RU2177996C2 - Способ получения недифференцированной клетки - Google Patents
Способ получения недифференцированной клетки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2177996C2 RU2177996C2 RU97114802/14A RU97114802A RU2177996C2 RU 2177996 C2 RU2177996 C2 RU 2177996C2 RU 97114802/14 A RU97114802/14 A RU 97114802/14A RU 97114802 A RU97114802 A RU 97114802A RU 2177996 C2 RU2177996 C2 RU 2177996C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- receptor
- antigen
- hla
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 486
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 41
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 133
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 133
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 133
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 66
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 49
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 42
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 42
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 34
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 34
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 14
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008512 biological response Effects 0.000 claims description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 3
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims description 2
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 claims description 2
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 claims description 2
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 claims description 2
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 76
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004524 haematopoietic cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 116
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 116
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 92
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 92
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 54
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 54
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 44
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 44
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 39
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 37
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 31
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 26
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 26
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 25
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 25
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 25
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 24
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 23
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 21
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 21
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 19
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 19
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 11
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 11
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 11
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 11
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 10
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 8
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 8
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 7
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 7
- 102000013925 CD34 antigen Human genes 0.000 description 6
- 108050003733 CD34 antigen Proteins 0.000 description 6
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 6
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 6
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 6
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 5
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 4
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 4
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 4
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 4
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000000998 lymphohematopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 3
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 101150000157 ARHGEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000008162 B cell deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108010067802 HLA-DR alpha-Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010053491 HLA-DR beta-Chains Proteins 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 2
- 208000007924 IgA Deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 2
- 101150064138 MAP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010039915 Selective IgA immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000011186 acute T cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004730 hepatocarcinogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 201000007156 immunoglobulin alpha deficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000000506 liquid--solid chromatography Methods 0.000 description 2
- 101150055452 lsc gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 208000029138 selective IgA deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 108010027122 ADP-ribosyl Cyclase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018667 ADP-ribosyl Cyclase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 201000010717 Bruton-type agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 108010003639 CD56 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000004652 CD56 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010001017 CD71 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010032795 CD8 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100400452 Caenorhabditis elegans map-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000968028 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 1
- 108010031801 Lipopolysaccharide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005482 Lipopolysaccharide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000001555 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- AXIKDPDWFVPGOD-UHFFFAOYSA-O [7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;2-(2,4,5,7-tetrabromo-3,6-dihydroxyxanthen-10-ium-9-yl)benzoic acid Chemical compound C1=CC(=[N+](C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21.OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=C(Br)C(O)=C2Br)C2=[O+]C2=C1C=C(Br)C(O)=C2Br AXIKDPDWFVPGOD-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003104 cytoplasmic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004287 null lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009703 regulation of cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности клеточной иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что в клеточной популяции (в культуре) повышают число СD 34+ клеток за счет взаимодействия клеточной популяции (например, гемопоэтических клеток) с антителом, например СР3/43, при этом антитело может быть использовано в сочетании с алкилирующим агентом, например циклофосфамидом. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для лечения заболеваний иммунной системы. 19 з. п. ф-лы, 20 табл. , 6 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения недифференцированной клетки.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения недифференцированной клетки из более коммитированной клетки.
Кроме того, настоящее изобретение к использованию недифференцированной клетки настоящего изобретения для получения новой более коммитированной клетки - т. е. рекоммитированной клетки.
Настоящее изобретение также относится к использованию недифференцированной клетки настоящего изобретения или рекоммитированной клетки настоящего изобретения, которая бы оказывала влияние (прямо или косвенно посредством использования полученных из нее продуктов) на иммунную систему, такое как облегчение симптомов, связанных с, или на частичное или полное излечение от иммунологического состояния или заболевания.
В качестве введения, дифференциация представляет процесс, в результате которого структуры и функции клеток прогрессивно коммитируются для обеспечения развития в более специализированные клетки, такой как образование Т-клеток или В-клеток. Поэтому, по мере того как клетки становятся более коммитированными, они становятся более специализированными.
Напротив, ретродифференциация представляет процесс, в результате которого структуры и функции клеток прогрессивно меняются для обеспечения развития в менее специализированные клетки.
Недифференцированное клетки способны дифференцироваться по многим линиям, т. е. они способны дифференцироваться в два или более типов специализированных клеток. Типичным примером недифференцированной клетки является стволовая клетка.
Напротив, дифференцированные клетки неспособны дифференцироваться по многим линиям. Типичным примером дифференцированной клетки является Т-клетка.
Существует много недифференцированных клеток и дифференцированных клеток, обнаруженных in vivo, и общая наука богата общими представлениями о них.
В качестве примера, можно сделать ссылку, наряду с другими, на Levitt and Mertelsman, 1995 (Haematopoietic Stem Cells, published Marcel Dekker Inc. - в частности, страницы 45-59) и Roitt et al. (Immunology, 4 th Edition, Eds. Roitt, Brostoff and Male, 1996, Publ. Mosby - в частности, глава 10).
Вкратце, однако, примеры недифференцированных клеток включают лимфогематопоэтические клетки - предшественники (LPC). LPC включают плюрипотентные стволовые клетки (PSC), лимфоидные стволовые клетки (LSC) и миелоидные стволовые клетки (MSC). LSC и MSC - каждые образованы дифференциацией PSC. Следовательно, LSC и MSC являются более коммитированными, чем PSC.
Примеры дифференцированных клеток включают Т-клетки, В-клетки, эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, мегакариоциты, моноциты, эритроциты, гранулоциты, тучные клетки и лимфоциты.
Т-клетки и В-клетки образованы посредством дифференциации LSC. Следовательно, Т-клетки и В-клетки являются более коммитированными, чем LSC.
Эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, мегакариоциты, моноциты, эритроциты, гранулоциты, тучные клетки, естественные клетки - киллеры (NK) и лимфоциты образуются посредством дифференциации MSC. Следовательно, каждые из этих клеток являются более коммитированными, чем MSC.
Антигены связаны с недифференцированными и дифференцированными клетками. Термин "связаны" здесь обозначает клетки, экспрессирующие или способные экспрессировать или представляющие или способные быть индуцированными представлять или включающие соответствующий антиген(ы).
Большинство недифференцированных клеток и дифференцированных клеток включают антигены класса I и/или антигены класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). Если эти антигены связаны с теми клетками, то они называются клетками Класса I+ и/или клетками Класса II+.
Каждый специфический антиген, связанный с недифференцированной клеткой или с дифференцированной клеткой, может действовать в качестве маркера. Следовательно, различные типы клеток можно отличить друг от друга на основании связанного с ними данного антигена (антигенов) или на основании данной комбинации связанных антигенов.
Примеры этих маркерных антигенов включают антигены CD34, CD19 и CD3. Если эти антигены присутствуют, то эти конкретные клетки называются соответственно CD34+, CD19+ и CD3+. Если эти антигены не присутствуют, то эти конкретные клетки называются CD34-, CD19- и CD3-.
Более подробно, PCS представляют клетки CD34+. LSC представляют клетки DR+, CD34+ и TdT+. MSC представляют клетки CD34+, DR+, CD13+, CD33+, CD7+ и TdT+. В-клетки представляют клетки CD19+, CD21+, CD22+ и DR+. Т-клетки представляют клетки CD2+, CD3+, и/или CD4+, или CD8+. Незрелые лимфоциты представляют клетки CD4+ и CD8+. Активированные Т-клетки представляют клетки DR+. Естественные клетки-киллеры (NK) представляют клетки CD56+ и CD16+. Т-лимфоциты представляют клетки CD7+. Лейкоциты представляют клетки CD45+. Гранулоциты представляют клетки CD33+. Моноциты макрофаги представляют клетки CD16+ и DR+.
Следовательно, с помощью поиска присутствия перечисленных выше антигенных маркеров, можно идентифицировать определенные типы клеток (например, является или нет клетка недифференцированной клеткой или дифференцированной клеткой) и специализацию этого типа клеток (например, является ли эта клетка Т-клеткой или В-клеткой).
Общая концепция ретродифференциации не нова. Действительно, в 1976 г. Jose Uriel (Cancer Research 36, 4269-4275. November, 1976) представил обзор на эту тему, в котором он писал: "ретродифференциация представляется обычным адаптационным процессом для поддержания клеточной целостности в противодействие агентам различной этиологии (физическим, химическим и вирусным). Сохраняя всю информацию, закодированную в их геноме, клетки, подвергающиеся ретродифференциации, теряют морфологическое и функциональное разнообразие в результате процесса самоделеции цитоплазматических структур и перехода к более юному типу экспрессии гена. Это приводит к прогрессирующему развитию однотипности первоначально различных клеточных фенотипов и к снижению реактивности на регуляторные сигналы, функционирующие во взрослых клетках. Ретродифференциация в норме сбалансируется противоположно направленным процессом реонтогенеза, который имеет тенденцию восстанавливать конечные фенотипы, когда начинается реверсия. Это объясняет, почему ретродифференциация остается неизменно связанной с клеточной регенерацией и восстановлением тканей. "
Uriel (там же) затем продолжил обсуждение случаев выявленной ретродифференциации - таких как работа Gurdon, относящаяся к ядрам из клеток кишечного эпителия головастиков Xenopus (Advances in Morphogenesis [1966] vol 4, рр. 1-43. New York Academic Press, Eds Abercombie and Bracher) и работа Bresnick, относящаяся к регенерации печени (Methods in Cancer Research [1971] vol 6, рр. 347-391).
Uriel (там же) затем продолжил обсуждение случаев выявленной ретродифференциации - таких как работа Gurdon, относящаяся к ядрам из клеток кишечного эпителия головастиков Xenopus (Advances in Morphogenesis [1966] vol 4, рр. 1-43. New York Academic Press, Eds Abercombie and Bracher) и работа Bresnick, относящаяся к регенерации печени (Methods in Cancer Research [1971] vol 6, рр. 347-391).
Uriel (там же) также сообщил о работе, относящейся к изолированным паренхиматозным клеткам печени для культур in vitro. По Uriel: "В отличие от результатов, полученных с гепатоцитами плода или новорожденных, при использовании гепатоцитов из регенерирующей печени или из установленных гепатом, было трудно получить линии постоянного класса из взрослых гепатоцитов в покое. "
Uriel также сообщил о видимой ретродифференциации при раке, причем он заявил: "биохимические фенотипы многих опухолей проявляют аналогичные изменения реверсии по направлению к незрелости. . . во время предраковой стадии канцерогенеза печени, происходит также ретродифференциация клеток. "
Более свежие данные о ретродифференциации включают работу Minoru Fukunda (Cancer Research [1981] vol 41, рр. 4621-4628). Fukunda вызывал специфические изменения профиля гликопротеида клеточной поверхности клеток лейкоза человека К562 с помощью использования способствующего развитию опухолей форболового эфира 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетата (ТРА). По Fukunda, TPA, как представляется, вызывает стадию ретродифференциации клеток лейкоза человека К562.
Uriel также сообщил о видимой ретродифференциации при раке, причем он заявил: "биохимические фенотипы многих опухолей проявляют аналогичные изменения реверсии по направлению к незрелости. . . во время предраковой стадии канцерогенеза печени, происходит также ретродифференциация клеток. "
Более свежие данные о ретродифференциации включают работу Minoru Fukunda (Cancer Research [1981] vol 41, рр. 4621-4628). Fukunda вызывал специфические изменения профиля гликопротеида клеточной поверхности клеток лейкоза человека К562 с помощью использования способствующего развитию опухолей форболового эфира 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетата (ТРА). По Fukunda, TPA, как представляется, вызывает стадию ретродифференциации клеток лейкоза человека К562.
Наряду с этим, Hass et al. (Cell Growth & Differentiation [1991] vol 2, pp. 541-548) сообщили о долгосрочной культуре дифференцированных ТРА клеток лейкоза U-937 в отсутствии форболового эфира в течение 32-36 дней, что в результате привело к процессу ретродифференциации, и что ретродифференцированные клетки отделялись от субстрата и повторно начинали пролиферацию.
Еще один случай ретродифференциации содержится в работе Curtin and Snell (Вr. J. Cancer [1983] vol 48, pp. 495-505). Эти исследователи сравнили ферментные изменения, происходящие во время вызванного диэтилнитрозамином гепатоканцерогенеза, и регенерации печени после частичной гепатэктомии, с нормальной печеночной дифференциацией. Эти исследователи обнаружили изменения активности ферментов во время канцерогенеза, которые были аналогичны ступенчатому устранению дифференциации. По данным исследователей, полученные ими результаты свидетельствуют о том, что лежащий в основе процесс ретродифференциации является общим как для процесса гепатоканцерогенеза, так и для печеночной регенерации.
Более недавно Chastre et al. (FEBS Letters [1985] vol 188, number 2, pp. 2810-2811) сообщили о ретродифференциации канкрозного субклона толстой кишки человека НТ29-18.
Еще более недавно, Kobayashi et al. (Leukaemia Research [1994] vol 18, no. 12, pp. 929-933) сообщили об установлении ретродифференцированной клеточной линии (RD-1) из одиночной клетки крысиного миело - моноцитарного лейкоза, которая дифференцировалась в макрофагоподобную клетку под влиянием обработки липополисахаридом (LPS).
В соответствии с современным представлением, подтвержденным положениями, найденными на странице 911 книги Molecular Biology of the Cell (pub. Garland Publishers Inc. 1983) и более недавно no Levitt and Mertelsman (там же), стволовая клетка, такая как PSC, имеет следующие четыре характеристики:
i. она является недифференцированной клеткой - т. е. она не является окончательно дифференцированной;
ii. она способна делиться без ограничений;
iii. она способна дать развитие дифференцированному потомству, такому как дифференцированные клетки, упомянутые ранее; и
iv. когда она делится, каждая дочерняя клетка имеет выбор: она может или оставаться в виде PSC как ее партнер, или она может встать на путь, необратимо ведущий к окончательной дифференциации.
i. она является недифференцированной клеткой - т. е. она не является окончательно дифференцированной;
ii. она способна делиться без ограничений;
iii. она способна дать развитие дифференцированному потомству, такому как дифференцированные клетки, упомянутые ранее; и
iv. когда она делится, каждая дочерняя клетка имеет выбор: она может или оставаться в виде PSC как ее партнер, или она может встать на путь, необратимо ведущий к окончательной дифференциации.
Следует подчеркнуть последнюю характеристику, а именно, что в соответствии с общими положениями в этой области знаний, как только недифференцированная клетка дифференцировалась в более коммитированную клетку, она затем не может ретродифференцироваться. Это представление было даже поддержано положениями Uriel (там же), Fukunda (там же), Hass et al. (там же), Curtin and Snell (там же), Chastre et al. (там же) и Kobayashi et al. (там же), так как эти исследователи ретродифференцировали определенные типы дифференцированных клеток, но при этом эти клетки оставались коммитированными к одной и той же линии, и они не ретродифференцировали в недифференцированные клетки.
Поэтому, в соответствии с научными представлениями перед настоящим изобретением, считалось, что было невозможно образовать недифференцированные клетки, такие как стволовые клетки, из более коммитированных клеток. Однако настоящее изобретение показывает, что это представление неточное, и что возможно образовать недифференцированные клетки из более коммитированных клеток.
Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предоставляется способ получения недифференцированной клетки, причем способ включает контактирование более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предоставляется способ, включающий контактирование более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку; и затем коммитирование недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку.
Термин "рекоммитированная клетка" обозначает клетку, полученную из недифференцированной клетки - т. е. , новую, более коммитированную клетку.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, предоставляется недифференцированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения.
В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предоставляется недифференцированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения в качестве или при получении лекарственного препарата.
В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения, в производстве лекарственного препарата для лечения иммунологического расстройства или заболевания.
В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения, предоставляется рекоммитированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения.
В соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения, предоставляется рекоммитированная клетка, полученная в соответствии со способом настоящего изобретения в качестве или при получении лекарственного препарата.
В соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения, предоставляется использование рекоммитированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения, в производстве лекарственного препарата для лечения иммунологического расстройства или заболевания.
В соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется более коммитированная клетка, имеющая прикрепленный к ней агент, который может вызвать ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку.
В соответствии с десятым аспектом настоящего изобретения, предоставляется клетка CD19+ и CD3+.
Таким образом, в своем самом широком смысле, настоящее изобретение основано на крайне удивительной находке, что возможно образовать недифференцированную клетку из более коммитированной клетки.
Настоящее изобретение имеет большое преимущество, поскольку в настоящее время возможно получить недифференцированные клетки из более коммитированных клеток и затем использовать эти недифференцированные клетки в качестве или для получения лекарственных препаратов или in vitro или in vivo или их комбинаций для лечения расстройств.
Настоящее изобретение имеет также преимущество, так как возможно коммитировать недифференцированную клетку, полученную с помощью ретродифференциации в рекоммитированную клетку, такую как новая дифференцированная клетка, имея в виду коррекцию или удаление первоначальной более коммитированной клетки или для коррекции или удаления ее продукта.
Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку I+ Класса и/или II+ Класса МНС.
Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку, включающую антиген стволовой клетки.
Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в недифференцированную клетку CD34+.
Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в лимфогематопоэтическую клетку - предшественника.
Предпочтительно, более коммитированная клетка способна ретродифференцироваться в плюрипотентную стволовую клетку.
Недифференцированная клетка может включать любые компоненты, которые имеют отношение к представлению антигена, его захвату или распознаванию. Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет клетку I+ Класса и/или II+ Класса МНС.
Предпочтительно, недифференцированная клетка включает антиген стволовой клетки.
Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет недифференцированную клетку CD34+.
Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет лимфогематопоэтическую клетку - предшественника.
Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет плюрипотентную стволовую клетку.
Более коммитированная клетка может включать любые компоненты, которые имеют отношение к представлению антигена, его захвату или распознаванию. Предпочтительно, недифференцированная клетка представляет клетку I+ Класса и/или II+ Класса МНС.
Предпочтительно, агент действует внеклеточно по отношению к более коммитированной клетке.
Предпочтительно, более коммитированная клетка включает рецептор, который может функционально вовлекаться агентом, и в котором агент функционально вовлекает рецептор.
Предпочтительно, рецептор представляет рецептор клеточной поверхности.
Предпочтительно, рецептор включает α-компонент и/или β-компонент.
Предпочтительно, рецептор включает β-цепь, имеющую гомологичные регионы.
Предпочтительно, рецептор включает по крайней мере гомологичные регионы β-цепи HLA-DR.
Предпочтительно, рецептор включает α-цепь, имеющую гомологичные регионы.
Предпочтительно, рецептор включает по крайней мере гомологичные регионы α-цепи HLA-DR.
Предпочтительно, агент представляет антитело к рецептору.
Предпочтительно, агент представляет моноклональное антитело к рецептору.
Предпочтительно, агент представляет антитело, предпочтительно, моноклональное антитело к гомологичным регионам β-цепи HLA-DR.
Предпочтительно, агент представляет антитело, предпочтительно, моноклональное антитело к гомологичным регионам α-цепи HLA-DR.
Предпочтительно, агент используется в комбинации с модификатором биологической реакции.
Предпочтительно, модификатор биологической реакции представляет алкилирующий агент.
Предпочтительно, алкилирующий агент представляет или включает циклофосфамид.
В одном предпочтительном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку.
Предпочтительно, более коммитированная клетка представляет любую из В-клетки или Т-клетки.
В альтернативном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет более зрелую недифференцированную клетку.
В одном предпочтительном варианте реализации, когда недифференцированная клетка коммитирует в рекоммитированную клетку, рекоммитированная клетка относится к той же линии, как и более коммитированная клетка перед ретродифференциацией.
В другом предпочтительном варианте реализации, когда недифференцированная клетка коммитирует в рекоммитированную клетку, рекоммитированная клетка относится к другой же линии, чем более коммитированная клетка перед ретродифференциацией.
Предпочтительно, рекоммитированная клетка представляет любую из В-клетки, Т-клетки или гранулоцита.
Предпочтительно, способ представляет способ in vitro.
Предпочтительно, агент модулирует экспрессию гена МНС, предпочтительно, в котором агент модулирует экспрессию МНС I+ Класса и/или МНС II+ Класса.
Агент функционально вовлекает более коммитированную клетку для ретродифференциации этой клетки в недифференцированную клетку. В этом отношении, агент для ретродифференциации более коммитированной клетки в недифференцированную клетку, может действовать в прямом контакте или непрямом контакте с более коммитированной клеткой.
Примером прямого контакта является то, когда более коммитированная клетка имеет по крайней мере один рецептор клеточной поверхности на ее клеточной поверхности, такой как β-цепь, имеющую гомологичные регионы (регионы, которые обычно имеют такую же или подобную последовательность), такие как те, которые могут быть обнаружены на В-клетках, и в которых агент вступает в прямой контакт с рецептором клеточной поверхности. Другим примером является то, когда более коммитированная клетка имеет рецептор клеточной поверхности на ее клеточной поверхности такой как α-цепь, имеющую гомологичные регионы, такие как те, которые могут быть обнаружены на Т-клетках, и в которых агент вступает в прямой контакт с рецептором клеточной поверхности.
Примером непрямого контакта является то, когда более коммитированная клетка имеет по крайней мере два рецептора клеточной поверхности на ее клеточной поверхности, и контакт агента с одним из рецепторов воздействует на другой рецептор, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки.
Агент для ретродифференциации более коммитированной клетки в недифференцированную клетку может быть химическим соединением или композицией. Предпочтительно, однако, агент способен вступать в контакт с рецептором клеточной поверхности на поверхности более коммитированной клетки. Например, предпочтительные агенты включают любой один или более из циклического аденозин монофосфата (сАМР), молекулы CD4, молекулы CD8, части или всего рецептора Т-клетки, лиганда (фиксированного или свободного), пептида, рецептора Т-клетки (TCR), антитела, перекрестно реактивного антитела, моноклонального антитела или поликлонального антитела.
Если агент представляет антитело, перекрестно реактивное антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело, то предпочтительно агент представляет любое из одного или более антитела, перекрестно реактивного антитела, моноклонального антитела или поликлонального антитела к любому одному или более из: β-цепи антигена II класса МНС, β-цепи антигена HLA-DR MHC, α-цепи антигена I класса или II класса МНС, α-цепи антигена HLA-DR МНС, α- и β-цепи антигена II класса МНС, или антигена I класса МНС. Примером подходящего антитела является CR3/43 (поставляемого Dako).
Более коммитированная клетка представляет любую клетку, происходящую или которая может происходить из недифференцированной клетки.
Таким образом, в одном предпочтительном варианте реализации, более коммитированная клетка представляет также недифференцированную клетку. Поэтому в качестве примера недифференцированная клетка может быть лимфоидной стволовой клеткой или миелоидной стволовой клеткой, а недифференцированная клетка представляет плюрипотентную стволовую клетку.
В другом варианте реализации, более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку, такую как клетка CFC - Т, клетка CFC - В, клетка CFC - Eisin, клетка CFC - Bas, клетка CFC - GM, клетка CFC - Е, Т-клетка, В-клетка, эозинофил, базофил, нейтрофил, моноцит, мегакариоцит или эритроцит; а недифференцированная клетка представляет миелоидную стволовую клетку, лимфоидную стволовую клетку или плюрипотентную стволовую клетку.
Если более коммитированная клетка представляет дифференцированную клетку, то предпочтительно дифференцированная клетка представляет В-лимфоцит (активированный или не активированный), Т-лимфоцит (активированный или не активированный), клетку из линии макрофагов моноцитов, содержащую ядро клетку, способную экспрессировать антигены класса I или антигены класса II, клетку, которая может быть индуцирована экспрессировать антигены класса I или класса II, или энуклеированную клетку (т. е. клетку, которая не содержит ядро - такую как эритроцит).
В альтернативных предпочтительных вариантах реализации, дифференцированная клетка выбрана из любой группы клеток, включающей крупные гранулярные лимфоциты, нуль-лимфоциты и естественные клетки-киллеры, каждая экспрессирующая рецепторы клеточной поверхности CD56 и/или CD16.
Дифференцированная клетка может даже быть образована с помощью нуклеации энуклеированной клетки.
Агент может действовать внутриклеточно внутри более коммитированной клетки. Однако предпочтительно, агент действует внеклеточно по отношению к более коммитированной клетке.
В предпочтительном варианте реализации, агент функционально задействует рецептор, присутствующий на поверхности более коммитированной клетки, причем рецептор может быть экспрессирован более коммитированной клеткой, такой как рецептор, который способен быть экспрессирован более коммитированной клеткой.
Предпочтительно, рецептор представляет антиген Класса I или Класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). В предпочтительных вариантах реализации, рецептор клеточной поверхности представляет собой любой из: рецептора HLA-DR, рецептора DM, рецептора DP, рецептора DQ, рецептора HLA-А, рецептора HLA-В, рецептора HLA-С, рецептора HLA-Е, рецептора HLA-F или рецептора HLA-G.
В наиболее предпочтительных вариантах реализации, рецептор клеточной поверхности представляет рецептор HLA-DR.
Предпочтительно, этап контактирования включает вступление агента во взаимодействие с любым одним или более из следующих: гомологичных регионов α-цепи антигенов I класса, гомологичных регионов α-цепи антигенов II класса, рецептора CD4 клеточной поверхности, рецептора CD8 клеточной поверхности, гомологичных регионов β-цепи антигенов II класса в присутствии лимфоцитов, гомологичных регионов α-цепи антигенов I класса в присутствии лимфоцитов, или гомологичных регионов α-цепи антигенов II класса в присутствии лимфоцитов.
Предпочтительно, этап контактирования происходит в присутствии модификатора биологической реакции.
Предпочтительно, модификатор биологической реакции представляет один или более модуляторов, таких как иммуномодулятор, фактор роста, цитокин, рецептор клеточной поверхности, гормон, нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, антиген или пептид.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, недифференцированная клетка затем коммитируется в рекоммитированную клетку, такую как дифференцированная клетка.
Рекоммитированная клетка может относиться к той же линии, что и коммитированная клетка, из которой была получена недифференцированная клетка.
Альтернативно, рекоммитированная клетка может относиться к другой линии, чем коммитированная клетка, из которой получена недифференцированная клетка.
Кроме того, настоящее изобретение также включает способ настоящего изобретения получения недифференцированной клетки, в котором способ включает коммитирование недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку и затем слияние рекоммитированной клетки с миеломой. Это обеспечивает экспрессию in vitro больших количеств желаемого продукта, такого как антитело или антиген или гормон и т. д.
Другой аспект настоящего изобретения включает:
Использование любого из агентов настоящего изобретения для получения недифференцированной клетки из более коммитированной клетки.
Использование любого из агентов настоящего изобретения для получения недифференцированной клетки из более коммитированной клетки.
Использование продукта недифференцированной клетки в соответствии со способом настоящего изобретения получения любого моноклонального или поликлонального или специфического антитела из В-лимфоцита или Т-лимфоцита; клетки из линии макрофагов моноцитов, содержащей ядро, способной экспрессировать антигены класса I или класса II; клетки, способной индуцироваться для экспрессии антигенов класса I или класса II; энуклеированной клетки; или апоптической клетки.
Использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения получения эффекторных Т-лимфоцитов из В-лимфоцитов и/или наоборот.
Использование недифференцированной клетки, полученной в соответствии со способом настоящего изобретения получения любого одного или более: лекарственного препарата, такого как лекарственный препарат, включающий или полученный из В-лимфоцита, Т-лимфоцита, клетки из линии макрофагов моноцитов; содержащей ядро, способной экспрессировать антигены класса I или класса II; способной индуцироваться для экспрессии антигенов класса I или класса II; или энуклеированной клетки.
Настоящее изобретение также включает процессы с использованием указанных выше способов использования и продуктов или композиций, полученных в результате таких процессов.
Настоящее изобретение также включает лекарственный препарат, включающий недифференцированную клетку в соответствии с настоящим изобретением или продукт, полученный из нее, смешанный с подходящим растворителем, носителем или наполнителем.
В одном предпочтительном варианте реализации, лекарственный препарат включает антитело или антиген, полученный из недифференцированной клетки в соответствии с настоящим изобретением, смешанный с подходящим растворителем, носителем или наполнителем.
Предпочтительно, лекарственный препарат предназначен для лечения любого из следующих состояний: рак, аутоиммунные заболевания, заболевания крови, клеточная или тканевая регенерация, регенерация органов, лечение трансплантатов органов или тканей или врожденных нарушений метаболизма.
В предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения гена в геном недифференцированной клетки, причем способ включает введение гена в более коммитированную клетку, и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в недифференцированной клетке.
В более предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения гена в геном недифференцированной клетки, в котором способ включает вставку гена в геном более коммитированной клетки, и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в недифференцированной клетке.
В еще более предпочтительном варианте реализации, настоящее изобретение относится к способу введения генома гена в недифференцированную клетку, в котором способ включает вставку гена в геном более коммитированной клетки и затем получение недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, посредством чего ген присутствует в геноме недифференцированной клетки.
Настоящее изобретение охватывает недифференцированную клетку, полученную с помощью любого из этих способов настоящего изобретения.
Как уже упоминалось, настоящее изобретение также охватывает лекарственный препарат, включающий недифференцированную клетку, полученную с помощью любого из этих способов, смешанную с подходящим растворителем, носителем или наполнителем. С таким лекарственным препаратом недифференцированная клетка может использоваться для получения преимущественно более коммитированной клетки, такой как клетка, имеющая правильную геномную структуру, для облегчения любых симптомов или состояний, вызванных или связанных с более коммитированной клеткой, имеющей неправильную геномную структуру.
Таким образом, настоящее изобретение также представляет способ устранения приобретенной мутации из более коммитированной клетки, в котором способ включает образование недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, превращающего недифференцированную клетку в рекоммитированную клетку, посредством которого расположение или перестройка генома и/или ядра клетки вызывает устранение мутации.
Предпочтительно, ген вставляется в иммуноглобулиновый регион или регион TCR-генома.
Альтернативно, недифференцированная клетка может использоваться для получения более коммитированной клетки, которая продуцирует агент, который излечивает симптомы или состояния, вызванные или связанные с более коммитированной клеткой, имеющей неправильную геномную структуру.
Например, настоящее изобретение может быть использовано для получения антител или рецепторов Т-клеток для антигена, который экспрессируется более коммитированной клеткой, которая ретродифференцировалась в недифференцированную клетку. В этом отношении, антиген может быть фетоспецифическим антигеном или перекрестно реактивным фетоспецифическим антигеном.
Настоящее изобретение также включает способ контролирования уровней недифференцированных клеток и более коммитированных клеток. Например, настоящее изобретение включает способ, включающий образование недифференцированной клетки с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, и затем активацию гена апоптоза для воздействия на недифференцированную клетку, так, чтобы вызвать ее смерть.
В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, более коммитированная клетка не представляет раковую клетку. В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, агент не является ни канцерогенным, ни способен стимулировать рост рака.
Настоящее изобретение также охватывает способ лечения пациента, страдающего заболеванием или расстройством в результате дефективной клетки или нежелательной клетки, причем способ включает получение недифференцированной клетки с помощью контактирования более коммитированной клетки с агентом, который вызывает ретродифференциацию более коммитированной клетки в недифференцированную клетку, а затем необязательно превращение недифференцированной клетки в рекоммитированную клетку; в котором недифференцированная клетка, или рекоммитированная клетка, воздействует на дефективную клетку или нежелательную клетку для облегчения симптомов заболевания или расстройства или для излечения пациента с заболеванием или состоянием.
Подводя итог, настоящее изобретение относится к получению недифферецированной клетки из более коммитированной клетки.
Теперь настоящее изобретение будет описано в виде примера, в котором будет делаться ссылка на следующие фигуры:
фиг. 1, которая представляет вид клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 2, которая представляет вид клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения;
фиг. 3, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения, но при более низком увеличении;
фиг. 4, которая представляет вид под микроскопом клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 5, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения; и
фиг. 6, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения.
фиг. 1, которая представляет вид клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 2, которая представляет вид клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения;
фиг. 3, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения, но при более низком увеличении;
фиг. 4, которая представляет вид под микроскопом клеток перед использованием способа настоящего изобретения;
фиг. 5, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения; и
фиг. 6, которая представляет вид под микроскопом клеток, полученных с помощью способа настоящего изобретения.
А. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
ПАЦИЕНТЫ
Пробы крови были получены в трубках с лавандовыми верхушками, содержащими ЭДТА у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом, пациентов с дефицитом антител (включая дефицит IgА и сцепленные с Х-хромосомой гипогаммаглобулинемии у детей), пациентов с ВИЧ-инфекциями и синдромом СПИД, пациента с инфекцией цитомегаловирусом (ЦМВ), пациента с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с бластоцитозом, различных пациентов с различными инфекциями и клиническими состояниями, пуповинная кровь, костный мозг и обогащенные препараты В-лимфоцитов здоровых доноров крови.
ПАЦИЕНТЫ
Пробы крови были получены в трубках с лавандовыми верхушками, содержащими ЭДТА у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом, пациентов с дефицитом антител (включая дефицит IgА и сцепленные с Х-хромосомой гипогаммаглобулинемии у детей), пациентов с ВИЧ-инфекциями и синдромом СПИД, пациента с инфекцией цитомегаловирусом (ЦМВ), пациента с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с Ходжкиновскими лимфомами, пациента с острым Т-клеточным лейкозом, 6-дневного младенца с бластоцитозом, различных пациентов с различными инфекциями и клиническими состояниями, пуповинная кровь, костный мозг и обогащенные препараты В-лимфоцитов здоровых доноров крови.
КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ
Клинические и экспериментальные условия лечения пациентов, включая различные типы обработки образцов их крови, описаны в таблице 1. Лейкоцитарную формулу (WBC) получали с использованием счетчика Кольтера, и она включена в ту же таблицу.
Клинические и экспериментальные условия лечения пациентов, включая различные типы обработки образцов их крови, описаны в таблице 1. Лейкоцитарную формулу (WBC) получали с использованием счетчика Кольтера, и она включена в ту же таблицу.
ОБРАБОТКА КРОВИ
После взятия образцы крови обрабатывали чистым моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR (DAKO) и оставляли для смешивания на многоголовочном роллере при комнатной температуре в течение максимум 24 часов. Некоторые пробы сначала смешивали на многоголовочном роллере в течение 15 минут, после чего их оставляли для инкубации в инкубаторе при 22oС. Концентрация моноклонального антитела, добавляемого в образцы крови, колебалась от 10 до 50 мкл/мл крови.
После взятия образцы крови обрабатывали чистым моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR (DAKO) и оставляли для смешивания на многоголовочном роллере при комнатной температуре в течение максимум 24 часов. Некоторые пробы сначала смешивали на многоголовочном роллере в течение 15 минут, после чего их оставляли для инкубации в инкубаторе при 22oС. Концентрация моноклонального антитела, добавляемого в образцы крови, колебалась от 10 до 50 мкл/мл крови.
Кроме того, применяли другие способы обработки при тех же концентрациях, и они включали добавление моноклонального антитела к гомологичному региону α-цепи антигена HLA-DR, моноклонального антитела к гомологичному региону антигенов класса I, моноклонального антитела к CD8 и иммобилизованного на ПЭ моноклонального антитела к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR.
Другие способы обработки включали одновременное добавление в образцы крови моноклональных антител к гомологичным регионам α- и β-цепей антигена HLA-DR.
Кроме того, в образцы крови добавляли алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид в комбинации с чистым моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR.
После этих способов обработки образцы крови окрашивали набором меченых моноклональных антител в соответствии с инструкциями производителя, и затем проводили анализ с использованием проточной цитометрии.
Периоды инкубации с моноклональными антителами колебались в интервалах от 2 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов до 24 часов.
МЕЧЕНЫЕ АНТИТЕЛА
Следующие моноклональные антитела были использованы для выявления следующих маркеров на клетках с помощью проточной цитометрии: CD19 и CD3, CD4 и CD8, DR и CD3, CD56 & 16 и CD3, CD45 и CD14, CD8 и CD3, CD8 и CD28, контроль с помощью одновременной пробы (lgG1 FITC + lgG2a РЕ), CD34 и CD2, CD7 и CD13 & 33, CD10 и CD25, CD5 и CD10, CD5 и CD21, CD7 и CD5, CD13 и CD20, CD23 и CD57 и CD25 и CD45 RA (Becton & Dickenson и DAKO).
Следующие моноклональные антитела были использованы для выявления следующих маркеров на клетках с помощью проточной цитометрии: CD19 и CD3, CD4 и CD8, DR и CD3, CD56 & 16 и CD3, CD45 и CD14, CD8 и CD3, CD8 и CD28, контроль с помощью одновременной пробы (lgG1 FITC + lgG2a РЕ), CD34 и CD2, CD7 и CD13 & 33, CD10 и CD25, CD5 и CD10, CD5 и CD21, CD7 и CD5, CD13 и CD20, CD23 и CD57 и CD25 и CD45 RA (Becton & Dickenson и DAKO).
Анализ образцов крови каждого пациента, как обработанных, так и не обработанных, проводили с использованием большинства компонентов из указанного выше набора для определения характера иммунофенотипических изменений, которые сопровождали различные типы обработки, и они проводились раздельно на различных аликвотных количествах одного и того же образца крови. Окрашивание и анализ необработанных образцов и образцов после других контрольных способов обработки проводили одновременно.
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
Окрашивание и лизирование цельных образцов крови проводили в соответствии с инструкциями производителя. Проточный цитометрический анализ проводили на FACScan@ с помощью или одновременного теста или компьютерной программы PAINT A GATE (BDIS), которая включала отрицательные контроли при обратном прослеживании. В файлах списочного типа накапливали и хранили от 10000 до 20000 сеансов обработки.
Окрашивание и лизирование цельных образцов крови проводили в соответствии с инструкциями производителя. Проточный цитометрический анализ проводили на FACScan@ с помощью или одновременного теста или компьютерной программы PAINT A GATE (BDIS), которая включала отрицательные контроли при обратном прослеживании. В файлах списочного типа накапливали и хранили от 10000 до 20000 сеансов обработки.
МОРФОЛОГИЯ
Морфологию анализировали с использованием микроскопии и окрашивания по Wright.
Морфологию анализировали с использованием микроскопии и окрашивания по Wright.
В. РЕЗУЛЬТАТЫ
НАБОР CD19 и CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи HLA-DR всегда уменьшала относительное количество клеток CD19+. Этот маркер представляет общий В-клеточный антиген (см. таблицу). Этот антиген присутствует на всех В-лимфоцитах человека на всех стадиях созревания, но он утрачивается на окончательно дифференцированных плазматических клетках. Следовательно, это является показателем, что В-клетки ретродифференцировались в недифференцированные клетки.
НАБОР CD19 и CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи HLA-DR всегда уменьшала относительное количество клеток CD19+. Этот маркер представляет общий В-клеточный антиген (см. таблицу). Этот антиген присутствует на всех В-лимфоцитах человека на всех стадиях созревания, но он утрачивается на окончательно дифференцированных плазматических клетках. Следовательно, это является показателем, что В-клетки ретродифференцировались в недифференцированные клетки.
Такая же обработка вызвала резкое увеличение относительного количества клеток CD3+, особенно в крови пациентов с В-клеточным лимфолейкозом (В-CLL), которое всегда сопровождалось увеличением относительного количества клеток CD3- CD19-. CD3 присутствует на всех зрелых Т-лимфоцитах и на 65% - 85% тимоцитов. Этот маркер всегда обнаруживается в связи с α-/β- или гамма/дельта рецепторами Т-клеток (TCR), и вместе эти комплексы важны в передаче сигналов внутрь клетки. Следовательно, это является показателем, что В-клетки ретродифференцировались в недифференцированные клетки и затем превращаются в новые дифференцированные клетки, а именно Т-клетки.
В обработанной крови пациентов с В-CLL появился новый клон клеток, совместно экспрессирующий маркеры CD19 и CD3, т. е. CD19+ и CD3+ (см. карту 1, пациент 2, 3 и 4 через 2 ч, 6 ч и 24 ч после начала обработки). У других пациентов с различными состояниями выявлено увеличение относительного количества этих клонов клеток. Эти клетки были исключительно крупными и обильно гранулированными, и на их клеточной мембране были экспрессированы крайне высокие уровни CD19. Представляется, что маркер CD3 экспрессирован на этих клетках на уровнях, аналогичных уровням, экспрессированным на нормальных зрелых лимфоцитах.
В таблице 2 пациенты номер 2, 3 и 4 в действительности являются номерами, представляющими одного и того же пациента, и их обозначение было просто предназначено для иллюстрации влияния обработки на кровь с течением времени (экспериментальное и клиническое состояние этого пациента показано в таблице 1).
Представляется, что клоны CD19+ и CD3+ в обработанных образцах уменьшаются с течением времени, достигая первоначальных уровней, которые были определены в необработанном образце на интервалах 2 ч, 6 ч и 24 ч.
Другой тип клетки того же размера и зернистости был обнаружен в обработанных образцах, и эти клетки имели высокие уровни CD19, экспрессированных на их поверхности, но были отрицательны по маркеру CD3 и богаты рецепторами FC. Однако оказалось, что относительное количество этих клеток уменьшалось со временем. Интересно, что через 24 ч после обработки образца крови (2, 3 и 4) было уменьшение относительного количества клеток CD19- CD3- (в группе клеток, увеличение количества которых первоначально наблюдалось через 2 и 6 ч после обработки образцов крови. Однако наблюдалось уменьшение количества популяций лейкоцитов при подсчете Кольтеровской формулы при обработке крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR. Эти данные свидетельствуют о том, что этот тип обработки вызывает развитие атипичных клеток, которые нельзя выявить с помощью счетчика Колтера (таблица 1), но может обнаруживаться при измерении с помощью проточной цитометрии, которая подсчитывает клетки на основании поверхностных маркеров, размера и зернистости. Кроме того, эти атипичные клетки выявлялись с помощью анализа морфологии с использованием красителя Wright под микроскопом. Графики проточной цитометрии этих феноменов представлены на графиках (1, 2, 3 и 4) и представляется, что иммунофенотипические изменения, полученные после обработки образцов крови, свидетельствуют о том, что лимфоциты CD19+ и CD3+ представляют связанную друг с другом группу клеток, но остаются отличными на основании относительной экспрессии CD19 и CD3 в сравнении со стволовыми клетками.
В таблице 2 пациент под номерами 5 и 6 представляет одного и того же пациента, но анализ обработанного и необработанного образцов крови контролировались в динамике и в одно и то же время (см. таблицу 1).
Кровь пациентов со злокачественными В-клеточными заболеваниями проявила аналогичные тенденции иммунофенотипических изменений при сравнении с кровью пациентов с В-CLL, но изменения не были выражены в той же степени. Однако относительное и абсолютное количество В-лимфоцитов и положительных по классу II МНС клеток в крови этих пациентов крайне низкое, по сравнению с тем, которое обнаружено в крови пациентов с В-CLL.
У двух братьев со сцепленной с Х-хромосомой детской гипогаммаглобулинемией, у которых был дефицит В-клеток, были выявлены различные иммунофенотипические изменения в относительном количестве клеток CD3+ после обработки их крови. У младшего брата, которому было 2 месяца и который не был болен, после обработки
его крови, было выявлено незначительное увеличение относительного количества клеток CD3+, которое сопровождалось уменьшением относительного количества клеток CD3- и CD19-. С другой стороны, у другого брата, которому было 2 года и который был крайне болен и у которого было относительно высокое количество активированных Т-клеток, экспрессирующих антигены DR, было выявлено уменьшение количества клеток CD3+ после обработки его крови. Никакие другие маркеры не использовались для измерения других иммунофенотипических изменений, которые могли произойти, потому что образцы крови, полученные у этих двух пациентов, были крайне малы (таблица 2, ID 43/BD и 04/BD).
его крови, было выявлено незначительное увеличение относительного количества клеток CD3+, которое сопровождалось уменьшением относительного количества клеток CD3- и CD19-. С другой стороны, у другого брата, которому было 2 года и который был крайне болен и у которого было относительно высокое количество активированных Т-клеток, экспрессирующих антигены DR, было выявлено уменьшение количества клеток CD3+ после обработки его крови. Никакие другие маркеры не использовались для измерения других иммунофенотипических изменений, которые могли произойти, потому что образцы крови, полученные у этих двух пациентов, были крайне малы (таблица 2, ID 43/BD и 04/BD).
У пациента 91 в таблице 2 выявляется уменьшение относительного количества клеток CD3+ после обработки крови, которое сопровождалось увеличением относительного количества клеток CD3- и CD19-. Однако при анализе других поверхностных маркеров, таких как CD4 и CD8 (см. таблицу 3), было отмечено, что у пациента имеется высокое относительное число клеток CD4+ CD8+ в его крови, и это было отмечено перед обработкой образцов крови моноклональным антигеном к β-цепи антигена DR, и количество этих дважды положительных клеток заметно снижалось после обработки крови. Кроме того, когда был проведен анализ других маркеров, было отмечено, что относительное число клеток CD3+ возросло (см. таблицу 4).
В обогащенном препарате В-лимфоцитов, полученном от здоровых доноров крови, после обработки образцов крови моноклональным антигеном к β-цепи антигенов DR, выявлено резкое увеличение относительного числа клеток CD3+, которое всегда сопровождалось уменьшением относительного количества клеток CD19+ и увеличением относительного количества клеток CD3+ и CD19+. Дальнейший анализ с использованием маркеров, таких как CD4 и CD8, выявил сопутствующее увеличение относительного количества этих маркеров. Однако в обогащенном препарате Т-лимфоцитов тех же доноров крови после обработки тем же моноклональным антителом не было таких же изменений.
НАБОР CD4 и CD8
Антиген CD4 представляет рецептор вируса иммунодефицита человека. Молекула CD4 связывает антиген класса II МНС в домене В2, регионе, который аналогичен участкам связывания CD8 на антигенах класса I. Связывание CD4 с антигеном класса II усиливает реактивность Т-клеток к антигенам, как и связывание CD8 с антигенами класса I. Антигены CD8 присутствуют на субпопуляции суппрессорных/цитотоксических Т-лимфоцитов человека, а также на субпопуляции лимфоцитов естественных киллерах (NK) и на большинстве нормальных лимфоцитов. Антигены CD4 и CD8 совместно экспрессированы на тимоцитах, и эти клетки теряют все маркеры по мере созревания в Т-лимфоциты.
Антиген CD4 представляет рецептор вируса иммунодефицита человека. Молекула CD4 связывает антиген класса II МНС в домене В2, регионе, который аналогичен участкам связывания CD8 на антигенах класса I. Связывание CD4 с антигеном класса II усиливает реактивность Т-клеток к антигенам, как и связывание CD8 с антигенами класса I. Антигены CD8 присутствуют на субпопуляции суппрессорных/цитотоксических Т-лимфоцитов человека, а также на субпопуляции лимфоцитов естественных киллерах (NK) и на большинстве нормальных лимфоцитов. Антигены CD4 и CD8 совместно экспрессированы на тимоцитах, и эти клетки теряют все маркеры по мере созревания в Т-лимфоциты.
После анализа маркеров CD4 и CD8 (см. ниже) и по большинству образцов крови, представленных в таблице 2, возникает тип окрашивания, который подтверждает присутствие процесса ретродифференциации В-лимфоцитов в недифференцированные клетки и последующей дифференциации в Т-лимфоциты.
Клетки CD4- CD4-, которые представляют дважды положительные клетки, всегда появлялись после обработки образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи, и количество этих типов клеток заметно возрастало в крови обработанных образцов пациентов с В-CLL, но они всегда отсутствовали в необработанных образцах (см. таблицу 3 и карты 1, 2, 3 и 4). В тех же образцах также отмечалось одновременное увеличение относительного количества одиночных положительных клеток, таких как клетки CD8+ и CD4+. Кроме того, отмечалось резкое снижение относительного количества клеток CD4- CD8-, которое, по крайней мере в случае В-CLL, соответствует В-клеткам, в обработанных образцах, при сравнении с необработанными образцами, которые оставались на том же уровне при измерении в динамике. Однако определение относительного количества клеток CD4+ CD8+ в динамике в обработанных образцах показало, что было сопутствующее возрастание количества одиночных положительных клеток со снижением относительного количества дважды положительных клеток. Этот тип фенотипического изменения характерен для тимического развития клеток - предшественников линии Т-лимфоцитов в тимусе (пациент номер 2, 3 и 4). Антиген CD4 присутствует на субпопуляциях Т-лимфоцитов хелперов/индукторов (CD4+ CD3+) и большинстве нормальных тимоцитов. Однако этот антиген присутствует при низкой плотности на клеточной поверхности моноцитов и в цитоплазме моноцитов и макрофагов (CD3- CD4+).
После обработки в различных образцах крови отмечено различное влияние на клетки с относительно низким количеством CD4+ . Представляется, что обработка не влияет на относительное количество этого типа клеток в образцах крови пациентов с В-CLL, по сравнению с необработанными образцами. Такие низкие уровни экспрессии CD4 обнаружены на моноцитах и на тимоцитах на очень ранних стадиях развития.
У пациента HIV+ 25 после обработки выявлено существенное увеличение количества дважды положительных клеток, экспрессирующих одновременно CD4 и CD8. С другой стороны, у пациента 91 после обработки выявлено уменьшение количества этого подтипа клеток, и наблюдение такого феномена зависит от времени. Наблюдалось увеличение относительного количества клеток CD8+ в необработанных образцах крови пациентов с В-CLL при измерении в динамике, тогда как в те же самые периоды наблюдалось уменьшение относительного количества клеток с низким содержанием CD4+ и CD4+ (таблица 3, пациент 2, 3 и 4).
НАБОР DR И CD3
Маркеры DR присутствуют на моноцитах, дендритных клетках, В-клетках и активированных Т-лимфоцитах.
Маркеры DR присутствуют на моноцитах, дендритных клетках, В-клетках и активированных Т-лимфоцитах.
В обработанных и необработанных пробах, проанализированных с использованием этого набора, выявлены иммунофенотипические изменения, подобные изменениям, полученным, когда пробы крови анализировали с использованием маркеров CD19 и CD3 (см. таблицу 2), и эти антигены, как указано ранее, представляют соответственно пан-В- и Т-клеточные маркеры.
Представляется, что обработка крови моноклональными антителами влияет на относительное количество В-лимфоцитов DR+ так, что уровень клеток DR+ уменьшается. Напротив, относительное количество клеток CD3+ (Т-клеток) значительно увеличивается (см. таблицу 4 и карту). Кроме того, относительное количество активированных Т-клеток увеличивалось в большинстве обработанных проб крови пациентов с В-CLL, и на эти типы клеток оказывались различные воздействия в обработанных образцах пациентов с другими состояниями. Кроме того, относительное количество DR высоко положительных клеток DR появлялось в значительных количествах обработанных образцов пациентов с В-CLL и у 6-дневного младенца с увеличенным содержанием бластов DR+ CD34+ в крови. Однако следует отметить, что бласты, которые присутствовали в крови этого пациента, были отрицательны по Т- и В-клеточным маркерам до и после обработки, но становились более положительными по антигенам миелоидной линии после обработки. Относительное количество клеток DR- CD34- увеличивалось в большинстве обработанных образцов крови и было пропорционально увеличению относительного количества клеток CD3+ (Т-клеток) и было обратно пропорционально уменьшению относительного количества клеток DR+ (В-клеток).
НАБОР CD56 & 16 И CD3
Маркеры CD56 & CD16 обнаруживаются на гетерогенной группе клеток, субпопуляции лимфоцитов, известной в целом как крупные гранулярные лимфоциты и лимфоциты - естественные киллеры (NK). Антиген CD16 экспрессирован практически на всех покоящихся лимфоцитах NK, и слабо экспрессирован на некоторых Т-лимфоцитах CD3+ от определенных лиц. Этот антиген обнаруживается на гранулоцитах в меньшем количестве и связан с лимфоцитами, содержащими крупные азурофильные гранулы. Антиген CD16 представляет рецептор III lgG FC.
Маркеры CD56 & CD16 обнаруживаются на гетерогенной группе клеток, субпопуляции лимфоцитов, известной в целом как крупные гранулярные лимфоциты и лимфоциты - естественные киллеры (NK). Антиген CD16 экспрессирован практически на всех покоящихся лимфоцитах NK, и слабо экспрессирован на некоторых Т-лимфоцитах CD3+ от определенных лиц. Этот антиген обнаруживается на гранулоцитах в меньшем количестве и связан с лимфоцитами, содержащими крупные азурофильные гранулы. Антиген CD16 представляет рецептор III lgG FC.
Различное количество лимфоцитов CD16+ экспрессирует или антиген CD57 или антиген CD8 низкой плотности, или оба. У большинства лиц фактически нет перекрытия с другими антигенами Т-лимфоцитами, такими как антигены CD5, CD4 или CD3. Антиген CD56 присутствует по существу на всех покоящихся и активированных лимфоцитах CD16+ NK, и эти субпопуляции клеток осуществляют цитотоксичность, не ограниченную главным комплексом гистосовместимости.
Иммунотипирование обработанных и необработанных образцов крови пациентов с В-CLL и некоторых других пациентов с другими состояниями показало увеличение относительного количества клеток, совместно экспрессирующих антигены CD56 & CD16, которые были сильно гранулированы и имели средний размер (см. таблицу 5 и карты 1, 2, 3 и 4). Эти наблюдения также сопровождались выраженным увеличением относительного количества клеток, экспрессирующих только антиген CD3 (без экспрессии маркеров CD56 и CD16) и клеток, совместно экспрессирующих маркеры CD56 & CD16 и CD56 & CD3.
В таблице 5 номера пациента 2, 3 и 4 представляют ту же пробу крови, но проанализированную соответственно через 2 часа, 6 часов и 24 часа (до и после обработки). Эта проба показывает, что обработка крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR, как представляется, вызывает спонтанную выработку клеток CD56+ и CD16+, клеток CD3+ и CD56+ и клеток CD16+ CD3=, и эти наблюдения всегда сопровождались исчезновением маркеров В-клеток (CD19, DR, CD56, CD16- CD3-).
Продолжающийся в динамике анализ этой пробы крови до и после обработки показал, что со временем уровни клеток CD56+ и CD16+ снижались, а уровень клеток CD3+ со временем возрастал.
В образцах крови пациента 7 с В-CLL не были выявлены какие-либо изменения количества клеток, экспрессирующих антигены CD56, CD16 и CD3 при сравнении с иммунофенотипическими изменениями, наблюдавшимися в обработанных и необработанных пробах, и это происходит потому, что количество добавленного моноклонального антитела было крайне низким относительно количества В-лимфоцитов. Однако обработка пробы крови этого пациента в отдельном случае соответствующим количеством моноклонального антитела показала значительное увеличение относительного количества клеток CD3+, CD56+ и CD16+ и CD56+ и CD16+ CD3+.
Образцы крови других пациентов с другими состояниями показали различные изменения уровня этих клеток, и, как представляется, это зависит от количества В-лимфоцитов, присутствующих в крови перед обработкой, длительности обработки и, вероятно, клинического состояния пациентов.
НАБОР CD45 и CD14
Антиген CD45 присутствует на всех лейкоцитах человека, включая лимфоциты, моноциты, полиморфоядерные клетки и эозинофилы в периферической крови, тимусе, селезенке и небные миндалины и предшественники лейкоцитов в костном мозге.
Антиген CD45 присутствует на всех лейкоцитах человека, включая лимфоциты, моноциты, полиморфоядерные клетки и эозинофилы в периферической крови, тимусе, селезенке и небные миндалины и предшественники лейкоцитов в костном мозге.
CD14 присутствует на от 70 до 90% нормальных моноцитах периферической крови, на от 77 до 90% фагоцитов плевральной или брюшинной жидкости. Этот антиген слабо экспрессирован на гранулоцитах и не существует на не стимулированных лимфоцитах, активированных митогеном Т-лимфоцитах, эритроцитах или тромбоцитах.
Антиген CD45 представляет семейство белковых тирозин фосфатаз, и эта молекула взаимодействует с внешними стимулами (антигенами) и влияет на передачу сигнала через членов семейства Scr, ведущую к регуляции роста и дифференциации клеток.
Участие β-цепи антигенов DR в обработанных пробах крови, особенно, образцах, полученных у пациентов с В-CLL, свидетельствует о том, что такая обработка воздействует на уровень антигенов CD45 на В-лимфоцитах. Представляется, что иммунофенотипические изменения в целом, которые имеют место при стимуляции β-цепи антигена DR обусловливают появление различных типов клеток, которые могут быть отделены на основании уровня экспрессии CD45 и CD14, а также морфологии по данным определения прямого рассеяния и бокового рассеяния (соответственно размер и зернистость), и эти результаты представлены в таблице 6 и картах (1, 2, 3, 4 и 5).
При обработке относительное количество клеток с низким уровнем CD45 (при сравнении с необработанными пробами) значительно увеличивалось, так же как относительное количество клеток, совместно экспрессирующих антигены CD45 и CD14. Этот тип иммунофенотипических изменений совпадал с уменьшением относительного количества клеток с высоким уровнем CD45 (по сравнению с необработанными пробами). Однако эта последняя популяция клеток может далее разделяться на основании морфологии и степени экспрессии CD45. Один тип был крайне большим и имел крайне высокие уровни антигена CD45 при сравнении с остальными клетками, представленными в картах (см. карты 1, 2, 3 и 4). При анализе этого набора после обработки в динамике (см. таблицу, пациент 2, 3 и 4 и карты), относительное количество клеток CD45+ первоначально резко падало со временем, вызывая появление клеток с низким уровнем CD45. Однако анализ крови через 24 часа показал противоположную ситуацию.
Пробы 5 и 7 выявляют иммунофенотипические изменения, противоположные тем, которые были получены с другими пробами, взятыми у других пациентов с В-CLL, и это связано с тем, что анализ проб проводился гораздо на более ранних периодах инкубации с моноклональным антителом. Фактически представляется, что последовательный анализ образцов крови после обработки свидетельствует о том, что иммунофенотипические изменения, предпринятые В-лимфоцитами, являются зависимыми от времени, потому что это представляет стадию развития, и иммунофенотипические изменения, определенные во время X, не будут такими же как во время Х плюс (будучи вызванными, они не являются фиксированными). Однако эти типы изменений должны происходить более строго определенным образом в организме, иначе бы возникла иммунопатология. Влияние обработки проб крови от других пациентов со злокачественными заболеваниями, не связанными с В-клетками, показывает различные изменения иммунофенотипов клеток, и это связано с тем, что В-лимфоциты присутствуют в меньшем количестве. Однако обработка обогащенных фракций В-лимфоцитов, полученных у здоровых доноров крови, показывает иммунофенотипические изменения, аналогичные изменениям, полученным при В-CLL с большим количеством В-лимфоцитов.
НАБОР CD8 И CD3
Антигенная детерминанта CD8 взаимодействует с молекулами класса I MHC, что приводит к возросшей адгезии между Т-лимфоцитами CD8+ и клетками-мишенями. Этот тип взаимодействия усиливает активацию покоящихся лимфоцитов. Антиген CD8 соединен с белковой протеин киназой (p56ick), и в свою очередь комплекс CD8/p56ick может играть роль в активации Т-лимфоцитов.
Антигенная детерминанта CD8 взаимодействует с молекулами класса I MHC, что приводит к возросшей адгезии между Т-лимфоцитами CD8+ и клетками-мишенями. Этот тип взаимодействия усиливает активацию покоящихся лимфоцитов. Антиген CD8 соединен с белковой протеин киназой (p56ick), и в свою очередь комплекс CD8/p56ick может играть роль в активации Т-лимфоцитов.
Обработка проб крови, полученных у пациентов с В-CLL моноклональным антителом к В-цепи, вызывает значительное увеличение относительного количества клеток, положительных по CD3 CD8 и CD3 (весьма вероятно положительных по CD4 CD3), что более ясно указывает на то, что двойные положительные клетки, генерированные первоначально, подвергаются развитию в зрелые Т-лимфоциты. Это процесс, который может быть прямо измерен с помощью антигенов CD19 и DR и косвенно с помощью антигенов CD8- CD3-. Представляется, что динамическая серийная оценка образцов обработанной крови одного и того же пациента согласуется с процессом, который идентичен развитию тимоцитов (таблица 7, пациент 2, 3 и 4 и карта 1).
Относительное количество клеток CD8+ со временем возрастает в обработанных и необработанных образцах, но в большей степени - в необработанных образцах. С другой стороны, относительное количество клеток CD8+ CD3+ уменьшается со временем в необработанных образцах. Однако относительное количество клеток CD3+ увеличивается в обработанных образцах крови при измерении в динамике, и эти типы клеток высоко соответствуют одиночным положительным клеткам CD4+ CD3+, более зрелой форме тимоцитов. Кроме того, поскольку эти образцы были также иммунофенотипированы другими наборами (упомянутыми выше в таблицах 3, 4, 5 и 6), общие изменения активно вовлекают В-клетки в генерацию предшественников и потомков Т-лимфоцитов.
Пробы крови от пациента с В-CLL (номер 2, 3 и 4 таблицы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) в отдельных аликвотных количествах не обрабатывали ничем, обрабатывали связанным с ПЭ моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR и несвязанной формой того же моноклонального антитела. При сравнении, обработка антигеном, связанным с ПЭ, не указывает на изменения относительного количества клеток, положительных по CD3 и связанных маркеров, таких как CD4, которые наблюдались в значительных количествах, когда тот же образец крови был обработан несвязанной формой антитела. Однако при измерении в динамике отмечалось увеличение количества клеток, положительных по CD45 без экспрессии антигена DR на их поверхности (см. таблицу 8). Данные, которые были аналогичны данным, полученным в необработанных пробах при иммунофенотипировании в динамике (таблица 6). Кроме того, относительное количество клеток, экспрессирующих низкий уровень CD45, со временем уменьшалось, феномен, который также отмечался в необработанных пробах (при измерении в динамике ) одного и того же пациента (см. карту 1А).
С. СРАВНЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ДРУГИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С РАЗЛИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ НА Т-ЛИМФОПОЭЗ
НАБОР CD19 И CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR и гомологичному региону антигенов Класса I MHC уменьшала количество клеток CD3+ и увеличивала количество клеток CD19+. Обработка той же крови моноклональным антигеном к гомологичному региону β-цепи антигена DR уменьшала количество клеток CD19+ и увеличивала количество клеток CD3+. Обработка последним моноклональным антителом с циклофосфамидом выявила такой же эффект (таблица 14, пациент 5/6 с В-CLL через 2 ч после обработки).
НАБОР CD19 И CD3
Обработка образцов крови моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR и гомологичному региону антигенов Класса I MHC уменьшала количество клеток CD3+ и увеличивала количество клеток CD19+. Обработка той же крови моноклональным антигеном к гомологичному региону β-цепи антигена DR уменьшала количество клеток CD19+ и увеличивала количество клеток CD3+. Обработка последним моноклональным антителом с циклофосфамидом выявила такой же эффект (таблица 14, пациент 5/6 с В-CLL через 2 ч после обработки).
Продолжающийся анализ клеток CD19+ и CD3+ в тех же образцах выявил дальнейшее увеличение относительного количества клеток CD3+ только в крови, обработанной моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR (таблица 14, пациент 5/6 с В-CLL, через 24 ч после обработки). Однако продолжающийся анализ (через 24 часа, пациент 5/6, таблица 14) проб крови, обработанных циклофосфамидом плюс моноклональное антитело к β-цепи антигена DR выявило устранение изменений относительного количества клеток CD19+ и CD3+ в сравнении с количеством, наблюдавшимся после периода инкубации 2 часа точно в таких же условиях.
В целом, обработка образцов крови одного и того же пациента моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR или моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена класса I показывает увеличение относительного количества клеток CD19+ (пан В маркер) при сравнении с необработанным образцом. Относительное количество клеток CD19- CD3- незначительно уменьшалось в пробах крови, обработанных моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR или моноклональным антителом к антигенам класса I (см. таблицу 14 и карты 2, 3 и 4). Обработка образцов крови пациента 09 моноклональным антителом к антигенам класса I увеличивала относительное количество клеток CD3+ и слегка уменьшала относительное количество клеток CD19+ и CD19- CD3-. Однако обработка обогащенного препарата В-лимфоцитов, полученных у здоровых доноров крови, моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи или α-цепи антигена DR показала иммунофенотипические изменения, аналогичные изменениям, полученным у пациента с В-CLL.
Лечение пациента с HIV+ и дефицитом IgA моноклональным антителом к β-цепи антигена DR увеличивала относительное количество клеток CD3+ и слегка уменьшала относительное количество клеток CD19+. Однако обработка того же образца крови моноклональным антителом к гомологичному региону антигена класса I не давала такого же эффекта. Обработка образцов крови, полученных у пациентов (34/BD и 04/BD) с дефицитом В-клеток показала различные иммунофенотипические изменения при обработке моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR, антигенам класса I и антигену CD4.
НАБОР CD4 И CD8
Образцы крови, анализ которых проводили с использованием набора CD19 и CD3 (таблица 14), также иммунотипировали набором CD4 и CD8 (таблица 15). Представляется, что оба набора согласуются и подтверждают друг друга. Инкубация в течение 2 часов образцов крови пациентов с В-CLL (таблица 15, пациенты 5/6 и 10, карты 2, 3 и 4) моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид увеличивала относительное количество клеток CD8+ и CD4+ и клеток, экспрессирующих оба маркера. С другой стороны, обработка тех же образцов моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR или к гомологичному региону α-цепи антигена класса I не давала таких же эффектов.
Образцы крови, анализ которых проводили с использованием набора CD19 и CD3 (таблица 14), также иммунотипировали набором CD4 и CD8 (таблица 15). Представляется, что оба набора согласуются и подтверждают друг друга. Инкубация в течение 2 часов образцов крови пациентов с В-CLL (таблица 15, пациенты 5/6 и 10, карты 2, 3 и 4) моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид увеличивала относительное количество клеток CD8+ и CD4+ и клеток, экспрессирующих оба маркера. С другой стороны, обработка тех же образцов моноклональным антителом к гомологичному региону α-цепи антигена DR или к гомологичному региону α-цепи антигена класса I не давала таких же эффектов.
Сравнение иммунофенотипических тенденций, полученных после периодов инкубации 2 часа и 24 часа с моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR плюс циклофосфамид, выявила обратные изменения относительного количества клеток, положительных по CD4 и CD8 (таблица 15, пациент 5/6 с В-CLL через 2 часа и 24 часа), и такие изменения были в соответствии с изменениями, полученными, когда проводился анализ такого же образца крови с набором CD19 и CD3 (таблица 14, тот же пациент). Более поздние данные показывают, что последующая дифференциация обратима, поскольку недифференцированные клетки могут дифференцироваться в Т-лимфоциты или В-лимфоциты.
НАБОР DR И CD3
Иммунофенотипические изменения, полученные с набором DR и CD3 (таблица 16) подтверждают данные, полученные с набором CD19 и CD3 (таблицы 14 и 15 и карты 2, 3 и 4), которые следовали за обработкой тех же образцов крови моноклональными антителами к гомологичному региону бета- или альфа-стороны антигена DR или моноклональным антителом к антигенам класса или моноклональным антителом к β-цепи антигена DR плюс циклофосфамид при анализе через 2 часа.
Иммунофенотипические изменения, полученные с набором DR и CD3 (таблица 16) подтверждают данные, полученные с набором CD19 и CD3 (таблицы 14 и 15 и карты 2, 3 и 4), которые следовали за обработкой тех же образцов крови моноклональными антителами к гомологичному региону бета- или альфа-стороны антигена DR или моноклональным антителом к антигенам класса или моноклональным антителом к β-цепи антигена DR плюс циклофосфамид при анализе через 2 часа.
На основании этих результатов, представляется, что моноклональное антитело к гомологичному региону β-цепи антигена DR обладает высокой способностью запускать выработку клеток, положительных по CD3, из клеток DR+.
Кроме того, обработки, такие как обработки, включающие вовлечение α-цепи антигенов DR или вовлечение β-стороны молекулы в комбинации с циклофосфамидом (длительное время инкубации) способствовало увеличению относительного количества клеток CD19+ или клеток DR+.
НАБОР CD56 & 16 И CD3
Обработка проб крови, особенно проб больных с В-CLL с высоким уровнем В-лимфоцитов, моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR увеличивала относительное количество клеток, положительных по CD56 & 16.
Обработка проб крови, особенно проб больных с В-CLL с высоким уровнем В-лимфоцитов, моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR увеличивала относительное количество клеток, положительных по CD56 & 16.
У этих пациентов относительное количество клеток CD3+ и CD56+ и CD16+ CD3- также возрастало после обработки образцов крови моноклональным антителом к β-цепи, подтверждая ранее имевшиеся наблюдения, отмеченные при такой же обработке, когда такие же образцы крови анализировали наборами CD3 и CD19 и DR и CD3.
НАБОР CD45 И CD14
Образцы крови, обработанные моноклональными антителами к β- или α-цепям антигена DR или к β-цепи плюс циклофосфамид или к антигенам класса I, анализировали также набором CD45 и CD14 (таблица 18). Определение низкого по CD45, высокого по CD45 и среднего по CD45 является произвольным. Обработка образца крови 5/6 (через 2 часа) моноклональными антителами к β-цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид, генерировала клетки, низкие по CD45+ и увеличивала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45+. Однако первая из указанных обработок увеличивала относительное количество клеток с высоким уровнем CD45+, а последняя из указанных обработок уменьшала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45+, и эти изменения, как представлялось, зависели от времени.
Образцы крови, обработанные моноклональными антителами к β- или α-цепям антигена DR или к β-цепи плюс циклофосфамид или к антигенам класса I, анализировали также набором CD45 и CD14 (таблица 18). Определение низкого по CD45, высокого по CD45 и среднего по CD45 является произвольным. Обработка образца крови 5/6 (через 2 часа) моноклональными антителами к β-цепи антигена DR или этим моноклональным антителом плюс циклофосфамид, генерировала клетки, низкие по CD45+ и увеличивала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45+. Однако первая из указанных обработок увеличивала относительное количество клеток с высоким уровнем CD45+, а последняя из указанных обработок уменьшала относительное количество клеток, со средним уровнем CD45+, и эти изменения, как представлялось, зависели от времени.
В образцах крови от пациента 5/6 и 10 (В-CLL) после обработки моноклональным антителом к антигенам класса I выявлено уменьшение относительного количества клеток, со средним уровнем CD45+ и аналогичные данные были отмечены в образцах крови 09 и HIV+ после такой же обработки при сравнении с необработанными пробами. Обработка образцов крови пациентов с HIV+ и IgA/D моноклональным антителом к антигену класса I увеличила относительное количество клеток с низким уровнем CD45+ при сравнении с необработанными образцами или образцами, моноклональным антителом к β-цепи антигена DR. Однако в образцах крови этих пациентов выявлено уменьшение относительного количества клеток со средним уровнем CD45+ после обработки моноклональным антителом к гомологичным регионам β-цепи антигена DR. Количество клеток со средним уровнем CD45+ в пробах крови пациента IgA/D после обработки моноклональным антителом к антигену класса I. Клетки, которые были крайне большими, насыщенными гранулами и экспрессировали интенсивные уровни антигена CD45, отмечались в образцах крови, обработанных моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR антигенов класса II МНС (см. карты 1, 2, 3, 4 и 5).
НАБОР CD8 И CD28
Антиген CD8 присутствует приблизительно на от 60 до 80% Т (CD3+)-лимфоцитах периферической крови, 50% Т-лимфоцитах CD8+ и 5% незрелых тимоцитах CD3-. Во время созревания тимоцитов экспрессия антигена CD28 возрастает от низкой плотности на большинстве тимоцитов CD4+ CD8+ до более высокой плотности на фактически всех зрелых тимоцитах CD3+, CD4+ или CD8+. Клеточная активация далее усиливает плотность антигена CD28. Экспрессия CD28 также делит лимфоциты CD8+ на две функциональные группы. Лимфоциты CD8+ CD28+ опосредуют аллоантиген - специфическую цитотоксичность, которая ограничена классом I главного комплекса гистосовместимости (МНС). Подавление клеточной пролиферации опосредуется субпопуляцией CD8+ CD28+. Антиген CD28 представляет молекулу клеточной адгезии и функционирует в качестве лиганда для антигена В7/ВВ-1, который присутствует на активированных В-лимфоцитах.
Антиген CD8 присутствует приблизительно на от 60 до 80% Т (CD3+)-лимфоцитах периферической крови, 50% Т-лимфоцитах CD8+ и 5% незрелых тимоцитах CD3-. Во время созревания тимоцитов экспрессия антигена CD28 возрастает от низкой плотности на большинстве тимоцитов CD4+ CD8+ до более высокой плотности на фактически всех зрелых тимоцитах CD3+, CD4+ или CD8+. Клеточная активация далее усиливает плотность антигена CD28. Экспрессия CD28 также делит лимфоциты CD8+ на две функциональные группы. Лимфоциты CD8+ CD28+ опосредуют аллоантиген - специфическую цитотоксичность, которая ограничена классом I главного комплекса гистосовместимости (МНС). Подавление клеточной пролиферации опосредуется субпопуляцией CD8+ CD28+. Антиген CD28 представляет молекулу клеточной адгезии и функционирует в качестве лиганда для антигена В7/ВВ-1, который присутствует на активированных В-лимфоцитах.
Обработка образцов крови пациентов (таблица 19, пациенты 5/6 и 8) с В-CLL моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена DR увеличивало относительное количество клеток CD8+, CD28+ и CD8+ CD28+, а все другие типы не увеличивали.
НАБОР CD34 И CD2
Антиген CD34 присутствует на незрелых гематопоэтических клетках-предшественниках и всех гематопоэтических колониеобразующих клетках в костном мозге, включая унипотентные (CFU-GM, BFU-Е) и плюрипотентные предшественники (CFU-GEMM, CFU-Mix CFU-бласт). CD34 также экспрессируется на стромальных клетках-предшественниках. В- и Т-лимфоидные предшественники с терминальной дезоксинуклеотидил трансферазой (TdT)+ в нормальной кости являются CD34-. Антиген CD34 присутствует на ранних миелоидных клетках, которые экспрессируют антиген CD33, но не имеют антигенов CD14 и CD15 и на ранних эритроидных клетках, которые экспрессируют антиген CD71 и слабо экспрессируют антиген CD45. Антиген CD34 также обнаруживается на капиллярных эндотелиальных клетках и приблизительно на 1% тимоцитов человека. Нормальные лимфоциты, моноциты, гранулоциты и тромбоциты периферической крови не экспрессируют антиген CD34. Плотность антигена CD34 является самой высокой на ранних гематопоэтических клетках-предшественниках и снижается по мере созревания клеток. Антиген отсутствует на полностью дифференцированных гематопоэтических клетках.
Антиген CD34 присутствует на незрелых гематопоэтических клетках-предшественниках и всех гематопоэтических колониеобразующих клетках в костном мозге, включая унипотентные (CFU-GM, BFU-Е) и плюрипотентные предшественники (CFU-GEMM, CFU-Mix CFU-бласт). CD34 также экспрессируется на стромальных клетках-предшественниках. В- и Т-лимфоидные предшественники с терминальной дезоксинуклеотидил трансферазой (TdT)+ в нормальной кости являются CD34-. Антиген CD34 присутствует на ранних миелоидных клетках, которые экспрессируют антиген CD33, но не имеют антигенов CD14 и CD15 и на ранних эритроидных клетках, которые экспрессируют антиген CD71 и слабо экспрессируют антиген CD45. Антиген CD34 также обнаруживается на капиллярных эндотелиальных клетках и приблизительно на 1% тимоцитов человека. Нормальные лимфоциты, моноциты, гранулоциты и тромбоциты периферической крови не экспрессируют антиген CD34. Плотность антигена CD34 является самой высокой на ранних гематопоэтических клетках-предшественниках и снижается по мере созревания клеток. Антиген отсутствует на полностью дифференцированных гематопоэтических клетках.
Некоммитированными клетками-предшественниками CD34+ являются CD34-, DR- и не имеют специфичных для линии антигенов, таких как CD71, CD33, CD10 и CD5, тогда как клетки CD34+, которые коммитированы с линией, в большой плотности экспрессируют антиген CD38.
Большинство клеток CD34+ реципрокно экспрессируют или антиген CD45RO, или антиген CD45RA. Приблизительно 60% клеток острого В-лимфоидного лейкоза и острого миелоидного лейкоза экспрессируют антиген CD34. Антиген не экспрессируется на клетках хронического лимфолейкоза (В- или Т-линии) или лимфом. Антиген CD2 присутствует на Т-лимфоцитах и субпопуляции лимфоцитов - естественных киллеров (NK).
Результаты показаны на картах 2, 3 и 5.
Анализ образцов крови пациента с В-CLL (таблица 20, пациент 5/6 через 2 часа) после обработки моноклональными антителами к β-цепи антигена DR или α-цепи того же антигена выявил выраженное увеличение относительного количества клеток CD34+ и CD34- CD2- после обработки первым из указанных антител. Поскольку те же образцы крови иммунотипировались упомянутыми выше наборами (см. таблицы от 14 до 19) по другим маркерам, наблюдаемое здесь увеличение относительного количества клеток CD34+ и CD34- CD2-, как представляется, совпадает с увеличением относительного количества одиночно положительных (SP) клеток CD4+ CD8+, CD8+ CD3+ и CD4+ CD3+. Кроме того, эти данные, которые, как представляется, исключительны для вовлечения β-цепи антигена HLA-DR, прямо подтверждают, что процесс запускает Т-лимфопоэз через регрессию В-лимфоцитов.
При анализе такой же обработки через 24 часа уровни клеток CD34+, как представлялось, снижались для обеспечения дальнейшего увеличения относительного количества Т-лимфоцитов. Процесс ретродифференциации, который первоначально обеспечивал Т-лимфопоэз, может быть отменен для обеспечения В-лимфопоэза. Первый из указанных феноменов наблюдался через 2 часа периода инкубации с моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR с циклофосфамидом, тогда как последний из указанных процессов был отмечен через 24 часа времени инкубации при той же обработке в той же пробе (карта 2).
Обработка проб крови пациента HIV+ (таблица 20, пациент HIV+) моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR значительно увеличивала относительное количество клеток CD34+ и CD2+ CD34+, и это же давала обработка того же образца крови моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR и моноклональным антителом к α-цепи того же антигена при совместном добавлении. Однако обработка этого образца крови моноклональным антителом к α-цепи антигена HLA-DR не влияла на уровень клеток CD34+. Обработка проб крови от 6-дневного младенца (ВВ/ST, таблица 20), который обследовался в то время для выявления лейкоза и у которого было очень большое количество атипичных клеток (бластов) в его крови моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR или моноклональным антителом к α-цепи того же антигена или обоими моноклональными антителами, добавляемыми вместе, приводила к следующим иммунофенотипическим изменениям.
При анализе необработанных проб крови относительное количество клеток CD34+ и DR+ заметно увеличивалось и далее увеличивалось при обработке моноклональным антителом к β-цепи относительное количество клеток CD34+, но было отмечено уменьшение после обработки моноклональным антителом к α-цепи антигена HLA-DR или обработки моноклональными антителами к α- и β-цепям молекулы при совместном добавлении. Однако последняя обработка увеличивала относительное количество клеток CD34+ CD2+ и противоположное происходило, когда тот же образец крови был обработан только моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR. При анализе обработанных и необработанных аликвотных количеств крови одного и того же пациента через 24 часа относительное количество клеток CD34+ уменьшилось при всех указанных выше способах обработки, за исключением того, что оно поддерживалось на гораздо более высоком уровне при обработке моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR. Последняя обработка продолжала уменьшать относительное количество клеток CD34+ CD2+ через 24 часа.
Эти результаты показывают, что вовлечение антигена HLA-DR через β-цепь способствует продукции большего количества клеток CD34+ из пула CD2+ CD34- или из более зрелых типов клеток, таких как В-лимфоциты пациентов с В-CLL, и эти результаты показывают, что этот тип обработки способствует ретродифференциации. Однако иммунофенотипирование проб крови через 24 часа свидетельствует о том, что эти типы клеток, как представляется, существуют в целом в другой линии, и в этом случае клетки, как представляется, существуют или скорее переходят в миелоидную линию, что наблюдалось при анализе пробы крови, обработанной набором CD7 и CD13 & 33.
Морфология изменяет иммунофенотипические характеристики В-лимфоцитов В-CLL и обогащенных фракций здоровых лиц (с использованием бусин CD19) после обработки моноклинальными антителами к гомологичным регионам β-цепи антигенов класса II МНС. Они сопровождались изменением морфологии В-лимфоцитов. Наблюдалось, что В-лимфоциты, колонизирующие стеклянные покровные стекла, в необработанных мазках крови замещались гранулоцитами, моноцитами, большими количествами примитивно выглядящих клеток и имеющих ядра эритроцитов. В обработанных и необработанных мазках крови не наблюдались митотические фигуры или значительная гибель клеток.
Результаты, представленные в таблице 20, также демонстрирует еще одну важную находку, состоящую в том, что в соответствии со способами настоящего изобретения, можно получить недифференцированную клетку с помощью ретродифференциации более зрелой недифференцированной клетки.
D. МИКРОФОТОГРАФИИ
В дополнение к испытанию антигена, как указано выше, способ настоящего изобретения контролировался визуально с помощью микроскопа.
В дополнение к испытанию антигена, как указано выше, способ настоящего изобретения контролировался визуально с помощью микроскопа.
В этом отношении, фиг. 1 представляет микрофотографию дифференцированных В-клеток перед использованием способа настоящего изобретения. Фиг. 2 представляет микрофотографию недифференцированных клеток, образованных с помощью ретродифференциации В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, в котором агентом было моноклональным антителом к гомологичным регионам β-цепи антигена HLA-DR. Недифференцированные клетки представляют темно-окрашенные группы клеток. Фиг. 3 представляет микрофотографию тех же недифференцированных клеток, но при меньшем увеличении.
Таким образом, фиг. от 1 до 3 иллюстрируют ретродифференциацию В-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения.
Фиг. 4 представляет микрофотографию дифференцированных В--клеток перед использованием способа настоящего изобретения.
Фиг. 5 представляет микрофотографию недифференцированных клеток, образованных с помощью ретродифференциации В-клеток в соответствии с настоящим изобретением, в котором использованным агентом было моноклональное антитело к гомологичным регионам β-цепи антигена HLA-DR. И в этом случае недифференцированные клетки представляют темно-окрашенные группы клеток.
Фиг. 6 представляет микрофотографию образования дифференцированных гранулоцитарных клеток из тех же недифференцированных клеток, что и на фиг. 5.
Таким образом, фиг. от 4 до 6 иллюстрируют ретродифференциацию В-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения с последующим превращением недифференцированных клеток в новые дифференцированные клетки, относящиеся к линии, отличной от исходных дифференцированных клеток.
Ретродифференциация Т-клеток в недифференцированные стволовые клетки с помощью способа настоящего изобретения с последующим превращением недифференцированных клеток в новые дифференцированные клетки, относящиеся к линии, отличной от исходных дифференцированных клеток, также прослеживалась с помощью микроскопии.
Е. РЕЗЮМЕ
Вкратце, примеры описывают эксперименты in vitro, которые выявляют крайне интересные находки относительно онтогенеза и развития Т- и В-лимфоцитов, которые могут быть использованы при образовании стволовых клеток для воздействия на лимфогематопэз в пробах периферической крови в течение нескольких часов.
Вкратце, примеры описывают эксперименты in vitro, которые выявляют крайне интересные находки относительно онтогенеза и развития Т- и В-лимфоцитов, которые могут быть использованы при образовании стволовых клеток для воздействия на лимфогематопэз в пробах периферической крови в течение нескольких часов.
Обработка образцов периферической крови, полученных у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-CLL) с высоким уровнем В-лимфоцитов моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигенов класса II вызвали выраженное увеличение относительного количества одиночных положительных (SP) Т-лимфоцитов и их предшественников, которые были дважды положительными по маркерам тимоцитов антигенам CD4 и CD8, и они совместно экспрессировались одновременно. Однако эти феномены всегда сопровождались значительным уменьшением относительного количества В-лимфоцитов. Эти наблюдения не отмечались, когда те же пробы крови обрабатывали моноклональными антителами к гомологичному региону α-цепи антигенов класса II или к гомологичному региону антигенов класса I.
Как оказалось, обработка цельной крови, полученной у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (CLL) моноклональным антителом к гомологичному региону В-цепи антигена HLA-DR вызвала развитие Т-лимфопоэза. Этот процесс был отмечен появлением дважды положительных клеток, совместно экспрессирующих маркеры CD4 и CD8, появлением клеток, экспрессирующих CD34, и одновременным увеличением количества одиночных положительных лимфоцитов CD4+ CD3+ и CD8+ CD3+. Кроме того, иммунофенотипические изменения, которые имели место при генерации таких клеток, были идентичны изменениям, отмеченным при развитии тимоцитов, особенно, при определении в динамике.
Процентное содержание дважды положительных клеток (DP), генерированных через 2 ч периода инкубации цельной крови с моноклональным антителом к гомологичным регионам β-цепи антигена DR, уменьшалось со временем, и эти процессы сопровождались увеличением процентного содержания одиночных положительных клеток CD4+ CD3+ и CD8+ CD3+ одновременно и на более поздних сроках также. α и β-цепи TCR были также экспрессированы на этих типах клеток.
Наблюдалось, что В-лимфоциты постоянно теряли маркеры, такие как CD19, CD21, CD23, IgM и DR, и это совпадало с появлением клеток CD34+ и CD34+ CD2+, увеличением количества клеток CD7+, увеличением количества клеток CD8+ CD28+ и CD28+, увеличением количества клеток CD25+, появлением клеток CD10+ и CD34+ и CD34+ и клеток CD19+, увеличением количества клеток CD5+ и клеток, экспрессирующих низкие уровни антигена CD45. Эти изменения были вследствие обработки крови моноклональным антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR.
Иммунофенотипические изменения, связанные с такой обработкой, согласуются с ретродифференциацией и последующим коммитированием (т. е. рекоммитированием) В-лимфоцитов, потому что большинство лейкоцитов в крови пациентов с В-CLL перед обработкой, были В-лимфоцитами. Кроме того, В-лимфоциты пациентов с В-CLL, превращение которых в Т-лимфоциты было индуцировано после обработки циклофосфамидом и моноклональным антителом к β-цепи антигена HLA-DR, были способны вернуться к В-лимфоцитам после длительной инкубации при этой обработке.
При анализе образцов, обработанных антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR с использованием наборов CD16 & 56 и CD3 и CD8 и CD3, относительное количество клеток, экспрессирующих эти маркеры, постоянно увеличивается с приростами, согласующимися с приростами, определенными с использованием наборов, таких как CD19 и CD3 и DR и CD3. Исследование надосадочной жидкости обработанных и необработанных образцов пациентов с инфекцией HIV с использованием нефелометрии и иммуноэлектрофореза, выявляет увеличенные уровни IgG, указывающие на то, что В-клетки должно быть прошли через стадию плазматических клеток. Увеличение относительного количества всех указанных выше клеток также сопровождалось появлением клеток среднего размера, насыщенных гранулами, экспрессирующих антигены CD56 & 16 в крайне больших количествах. Наблюдалось транзиторное появление других клеток, которые были очень крупными и насыщенные гранулами, и они были положительными по CD34 и дважды положительными по маркерам CD4 CD8. Наблюдались также другие транзиторные клетки, и они были крупными и зернистыми и положительными по рецепторам CD3 и CD19. CD25, который присутствовал на большинстве В-лимфоцитов, был утрачен и стал экспрессироваться вновь образованными Т-лимфоцитами, количество которых наблюдалось всегда.
Клетки CD28+ CD8+ и CD28+ появлялись после обработки цельной крови пациентов с В-CLL моноклональным антителом к гомологичному региону В-цепи антигена DR. Эти данные получены вследствие обработки крови антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR.
Т-лимфопоэз, генерированный таким образом, также наблюдался в периферической крови здоровых доноров крови, пуповинной крови, костном мозге, пациентов с различными инфекциями, включая лиц с HIV+ и пациентов со СПИДом, обогащенных фракциях В-лимфоцитов, полученных из проб крови здоровых доноров крови, пациентов с дефицитом lgА и других пациентов с различными другими состояниями. Кроме того, анализ миелоидных маркеров в обработанных образцах двух пациентов с В-CLL антителом к гомологичному региону β-цепи антигена HLA-DR, показал значительное увеличение относительного количества клеток, экспрессирующих миелоидные маркеры, такие как CD13 и CD33. Эти маркеры совместно экспрессировались с антигенами CD56 & 16 или CD7. Однако на отдельной популяции клеток наблюдалось относительное количество клеток CD7+ с маркерами Т-лимфоцитов и без миелоидных антигенов. Именно эти изменения не отмечались в необработанных образцах или в образцах, обработанных моноклональными антителами к антигенам класса I или к гомологичному региону α-цепи антигена HLA-DR (см. карты 2 и 3). Эти окончательные результаты свидетельствуют о том, что В-лимфоциты, однажды запущенные посредством β-цепи антигена HLA-DR способны не только к обратному развитию в клетки-предшественники Т-лимфоцитов, но также способны существовать в миелоидной и эритроидной линии.
Следует отметить, что стволовые клетки, которые произведены с помощью способа настоящего изобретения, могут быть стволовыми клетками любой ткани и не обязательно ограничены лимфогематопоэтическими клетками-предшественниками.
Другие модификации настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в этой области.
Claims (20)
1. Способ повышения относительного числа клеток CD34+ в клеточной популяции, включающей в себя коммитированные клетки, который включает в себя I) контактирование клеточной популяции с агентом, который оперативно взаимодействует с указанными коммитированными клетками, и II) инкубацию коммитированных клеток, которые взаимодействуют с указанным агентом, так что относительное число клеток CD34+ в результате этого взаимодействия возрастает.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются гемопоэтическими клетками.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент взаимодействует с рецептором, которым опосредованы захват, узнавание или представление антигена на поверхности коммитированных клеток.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный рецептор является антигеном класса I МНС или антигеном класса II МНС.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанным антигеном класса I МНС является ассоциированный с лейкоцитами человека (HLA)-A-рецептор, HLA-B-рецептор, HLA-C-рецептор, HLA-E-рецептор, HLA-F-рецептор или HLA-G-рецептор, а указанным антигеном класса II является HLA-DM-рецептор, HLA-DP-рецептор, HLA-DQ-рецептор или HLA-DR-рецептор.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рецептором является HLA-DR-рецептор.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что рецептор включает в себя β-цепь.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что β-цепь имеет гомологичные участки.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что рецептор включает в себя по меньшей мере гомологичный участок β-цепи HLA-DR.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что агентом является антитело к рецептору.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что агентом является моноклональное антитело к рецептору.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела CR3/43.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная инкубация длится от 2 до 24 ч.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются нераковыми клетками.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки являются дифференцированными клетками.
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коммитированные клетки выбираются из колониеобразующих Т-клеток (CFC-T-клетки), колониеобразующих В-клеток (CFC-B-клетки), эозинофильных колониеобразующих клеток (CFC-эозинофильные клетки), базофильных колониеобразующих клеток (CFC-базофильные клетки), колониеобразующих гранулоцитарных/моноцитарных клеток (CFC-GM-клетки), колониеобразующих мегакариоцитов (CFC-MEG-клетки), бурст-образующих эритроцитов (BFC-E-клетки), колониеобразующих эритроцитов (CFC-E-клетки), Т-клеток и В-клеток.
17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки CD34+ являются клетками, содержащими антигены класса I MHC (МНС-класс I+-клетки) и/или антигены класса II MHC (МНС-класс II+-клетки).
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что агент используется в сочетании с модификатором биологического ответа.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что модификатор биологического ответа представляет собой алкилирующий агент.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что алкилирующий агент представляет собой или включает в себя циклофосфамид.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9502022.8A GB9502022D0 (en) | 1995-02-02 | 1995-02-02 | A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells |
GB9502022.8 | 1995-02-02 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000130595/14A Division RU2215539C2 (ru) | 1995-02-02 | 1996-01-31 | Способ получения недифференцированной клетки |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97114802A RU97114802A (ru) | 1999-07-10 |
RU2177996C2 true RU2177996C2 (ru) | 2002-01-10 |
Family
ID=10768971
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97114802/14A RU2177996C2 (ru) | 1995-02-02 | 1996-01-31 | Способ получения недифференцированной клетки |
RU2000130595/14A RU2215539C2 (ru) | 1995-02-02 | 1996-01-31 | Способ получения недифференцированной клетки |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000130595/14A RU2215539C2 (ru) | 1995-02-02 | 1996-01-31 | Способ получения недифференцированной клетки |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6090625A (ru) |
EP (1) | EP0807166B1 (ru) |
JP (4) | JPH10513053A (ru) |
KR (1) | KR100630591B1 (ru) |
CN (1) | CN1289660C (ru) |
AP (1) | AP693A (ru) |
AT (1) | ATE396253T1 (ru) |
AU (1) | AU4545196A (ru) |
BR (1) | BR9606866A (ru) |
CA (1) | CA2211147C (ru) |
CY (1) | CY2206B1 (ru) |
DE (1) | DE69637534D1 (ru) |
DK (1) | DK0807166T3 (ru) |
ES (1) | ES2308774T3 (ru) |
GB (1) | GB9502022D0 (ru) |
HK (1) | HK1017710A1 (ru) |
IL (2) | IL139244A (ru) |
NZ (1) | NZ300650A (ru) |
PT (1) | PT807166E (ru) |
RU (2) | RU2177996C2 (ru) |
SI (1) | SI0807166T1 (ru) |
WO (1) | WO1996023870A1 (ru) |
ZA (1) | ZA96727B (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7842502B2 (en) | 2003-08-12 | 2010-11-30 | Tigenix N.V. | Use of CXCL6 chemokine for inducing precursor cells into chondrocytes |
RU2497947C1 (ru) * | 2012-08-15 | 2013-11-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства зравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России) | Способ модификации моноцитов периферической крови для повышения их паракринной активности при аутологической трансплантации |
RU2603094C2 (ru) * | 2009-09-15 | 2016-11-20 | Зэ Юниверсити оф Токио | Новый способ получения дифференцированных клеток |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9502022D0 (en) * | 1995-02-02 | 1995-03-22 | Abuljadayel Ilham M S | A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells |
US9068164B1 (en) | 1995-02-02 | 2015-06-30 | Tristem Trading (Cyprus) Limited | Method of preparing an undifferentiated cell |
ATE514772T1 (de) * | 1999-08-05 | 2011-07-15 | Abt Holding Co | Multipotente erwachsene stammzellen und verfahren zu deren isolierung |
US7015037B1 (en) | 1999-08-05 | 2006-03-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Multiponent adult stem cells and methods for isolation |
US7927587B2 (en) * | 1999-08-05 | 2011-04-19 | Regents Of The University Of Minnesota | MAPC administration for the treatment of lysosomal storage disorders |
US8252280B1 (en) | 1999-08-05 | 2012-08-28 | Regents Of The University Of Minnesota | MAPC generation of muscle |
US8609412B2 (en) | 1999-08-05 | 2013-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mapc generation of lung tissue |
US8075881B2 (en) * | 1999-08-05 | 2011-12-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Use of multipotent adult stem cells in treatment of myocardial infarction and congestive heart failure |
US10638734B2 (en) | 2004-01-05 | 2020-05-05 | Abt Holding Company | Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof |
CN101386839A (zh) * | 2000-05-10 | 2009-03-18 | 特里施泰姆贸易(塞浦路斯)有限公司 | 一种设备 |
NL1017973C2 (nl) * | 2000-05-10 | 2002-11-08 | Tristem Trading Cyprus Ltd | Inrichting. |
EP1491093B1 (en) * | 2001-02-14 | 2013-07-31 | ABT Holding Company | Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof |
DE10144326B4 (de) * | 2001-09-10 | 2005-09-22 | Siemens Ag | Verfahren und System zur Überwachung eines Reifenluftdrucks |
TWI288779B (en) * | 2002-03-28 | 2007-10-21 | Blasticon Biotech Forschung | Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use |
DE10231655A1 (de) * | 2002-07-12 | 2004-02-26 | Blasticon Biotechnologische Forschung Gmbh | Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung |
US20060228798A1 (en) | 2002-11-27 | 2006-10-12 | Catherine Verfaillie | Homologous recombination in multipotent adult progenitor cells |
PL379549A1 (pl) * | 2003-07-11 | 2006-10-16 | Blasticon Biotechnologische Forschung Gmbh | Autologiczne, indukujące tolerancję na antygeny własne komórki pochodzenia monocytarnego oraz ich zastosowanie w preparatach farmaceutycznych |
JP2007513188A (ja) | 2003-12-04 | 2007-05-24 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | リソソーム蓄積症の処置のための組成物および方法 |
WO2006047743A2 (en) * | 2004-10-26 | 2006-05-04 | Regents Of The University Of Minnesota | Swine multipotent adult progenitor cells |
EP2428563A1 (en) * | 2005-02-10 | 2012-03-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Vascular/lymphatic endothelial cells |
US20080311084A1 (en) * | 2005-05-05 | 2008-12-18 | Verfaillie Catherine M | Mapc Engraftment in the Hematopoietic System |
AU2005331559B2 (en) * | 2005-05-05 | 2012-04-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Use of NK cell inhibition to facilitate persistence of engrafted MHC-I negative cells |
WO2007117262A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-10-18 | Athersys, Inc. | Culture of non-embryonic cells at high cell density |
SG169324A1 (en) | 2005-10-14 | 2011-03-30 | Univ Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
US9005964B2 (en) | 2006-11-24 | 2015-04-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Endodermal progenitor cells |
CA2712496C (en) * | 2008-01-18 | 2021-01-12 | Wei-Shou Hu | Stem cell aggregates and methods for making and using |
EP2362899A1 (en) | 2008-10-31 | 2011-09-07 | Katholieke Universiteit Leuven | Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte and hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods for using the cells |
AU2010254811B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-02-19 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Reprogramming T cells and hematopoietic cells |
DK2456853T3 (da) * | 2009-07-21 | 2021-02-01 | Abt Holding Co | Anvendelse af stamceller til reduktion af leukocyt-ekstravasation |
CA2768573C (en) * | 2009-07-21 | 2020-09-15 | Abt Holding Company | A method for constructing a cell bank and a method for drug discovery |
AU2009354350B2 (en) * | 2009-10-19 | 2015-09-03 | Tristem Trading (Cyprus) Limited | Treatment using reprogrammed mature adult cells |
WO2011106476A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Abt Holding Company | Modulation of microglia activation |
US20110206647A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Abt Holding Company | Modulation of Angiogenesis |
US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
SG10201503700WA (en) | 2010-05-12 | 2015-06-29 | Abt Holding Co | Modulation of splenocytes in cell therapy |
WO2011158125A2 (en) | 2010-06-17 | 2011-12-22 | Katholieke Universiteit Leuven | Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells and hepatic sinusoidal endothelial cells, cells produced by the methods, and methods for using the cells |
AU2011293440B2 (en) | 2010-08-24 | 2016-05-05 | Katholieke Universiteit Leuven | Non-static suspension culture of cell aggregates |
CN112048466A (zh) * | 2012-04-24 | 2020-12-08 | 细胞疗法有限责任公司 | 从头生成多能细胞 |
PL2983680T3 (pl) | 2013-04-12 | 2021-03-08 | Houston Methodist Hospital | Ulepszanie narządów do przeszczepu |
US10967006B2 (en) | 2016-01-21 | 2021-04-06 | Abt Holding Company | Stem cells for wound healing |
JP2017008049A (ja) * | 2016-07-04 | 2017-01-12 | トライステム・トレイディング・(キプロス)・リミテッドTriStem Trading (Cyprus) Limited | 再プログラム化成熟成体細胞を用いる治療 |
US20220125852A1 (en) * | 2020-10-27 | 2022-04-28 | Therapeutic Solutions International, Inc. | Protection and regeneration of neurological function by using stem cells |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5004681B1 (en) * | 1987-11-12 | 2000-04-11 | Biocyte Corp | Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood |
US5061620A (en) * | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
US6194376B1 (en) * | 1991-03-11 | 2001-02-27 | Creative Biomolecules, Inc. | Method for modulating inflammatory response comprising administering morphogen |
US5199942A (en) * | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
AU673987C (en) * | 1991-11-22 | 2005-02-17 | General Hospital Corporation, The | Specific tolerance in transplantation |
WO1993025216A1 (en) * | 1992-06-08 | 1993-12-23 | Becton, Dickinson And Company | Human primitive stem cells |
DE4240635C2 (de) * | 1992-12-03 | 1997-07-10 | Lothar Prof Dr Kanz | Vermehrung hämatopoetischer Vorläuferzellen ex vivo sowieZusammensetzungen hämatopoetischer Wachstumsfaktoren |
US5654186A (en) * | 1993-02-26 | 1997-08-05 | The Picower Institute For Medical Research | Blood-borne mesenchymal cells |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
GB9502022D0 (en) * | 1995-02-02 | 1995-03-22 | Abuljadayel Ilham M S | A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells |
US5877299A (en) * | 1995-06-16 | 1999-03-02 | Stemcell Technologies Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
US5843633A (en) * | 1996-04-26 | 1998-12-01 | Amcell Corporation | Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen |
US6227202B1 (en) * | 1996-09-03 | 2001-05-08 | Maulana Azad Medical College | Method of organogenesis and tissue regeneration/repair using surgical techniques |
US6468794B1 (en) * | 1999-02-12 | 2002-10-22 | Stemcells, Inc. | Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
TWI288779B (en) * | 2002-03-28 | 2007-10-21 | Blasticon Biotech Forschung | Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use |
-
1995
- 1995-02-02 GB GBGB9502022.8A patent/GB9502022D0/en active Pending
-
1996
- 1996-01-31 RU RU97114802/14A patent/RU2177996C2/ru active
- 1996-01-31 AP APAP/P/1997/001031A patent/AP693A/en active
- 1996-01-31 DK DK96901432T patent/DK0807166T3/da active
- 1996-01-31 IL IL139244A patent/IL139244A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 AT AT96901432T patent/ATE396253T1/de active
- 1996-01-31 US US08/594,164 patent/US6090625A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-31 PT PT96901432T patent/PT807166E/pt unknown
- 1996-01-31 IL IL11699496A patent/IL116994A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 AU AU45451/96A patent/AU4545196A/en not_active Abandoned
- 1996-01-31 DE DE69637534T patent/DE69637534D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-31 ES ES96901432T patent/ES2308774T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-31 CA CA2211147A patent/CA2211147C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-31 NZ NZ300650A patent/NZ300650A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 RU RU2000130595/14A patent/RU2215539C2/ru active IP Right Revival
- 1996-01-31 BR BR9606866A patent/BR9606866A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-31 SI SI9630761T patent/SI0807166T1/sl unknown
- 1996-01-31 KR KR1019970705346A patent/KR100630591B1/ko active IP Right Grant
- 1996-01-31 JP JP8523345A patent/JPH10513053A/ja active Pending
- 1996-01-31 EP EP96901432A patent/EP0807166B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-31 ZA ZA96727A patent/ZA96727B/xx unknown
- 1996-01-31 WO PCT/GB1996/000208 patent/WO1996023870A1/en active IP Right Grant
- 1996-01-31 CN CNB961930217A patent/CN1289660C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-10-13 HK HK98111223A patent/HK1017710A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-09 US US09/521,700 patent/US20020076812A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-21 CY CY0000061A patent/CY2206B1/xx unknown
-
2007
- 2007-07-12 JP JP2007183193A patent/JP2007259868A/ja active Pending
-
2008
- 2008-12-25 JP JP2008330347A patent/JP2009148266A/ja active Pending
-
2011
- 2011-02-23 US US13/033,093 patent/US20110143431A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-05 JP JP2011220926A patent/JP2012040011A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ХАРЧЕНКО Е.П., ДИТЯТЕВ А.Э. Предсказание пептидных антигенных структур, узнаваемых основным комплексом гистосовместимости". - Доклады Академии наук СССР, 1991. т. 318, № 4, 1007-1013. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7842502B2 (en) | 2003-08-12 | 2010-11-30 | Tigenix N.V. | Use of CXCL6 chemokine for inducing precursor cells into chondrocytes |
RU2603094C2 (ru) * | 2009-09-15 | 2016-11-20 | Зэ Юниверсити оф Токио | Новый способ получения дифференцированных клеток |
RU2497947C1 (ru) * | 2012-08-15 | 2013-11-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства зравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России) | Способ модификации моноцитов периферической крови для повышения их паракринной активности при аутологической трансплантации |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2177996C2 (ru) | Способ получения недифференцированной клетки | |
Watson et al. | Effect of IL-7 on the growth of fetal thymocytes in culture. | |
Phillips et al. | Natural killer cells activated in a human mixed lymphocyte response culture identified by expression of Leu-11 and class II histocompatibility antigens. | |
EP1366144A2 (en) | A device for preparing cells | |
Brod et al. | Lymphokine regulation of CD45R expression on human T cell clones. | |
US7220412B2 (en) | Method of preparing an undifferentiated cell | |
US7112440B2 (en) | Method of increasing the relative number of CD45 low cells in a cell population | |
JP2007105037A (ja) | キメリズムを利用した幹細胞移植のための検査 | |
Baumgartner et al. | Expression of the VEP13 antigen (CD16) on native human alveolar macrophages and cultured blood monocytes | |
AU751866B2 (en) | A method of preparing an undifferentiated cell | |
GB2297558A (en) | Conversion of a more committed cell into an undifferentiated cell | |
AU751928B2 (en) | A method of preparing an undifferentiated cell | |
IL133155A (en) | Method for producing a medicament comprising retrodifferentiated cells | |
KR20230019157A (ko) | 유도 조절 t 세포, 이의 제조 방법, 및 용도 | |
CA2395452A1 (en) | A method of preparing an undifferentiated cell | |
MXPA97005919A (en) | A method for preparing an indiferencial cell | |
Dussault | Natural killer (NK) cells in normal and leukemic infant, young adult and aged mice: effects of interleukin-2 and indomethacin | |
AU2005201200A1 (en) | A Method of Preparing an Undifferentiated Cell | |
Assensi et al. | In vivo influence of the anti-B220 monoclonal antibody administration on the T cell differentiation in mice | |
Harding | Lectin Binding to Normal and Malignant Haemopoietic Cells | |
Miura et al. | Host Response to Myeloma: Effect of Syngeneic Spleen Cells on the Growth and Functionof MOPC 104E Myeloma in Vitro |