RU219011U1 - Микрофлюидный чип для распознавания бактерий в пищевых продуктах - Google Patents

Abstract

Полезная модель относится к области пищевой промышленности и может быть использована для определения патогена Salmonella Typhimurium. Полезная модель представляет собой микрофлюидный чип с размером 50 мм×75 мм×5 мм, состоящий из трех отсеков: (1) камера смешивания исходных компонентов диаметром 8 мм, глубиной 3 мм; (2) змеевиковый канал для образования комплекса с Salmonella Typhimurium шириной 600 мкм, высотой 600 мкм и общей длиной 40 см, (3) многофункциональная камера диаметром 8 мм и глубиной 3 мм для магнитного разделения комплекса с Salmonella Typhimurium, промывки и катализа OPD/H₂O₂, с образованием желтого DAP, отличающегося тем, что в микрофлюидном чипе образуется комплекс MOF-Salmonella-MN при введении 80 мкл раствора MN-mAb (20 мкг) и 80 мкл раствора MOF-pAb (80 мкг), обладающего пероксидазоподобной активностью. Полезная модель обеспечивает визуальное обнаружение патогена Salmonella Typhimurium в пищевых продуктах в линейном диапазоне от 1,5×101 до 1,5×107 КОЕ/мл, с нижний пределом обнаружения 14 КОЕ/мл, образуя комплекс MOF-Salmonella-MN при добавлении в микрофлюидный чип MOF-pAb и MN-mAb.

Description

Полезная модель относится к области пищевой промышленности и может быть использована для определения патогена Salmonella Typhimurium.

Вспышки пищевого отравления, вызванные патогенами, происходят во всем мире и приводят к серьезным проблемам со здоровьем и огромным экономическим потерям. Бактерии, ответственные за эти вспышки, в основном относятся к видам Salmonella, E.coli, Vibrio cholera, Listeria monocytogenes [Newell D. G. et al. Food-borne diseases—the challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge //International journal of food microbiology. – 2010. – Т. 139. – С. S3-S15., Cabral J. P. S. Water microbiology. Bacterial pathogens and water //International journal of environmental research and public health. – 2010. – Т. 7. – №. 10. – С. 3657-3703.]. Среди них Salmonella является патогеном, который чаще всего ответственен за болезни пищевого происхождения во всем мире [Shen Y., Xu L., Li Y. Biosensors for rapid detection of Salmonella in food: A review //Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. – 2021. – Т. 20. – №. 1. – С. 149-197.].

Salmonella — род факультативно анаэробных палочковидных грамотрицательных бактерий, который принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и содержит более 2500 серотипов, из которых Salmonella enterica serovar typhimurium (Salmonella Typhimurium ) наиболее часто вызывает заболевания пищевого происхождения у человека [Pashazadeh P. et al. Nano-materials for use in sensing of salmonella infections: recent advances //Biosensors and Bioelectronics. – 2017. – Т. 87. – С. 1050-1064.]. Употребление пищи или воды, зараженных Salmonella Typhimurium вызывает диарею, боль в животе, тошноту и дискомфорт в желудке, а клинические симптомы обычно длятся до 5 дней [Inbaraj B. S., Chen B. H. Nanomaterial-based sensors for detection of foodborne bacterial pathogens and toxins as well as pork adulteration in meat products //journal of food and drug analysis. – 2016. – Т. 24. – №. 1. – С. 15-28.]

На сегодняшний день для определения Salmonella Typhimurium в пищевых продуктах используют метод полуколичественного культивирования на чашках, который является «золотым стандартом» для идентификации бактерий, однако он требует много времени, ограничен низкой частотой положительных результатов и с трудом позволяет дифференцировать бактерии на уровне штаммов и видов [Yu, Fang, et al. "DNAzyme-integrated plasmonic nanosensor for bacterial sample-to-answer detection." Biosensors and Bioelectronics 89 (2017): 880-885.].

В последние годы для идентификации бактерий, в том числе Salmonella Typhimurium, были разработаны современные иммунологические и молекулярные методы диагностики. Иммунологическая диагностика основана на использовании специфических антител для распознавания соответствующих микроорганизмов с последующим спектрофотометрическим или флуоресцентным спектрометрическим обнаружением. Молекулярная диагностика разработана на основе протеомных и геномных подходов, включая масс-спектрометрию (МС), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), петлевую изотермическую амплификацию (LAMP) [Pietrowska, Monika, et al. "Mass spectrometry-based serum proteome pattern analysis in molecular diagnostics of early stage breast cancer." Journal of Translational Medicine 7 (2009): 1-13.; Mirsaidov, Utkur M., et al. "Molecular diagnostics for personal medicine using a nanopore." Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology 2.4 (2010): 367-381.; Barr, N. B., et al. "Molecular diagnostics of economically important Ceratitis fruit fly species (Diptera: Tephritidae) in Africa using PCR and RFLP analyses." Bulletin of Entomological Research 96.5 (2006): 505-521.; Han, Eun-Taek. "Loop-mediated isothermal amplification test for the molecular diagnosis of malaria." Expert review of molecular diagnostics 13.2 (2013): 205-218.].

Масс-спектрометрия — метод, который позволяет выяснить молекулярную структуру и молекулярную массу аналитов. Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией и масс-спектрометрия с использованием матрицы (MALDI-TOF MS) широко используется для идентификации бактерий с 1990-х годов [Claydon, Martin A., et al. "The rapid identification of intact microorganisms using mass spectrometry." Nature biotechnology 14.11 (1996): 1584-1586.]. Из-за значительных различий в молекулярном составе разных видов бактерий масс-спектры MALDI-TOF, полученные из интактных бактериальных клеток, имеют характеристики отпечатков пальцев и могут использоваться для идентификации бактерий [Ziegler, Dominik, et al. "Ribosomal protein biomarkers provide root nodule bacterial identification by MALDI-TOF MS." Applied microbiology and biotechnology 99 (2015): 5547-5562.]. Система идентификации бактерий, основанная на MS, была коммерциализирована несколькими производителями, например, bioMérieux как Vitek MS и Bruker как Biotyper [Huang, Angela M., et al. "Impact of rapid organism identification via matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight combined with antimicrobial stewardship team intervention in adult patients with bacteremia and candidemia." Clinical infectious diseases 57.9 (2013): 1237-1245., Buchan, Blake W., Katherine M. Riebe, and Nathan A. Ledeboer. "Comparison of the MALDI Biotyper system using Sepsityper specimen processing to routine microbiological methods for identification of bacteria from positive blood culture bottles." Journal of clinical microbiology 50.2 (2012): 346-352.]. Однако этот метод может идентифицировать только высокоочищенные бактериальные образцы, т. е. единичные колонии после посева на чашке, и, таким образом, он все еще ограничен длительной процедурой и низким процентом положительных результатов бактериального посева.

ПЦР — метод амплификации, который можно использовать для идентификации Salmonella Typhimurium. Несколько миллионов копий ДНК могут быть получены из одной молекулы образца за несколько циклов ПЦР. Цикл ПЦР обычно состоит из трех температурно-зависимых стадий, а именно денатурации, отжига и удлинения [Does W. P. Polymerase chain reaction //J. Investig. Dermatol. – 2013. – Т. 133.]. Во время фазы денатурации генетический материал, содержащий образец, нагревается выше соответствующей точки кипения (95°C), чтобы обеспечить раскручивание и разделение цепей ДНК [Chen J. J., Li K. T. Analysis of PCR kinetics inside a microfluidic DNA amplification system //Micromachines. – 2018. – Т. 9. – №. 2. – С. 48.]. Впоследствии, во время фазы отжига, температуру снижают (55°C), чтобы сделать возможным присоединение специфических праймеров к целевым сегментам ДНК. Наконец, целевые и праймированные сегменты удлиняются во время фазы удлинения, когда температура снова повышается (72°C). Традиционные системы ПЦР требуют 20–30 циклов для амплификации ДНК. Однако недостатком присущим традиционным методам ПЦР является громоздкое оборудование и большие реакционные объемы.

Как и ПЦР, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) требует выделения нуклеиновых кислот для амплификации. Технология LAMP является недавним достижением в области быстрого обнаружения патогенов, в котором используется метод автоциклического синтеза ДНК с замещением цепи в присутствии ДНК-полимеразы Bst в изотермических условиях между 60 и 65°C [Shang Y. et al. Loop-mediated isothermal amplification-based microfluidic chip for pathogen detection //Critical reviews in food science and nutrition. – 2020. – Т. 60. – №. 2. – С. 201-224.]. В течение 30–60 мин этот метод позволяет получить 106 –109 копий целевых цепей ДНК [Jagannath A. et al. Pathogen detection on microfluidic platforms: Recent advances, challenges, and prospects //Biosensors and Bioelectronics: X. – 2022. – С. 100134.]. Несмотря на то, что LAMP, как и ПЦР, также является термически опосредованным процессом амплификации, он происходит изотермически при одной температуре и не требует нескольких температурных стадий, как ПЦР. Как более новая технология, LAMP предлагает преимущество более низкой стоимости и более высокой скорости работы, чем ПЦР. Однако, как и ПЦР, для LAMP требуется отдельная лаборатория с высоким классом чистоты, специальные боксы, а также высокая квалификация персонала. Помимо этого, оборудование для проведения ПЦР и LAMP все еще остается дорогостоящим.

Таким образом, новизна представленной полезной модели связана с нетривиальным подходом и созданием портативного микрофлюидного чипа, с использованием MOF-pAb и MN-mAb, для распознавания Salmonella Typhimurium в пищевых продуктах.

В основе принципа работы микрофлюидного чипа лежит непрямой иммуноферментный анализ ELISA сэндвич-типа [Alhajj M., Farhana A. Enzyme linked immunosorbent assay //StatPearls [Internet]. – StatPearls Publishing, 2022.].

Однако вместо фермента в микрофлюидном чипе используются наночастицы ферментоподобного пористого металлорганического каркаса NH2-MIL-101 (MOF), модифицированного поликлональными антителами (pAb) Salmonella Typhimurium - MOF-pAb.

Для эффективного смешивания и разделения используются магнитные частицы (MN), модифицированные моноклональными антителами (mAb) Salmonella Typhimurium - MN-mAb.

При появлении патогена Salmonella Typhimurium, MOF-pAb и MN-mAb специфично соединяются с ним, образуя комплекс MOF-Salmonella-MN. MOF из комплекса катализирует реакцию между перекисью водорода (Н₂О₂) и бесцветным о-фенилендиамином (OPD), с образованием желтого катализата - 2,3-диаминофеназина (DAP), который можно обнаружить невооруженным взглядом.

Микрофлюидный чип состоит из трех отсеков: (1) камера смешивания исходных компонентов (Salmonella Typhimurium, MOF-pAb и MN-mAb); (2) змеевиковый канал для образования сэндвич-комплекса MOF-Salmonella-MN, (3) многофункциональная камера для магнитного разделения комплекса, промывки от избытка MOF-pAb, катализа OPD и H₂O₂, с образованием DAP.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют использование микрофлюидного чипа, предложенного в настоящей работе, и не должны рассматриваться как ограничивающие его полную сферу применения, охватываемую прилагаемой формулой полезной модели.

Пример 1. Получение MOF-pAb

Для создания комплекса pAb-MOF выбрали клик-реакцию со сложным эфиром TCO-PEG4-NHS (TCO) и сложным эфиром тетразин-сульфо-NHS (Tz), растворенных в 10 мМ ДМФА. Сначала 4 мг MOF и 200 мкг pAb смешивали с TCO и Tz в мольном соотношении 1:40 и выдерживали в течение 45 мин. При этом были получены TCO-MOF, путем центрифугирования при 4000×g в течение 10 мин, и Tz-pAb путем фильтрации при 10 кДа и центрифугирования при 15000×g в течение 10 мин при 4°С. Далее, для удаления излишков меченых реагентов, TCO-MOF и Tz-pAb были трижды промыты деионизированной водой, затем перемешивались с 1% BSA при 15 об/мин в течение 45 мин для блокирования избыточных сайтов связывания.

Наконец, после трехкратной промывки деионизированной водой, сушки при 40 ° C в течение ночи, был получен коричнево-бордовый порошок MOF-pAb (рис.1а). Синтезированный MOF-pAb имеет октаэдрическую морфологию с диаметром около 400 нм (рис. 1б).

Влияние pAb на структуру MOF исследовали методом рентгеновской дифракции (XRD) (рис. 2). pAb является аморфным и пиков на рентгенограмме не дает. После модификации pAb, дифракционные пики остаются неизменными, что указывает на структурную целостность MOF. pAb связывается с MOF за счет координационных взаимодействий и ван-дер-ваальсовых сил.

Пример 2. Получение MN-mAb

Для получения магнитных частиц MN, модифицированных моноклональными антителами (mAb) Salmonella Typhimurium использовали стрептавидин-биотиновый метод.

Для начала mAb пометили биотином по следующей процедуре: mAb растворили в буфере для конъюгации в соотношении 5 мг/мл. Далее растворили биотин с буфером для растворения (1мг/100мкл), затем в полученный раствор (60 мкл) добавили 1 мл раствора с mAb и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при периодическим поворачивании пробирки.

Далее модифицировали магнитные наночастицы (MN) стрептавидином путем прямого смешивания в пропорции 1мг/мл в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Затем 30 мкг MN-стрептавидин промыли 3 раза PBS и ресуспендировали в 500 мкл PBS. Далее к раствору MN-стрептавидин добавили 3 мкг mAb-биотин и инкубировали в течение 45 минут при перемешивании 15 об/мин. Полученный MN-mAb промыли 500 мкл PBST (PBS с 0,05% Tween 20) для удаления избытка mAb. Затем MN-mAb ресуспендировали с 10 мкл PBS и хранили при 4°С.

Количество MN - mAb оказывают большое влияние на эффективность разделения целевых бактерий Salmonella Typhimurium.

Для оптимизации количества MN - mAb вводили различные количества (20, 40, 60, 70 и 80 мкг) со скоростью потока 1,2 мл/мин для отделения целевых бактерий концентрацией 1,5×103 КОЕ/мл от надосадочной жидкости и избытка MOF-pAb. Как показано на рис. 3 эффективность разделения возрастала с 50,6% до 89,1% при изменении количества MN - mAb от 20 мкг до 70 мкг и оставалась на том же уровне (89,7%) при использовании 80 мкг MN - mAb. Это указывало на то, что 70 мкг MN - mAb было достаточно для магнитного разделения.

Пример 3. Создание микрофлюидного чипа

Микрожидкостный чип был изготовлен с использованием 3D-печати и поверхностного плазменного соединения. Формы каналов и камер были спроектированы с использованием программного обеспечения Solidworks.

Микрофлюидный чип состоит из трех отсеков: (1) камера смешивания исходных компонентов (Salmonella Typhimurium, MOF-pAb и MN-mAb); (2) змеевиковый канал для образования сэндвич-комплекса MOF-Salmonella-MN, (3) многофункциональная камера для магнитного разделения комплекса, промывки от избытка MOF-pAb, катализа OPD и H2O2, с образованием DAP (рис. 4).

Микрофлюидный чип напечатан с использованием 3D-принтера Object24. Форполимер из полидиметилсилана (ПДМА) и отвердитель от Dow Corning Sylgard 184 полностью смешивали в соотношении 10:1, заливали в форму и отверждали при 65°C в течение 12 часов. Наконец, отвержденный ПДМС был извлечен из формы и соединен тонкой мембраной ПДМС толщиной 200 мкм путем обработки поверхностной кислородной плазмой для получения микрофлюидного чипа размером 50 мм × 75 мм × 5 мм (рис 5). Камеру смешивания изготовили диаметром 8 мм и глубиной 3 мм, куда вмещается объем 600 мкл. Змеевиковый канал изготовили шириной 600 мкм, высотой 600 мкм и общей длиной 40 см. Многофункциональную камеру изготовили диаметром 8 мм и глубиной 3 мм, куда вмещается объем 600 мкл.

Пример 4. Обнаружение патогена Salmonella Typhimurium при помощи микрофлюидного чипа, MOF-pAb и MN-mAb.

Для обнаружения патогена Salmonella Typhimurium 450 мкл бактериального образца с различной концентрацией патогена, раствор MN-mAb (20 мкг) в PBS 70 мкл и раствор MOF-pAb (80 мкг) в PBS 80 мкл одновременно ввели в микрофлюидный чип со скоростью потока 30 мкл/мин. Затем исходные компоненты смешивали в камере смешивания микрофлюидного чипа при помощи внешней вибромешалки в течение 5 мин. Далее инкубировали смесь в змеевиковом канале при скорости потока 30 мкл/мин в течение 4 минут. После того, как вся смесь попала из змеевикового канала в многофункционульную камеру, применили внешнее магнитное поле для захвата комплекса MN-Salmonella-MOF и промыли деионизированной водой при скорости потока 30 мкл/мин в течение 1 минуты для удаления несвязанных MOF-pAb. Затем в многофункциональную камеру подали смесь 100 мкл OPD (0,1 М) и 100 мкл H₂O₂(0,3 мМ) и инкубировали в течение 15 минут. Спустя 15 минут наблюдали изменение цвета катализата с бесцветного (рис 6а) на желтый (рис. 6б).

По мере увеличения концентрации патогена интенсивность цвета также увеличивается в линейном диапазоне от 1,5×101 до 1,5×107 КОЕ/мл, с пределом обнаружения (LOD) патогена равным 14 КОЕ/мл (S / N = 3) (рис 7).

Пример 5. Исследование селективности микрофлюидного чипа по отношению к другим патогенам.

Далее оценивали селективность микрофлюидого чипа на обнаружение бактерии-мишени и нецелевых бактерий (Listeria monocytogenes, E. coli O157: H7 и Salmonella Enteritidis). Как показано на рис. 8, абсорбция нецелевых бактерий намного ниже, чем у Salmonella Typhimurium (93%), что свидетельствует о хорошей селективности микрофлюидного чипа для регистрации штамма Salmonella Typhimurium.

Изображения:

Рис. 1 Изображение MOF-pAb: а – внешний вид; б - СЭМ-изображение;

Рис. 2 Рентгенограмма MOF (NH2-MIL-101) и MOF – pAb;

Рис. 3 Оптимизация количества MN - mAb для эффективного разделения целевых бактерий Salmonella Typhimurium от надосадочной жидкости и избытка MOF-pAb;

Рис. 4 Схема микрофлюидного чипа;

Рис. 5 Изображение готового микрофлюидного чипа;

Рис. 6 Иллюстрация изменения цвета катализата с бесцветного (а) на желтый (б);

Рис. 7 Калибровочная кривая микрофлюидного чипа для обнаружения Salmonella Typhimurium: линейный диапазон от 1,5×101 до 1,5×107 КОЕ/мл, с пределом обнаружения (LOD) патогена - 14 КОЕ/мл (S/N=3).

Рис. 8 График селективности микрофлюидного чипа к бактерии-мишени Salmonella Typhimurium.

Claims (1)

1. Микрофлюидный чип для визуального обнаружения патогена Salmonella Typhimurium в пищевых продуктах в линейном диапазоне от 1,5×101 до 1,5×107 КОЕ/мл, с пределом обнаружения (LOD) 14 КОЕ/мл, размером 50 мм×75 мм×5 мм, состоящий из трех отсеков: (1) камера смешивания исходных компонентов диаметром 8 мм, глубиной 3 мм; (2) змеевиковый канал для образования комплекса с Salmonella Typhimurium шириной 600 мкм, высотой 600 мкм и общей длиной 40 см, (3) многофункциональная камера диаметром 8 мм и глубиной 3 мм для магнитного разделения комплекса с Salmonella Typhimurium, промывки и катализа OPD/H₂O₂, с образованием желтого DAP, отличающийся тем, что твердая основа микрофлюидного чипа изготовлена путем смешивания полидиметилсилана (ПДМА) и отвердителя в соотношении 10:1, при выдерживании при температуре 65°C в течение 12 часов, затем твердая основа микрофлюидного чипа соединена с тонкой мембраной из полидиметилсилоксана (ПДМС) толщиной 200 мкм путем обработки поверхностной кислородной плазмой.

Images