RU2177325C1 - Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity - Google Patents
Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2177325C1 RU2177325C1 RU2000123980A RU2000123980A RU2177325C1 RU 2177325 C1 RU2177325 C1 RU 2177325C1 RU 2000123980 A RU2000123980 A RU 2000123980A RU 2000123980 A RU2000123980 A RU 2000123980A RU 2177325 C1 RU2177325 C1 RU 2177325C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substance
- acetic acid
- immunostimulating activity
- activity
- extraction
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и касается получения вещества из бурсы Фабрициуса птиц, обладающего иммуностимулирущей активностью. The invention relates to medicine and the medical industry, and relates to the production of a substance from the bursa of Fabrizius birds with immunostimulating activity.
Известны различные способы получения иммуностимуляторов, которые можно рассматривать в качестве аналогов предлагаемого способа. К ним, в первую очередь, можно отнести способы получения иммуностимулирующих веществ из центральных органов иммунитета: костного мозга (АС СССР N 1077089, 1994; АС СССР N 1836954, 1993; AC СССР N 1822784, 1993; АС СССР N 1005790, 1982; патент РФ N 2041716, 1995; патент РФ N 2120799, 1998) и тимуса (АС СССР N 975017, 1982; AC СССР N 1255136, 1986; АС СССР N 1443237, 1985; патент СССР N 1442064, 1988; АС РФ N 1112606, 1996; АС РФ N 1506668, 1996), а также из селезенки (АС СССР N 1158201, 1985; патент РФ N 2033796, 1995). Но наиболее близкими к предлагаемому решению являются способы получения иммуностимулирующих веществ из бурсы Фабрициуса - центрального органа гуморального иммунитета птиц, аналог которого у млекопитающих отсутствует. There are various methods of obtaining immunostimulants, which can be considered as analogues of the proposed method. These include, first of all, methods of obtaining immunostimulating substances from the central organs of immunity: bone marrow (USSR AS N 1077089, 1994; USSR AS N 1836954, 1993; USSR AC 1822784, 1993; USSR AS 1005790, 1982; patent RF N 2041716, 1995; RF patent N 2120799, 1998) and thymus (AC USSR N 975017, 1982; AC USSR N 1255136, 1986; USSR AC N 1443237, 1985; USSR patent N 1442064, 1988; AC RF N 1112606, 1996 ; AS of the Russian Federation N 1506668, 1996), as well as from the spleen (AS of the USSR N 1158201, 1985; RF patent N 2033796, 1995). But the closest to the proposed solution are methods for producing immunostimulating substances from the bursa of Fabricius, the central organ of humoral immunity of birds, an analogue of which is absent in mammals.
Известен способ получения пептидного экстракта из бурсы, названного "бурсопоэтином" [1]. Способ включает забор бурсы Фабрициуса у цыплят в возрасте 8-10 недель, замораживание сырья, гомогенизацию в гомогенизаторе в среде RPMI-1630 с добавлением 15 мМ HEPES, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 14-18 ед/мл ДНК, 5 ед/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина с последующим центрифугированием. Супернатант собирают и для хранения замораживают при -70oC. Получаемое вещество обладает способностью стимулировать В-лимфоциты и их предшественники, и в значительно меньшей степени влиять на Т-клетки. Однако такой ограниченный спектр иммуностимулирующей активности не позволяет широко применять данное вещество в качестве иммуностимулятора. Кроме того, целевой продукт нестабилен при хранении, что делает трудным стандартизацию препарата.A known method of producing a peptide extract from bursa, called "bursopoietin" [1]. The method includes taking bursa of Fabricius in chickens aged 8-10 weeks, freezing raw materials, homogenizing in a homogenizer in RPMI-1630 medium with the addition of 15 mM HEPES, 5% fetal calf serum, 14-18 u / ml DNA, 5 u / ml heparin , 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, followed by centrifugation. The supernatant is collected and frozen for storage at -70 o C. The resulting substance has the ability to stimulate B lymphocytes and their precursors, and to a much lesser extent affect T cells. However, such a limited spectrum of immunostimulating activity does not allow the wide use of this substance as an immunostimulant. In addition, the target product is unstable during storage, which makes it difficult to standardize the drug.
Известен также способ получения вещества, стимулирующего иммунитет, путем экстракции физиологическим раствором из ткани сумки Фабрициуса [2]. Необходимо отметить, что конечный продукт указанного способа также представляет собой грубый, неочищенный экстракт, что придает ему дополнительные аллергогенные и токсические свойства и требует высокой концентрации вещества для проявления иммуностимулирующей активности. There is also a method of obtaining substances that stimulate the immune system, by extraction with saline from the tissue of the bag of Fabricius [2]. It should be noted that the final product of this method is also a crude, crude extract, which gives it additional allergenic and toxic properties and requires a high concentration of the substance for the manifestation of immunostimulating activity.
Известен способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью, из ткани сумки Фабрициуса птиц [3], который по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и выбран в качестве прототипа. A known method of obtaining a substance with immunostimulating activity from the fabric of a bag of Fabricius birds [3], which by technical essence and the achieved effect is the closest to the proposed solution and is selected as a prototype.
Согласно известному способу сумки Фабрициуса птиц замораживают при -40oC, гомогенизируют и загружают в реактор с охлаждением и мешалкой в 3%-ный раствор уксусной кислоты (1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты) и добавляют хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты (pH 3,5-4,0). Экстракцию проводят в течение 48-72 ч при 4-10oC. Экстракт отфильтровывают, центрифугируют (5000 об/мин в течение 20 мин) и приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта к 5 частям ацетона). Формирование осадка продолжается 24 ч при (-5)-(-8)oC. Осадок отфильтровывают под вакуумом и отмывают чистым ацетоном. Раствор препарата стерилизуют фильтрацией, разливают в стерильные флаконы и лиофилизируют. Полученное вещество обладает иммуностимулирующей активностью - нормализует иммунный статус у бурсэктомированных и тимэктомированных животных, усиливает экспрессию lg-рецепторов на В-лимфоцитах, увеличивает количество Еа-РОК в культуре лимфоцитов.According to the known method, Fabricius bags of birds are frozen at -40 ° C, homogenized and loaded into a reactor with cooling and stirrer in a 3% solution of acetic acid (1 part of the feed to 5 parts of acetic acid solution) and zinc chloride is added at a rate of 1 g per 1 l of 3% acetic acid (pH 3.5-4.0). The extraction is carried out for 48-72 hours at 4-10 o C. The extract is filtered off, centrifuged (5000 rpm for 20 minutes) and poured into chilled acetone in a ratio of 1: 5 (1 part of the extract to 5 parts of acetone). The formation of a precipitate lasts 24 hours at (-5) - (- 8) o C. The precipitate is filtered off under suction and washed with pure acetone. The drug solution is sterilized by filtration, poured into sterile vials and lyophilized. The obtained substance has immunostimulating activity - it normalizes the immune status in bursectomized and thimectomized animals, enhances the expression of lg receptors on B lymphocytes, and increases the number of Ea-ROCK in the lymphocyte culture.
Однако данный способ позволяет получить вещество, обладающее низкой иммуностимулирующей активностью. Так, вещество, полученное по способу-прототипу, проявляет свою активность лишь в концентрации 100 мкг/мл in vitro и 1 мг/кг веса тела in vivo. Кроме того, молекулярная масса данного вещества колеблется от 2000 до 12000 Д, что указывает на присутствие большого количества примесных соединений, не обладающих специфической активностью. Присутствие значительного количества балластных неактивных компонентов и обуславливает необходимость столь высокой дозировки, а также наличие побочных эффектов препарата. However, this method allows to obtain a substance with low immunostimulating activity. So, the substance obtained by the prototype method, shows its activity only at a concentration of 100 μg / ml in vitro and 1 mg / kg of body weight in vivo. In addition, the molecular weight of this substance varies from 2000 to 12000 D, which indicates the presence of a large number of impurity compounds that do not have specific activity. The presence of a significant amount of ballast inactive components and necessitates such a high dosage, as well as the presence of side effects of the drug.
Заявляемое изобретение направлено на повышение иммуностимулирующей активности вещества. Решение поставленной задачи достигается тем, что сырье замораживают трехкратно при -40oC, чередуя заморозку с оттаиванием, экстракцию проводят 1 н. раствором уксусной кислоты с добавлением ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфторида 0,1 мМ в течение 30-60 минут, а целевой продукт подвергают гель-фильтрации на Tyoperal HW-40 и отбирают фракции с молекулярной массой от 300 до 3000 Д.The claimed invention is directed to increasing the immunostimulating activity of a substance. The solution to this problem is achieved by the fact that the raw materials are frozen three times at -40 o C, alternating between freezing and thawing, the extraction is carried out 1 N. acetic acid solution with the addition of 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride protease inhibitor for 30-60 minutes, and the target product is subjected to gel filtration on Tyoperal HW-40 and fractions with a molecular weight of 300 to 3000 D are selected.
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Используемые в качестве сырья сумки Фабрициуса птиц получают на птицефабрике при разделке цыплят-бройлеров, причем забор сырья вписывается в технологическую цепочку забоя. Полученное сырье подвергают трехкратному замораживанию при температуре -40oC, чередующимся с оттаиванием. Затем сырье гомогенизируют в гомогенизаторе. Гомогенат заливают 1 н. раствором уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 (1 часть сырья и 5 частей раствора), добавляют фенилметилсульфонилфторид в концентрации 0,1 мМ. Экстракцию проводят на холоду при температуре +4 - +8oC в течение 30-60 минут при постоянном перемешивании. Экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. К фильтрату добавляют охлажденный ацетон в соотношении 1: 5 (1 часть супернатанта и 5 частей ацетона). Формирование осадка продолжается в течение 24 часов при температуре (-5)-(-8)oC. Осадок фильтруют под вакуумом, отмывают чистым ацетоном и высушивают на воронке Бюхнера. Порошок растворяют в 0,1 н. уксусной кислоте и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант подвергают гель-фильтрации на Tyoperal HW-40 и отбирают фракции с молекулярной массой от 300 до 3000 Д. Собранные фракции объединяют, разливают в стерильные флаконы и лиофилизируют. Полученное вещество обладает высокой иммуностимулирующей активностью.Bags of the Fabricius birds used as raw materials are obtained at the poultry farm when cutting broiler chickens, and the intake of raw materials fits into the technological chain of the slaughter. The resulting raw material is subjected to three freezing at a temperature of -40 o C, alternating with thawing. The feed is then homogenized in a homogenizer. The homogenate is poured 1 N. a solution of acetic acid in a volume ratio of 1: 5 (1 part of the feed and 5 parts of the solution), add phenylmethyl sulfonyl fluoride at a concentration of 0.1 mm. The extraction is carried out in the cold at a temperature of +4 - +8 o C for 30-60 minutes with constant stirring. The extract is filtered through calico, centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. Chilled acetone was added to the filtrate in a ratio of 1: 5 (1 part supernatant and 5 parts acetone). The formation of a precipitate continues for 24 hours at a temperature of (-5) - (- 8) o C. The precipitate is filtered under vacuum, washed with pure acetone and dried on a Buchner funnel. The powder is dissolved in 0.1 N. acetic acid and centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes. The supernatant is subjected to gel filtration on a Tyoperal HW-40 and fractions with a molecular weight of 300 to 3000 D are collected. The collected fractions are combined, poured into sterile vials and lyophilized. The resulting substance has a high immunostimulating activity.
Способ иллюстрируется следующими примерами. The method is illustrated by the following examples.
ПРИМЕР 1. Берут 100 г свежезамороженных сумок Фабрициуса птиц, гомогенизирут в гомогенизаторе с добавлением 1 н. раствора уксусной кислоты. Далее гомогенат заливают 5 объемами 1 н. раствора уксусной кислоты и добавляют фенилметилсульфонилфторид 0,1 мМ. Экстракцию проводят в течение 30 минут при температуре +4oC при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляют охлажденный до -6oC ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта и 5 частей ацетона), осадок формируют в течение 24 часов при температуре -6oC. Полученный осадок отфильтровывают под вакуумом, тщательно промывают чистым ацетоном и высушивают. Порошок растворяют в 10 объемах 0,1 н. уксусной кислоты, перемешивая в течение 30 минут. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин при +4oC в течение 20 минут. Супернатант наносят на колонку с Tyoperal HW-40. Гель-фильтрацию проводят при +4oC, используя в качестве элюента 0,1 н. раствор уксусной кислоты, отбирают фракции с молекулярной массой от 300 до 3000 Д. Собранные фракции объединяют, разливают во флаконы по 3 мл и лиофильно высушивают. Полученное вещество обладает широким спектром иммуностимулирующей активности, так, например, in vitro в концентрации 10 мкг/мл увеличивает количество CD3+ клеток с 37,9 ±1,5 до 71,1±1,7%, a CD22+ клеток с 5,4±0,4 до 9,1±0,6%.EXAMPLE 1. Take 100 g of freshly frozen bags of bird fabric, homogenize in a homogenizer with the addition of 1 N. acetic acid solution. Next, the homogenate is poured in 5 volumes of 1 N. acetic acid solution and 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride is added. The extraction is carried out for 30 minutes at a temperature of +4 o C with constant stirring. Then the extract is filtered through calico, centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. Cooled to -6 ° C acetone was added to the obtained extract in a ratio of 1: 5 (1 part of extract and 5 parts of acetone), a precipitate was formed for 24 hours at a temperature of -6 o C. The resulting precipitate was filtered off with suction, washed thoroughly with pure acetone and are dried. The powder is dissolved in 10 volumes of 0.1 N. acetic acid, stirring for 30 minutes. Insoluble precipitate was separated by centrifugation at 8000 rpm at +4 o C for 20 minutes. The supernatant is applied to a Tyoperal HW-40 column. Gel filtration is carried out at + 4 o C, using as an eluent of 0.1 N. acetic acid solution, fractions with a molecular weight of 300 to 3000 D were selected. The collected fractions were combined, poured into 3 ml vials and freeze-dried. The resulting substance has a wide spectrum of immunostimulating activity, for example, in vitro at a concentration of 10 μg / ml increases the number of CD3 + cells from 37.9 ± 1.5 to 71.1 ± 1.7%, and CD22 + cells from 5, 4 ± 0.4 to 9.1 ± 0.6%.
ПРИМЕР 2. 300 г сумок Фабрициуса птиц подвергают трехкратной заморозке при 40oC, затем измельчают в гомогенизаторе с добавлением 1 н. раствора уксусной кислоты. Гомогенат заливают 5 объемами 1 н. уксусной кислоты с добавлением фенилметилсульфонилфторида 0,1 мМ. Экстракцию проводят в течение 60 минут при температуре +6oC при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляют охлажденный до -8oC ацетон в соотношении 1:6 (1 часть экстракта и 6 частей ацетона), осадок формируют в течение 24 часов при температуре -8oC. Полученный осадок отфильтровывают под вакуумом, тщательно промывают трехкратным объемом чистого ацетона и высушивают. Порошок растворяют в 10 объемах 0,1 н. уксусной кислоты при перемешивании в течение 1 часа и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант подвергают гель-фильтрации на Tyoperal HW-40 на холоду, элюцию проводят 0,1 н. уксусной кислоты, собирают фракции с молекулярной массой от 300 до 3000 Д. Собранные фракции объединяют, разливают во флаконы по 3 мл и лиофилизируют. Полученное вещество обладает высокой иммуностимулирующей активностью, в частности у эмбрионально бурсэктомированных цыплят в дозе 100 мкг/кг массы тела увеличивает титр гемагглютининов и гемолизинов с 2,1±0,4 до 5,9±0,5 и с 1,3±0,2 до 4,0±0,4 log2 соответственно, а количество АОК в селезенке с 10,5±1,3 до 22,5±1,5•103.EXAMPLE 2. 300 g of bags of Fabricius birds are subjected to three times freezing at 40 o C, then crushed in a homogenizer with the addition of 1 N. acetic acid solution. The homogenate is poured in 5 volumes of 1 N. acetic acid with the addition of phenylmethylsulfonyl fluoride 0.1 mm. The extraction is carried out for 60 minutes at a temperature of +6 o C with constant stirring. Then the extract is filtered through calico, centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. To the obtained extract was added acetone cooled to -8 ° C in a ratio of 1: 6 (1 part of the extract and 6 parts of acetone), a precipitate was formed for 24 hours at a temperature of -8 o C. The resulting precipitate was filtered off with suction, washed thoroughly with a three-fold volume of pure acetone and dried. The powder is dissolved in 10 volumes of 0.1 N. acetic acid with stirring for 1 hour and centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes. The supernatant is subjected to gel filtration on Tyoperal HW-40 in the cold, elution is carried out with 0.1 N. acetic acid, fractions with a molecular weight of 300 to 3000 D are collected. The collected fractions are combined, poured into 3 ml vials and lyophilized. The resulting substance has a high immunostimulating activity, in particular in embryo bursectomized chickens at a dose of 100 μg / kg body weight, it increases the titer of hemagglutinins and hemolysins from 2.1 ± 0.4 to 5.9 ± 0.5, and from 1.3 ± 0, 2 to 4.0 ± 0.4 log 2, respectively, and the amount of AOK in the spleen from 10.5 ± 1.3 to 22.5 ± 1.5 • 10 3 .
Полученное вещество представляет собой комплекс пептидов с молекулярной массой 300 - 3000 Д. Пептидная природа вещества, полученного по предлагаемому способу, подтверждается следующими данными:
1) Дает цветную реакцию с биуретовым реактивом;
2) Молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии, составляет от 300 до 3000 Д;
3) При аминокислотном анализе щелочного гидролизата вещества определяется 17 аминокислот в определенном соотношении (Glu - 13,86; Pro - 13,26; Gly - 8,52; Asp - 8,01; Lys - 7,41; Ala - 6,81; Arg - 6,64; Leu - 5,87; Thr - 5,66; Ser - 5,03; Val - 4,40; Ile - 3,63; His - 3,10; Phe - 2,90; Met - 2,14; Tyr - 2,14; Cys - 0,62);
4) Основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеблется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически).The resulting substance is a complex of peptides with a molecular weight of 300 - 3000 D. The peptide nature of the substance obtained by the proposed method is confirmed by the following data:
1) Gives a color reaction with a biuret reagent;
2) The molecular weight of the components, determined using gel chromatography, is from 300 to 3000 D;
3) In the amino acid analysis of an alkaline hydrolyzate of a substance, 17 amino acids are determined in a certain ratio (Glu - 13.86; Pro - 13.26; Gly - 8.52; Asp - 8.01; Lys - 7.41; Ala - 6.81 ; Arg - 6.64; Leu - 5.87; Thr - 5.66; Ser - 5.03; Val - 4.40; Ile - 3.63; His - 3.10; Phe - 2.90; Met - 2.14; Tyr - 2.14; Cys - 0.62);
4) The main absorption spectrum (peak) in ultraviolet light ranges from 220-230 nm (spectrophotometrically).
Вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного вещества. The above allows you to accurately identify the resulting substance.
При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки:
1) Оба способа предназначены для получения вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью;
2) В качестве исходного сырья используют сумки Фабрициуса птиц;
3) Сырье предварительно замораживают и гомогенизируют;
4) Гомогенат подвергают экстракции уксусной кислотой;
5) Экстракт фильтруют и центрифугируют;
6) Осаждение целевого продукта производят охлажденным ацетоном в течение 24 часов при (-5)-(-8)oC;
7) Осадок отфильтровывают под вакуумом;
8) Полученное вещество лиофильно высушивают.A comparative analysis of the proposed method and the prototype method revealed the following similar signs:
1) Both methods are intended to produce a substance having immunostimulating activity;
2) Bags of Fabricius birds are used as feedstock;
3) Raw materials are pre-frozen and homogenized;
4) The homogenate is subjected to extraction with acetic acid;
5) The extract is filtered and centrifuged;
6) Precipitation of the target product is carried out with chilled acetone for 24 hours at (-5) - (- 8) o C;
7) The precipitate is filtered off under vacuum;
8) The resulting substance is freeze-dried.
Однако известный способ-прототип и предлагаемый способ имеют следующие отличия:
1) В прототипе сырье замораживают однократно при -40oC, а в предлагаемом способе сырье трижды подвергают замораживанию при -40oC с последующим оттаиванием.However, the known prototype method and the proposed method have the following differences:
1) In the prototype, the raw materials are frozen once at -40 o C, and in the proposed method, the raw materials are subjected to freezing three times at -40 o C, followed by thawing.
2) В прототипе экстракцию проводят в 3%-ном растворе уксусной кислоты при pH 3,0-3,5 с добавлением хлористого цинка в концентрации 1 г/л, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют 1 н. раствором уксусной кислоты с добавлением ингибитора фенилметилсульфонилфторида в концентрации 0,1 мМ;
3) В способе-прототипе время экстракции составляет 48-72 часа, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в течение 30-60 минут;
4) В предлагаемом способе с целью дополнительной очистки целевого продукта осадок подвергают гель-фильтрации и собирают фракции с ММ от 300 до 3000 Д;
5) В способе - прототипе целевой продукт представлен щелочными полипептидами с молекулярной массой от 2 до 12 кД, а в предлагаемом способе выделяют пептиды с ММ от 300 до 3000 Д.2) In the prototype, the extraction is carried out in a 3% solution of acetic acid at a pH of 3.0-3.5 with the addition of zinc chloride at a concentration of 1 g / l, and in the proposed method, the extraction is carried out 1 N. a solution of acetic acid with the addition of a phenylmethylsulfonyl fluoride inhibitor at a concentration of 0.1 mm;
3) In the prototype method, the extraction time is 48-72 hours, and in the proposed method, the extraction is carried out for 30-60 minutes;
4) In the proposed method, in order to further purify the target product, the precipitate is subjected to gel filtration and fractions with MM from 300 to 3000 D are collected;
5) In the prototype method, the target product is alkaline polypeptides with a molecular weight of 2 to 12 kD, and in the proposed method, peptides with an MM of 300 to 3000 D are isolated.
Экстракция 1 н. раствором уксусной кислоты в присутствии ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфторида, значительное сокращение времени экстракции обеспечивают более щадящие условия выделения пептидов по сравнению со способом-прототипом. При этом практически отсутствует протеолиз нативных высокоактивных иммуностимулирующих пептидов, что ведет к повышению иммуностимулирующей активности целевого продукта. Трехкратный цикл замораживания-оттаивания в предлагаемом способе способствует разрушению клеток и субклеточных структур и более полному выходу из них биологически активных веществ.
В табл. 1 приведено сравнение различных способов получения веществ, обладающих иммостимулирующей активностью. In the table. 1 shows a comparison of various methods for producing substances having immunostimulating activity.
Наиболее оптимальные условия предлагаемого способа были подобраны экспериментально. Доказательство правильности выбранных параметров заморозки, экстракции и гель-фильтрации приведены в табл. 2-6. В качестве скрининг-теста оценки иммуностимулирующей активности использовали оценку влияния полученного вещества на экспрессию дифференцировочных антигенов CD3 (Т-лимфоциты) и CD22 (В-лимфоциты) на лимфоцитах больных с вторичными иммунодефицитами методом непрямой иммунофлюоресценции [4]. В качестве модели иммунодефицита использовали лимфоциты больных с ожоговой болезнью. Концентрация пептидов в опыте составляла 10 мкг/мл. The most optimal conditions of the proposed method were selected experimentally. The proof of the correctness of the selected parameters of freezing, extraction and gel filtration are given in table. 2-6. As a screening test for assessing immunostimulating activity, we used an assessment of the effect of the obtained substance on the expression of differentiating antigens CD3 (T-lymphocytes) and CD22 (B-lymphocytes) on lymphocytes of patients with secondary immunodeficiencies by indirect immunofluorescence [4]. As a model of immunodeficiency, lymphocytes of patients with burn disease were used. The concentration of peptides in the experiment was 10 μg / ml.
Наиболее оптимальным является режим трехкратной заморозки, поскольку он позволяет получить вещество с максимальной иммуностимулирующей активностью. The most optimal is the mode of triple freezing, because it allows you to get a substance with maximum immunostimulating activity.
Из табл. 3 видно, что для получения вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью, необходимо проводить экстракцию 1 н. раствором уксусной кислоты. Более высокая или более низкая концентрация уксусной кислоты приводят к снижению специфической активности целевого продукта. From the table. 3 shows that to obtain a substance with immunostimulating activity, it is necessary to carry out the extraction of 1 N. acetic acid solution. A higher or lower concentration of acetic acid leads to a decrease in the specific activity of the target product.
Таким образом, оптимальной концентрацией в экстрагирующем растворе ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфторида является 0,1 мМ. Увеличение концентрации фенилметилсульфонилфторида не приводит к возрастанию иммуностимулирующей активности. Thus, the optimal concentration of phenylmethylsulfonyl fluoride protease inhibitor in the extracting solution is 0.1 mM. An increase in the concentration of phenylmethylsulfonyl fluoride does not lead to an increase in immunostimulating activity.
Из табл. 5 видно, что оптимальное время экстракции составляет 3 - 60 минут. Уменьшение или увеличение времени экстракции приводит снижению биологической активности целевого продукта. From the table. Figure 5 shows that the optimal extraction time is 3-60 minutes. Reducing or increasing the time of extraction leads to a decrease in the biological activity of the target product.
Из табл. 6 видно, что максимальной специфической активностью обладает фракция с молекулярной массой от 300 до 3000 Д. From the table. Figure 6 shows that the fraction with a molecular weight of 300 to 3,000 D possesses maximum specific activity.
Биологическую активность полученного вещества in vitro, как и в способе - прототипе, изучали методом неиммунного розеткообразования с эритроцитами барана Е-РОК, Еа-РОК (Kerman В.Н. et al., 1976) и ЕАС-РОК (Bianco С. et al., 1983) [5]. Исследования проведены на модели лимфоцитов периферической крови больных с ожогами IIIб - IV степени 15 - 30% поверхности тела, сопровождающихся вторичным иммунодефицитом [6, 7]. Лимфоциты больных с ожоговой болезнью инкубировали с полученными пептидами в концентрации от 0,5 до 100 мкг/мл в течение 2 часов при температуре 37oC в полной питательной среде. Контролем служили лимфоциты, инкубированные с добавлением аналогичного объема физиологического раствора.The biological activity of the obtained substance in vitro, as in the prototype method, was studied by the method of non-immune rosette formation with sheep erythrocytes E-ROCK, Ea-ROCK (Kerman V.N. et al., 1976) and EAC-ROCK (Bianco C. et al ., 1983) [5]. The studies were carried out on the model of peripheral blood lymphocytes of patients with burns of IIIb – IV degree of 15–30% of the body surface, accompanied by secondary immunodeficiency [6, 7]. Lymphocytes of patients with a burn disease were incubated with the obtained peptides in a concentration of from 0.5 to 100 μg / ml for 2 hours at a temperature of 37 o C in a complete nutrient medium. Control was lymphocytes incubated with the addition of a similar volume of saline.
Полученное вещество увеличивает количество розеткообразующих клеток в концентрации 5 - 10 мкг/мл, в то время как, вещество способа-прототипа обладает аналогичной активностью лишь в концентрации 100 мкг/мл. Более того, вещество способа-прототипа увеличивает количество только Еа-РОК, не влияя на другие клетки, что свидетельствует о расширении спектра иммуностимулирующей активности вещества, полученного по предлагаемому способу. The resulting substance increases the number of rosette cells at a concentration of 5 to 10 μg / ml, while the substance of the prototype method has similar activity only at a concentration of 100 μg / ml. Moreover, the substance of the prototype method increases the amount of only Ea-ROCK, without affecting other cells, which indicates the expansion of the spectrum of immunostimulating activity of the substance obtained by the proposed method.
Кроме того, иммуностимулирующую активность полученного вещества изучали методом непрямой мембранной иммунофлуоресценции с моноклональными антителами к дифференцировочным антигенам основных популяций лимфоцитов: CD3 (Т-лимфоциты), CD16 (NK-клетки) и CD22 (В-лимфоциты). In addition, the immunostimulating activity of the obtained substance was studied by the method of indirect membrane immunofluorescence with monoclonal antibodies to differentiation antigens of the main populations of lymphocytes: CD3 (T-lymphocytes), CD16 (NK-cells) and CD22 (B-lymphocytes).
Полученное вещество способно стимулировать экспрессию дифференцировочных антигенов, что также является проявлением его иммуностимулирующей активности. The resulting substance is able to stimulate the expression of differentiation antigens, which is also a manifestation of its immunostimulating activity.
Иммуностимулирующую активность вещества in vivo оценивали, как и в прототипе, на модели эмбриональной буреэктомии. Цыплятам на 19 сутки инкубации in vivo удаляли сумку Фабрициуса. Через 1,5 месяца, когда у бурсэктомированных цыплят наблюдалось максимальное развитие иммунодефицита, им вводили полученное вещество в течение недели по 100 мкг/кг массы тела. Контролем служили птицы, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Затем цыплят иммунизировали эритроцитами барана и через 5 суток определяли состояние иммунитета. Полученные данные приведены в таблице 9. The immunostimulatory activity of the substance in vivo was evaluated, as in the prototype, on the model of embryonic burectomy. On day 19 of in vivo chickens, the Fabricius bag was removed. After 1.5 months, when bursectomized chickens showed the maximum development of immunodeficiency, they were injected with the resulting substance for a week at 100 μg / kg body weight. The control was birds that received physiological saline in a similar volume. Then the chickens were immunized with sheep red blood cells and after 5 days the state of immunity was determined. The data obtained are shown in table 9.
Введение вещества, полученного по заявляемому способу, восстанавливает иммунный ответ, птицы быстрее набирают в весе, увеличивается вес селезенки. Аналогичный эффект оказывает и вещество способа-прототипа, однако лишь в дозе 1 мг/кг массы тела. The introduction of the substance obtained by the present method restores the immune response, the birds gain weight faster, the weight of the spleen increases. A similar effect is exerted by the substance of the prototype method, however, only at a dose of 1 mg / kg body weight.
Таким образом, по предлагаемому способу получают вещество, обладающее высокой иммуностимулирующей активностью. По сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет достигнуть повышения активности целевого продукта, что выражается в снижении активной концентрации препарата. Так вещество, полученное по предлагаемому способу, обладает иммуностимулирующей активностью в концентрации от 2 до 10 мкг/мл в опытах in vitro и 100 мкг/кг in vivo, в то время как по способу-прототипу - 100 мкг/мл и 1 мг/кг соответственно. Изобретение обеспечивает повышение иммуностимулирующей активности в 10 раз, что позволяет снизить терапевтическую дозу препарата и уменьшить риск побочных эффектов. Кроме того, по сравнению со способом-прототипом отмечается расширение спектра иммуностимулирующей активности вещества. Thus, the proposed method receive a substance with high immunostimulating activity. Compared with the prototype method, the proposed method allows to increase the activity of the target product, which is expressed in a decrease in the active concentration of the drug. So the substance obtained by the proposed method, has immunostimulating activity in a concentration of from 2 to 10 μg / ml in experiments in vitro and 100 μg / kg in vivo, while the prototype method has 100 μg / ml and 1 mg / kg respectively. The invention provides an increase in immunostimulating activity by 10 times, which allows to reduce the therapeutic dose of the drug and to reduce the risk of side effects. In addition, in comparison with the prototype method, an expansion of the spectrum of the immunostimulating activity of the substance is noted.
Вещество, обладающее иммуностимулирующей активностью, может найти применение в медицине для профилактики и лечения широкого круга иммунодефицитных состояний различной этиологии. A substance with immunostimulating activity can be used in medicine for the prevention and treatment of a wide range of immunodeficiency states of various etiologies.
Источники информации
1. Brand A., Gilmour D.G., Goldstein G. Lymphocyte- differentiating hormone of bursa of Fabricius //Science.- 1976.- Vol. 193.- P. 319-321.Sources of information
1. Brand A., Gilmour DG, Goldstein G. Lymphocyte-differentiating hormone of bursa of Fabricius //Science.- 1976.- Vol. 193.- P. 319-321.
2. Арион В.Я. и др. Получение и свойства пептидов бурсы Фабрициуса цыплят // Тезисы 1 Всесоюзного иммунол. съезда.- 1989.- Том 1.- С. 12. 2. Arion V.Ya. and others. Obtaining and properties of peptides of the bursa of Fabricius chickens // Abstracts of 1 All-Union immunol. Congress .- 1989.- Volume 1.- S. 12.
3. Степанов А.В. Механизмы корригирующего действия полипептидов из лимфоидной ткани при иммунодефицитных состояниях и воспалении. Дисс. док. мед. наук, Иркутск, 1994, 331 с. 3. Stepanov A.V. The mechanisms of corrective action of polypeptides from lymphoid tissue in immunodeficiency states and inflammation. Diss. doc honey. Sciences, Irkutsk, 1994, 331 p.
4. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М.: Мир, 1990, 395 с. 4. Lymphocytes: Methods: Trans. from English / Ed. J. Klaus. - M .: Mir, 1990, 395 p.
5. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П.Тарасова. - М.: Медицина, 1987, 472 с. 5. Immunological methods / Ed. G. Frimel, Per. with him. A.P. Tarasova. - M.: Medicine, 1987, 472 p.
6. Колкер И. И., Вишневская С.М., Панова Ю.М. и др. Содержание Т- и В- лимфоцитов у больных с термическими ожогами//Клинич. медицина. - 1985. - N 7. - С. 87-93. 6. Kolker I.I., Vishnevskaya S.M., Panova Yu.M. and others. The content of T- and B-lymphocytes in patients with thermal burns // Clinical. the medicine. - 1985. - N 7. - S. 87-93.
7. Белоцкий С.М., Борисова Т.Г., Снастина Т.И. и др. Характеристика фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов у обожженных // Иммунология.-1983.- N 6.- С. 51-54. Ты 7. Belotsky S.M., Borisova T.G., Snastina T.I. et al. Characterization of phagocytes, T- and B-lymphocytes in burned patients // Immunology.-1983.- N 6.- P. 51-54. You
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000123980A RU2177325C1 (en) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000123980A RU2177325C1 (en) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2177325C1 true RU2177325C1 (en) | 2001-12-27 |
Family
ID=20240206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000123980A RU2177325C1 (en) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2177325C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012053928A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Shanin Vadim Yulyevich | Immunologically active substance, process for preparing same, bioprobe, pharmaceutical composition, diagnostics and treatment methods |
| RU2782347C1 (en) * | 2021-06-29 | 2022-10-26 | Наталья Александровна Кольберг | Processing method for poultry bursa of fabricius |
-
2000
- 2000-09-19 RU RU2000123980A patent/RU2177325C1/en active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КУЗНИК Б.И. и др. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. - М.: Медицина, 1989, с.264. * |
| СТЕПАНОВ А.В. Механизмы корригирующего действия полипептидов из лимфоидной ткани при иммунодефицитных состояниях и воспалении. Дисс. докт. мед. наук, Чита, 1994. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012053928A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Shanin Vadim Yulyevich | Immunologically active substance, process for preparing same, bioprobe, pharmaceutical composition, diagnostics and treatment methods |
| RU2782347C1 (en) * | 2021-06-29 | 2022-10-26 | Наталья Александровна Кольберг | Processing method for poultry bursa of fabricius |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2217152C2 (en) | Colostrinin and its application | |
| EP0396616B1 (en) | Reduction of side effects of cancer therapy | |
| JPH10509955A (en) | Treatment of secondary immunodeficiency | |
| CN101309705A (en) | Preventive or therapeutic agent and method for immune disease | |
| CN116535486A (en) | Keratin YK93-1, preparation method, pharmaceutical composition and application thereof | |
| CN111574586B (en) | Active peptide derived from Chinese JI Eupolyphaga Seu Steleophaga and having blood lipid reducing function, and preparation method and application thereof | |
| CN108997483B (en) | Bioactive polypeptide DQDLVLI and preparation method and application thereof | |
| CN110922466B (en) | Bioactive polypeptide KSWNETFHARLA, and preparation method and application thereof | |
| RU2177325C1 (en) | Method of preparing substance eliciting immunostimulating activity | |
| JPH03503530A (en) | Human tumor therapeutic drug and its manufacturing method | |
| CN101060851A (en) | Pharmaceuticals agents comprising blood components and/or kDa and their use for prophylaxis and treatment of defects of the immune system | |
| EP0432400A2 (en) | Pharmacologically active substance BPC, the process for its preparation and its use in the therapy | |
| RU2155068C1 (en) | Method of preparing substance stimulating antigen-nondepending differentiation of b-lymphocytes | |
| CN108794594B (en) | Bioactive polypeptide IPLIAGS and preparation method and application thereof | |
| SU1158201A1 (en) | Method of obtaining stimulator from mammalia spleen | |
| RU2089204C1 (en) | Method of preparing peptides recovering the prostate gland function | |
| CN114702549B (en) | Active hexapeptide with antioxidation effect and application thereof | |
| WO2024074110A1 (en) | Keratin yk93-5, preparation method, and pharmaceutical composition and use thereof | |
| CN116082483B (en) | Preparation method and application of polypeptide capable of improving osteoporosis and enhancing bone density | |
| RU1522485C (en) | Method of immunostimulating agent preparing | |
| US5948442A (en) | Stimulating ENTEROGENIN compositions and methods for their isolation and use | |
| CN107814840B (en) | Bioactive polypeptide PKYPVEPF as well as preparation method and application thereof | |
| EP0142109B1 (en) | Macromolecules extracted from cultured mesenchymal cells for the treatment of degenerative diseases | |
| RU2521230C1 (en) | Method of obtaining substance, stimulating antigen-independent differentiation of b-lymphocytes | |
| RU2136296C1 (en) | Method of preparing peptides showing antogonadotropic effect |