RU2135581C1 - Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' - Google Patents
Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' Download PDFInfo
- Publication number
- RU2135581C1 RU2135581C1 RU97116083/13A RU97116083A RU2135581C1 RU 2135581 C1 RU2135581 C1 RU 2135581C1 RU 97116083/13 A RU97116083/13 A RU 97116083/13A RU 97116083 A RU97116083 A RU 97116083A RU 2135581 C1 RU2135581 C1 RU 2135581C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- strain
- ctgcag
- restrictase
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'- CTGCAG -3'. The invention relates to the microbiological industry and genetic engineering and relates to the production of a new strain producing a site-specific endonuclease capable of recognizing and cleaving the 5'-CTGCAG-3 'nucleotide sequence.
Рестриктаза такой специфичности широко используется для использования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. A restriction enzyme of this specificity is widely used to use the primary structure of DNA, the physical mapping of various genomes. This endonuclease is a convenient model for studying the specificity of protein-nuclein interactions.
Известен штамм Providencia Stuartii 164, продуцирующий рестриктазу PstI (сайт узнавания 5'-CTGCAG-3') [1]. Основными недостатками данного штамма являются: нестабильность фермента после очистки (срок хранения несколько недель), активность фермента не указана, штамм является клиническим изолятом. A known strain of Providencia Stuartii 164, producing the restriction enzyme PstI (recognition site 5'-CTGCAG-3 ') [1]. The main disadvantages of this strain are: enzyme instability after purification (shelf life of several weeks), enzyme activity is not indicated, the strain is a clinical isolate.
Известно несколько продуцентов - изошизомеров этой рестриктазы. Several producers are known to be isoschizomers of this restrictase.
Известен штамм Caulobacter fusiformis BC-25, который способен продуцировать рестриктазу Cfu I (сайт узнавания 5'-CTGCAG-3') [2]. Основными недостатками штамма являются: низкое содержание данной рестриктазы, наличие 2 эндонуклеаз рестрикции (CfuI, CfuII), что значительно усложняет стадии выделения и очистки ферментов. A known strain of Caulobacter fusiformis BC-25, which is capable of producing the restriction enzyme Cfu I (recognition site 5'-CTGCAG-3 ') [2]. The main disadvantages of the strain are: low content of this restrictase, the presence of 2 restriction endonucleases (CfuI, CfuII), which greatly complicates the stages of isolation and purification of enzymes.
Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Streptomyces albus, продуцирующий единственную рестриктазу SalPI [3, прототип]. Фермент сохраняет активность от двух до восьми месяцев хранения при -20oC в зависимости от метода выделения. Выход фермента составляет 6000 ед/мл препарата. Термостабильность фермента не указана (отсутствует).Closest to the claimed strain is a strain of Streptomyces albus, producing the only restriction enzyme SalPI [3, prototype]. The enzyme retains activity from two to eight months of storage at -20 o C depending on the isolation method. The yield of the enzyme is 6000 units / ml of the drug. Thermostability of the enzyme is not indicated (absent).
Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы. The cultural and biotechnological properties of the strain have not been published.
Недостатком данного штамма является невысокий выход рестриктазы. The disadvantage of this strain is the low yield of restrictase.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CTGCAG-3', с высоким выходом фермента, стабильного при хранении. An object of the invention is to obtain a strain producing a restrictase, recognizing and cleaving the nucleotide sequence of 5'-CTGCAG-3 ', with a high yield of storage stable enzyme.
Поставленная задача решается выявлением и использованием штамма - продуцента сайт-специфической рестриктазы Ssp12-I. The problem is solved by the identification and use of a strain - producer of site-specific restriction enzyme Ssp12-I.
Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска новых продуцентов рестриктаз. The proposed strain isolated from the soil as a result of a search for new producers of restrictase.
Полученный штамм streptomyces Species ST-12 депонирован в НИИ Коллекции культур микроорганизмов Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером B-679, а продуцируемая им рестриктаза названа Ssp-12I согласно общепринятой номенклатуре. The resulting streptomyces Species ST-12 strain was deposited at the Scientific Research Institute of the Collection of Microorganism Cultures of the State Scientific Center for Virology and Biotechnology "Vector" under registration number B-679, and the restriction enzyme produced by it was named Ssp-12I according to generally accepted nomenclature.
Штамм Streptomyces sp. ST-12 относится к серой серии стрептомицетов и характеризуется следующими свойствами:
Морфологические: клетки нитевидные, неподвижные, ветвящиеся, грамположительные. Воздушный мицелий в зрелом состоянии образует цепочки неподвижных овальных опор. Поверхность спор гладкая, спороносцы прямые. На крахмало-аммиачной среде образует мелкие вросшие колонии; воздушный мицелий (ВМ) белого цвета, развит незначительно, субстратный (СМ) - грязно-желтоватый, меланоидный пигмент (МП) не образуется. На мясо-пептонном агаре - колонии слабо-вросшие, кожистые, без пигмента и без ВМ, СМ - светло-грязно-желтый, МП не выражен. На овсяном агаре обильный рост. ВМ - белый, при созревании - серо-сизый, СМ - бурый, МП - светло-бурый. В жидкой питательной среде образует мелкие округлые, хлопьевидные образования.Strain Streptomyces sp. ST-12 belongs to the gray streptomycete series and is characterized by the following properties:
Morphological: cells are filiform, motionless, branching, gram-positive. The aerial mycelium in a mature state forms chains of motionless oval supports. The surface of the spores is smooth, the spore-carriers are straight. On starch-ammonia medium forms small ingrown colonies; aerial mycelium (VM) is white, slightly developed, substrate (SM) - dirty yellowish, melanoid pigment (MP) is not formed. On meat-peptone agar, colonies are weakly grown, leathery, without pigment and without VM, SM is light dirty yellow, MP is not pronounced. Abundant growth on oat agar. VM - white, when ripe - gray-gray, SM - brown, MP - light brown. In a liquid nutrient medium forms small rounded, flaky formations.
Физиологические и биохимические: аэроб, температурный оптимум 28 - 30oC, pH среды - 7,0 - 7,2. Культура интенсивно ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рамзону, галактозу, маннит, слабо - инозит, сахарозу, не ферментирует сорбит; восстанавливает нитраты, не выделяет индол, амилазоположителен. Не обладает антагонизмом к E. coli, S.aureus.Physiological and biochemical: aerob, temperature optimum 28 - 30 o C, pH of the medium - 7.0 - 7.2. The culture intensively ferments glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, ramzon, galactose, mannitol, weakly - inositol, sucrose, does not ferment sorbitol; restores nitrates, does not secrete indole, amyl-positive. It does not have antagonism to E. coli, S.aureus.
Устойчивость к антибиотикам: высокочувствителен к стрептомицину, эритромицину, сульфатиазолу, гентамицину; устойчив к левомицетину, пенициллину, оксациллину, полимиксину, ристомицину, линкомицину, карбенициллину. Resistance to antibiotics: highly sensitive to streptomycin, erythromycin, sulfathiazole, gentamicin; resistant to chloramphenicol, penicillin, oxacillin, polymyxin, ristomycin, lincomycin, carbenicillin.
Штамм хранится в лиофильном состоянии и в питательной среде под слоем вазелинового масла. Для культивирования Streptomyces sp. применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат - 37, NaCl - 5, вода - остальное, pH 7,2. Культивирование проводят при 30oC с интенсивной аэрацией в течение 48 час. Выход целевого фермента 50000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 50000 ед/мл, что в несколько раз выше, чем в прототипе.The strain is stored in a lyophilic state and in a nutrient medium under a layer of liquid paraffin. For cultivation of Streptomyces sp. the following composition is used (g / l): fish hydrolyzate - 37, NaCl - 5, water - the rest, pH 7.2. The cultivation is carried out at 30 o C with intensive aeration for 48 hours. The yield of the target enzyme is 50,000 units / g of crude biomass with a specific activity of 50,000 units / ml, which is several times higher than in the prototype.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:
- высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип,
- высокая стабильность фермента (сохранение активности в течение двух лет хранения при - 20oC),
- термостабильность фермента, в результате чего сокращается процесс выделения.The defining difference of the proposed strain from the strain of the prototype is:
- high productivity of the strain, exceeding the prototype strain in this indicator,
- high stability of the enzyme (maintaining activity for two years of storage at -20 o C),
- thermostability of the enzyme, resulting in a reduced process of selection.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CTGCAG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень". Since the proposed strain was obtained for the first time and has never been used to isolate a restriction enzyme having a 5'-CTGCAG-3 'recognition site, it can be concluded that the proposed strain meets the criteria of the invention of "novelty" and "inventive step".
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Ssp12-I (дор. 1) и PstI ("СибЭнзим", сайт узнавания 5'-CTGCAG-3'), (дор. 2), PstI и Ssp12-I (дор.3). The drawing shows an electrophoregram of the products of hydrolysis of DNA of phage lambda enzyme Ssp12-I (dor. 1) and PstI (SibEnzyme, recognition site 5'-CTGCAG-3 '), dor. 2), PstI and Ssp12-I (dor. 3).
Как видно из представленной фигуры, индентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию. As can be seen from the presented figure, the identity of the splitting bands during parallel and joint hydrolysis confirms their isoshisomerism.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента. Example 1. Obtaining biomass and isolation of the enzyme.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 30oC. После 10 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы с питательной средой, содержащей следующие компоненты (г/л): рыбный гидролизат - 37, NaCl - 5, вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 30oC с аэрацией, при перемешивании - 250 об/мин. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4 - 5oC. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по методике [4] с модификацией [5].Before starting work, the cells of the producer strain are subcultured with a bacteriological loop on an agar medium. Petri dishes are placed in a thermostat at 30 o C. After 10 hours of incubation, the grown cells are transplanted into flasks with a nutrient medium containing the following components (g / l): fish hydrolyzate - 37, NaCl - 5, distilled water - the rest. The cultivation is carried out at 30 o C with aeration, with stirring - 250 rpm Cells are harvested by centrifugation at 1500 g and a temperature of 4 - 5 o C. Disintegration, isolation and purification is carried out according to the method [4] with modification [5].
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента. Example 2. Determination of the specificity and activity of the enzyme.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (см. чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 - 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CTGCAG-3'. The specificity of the enzyme is determined by the picture of parallel and joint hydrolysis of substrate DNA (see drawing). The identity of the hydrolysis patterns on 1-3 paths suggests that these enzymes recognize and cleave the same nucleotide sequence 5'-CTGCAG-3 '.
Выход фермента определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37oC. Выход фермента составляет 50000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 50000 ед/мл.The enzyme yield is determined by the electrophoretic picture of the hydrolysis of lambda phage DNA. The unit of activity is the minimum amount of enzyme necessary for complete cleavage of 1 μg of lambda phage DNA for 1 h at a temperature of 37 o C. The enzyme yield is 50,000 units / g of crude biomass, specific activity is 50,000 units / ml.
Фермент хранится при -20oC в глицерине.The enzyme is stored at -20 o C in glycerol.
Пример 3. Определение термоустойчивости фермента. Example 3. Determination of thermal stability of the enzyme.
Гидролиз ДНК фага лямбда проводят в стандартных условиях, но при температуре 50oC. Фермент сохраняет свою активность в данных условиях, что подтверждает его термостабильность (таблица 1).Hydrolysis of lambda phage DNA is carried out under standard conditions, but at a temperature of 50 o C. The enzyme retains its activity under these conditions, which confirms its thermal stability (table 1).
Гидролиз проводят в стандартных условиях в течение 60 мин. Hydrolysis is carried out under standard conditions for 60 minutes
Пример 4. Определение активности фермента в зависимости от времени хранения при -20oC. Определение активности проводят в стандартных условиях периодически в течение двух лет хранения рестриктазы (таблица 2). Поскольку рестриктаза имеет сайт узнавания 5'-CTGCAG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Sal PI, она может заменить прототип во всех генноинженерных работах.Example 4. The determination of the activity of the enzyme depending on the storage time at -20 o C. The determination of activity is carried out under standard conditions periodically for two years of storage of restrictase (table 2). Since the restriction enzyme has a 5'-CTGCAG-3 'recognition site identical to the Sal PI restriction enzyme recognition site, it can replace the prototype in all genetic engineering activities.
Список литературы
1. Smith D.I. et al (1976) Nucl. Acids Res 3: 343-353.List of references
1. Smith DI et al (1976) Nucl. Acids Res 3: 343-353.
2. Lebenka A.Y., Chitavichyus D.B. (1988) Biokhimia 53: 1895 - 1899. 2. Lebenka A.Y., Chitavichyus D.B. (1988) Biokhimia 53: 1895 - 1899.
3. Carter, J.A., Chater, K.F., Bruton, C.J., Brown, N.L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4943-4954. 3. Carter, J.A., Chater, K.F., Bruton, C.J., Brown, N.L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4943-4954.
4. Green P. J. et al (1978) Nucleic Acids Res. 5: 2373-2380. 4. Green P. J. et al (1978) Nucleic Acids Res. 5: 2373-2380.
5. Авторское свидетельство СССР N 1406159, 1988.1 5. Copyright certificate of the USSR N 1406159, 1988.1
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97116083/13A RU2135581C1 (en) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97116083/13A RU2135581C1 (en) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97116083A RU97116083A (en) | 1999-06-20 |
| RU2135581C1 true RU2135581C1 (en) | 1999-08-27 |
Family
ID=20197522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97116083/13A RU2135581C1 (en) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2135581C1 (en) |
-
1997
- 1997-09-26 RU RU97116083/13A patent/RU2135581C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Carter J.A. et al. Nucleis Acids Res, 1980, 8, p.4943-4954. Smith D.l et al. Nucl. Acids Res. 1976, 3, p.343-353. Green P.J. et al. Nucleis Acids Res. 1978, 5, p.2373-2380. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sekar et al. | Optimization studies on the production of cyclosporin A by solid state fermentation | |
| CN103509728B (en) | Produce the construction process of Coenzyme Q10 99.0 engineering bacteria, engineering bacteria and application method | |
| CN111621435A (en) | Myxobacteria and application thereof | |
| RU2500811C1 (en) | Recombinant bacillus subtilis bacteria strain-producer of specific phospholipase | |
| RU2135581C1 (en) | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' | |
| RU2266323C2 (en) | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence | |
| RU2021373C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilis producing restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′- cctnagc- 3′ | |
| RU1806191C (en) | Strain of bacterium micrococcus species - a producer of restrictase msp | |
| RU2115728C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ggtnacc-3' | |
| RU2073717C1 (en) | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' | |
| RU2057806C1 (en) | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-gatnnnn-atc-3′ | |
| RU2038380C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′-cc(a/t)-gg-3′ | |
| RU2046142C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilus - a producer of restriction endonuclease bpu 19-1 | |
| RU2105811C1 (en) | Strain of bacterium deleya aquamarina - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5'-gtgcac-3' | |
| RU2040540C1 (en) | Strain of bacteria bacillus coagulants being producer of side specific endonuclease which is enable to identify and to cleave series of 5′-ct(a/g)(t/c)ag-3′ nucleotides | |
| RU2077577C1 (en) | Strain of bacterium deleya marina - a producer of alkaline phosphatase and a method of alkaline phosphatase preparing | |
| RU2037522C1 (en) | Strain of bacterium bacillus species - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5'-(a/g)-ccgg-(t/c)-3' | |
| RU2053299C1 (en) | Strain of bacterium bacillus badius - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-(a/t)ccgg(a/t)-3′ | |
| RU2384619C1 (en) | STREPTOMYCIN-RESISTANT STRAIN Bacillus sp ARCIM B-9862, PRODUCER OF EXTRACELLULAR ALKALINE RIBONUCLEASE | |
| SU1645300A1 (en) | Streptomyces fradiae strain: producer of restrictase sfr 1 | |
| RU2270859C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS SUBTILIS AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Bisi | |
| RU2110573C1 (en) | Strain of bacterium photobacterium phosphoreum - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-gg(t/c)(ag)cc-3' | |
| RU2670054C1 (en) | BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM ICIS-310 BACTERIUM STRAIN - PRODUCER OF INHIBITOR OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINE INF-γ | |
| RU2034922C1 (en) | Strain of bacterium acinetobacter calcoaceticus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ggtacc-3' | |
| RU2018533C1 (en) | Strain of micrococcus varians bacteria producing endonuclease of restriction which recognizes and splints sequence of nucleotides 5′-ttcgaa-3' |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040927 |