RU2141339C1 - Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем - Google Patents
Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем Download PDFInfo
- Publication number
- RU2141339C1 RU2141339C1 RU96106615A RU96106615A RU2141339C1 RU 2141339 C1 RU2141339 C1 RU 2141339C1 RU 96106615 A RU96106615 A RU 96106615A RU 96106615 A RU96106615 A RU 96106615A RU 2141339 C1 RU2141339 C1 RU 2141339C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- pale
- supernatant
- treponemas
- strains
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается способа получения антигенов из культуральных бледных трепонем. Сущность изобретния: биомассу бледных трепонем выращивают на искусственной тиогликолевой среде из полного набора штаммов трех антигенных групп с последующей дезинтеграцией клеток ультразвуком, центрифугированием, отделением неразрушенных трепонем, центрифугированием надосадочной жидкости, выделением осадка стенок трепонем и супернатанта. Технический результат заключается в обеспечении безотходного промышленного производства антигена для серодиагностики сифилиса с повышенной антигенной активностью. 3 табл.
Description
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в промышленном производстве антигенов для серодиагностики сифилиса.
Открытие бледных трепонем как возбудителей сифилиса положило начало серологическим методам исследования сифилиса.
Традиционным способом серодиагностики сифилиса является реакция Вассермана, в которой антигеном может быть как протеиновый специфический комплекс, получаемый из культур бледных трепонем органов плода, зараженного сифилисом, так и неспецифический кардиолипиновый, извлекаемый из мышц бычьего сердца /К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеев - Микробиология, "Медицина", 1980, с. 362-363/.
Специфичность и чувствительность этого метода недостаточны, в частности в первичном периоде сифилиса реакция бывает положительной в половине случаев, но не ранее, чем через 2-3 недели после появления шанкра, или на 5-6-й неделе от момента заражения. Она может быть неспецифической при беременности, после родов, при туберкулезе, вирусных заболеваниях и т.д.
Получение применяемых антигенов в промышленных условиях для массового применения нереально.
На начальном этапе повышения эффективности серодиагностики сифилиса была доказана целесообразность использования в качестве антигена для PCK цельных клеток культур бледных трепонем.
С целью более полного использования их антигенных свойств был получен бесклеточный препарат путем разрушения клеток ультразвуком /Овчинников Н.М. Новые серологические реакции на сифилис. М., "Медицина", 1961/. С 1982 г. начат производственный выпуск этого препарата и включение его в комплекс серологических реакций для диагностики сифилиса.
Однако при использовании этого препарата еще высоко количество отрицательных результатов PCK при наличии заболевания и неспецифически-положительных реакций у лиц, свободных от инфекции. Это обусловлено состоянием иммунной системы пациентов, наличием в бледных трепонемах "убиквитерного" липида.
Экспериментальные исследования антигенных свойств культуральных бледных трепонем различных штаммов выявили их иммунологические различия в перекрестной реакции агглютинации с истощением сывороток крови кроликов. По антигенным свойствам штаммы можно разделить на 3 группы:
1 - I, VI, IX штаммы;
2 - II, VII, VIII штаммы;
3 - IV, V, Reiter штаммы
/Зебницкая Л.В. - Вести. дерматол., 1955, N 4, с. 24-27/.
1 - I, VI, IX штаммы;
2 - II, VII, VIII штаммы;
3 - IV, V, Reiter штаммы
/Зебницкая Л.В. - Вести. дерматол., 1955, N 4, с. 24-27/.
Известны работы по изучению химического состава наружной оболочки культуральных бледных трепонем. Выделены и изучены антигенные свойства белковых фрагментов наружных фибрилл культуральных трепонем штамма Reiter. /Petersen C. J. , Pedersen S.N., Axelsen N.H. - Acta path. microbiol Scand, 1981, vol. 89, p. 379-385/.
Однако эти работы не имеют системного подхода к решению проблемы, способы выделения, например, полипептидов, известные в биотехнологии, отличаются большой сложностью и дороговизной аппаратуры и не могут быть использованы в промышленном производстве антигенов.
Известны работы по дезинтеграции культуральных бледных трепонем. /Berg R. N. , Dunlan W.P., Thoruton C.Y. - Brit, J. vener. Dis., 1972, vol. 48, p. 489-495/, Скадене М. - Д.А. Получение и сравнительная оценка протеиновой фракции бледных трепонем в реакции связывания комплемента при сифилисе. Автореферат дис. к.мед.н., М., 1980/.
При исследовании дезинтеграта культуральных бледных трепонем были определены в центрифугате и супернатанте как термостабильные, так и термолабильные антигены. Исследование белковых фракций, полученных из дезинтеграта культуральных и тканевых бледных трепонем, показано наличие пяти различных по молекулярной массе белков. Высокой антигенной активностью обладали первые белковые фракции тканевых и культуральных бледных трепонем.
Однако в этих работах не определен структурный состав культуральных бледных трепонем, что затрудняет их промышленную обработку.
Известен способ выделения отдельных клеточных структур культуральных бледных трепонем с целью изучения их антигенных свойств в PCK /Пожарская В. О. - Вест. дерматол., 1985, N 9, с. 16-18/.
Согласно этому способу, отмытую изотоническим раствором натрия хлористого взвесь /1012 микробных клеток/мл/ культуральных бледных трепонем I, V, VIII штаммов /по одному представителю из трех антигенных групп с различными иммунологическими свойствами/ разрушают до 96 ± 1% клеток в дезинтеграторе системы Евстюгова-Бабаева и Жванецкой с добавлением бус. Центрифугированием при 5500 g в течение 10 мин отделяют от дезинтеграта неразрушенные трепонемы, затем дезинтеграт центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин и отделяют осадок клеточных стенок трепонем и незначительные количества наружных фибрилл, оставшуюся надосадочную жидкость центрифугируют при 30200 g в течение 30 мин с выделением осадка цитоплазматических мембран, незначительного количества блефаропластов, мезосом, внутренних фибрилл и наконец из оставшейся надосадочной жидкости путем добавления абсолютно охлажденного этилового спирта выделяют цитоплазму трепонем. Структуры, выделенные при разделенном центрифугировании, выявляют с помощью электронной микроскопии.
Выделенные структуры были консервированы и изучены в PCK с сыворотками крови больных с различными формами сифилиса, с последующим сравнением с результатами стандартного комплекса реакций на сифилис.
Выявлено, что по чувствительности антиген из клеточных стенок трепонем /средние титры 1:124/ превосходит ультраозвученный и кардиолипиновый антигены /средние титры 1:80/.
Цитоплазма обладает низкой чувствительностью /средние титры 1:10/. Цитоплазматические мембраны имеют средние титры 1:104.
Выявлены преимущества по диагностической ценности клеточных структур.
По специфичности все клеточные структуры имеют преимущества перед ультраозвученным и кардиолипиновым антигенами.
Проведенные эксперименты представляют большую ценность в оценке антигенных свойств отдельных клеточных структур культуральной бледной трепонемы.
Недостатком способа является то, что для применения в промышленном производстве он недостаточно эффективен. Применение механической дезинтеграции с наполнителем замедляет процесс из-за необходимости постоянной промывки и замены бус. Нецелесообразен процесс отделения цитоплазматических мембран, так как их количество незначительно.
Кроме того, при исследовании химического состава антигена из клеточных стенок трепонем выявлено недостаточное содержание белковых соединений, что снижает чувствительность антигена.
Наиболее близким по существу и назначению является способ получения антигенов из культуральных трепонем I, V, VIII штаммов /по одному представителю от каждой антигенной группы/ /А. с. СССР N 1650098, A 61 B 10/00, 23.05.95 г, БИ N 19/.
Способ включает приготовление биомассы трепонем на печеночном бульоне с добавлением кусочков печени крупного рогатого скота, pH 8.2 в анаэробных условиях в течение 8 дней. Выросшую культуру фильтруют, центрифугируют в течение при 5500 g 30 мин. Из полученного осадка готовят взвесь трепонем 1012 микр. кл/мл, затем смесь дезинтегрируют в течение 20 мин, и дезинтеграт центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин. Полученный осадок - клеточные стенки и наружные фибриллы культуральных бледных трепонем используют для промышленного получения трепонемного антигена, а супернатант, содержащий цитоплазматические мембраны, мезосомы, внутренние фибриллы, цитоплазмы клеток используют в качестве сорбента при серодиагностике сифилиса в РИФ-абс.
Недостатком прототипа является то, что процесс выращивания биомассы трепонем является длительным и дорогостоящим, что затрудняет промышленное производство антигенов.
Кроме того, при исследовании химического состава антигена из клеточных стенок трепонем выявлено недостаточное содержание белковых соединений, что снижает чувствительность антигена.
Целью изобретения является обеспечение безотходного промышленного производства антигена для серодиагностики сифилиса с повышенной антигенной активностью за счет использования штаммов трех антигенных групп и получения отдельных клеточных культур бледных трепонем.
Поставленная цель достигается тем, что способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем включает выращивание биомассы трепонем из полного набора штаммов трех антигенных групп на искусственной тиогликолевой среде, дезинтеграцию клеток ультразвуком, центрифугирование взвеси, отделение неразрушенных трепонем, центрифугирование надосадочной жидкости, выделение осадка клеточных стенок трепонем и супернатанта.
По отношению к прототипу изобретение имеет следующие отличительные признаки.
Подготовка биомассы на искусственной тиогликолевой среде удешевляет и ускоряет процесс при увеличении роста биомассы.
Использование в биомассе полного набора штаммов из трех антингенных групп обеспечивает содержание в антигене протеинового, полисахаридного и липидного компонентов, что способствует специфичности антигена.
Дезинтеграция клеток трепонемы ультразвуком упрощает процесс по сравнению с механическим способом, обеспечивая достаточную степень разрушения клеток до 96 ± 1% при тех же затратах времени, снижение потери биомассы антигена после дезинтеграции и отделения от бус, снижение трудозатрат.
Использование осадка клеточных стенок культуральных бледных трепонем для получения антигена, а осадка цитоплазмы - для получения сорбента обеспечивает безотходность производства.
Возможность реализации заявляемого способа показана в примере конкретного выполнения.
Пример 1. Готовят искусственную тиогликолевую питательную среду по известной методике /Инструкция по изготовлению питательной среды для контроля чистоты живых вакцин. Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", г. Саратов. Утв. ГУ карантинных инфекций Минздрава СССР 28.09.81/.
Пересевают культуральные трепонемы полного набора штаммов из трех антигенных групп на приготовленную питательную среду, добавляют сыворотку крупного рогатого скота. Полученную взвесь центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин, осадок отмывают трижды 0.9% раствором натрия хлористого.
Отмытый от питательной среды осадок культуральной трепонемы суспендируют в 0.9% раствора натрия хлористого /pH 7,3 ± 1/ из расчета 10-20 мл натрия хлористого на 1 г осадка и разливают суспензию поштаммно, затем направляют на дезинтеграцию.
Дезинтеграцию проводят на УЗ-генераторе УЛА-1000 В, напряжение 220 В, мощность 2-3 кВ, сила тока 50 А, интенсивность 8-12 Вт/см2.
Ультраозвучивание ведут в течение 25-30 мин. Полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин при 5500 g, при этом удаленные обломки неразрушенных трепонем возвращаются на дезинтеграцию. Надосадочную жидкость, которая является дезинтегратом трепонем, направляют на центрифугирование, которое проводят при 10000 g в течение 30 мин с 9000 об/мин в центрифугах ЦЛМ-ОС-6М, ШХ-2.779.043 со сменным ротором CH/1.
Надосадочную жидкость направляют в технологический процесс получения сорбента.
Осадок, который является антигеном из клеточных стенок трепонем /КСТ-антиген/, суспендируют в 0.9% растворе натрия хлористого, pH 7.3 ± 1 из расчета 40-50 мл на 1 г осадка, затем разливают, консервируют с добавлением стабилизатора, сушат на сублимационной установке, затем в вакууме, герметизируют флаконы и направляют на контроль.
В таблицах 1-3 представлены сравнительные характеристики антигена из клеточных стенок трепонем /КСТ-антигена/ и сорбента, полученных по заявляемому способу перед ультраозвученными антигенами, полученными без структурного разделения клеточной системы.
В таблице 1 представлена эффективность производства КСТ-антигена при различных способах дезинтеграции.
В таблице 2 представлена сравнительная оценка чувствительности антигена в PCK и сорбента для РИФ-абс.
В таблице 3 представлены сравнительная оценка КСТ-антигена в PCK и сорбента для РИС-абс.
Сравнительные данные показывают преимущества антигена и сорбента, полученных по заявляемому способу.
Способ был испытан в ЦКВИ, СПГ "Аллерген", Ставропольском кожно-венерологическом диспансере, что подтверждает возможность и целесообразность его использования в промышленности.
Claims (1)
- Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем, включающий выращивание биомассы трепонем из штаммов трех антигенных групп, дезинтеграцию клеток, центрифугирование взвеси, отделение неразрушенных трепонем, центрифугирование надосадочной жидкости, выделение осадка клеточных стенок трепонем и супернатанта, отличающийся тем, что биомассу выращивают на искусственной тиогликолевой среде из полного набора штаммов трех антигенных групп, дезинтеграцию клеток осуществляют ультразвуком.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU96106615A RU2141339C1 (ru) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU96106615A RU2141339C1 (ru) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU96106615A RU96106615A (ru) | 1998-06-10 |
RU2141339C1 true RU2141339C1 (ru) | 1999-11-20 |
Family
ID=20178959
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU96106615A RU2141339C1 (ru) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2141339C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018012994A1 (ru) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Эдуард Исаакович МОРДУХОВИЧ | Иммуностимулирующий препарат, обладающий противоопухолевой активностью |
-
1996
- 1996-03-26 RU RU96106615A patent/RU2141339C1/ru active
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018012994A1 (ru) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Эдуард Исаакович МОРДУХОВИЧ | Иммуностимулирующий препарат, обладающий противоопухолевой активностью |
US11160854B2 (en) | 2016-07-11 | 2021-11-02 | Limited Liability Company “Cancernet” | Immunostimulatory preparation exhibiting antitumor activity |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Edward | The pleuropneumonia group of organisms: a review, together with some new observations | |
Stephens | Immune responses of some insects to some bacterial antigens | |
WO1994006463A1 (en) | Immortalized cells and uses therefor | |
Epstein et al. | Histocompatibility typing and course of canine venereal tumors transplanted into unmodified random dogs | |
CN102746381B (zh) | 一种幽门螺杆菌抗原hla限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用 | |
RU2141339C1 (ru) | Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем | |
CN102353794A (zh) | 筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法 | |
US4678748A (en) | Process for the production of immunobiological preparations applicable in the diagnosis, prevention and/or treatment of Candida guilliermondii infections | |
Slack et al. | STUDIES WITH MICROAEROPHILIC ACTINOMYCETES I: The Agglutination Reaction | |
Gabalov et al. | The adjuvant effect of selenium nanoparticles, Triton X-114 detergent micelles, and lecithin liposomes for Escherichia coli antigens | |
RU2341288C1 (ru) | СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ ФОРМИРОВАТЬ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 Rv, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕГО (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА | |
Ferrieri | GBS Enzymes, Hemolysin, Toxins and Other Products1 | |
Thornley et al. | Cell envelopes with regularly arranged surface subunits in Acinetobacter and related bacteria | |
RU2324740C2 (ru) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ТОКСИН-КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ И OmpU ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА | |
Matthews et al. | Encapsulation of coagulase‐negative staphylococci of bovine origin | |
RU2691586C1 (ru) | Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа | |
RU2768008C1 (ru) | Вирулентный штамм бактерий Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni, используемый для экспериментального изучения лептоспирозной инфекции | |
CN102276697A (zh) | 幽门螺杆菌抗原hla限制性免疫显性表位肽及应用 | |
JPH06234647A (ja) | IgA産生促進剤およびその製造法 | |
Deneke et al. | Recombinant leptospiral immunoglobulin like B protein based latex agglutination test for serodiagnosis of human leptospirosis | |
RU2663133C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на токсически активные и неактивные | |
Feinman et al. | Serological reactions of glycolipids from streptococcal L-forms | |
RU2146150C1 (ru) | Способ изготовления культурального антигена из вируса инфекционной анемии лошадей и набор для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей | |
RU2118538C1 (ru) | Способ получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных | |
RU2175558C1 (ru) | Способ получения сухого флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума |