирования, что дает основание предположить, что тиоловые группы-мишени являются демаскированными во время проникновения несмотря на кооперативное взаимодействие между вирусом и его рецептором. Такое кооперативное и быстрое взаимодействие может создавать условия, при которых DTNB не может эффективно конкурировать с вирусным дисульфидным мостиком, подвергаясь тиолдисульфидной обменной реакции. Эта реакция протекает с большой скоростью, около 104с при рН 8,0, и неэффективность алкилирования критических тиолов должна приводить к неспособности полностью блокировать проникновение вируса Синдбис.
На фиг. 4 проиллюстрированы конформационные изменения в EI во время проникновения вируса Синдбис и слияния мембран, индуцированного низким рН. Как показано на фиг. 4А, гликопротеин в зрелом вирионе имеет функциональный и структурный домены, которые ответственны за слияние мембран и целостность оболочки соответственно. На фиг. 4В можно видеть, что конформационные изменения, индуцированные взаимодействием "рецептор-вирус" или экспонированием низким рН, демаскируют критические дисульфидные мостики, что способствует тем самым перестановке дисульфидных мостиков. На фиг. 4С показано, что восстановление критических дисульфидных мостиков, ответственное за поддержание белок-белковых ассоциаций, разрушает ригидную икосаэдрическую решетку белка, что приводит к последующему слиянию оболочки с клеточной мембраной. На фиг. 4 черные квадратики обозначают EI-EI-ассоциацию, а заштрихованные квадратики обозначают пептид слияния.
Слияние вирусов в оболочке с клеточными мембранами во время проникновения вируса является белок-опосредованным, как и внутриклеточное и межклеточное слияния. Присутствие домена слияния в оболочечном белке EI ответственно за слияние альфа-вирусов с клеточной мембраной. Кроме того, в настоящем изобретении показано, что стабилизированные дисульфидными мостиками EI-EI-ассоциации оболочки должны быть разрушены для того, чтобы произошло слияние мембран. Наиболее вероятным механизмом разборки оболочки вируса Синдбис после белок-белковых взаимодействий в процессе проникновения вируса является восстановление указанных стабилизирующих дисульфидных мостиков посредством реакций тиолдисульфидного обмена.
Тиолдисульфидная обменная реакция происходит посредством нуклеофильной атаки ионизированного тиола на дисульфидном мостике и является в высокой степени зависимой от рН среды, рКа тиола и стерического препятствия. Поэтому цистеин-опосредованные тиолдисульфид-обменные реакции требуют нейтрального или щелочного рН. FFWO, опосредованное штаммом HP вируса Синдбис, требует экспонирования средой с рН 5,3 и последующего возвращения, для индуцирования слияния в среду с рН, превышающим 6. Скорость слияния возрастает по мере возрастания рН среды, в которую возвращаются комплексы "вирус-клетка", при этом слияния не происходит, если рН ниже порогового значения, необходимого для осуществления слияния. Аналогичным образом для быстрой "разборки" вирусной оболочки с помощью DTT также требуется кратковременное присутствие в среде с рН 5,3 и последующее возвращение в среду с нейтральным рН. Эти наблюдения показали, что среда с нейтральным рН играет определенную роль в тиолдисульфид-обменных реакциях. В соответствии с настоящим изобретением было проиллюстрировано, что указанные реакции тиолдисульфидного обмена играют важную роль в процессе слияния вируса с клеткой.
Процесс FFWO, опосредованного низким рН, отличается от процесса инфицирования тем, что он требует высокой множественности вируса и не зависит от рецептора белка. Однако оба эти процесса должны обеспечивать механизм разрушения решетки оболочечного белка перед стадией слияния.
Настоящее изобретение показало, что оба эти процесса равным образом зависят от тиолдисульфидных обменных реакций. Добавление очень небольших концентраций восстановителя 2-МE (который, в отличие от DTT и биологических тиолов, осуществляет эффективное восстановление при рН 5,3) стимулирует слияние клеток в кислой среде, позволяя тем самым предположить, что химическое восстановление нужных дисульфидных мостиковых связей может индуцировать слияние в каких-либо других неблагоприятных условиях восстановления. Тот факт, что для стимуляции такого слияния требуются чрезвычайно низкие концентрации 2-МЕ, означает, что критические дисульфидные мостики, подвергаемые восстановлению, имеют очень вытянутую конформацию. Индуцированные низким рН конформационные изменения в оболочечных белках могут быть ответственны за формирование таких вытянутых критических дисульфидных мостиков и могут служить объяснением очень быстрой природы DTT-опосредованной in vitro "разборки" вируса после воздействия среды с низким рН.
Процесс проникновения вируса Синдбис в клетку-хозяина является рецептор-зависимым, и в этой связи было идентифицировано несколько потенциальных рецепторов. Взаимодействие вируса с рецептором клеточной поверхности при нейтральном рН индуцирует конформационные изменения в вирусном гликопротеине, которые предшествуют стадии проникновения вируса.
Настоящее изобретение показало, что кооперативные взаимодействия между рецептором и вирусом индуцируют конформационные изменения, которые способствуют восстановлению нужных дисульфидных мостиков в белках оболочки посредством реакций тиолдисульфидного обмена. Процессы, развивающиеся от момента возникновения рецептор-индуцированных конфармационных изменений до разрушения решетчатой структуры оболочечного белка и слияния, происходят, по всей вероятности, очень быстро. Тот факт, что стабилизирующие дисульфидные мостики и критические тиолы являются недоступными для таких молекул, как DTT и DTNB даже в естественном состоянии, наряду с исключительно высокой скоростью, с которой протекает процесс восстановления после рецептор-индуцированных конформационных изменений, может служить объяснением неэффективности DTNB в блокировании указанного процесса. Тиолы, опосредующие процессы восстановления, могут присутствовать либо в белке рецептора, либо в самом вирусе. В последнем случае перестановка дисульфидных мостиков после связывания может приводить к требуемому разрушению решетки оболочечного белка. В этой модели взаимодействие вируса с соответствующим рецептором приводит к изменению конформации EI, способствуя тем самым перестановке дисульфидных мостиков посредством тиолдисульфидных обменных реакций. Такая перестановка дисульфидных мостиков приводит к разрушению жестких белок-белковых ассоциаций в оболочке, способствуя тем самым последующему слиянию вирусной оболочки с плазматической мембраной.
Пример 9. Продуцирование мутанта Еl-Ser62
Данные о структуре белков, обладающих известной тиолредуктазной/протеиндисульфидизомеразной активностью, получали из Gene Bank. Хотя в функциональных доменах этих белков не имеется абсолютно консервативных аминокислотных последовательностей, однако в домене белка, содержащем положительно заряженные основные аминокислоты, неизменно присутствует "донорный" цистеин. Действительно, тиолредуктазная активность в этих белках может быть увеличена путем увеличения суммарного положительного заряда этого домена. Были исследованы все аминокислотные последовательности гликопротеинов EI всех известных альфа-вирусов. Благодаря этому исследованию были выявлены два цистеина (62 и 79), которые являются консервативными и находятся в типичных положительно заряженных доменах с известной тиолредуктазной активностью. Таким образом мутация с удалением одного из этих цистеинов приведет к потере инфекционности этим вирусом благодаря элиминации тиолредуктазной активности, ассоциированной с этим доменом.
Данные о структуре белков, обладающих известной тиолредуктазной/протеиндисульфидизомеразной активностью, получали из Gene Bank. Хотя в функциональных доменах этих белков не имеется абсолютно консервативных аминокислотных последовательностей, однако в домене белка, содержащем положительно заряженные основные аминокислоты, неизменно присутствует "донорный" цистеин. Действительно, тиолредуктазная активность в этих белках может быть увеличена путем увеличения суммарного положительного заряда этого домена. Были исследованы все аминокислотные последовательности гликопротеинов EI всех известных альфа-вирусов. Благодаря этому исследованию были выявлены два цистеина (62 и 79), которые являются консервативными и находятся в типичных положительно заряженных доменах с известной тиолредуктазной активностью. Таким образом мутация с удалением одного из этих цистеинов приведет к потере инфекционности этим вирусом благодаря элиминации тиолредуктазной активности, ассоциированной с этим доменом.
Мутацию путем замены цистеина на серин в положении 62 в последовательности гликопротеина EI вируса Синдбис получали посредством РСR-мутагенеза с использованием мегапраймера, как описано Liu и Brown (J. Gell.Biol., 120: 877-883 (1993). Эти праймеры, представляющие последовательности 9760-9779 (праймер А) и нуклеотиды 10445-10436 (праймер В) в нуклеотидной последовательности Toto 1101 вируса Синдбис, конструировали как "концевые праймеры".
Праймер А = 5' -CGАTGATGATTGGCGTAACT-3' (SEQ ID NO:1)
Праймер В = 5' -CGAAAAATCAAATCCTGCGGCTCC-3' (SEQ ID NO:2)
"Мутантный праймер" с заменой основания G на С состоял из нулеотидов 10236-10259:
5' -CCAAAAATCAAATCCTGC-3' (SEQ ID NO:3)
G (дикого типа).
Праймер В = 5' -CGAAAAATCAAATCCTGCGGCTCC-3' (SEQ ID NO:2)
"Мутантный праймер" с заменой основания G на С состоял из нулеотидов 10236-10259:
5' -CCAAAAATCAAATCCTGC-3' (SEQ ID NO:3)
G (дикого типа).
Мегапраймер конструировали путем присоединения мутантного праймера и праймера В к матрице Toto, в результате чего получали первый продукт, состоящий из нуклеотидов 10236-10445 с мутацией и сайтом расщепления SPL 1 в 10381.
Этот мутантный мегапраймер был удлинен для введения в него второго рестрикционного сайта путем объединения праймера А с продуктом первой PCR-реакции. Матрицу очищенного фрагмента Toto 1101, состоящего ив нуклеотидов 8571-10381, получали путем гидролиза рестриктирующими ферментами STU I и SPL I. Второй продукт состоял из нуклеотидов 9760-10445 и имел необходимую мутацию и рестрикционные сайты BSIW (NT 9804) и SPL 1 (NT 10381).
Ферменты BSIW и SPL I использовали для вырезания нуклеотидов 9804-10381 из Toto 1101 и второго PCR-npoдукта. Мутантный продукт, описанный выше, лигировали в Toto 1101 вместо последовательности дикого типа, в результате чего получали плазмиду, содержащую последовательность вируса Синдбис, в которой цистеин в положении 62 был заменен на серин. Эту плазмиду амплифицировали в Е. coli, и РНК, продуцированную из этой плазмиды путем in vitro -транскрипции, использовали для трансфекции клеток BHK-21 (клетки млекопитающих) и продуцирования вируса, показанного на фиг. 5.
Для осуществления программированной реакции транскрипции in vitro с помощью клона настоящего изобретения этот клон использовали с промотором SP6, в результате чего продуцировали матричную РНК, которая была идентичной РНК интактного вируса. Трансфекция РНК-продукта этой реакции в культивируемые клетки млекопитающего приводила к инфицированию, протекающему таким же образом, как и инфицирование интактным вирусом (фиг. 5). При этом были продуцированы зрелые вирусы которые по своей структуре и биохимическим свойствам были идентичны (за исключением замещения серином) нормальным вирусам. Однако, как было установлено с помощью стандартных анализов, эти вирусные частицы оказались абсолютно неинфекционными.
Настоящее изобретение продемонстрировало, что конформационные изменения в структуре мембранных гликопротеинов вируса происходят в том случае, когда вирус взаимодействует с рецептором клеточной поверхности. Такое конформационное изменение является необходимым условием для проникновения вируса через мембрану. Такое конформационное изменение делает тиоловую группу доступной и способной вступать в химическую реакцию с тиол-блокирующим агентом дитионитробензолом. Реакция этого агента с указанным тиолом блокирует процесс проникновения вируса. Указанный целевой критический тиол находится либо в рецепторном белке клеточной поверхности, либо в гликопротеине вирусной мембраны.
В результате разработки настоящего изобретения было получено прямое свидетельство тому, что тиол-донор и дисульфид-мишень находятся в вирусном гликопроетине EI и что домен белка, окружающий и включающий в себя цистеин 62 в последовательности EI, обладает активностью, аналогичной активности известной тиолредуктазы/протеинизомеразы.
Пример 10. Коронавирус
Действие тиол-блокирующего агента DTNB на инфицирование клеток с использованием модели коронавируса (вируса гепатита мыши) показано на фиг.6. Культивируемые клетки тканей были обработаны DTNB до инфицирования, во время инфицирования и после инфицирования вирусом, как показано выше. Вирусную РНК экстрагировали, и вирусную РНК из равного числа клеток выделяли с помощью гель-электрофореза. Наблюдения, проведенные с помощью денситометра, выявили, что количество 6 видов вирусной РНК снижалось на 50% в случае присутствия DTNB, несмотря на то, что инфицирование имело место. В экспериментах, где использовали пред- и пост-обработку, DTNB не оказывал значительного влияния на количество продуцируемой РНК по сравнению с контролем (без добавления DTNB) (крайняя правая дорожка). Таким образом была установлена параллель между вирусом гепатита мыши и вирусом Синдбис и было показано, что тиолдисульфидная обменная реакция играет решающую роль в инфицировании клеток мембраносодержащими коронавирусами.
Действие тиол-блокирующего агента DTNB на инфицирование клеток с использованием модели коронавируса (вируса гепатита мыши) показано на фиг.6. Культивируемые клетки тканей были обработаны DTNB до инфицирования, во время инфицирования и после инфицирования вирусом, как показано выше. Вирусную РНК экстрагировали, и вирусную РНК из равного числа клеток выделяли с помощью гель-электрофореза. Наблюдения, проведенные с помощью денситометра, выявили, что количество 6 видов вирусной РНК снижалось на 50% в случае присутствия DTNB, несмотря на то, что инфицирование имело место. В экспериментах, где использовали пред- и пост-обработку, DTNB не оказывал значительного влияния на количество продуцируемой РНК по сравнению с контролем (без добавления DTNB) (крайняя правая дорожка). Таким образом была установлена параллель между вирусом гепатита мыши и вирусом Синдбис и было показано, что тиолдисульфидная обменная реакция играет решающую роль в инфицировании клеток мембраносодержащими коронавирусами.
Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, являются показателем того уровня техники, к области которой относится настоящее изобретение. Все патенты и публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая конкретная публикация вводилась отдельно посредством ссылки.
Следует отметить, что настоящее изобретение может быть легко адаптировано для достижения нужных целей и преимуществ, присущих этому изобретению. Описанные примеры с раскрытыми в них методами, процедурами, молекулами и конкретными соединениями являются характерными для предпочтительных вариантов осуществления изобретения и носят иллюстративный характер, а поэтому не должны рассматриваться как некое ограничение объема изобретения.
В настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения, не выходящие, однако, за рамки существа изобретения, сформулированные в формуле изобретения.
Список последовательностей:
(2) Данные последовательности SEQ ID NO:1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 20
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:1:
CGATGATGAT TGGCGTAACT 20
(3) Данные последовательности SEQ ID NO:2:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 34
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(А) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:2:
CGAAAAAT AATCCTGCGG СТСС 34
(4) Данные последовательности SEQ ID NO:3:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 18
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(ix) Отличительная особенность:
(А) Другая информация:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:3:
ССАААААТСА AATCCTGC 18а
(2) Данные последовательности SEQ ID NO:1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 20
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:1:
CGATGATGAT TGGCGTAACT 20
(3) Данные последовательности SEQ ID NO:2:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 34
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(А) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:2:
CGAAAAAT AATCCTGCGG СТСС 34
(4) Данные последовательности SEQ ID NO:3:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 18
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(ix) Отличительная особенность:
(А) Другая информация:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:3:
ССАААААТСА AATCCTGC 18а
Claims (2)
1. Синдбис E1-SER62, неинфекционный, мутированный вирус Синдбис, используемый для получения вакцины, в котором консервативная аминокислота цистеин заменена серином в положении 62 белка Е1, при этом мутация находится в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную /протеиндисульфидизомеразную активность.
2. Фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей неинфекционный мутированный вирус Синдбис E1-SER62, охарактеризованный в п. 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/213,860 | 1994-03-21 | ||
| US08/213,860 US5532154A (en) | 1994-03-21 | 1994-03-21 | Mutated alpha virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96119259A RU96119259A (ru) | 1998-12-27 |
| RU2194754C2 true RU2194754C2 (ru) | 2002-12-20 |
Family
ID=22796796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96119259/13A RU2194754C2 (ru) | 1994-03-21 | 1995-03-21 | Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5532154A (ru) |
| EP (1) | EP0755440A4 (ru) |
| JP (1) | JP3821484B2 (ru) |
| KR (1) | KR100394163B1 (ru) |
| CN (1) | CN1122105C (ru) |
| AU (1) | AU688887B2 (ru) |
| CA (1) | CA2186044C (ru) |
| FI (1) | FI963717A (ru) |
| IL (1) | IL112990A (ru) |
| NZ (1) | NZ283575A (ru) |
| RU (1) | RU2194754C2 (ru) |
| SA (1) | SA95150618B1 (ru) |
| WO (1) | WO1995025788A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA952259B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720518C1 (ru) * | 2018-12-18 | 2020-04-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus 1383 clone 3) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US6465634B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-10-15 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| US6451592B1 (en) * | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| WO1998051297A1 (en) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | The University Of New Mexico | Inhibition of cell surface protein disulfide isomerase |
| US7128915B2 (en) * | 1997-09-18 | 2006-10-31 | Research Development Foundation | Membrane virus host range mutations and their uses as vaccine substrates |
| US7335363B2 (en) * | 1997-09-18 | 2008-02-26 | Research Development Foundation | Membrane virus host range mutations and their uses as vaccine substrates |
| CA2325564A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Cytos Biotechnology Ag | Inducible alphaviral gene expression system |
| JP2002521461A (ja) * | 1998-07-29 | 2002-07-16 | インビトロゲン・コーポレーション | Ｒｎａウイルスを用いる組換えタンパク質の調節発現 |
| US8647864B2 (en) * | 1999-04-14 | 2014-02-11 | Novartis Ag | Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems |
| WO2000061772A2 (en) * | 1999-04-14 | 2000-10-19 | Chiron Corporation | Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems |
| US6890487B1 (en) | 1999-09-30 | 2005-05-10 | Science & Technology Corporation ©UNM | Flow cytometry for high throughput screening |
| US7416903B2 (en) * | 1999-09-30 | 2008-08-26 | Stc.Unm | Wavy interface mixer |
| US6498189B1 (en) | 1999-11-10 | 2002-12-24 | University Of New Mexico | Method for induction of L-selectin shedding |
| WO2001042442A2 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Cytos Biotechnology Ag | Activation of endogenous genes by genomic introduction of a replicon |
| US20030208584A1 (en) * | 2000-05-12 | 2003-11-06 | Higgins Cyril John | Use of world-wire web |
| DE60135983D1 (de) | 2000-05-31 | 2008-11-13 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verfahren zur reinigung von alphaviralen replikon partikeln |
| WO2002006456A1 (en) * | 2000-07-13 | 2002-01-24 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for rapid protein and peptide extraction and isolation using a lysis matrix |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US20050054847A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-03-10 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for preparing short RNA molecules and other nucleic acids |
| US20070015803A1 (en) * | 2005-04-12 | 2007-01-18 | Romark Laboratories L.C. | Methods for treating diseases through interruption of protein maturation, compounds that inhibit the function of molecular chaperones such as protein disulfide isomerases or interfere with glycosylation, pharmaceutical compositions comprising them, and screening methods for identifying therapeutic agents |
| WO2010042760A2 (en) * | 2008-10-08 | 2010-04-15 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Compositions, methods, and kits for enhancing the immunogenicity of pathogenic antigens |
| EP2432869B1 (en) | 2009-05-21 | 2020-08-12 | Essen Instruments, Inc. d/b/a Essen BioScience, Inc. | System and method for separating samples in a continuous flow |
| US9752964B1 (en) | 2009-06-22 | 2017-09-05 | Stc.Unm | Flow cytometry apparatus pulling sample stream through observation chamber |
| WO2021180219A1 (zh) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | 挪贝肽医药科技(上海)有限公司 | Pi4k抑制剂的抗冠状病毒效果以及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0500791B1 (en) * | 1989-10-31 | 1998-02-04 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary UNITED STATES DEPARTMENT OF COMMERCE | The design and construction of non-infectious human retroviral mutants deficient in genomic rna |
| WO1994004185A2 (en) * | 1992-08-19 | 1994-03-03 | Trustees Of Boston University | Method of inhibiting reduction of disulfide bonds |
-
1994
- 1994-03-21 US US08/213,860 patent/US5532154A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-01-01 ZA ZA952259A patent/ZA952259B/xx unknown
- 1995-03-14 IL IL11299095A patent/IL112990A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-03-21 NZ NZ283575A patent/NZ283575A/en unknown
- 1995-03-21 RU RU96119259/13A patent/RU2194754C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-03-21 EP EP95914815A patent/EP0755440A4/en not_active Withdrawn
- 1995-03-21 CA CA002186044A patent/CA2186044C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-21 WO PCT/US1995/003605 patent/WO1995025788A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-03-21 JP JP52480695A patent/JP3821484B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-21 KR KR1019960705200A patent/KR100394163B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-21 CN CN95192229A patent/CN1122105C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-21 AU AU21913/95A patent/AU688887B2/en not_active Ceased
- 1995-04-25 SA SA95150618A patent/SA95150618B1/ar unknown
-
1996
- 1996-09-19 FI FI963717A patent/FI963717A/fi not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720518C1 (ru) * | 2018-12-18 | 2020-04-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus 1383 clone 3) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA952259B (en) | 1996-09-20 |
| WO1995025788A1 (en) | 1995-09-28 |
| IL112990A (en) | 1999-11-30 |
| EP0755440A4 (en) | 1998-08-19 |
| AU2191395A (en) | 1995-10-09 |
| CN1122105C (zh) | 2003-09-24 |
| CA2186044C (en) | 2005-08-23 |
| NZ283575A (en) | 2001-03-30 |
| JP3821484B2 (ja) | 2006-09-13 |
| IL112990A0 (en) | 1995-06-29 |
| AU688887B2 (en) | 1998-03-19 |
| CN1144536A (zh) | 1997-03-05 |
| US5532154A (en) | 1996-07-02 |
| KR100394163B1 (ko) | 2004-10-20 |
| CA2186044A1 (en) | 1995-09-28 |
| EP0755440A1 (en) | 1997-01-29 |
| KR970701778A (ko) | 1997-04-12 |
| FI963717A (fi) | 1996-11-20 |
| FI963717A0 (fi) | 1996-09-19 |
| SA95150618B1 (ar) | 2006-04-22 |
| JPH09510613A (ja) | 1997-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2194754C2 (ru) | Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его | |
| Lawrence et al. | Encephalomyocarditis virus infection of mouse plasmacytoma cells I. Inhibition of cellular protein synthesis | |
| Zhang et al. | Characterization of the membrane association of the influenza virus matrix protein in living cells | |
| Misra et al. | Proteins specified by bovine herpesvirus 1 (infectious bovine rhinotracheitis virus) | |
| Follett et al. | Virus replication in enucleate cells: vesicular stomatitis virus and influenza virus | |
| Edwards et al. | Conformational changes in Sindbis virus envelope proteins accompanying exposure to low pH | |
| Ahola et al. | Effects of palmitoylation of replicase protein nsP1 on alphavirus infection | |
| Garry et al. | Induction of stress proteins in Sindbis virus-and vesicular stomatitis virus-infected cells | |
| Gallaher et al. | Effect of 2-deoxy-D-glucose on cell fusion induced by Newcastle disease and herpes simplex viruses | |
| Hruby et al. | Vaccinia virus replication requires active participation of the host cell transcriptional apparatus. | |
| Kajioka et al. | The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earle's strain L cells II. Initiation of DNA synthesis and morphogenesis | |
| Mizzen et al. | Attenuation of murine coronavirus infection by ammonium chloride | |
| Itoh et al. | Increased induction of apoptosis by a Sendai virus mutant is associated with attenuation of mouse pathogenicity | |
| Petri Jr et al. | Glycoprotein micelles isolated from vesicular stomatitis virus spontaneously partition into sonicated phosphatidylcholine vesicles | |
| Scheefers-Borchel et al. | Sindbis virus maturation in cultured mosquito cells is sensitive to actinomycin D | |
| Robbins et al. | Inhibition of measles virus replication by cyclic AMP | |
| Wengler et al. | Analyses of the role of structural changes in the regulation of uncoating and assembly of alphavirus cores | |
| Evans et al. | The coronavirus avian infectious bronchitis virus requires the cell nucleus and host transcriptional factors | |
| Rao et al. | Intracellular complexes of viral spike and cellular receptor accumulate during cytopathic murine coronavirus infections | |
| MacBeth et al. | Single-site cleavage in the 5'-untranslated region of Leishmaniavirus RNA is mediated by the viral capsid protein. | |
| Datta et al. | Structure and synthesis of a lipid-containing bacteriophage: VI. The spectrum of cytoplasmic and membrane-associated proteins in Pseudomonas BAL 31 during replication of bacteriophage PM2 | |
| Omar et al. | Fusion of Semliki Forest virus infected Aedes albopictus cells at low pH is a fusion from within | |
| Brown et al. | A simple method for the preparation of extracts from animal cells which catalyze efficient in vitro protein synthesis. | |
| Luo et al. | Purification and characterization of a Sindbis virus-induced peptide which stimulates its own production and blocks virus RNA synthesis | |
| Gillies et al. | Generation of defective interfering particles of vesicular stomatitis virus in Aedes albopictus cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070322 |