RU2073717C1 - Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' - Google Patents
Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' Download PDFInfo
- Publication number
- RU2073717C1 RU2073717C1 RU94005709A RU94005709A RU2073717C1 RU 2073717 C1 RU2073717 C1 RU 2073717C1 RU 94005709 A RU94005709 A RU 94005709A RU 94005709 A RU94005709 A RU 94005709A RU 2073717 C1 RU2073717 C1 RU 2073717C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- ccnnnnnnngg
- restrictase
- enzyme
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3'.The invention relates to the microbiological industry and genetic engineering and relates to the production of a new strain producing a site-specific endonuclease capable of recognizing and cleaving the 5 ′ -CCNNNNNNNGG-3 ′ nucleotide sequence.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. A restriction enzyme of this specificity can be used to study the primary structure of DNA, the physical mapping of various genomes. This endonuclease is a convenient model for studying the specificity of protein-nuclein interactions.
Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspV 1 и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCTGC-3' и 5'-TCCGGA-3', соответственно) [1] Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3'. Обе эти рестриктазы являются термолабильными. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.A known strain of Bacillus species M producing restriction enzymes BspV 1 and BspM II (recognition sites 5 ' -ACCTGC-3 ' and 5 ' -TCCGGA-3 ' , respectively) [1] The disadvantage of this strain is that there are 2 restriction enzymes in one biomass . This complicates the purification procedure, and not one of the restriction enzymes is able to recognize and cleave the nucleotide sequence 5 ' -CCNNNNNNNGG-3 ' . Both of these restrictase are thermolabile. The cultural and biotechnological properties of the strain have not been published.
Известен штамм Bacillus caldolyticus, продуцирующий рестриктазу Bcl I (сайт узнавания 5'-TGATCA-3') [2] Данная рестриктаза является термостабильной. Недостатком данного штамма является то, что он имеет прочную клеточную оболочку. Для разрушения требуется несколько актов дезынтеграции. Кроме того, рестриктаза, выделенная из данного штамма не способна расщеплять последовательность неклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3'.A known strain of Bacillus caldolyticus producing the restriction enzyme Bcl I (recognition site 5 ' -TGATCA-3 ' ) [2] This restriction enzyme is thermostable. The disadvantage of this strain is that it has a strong cell membrane. Destruction requires several acts of disintegration. In addition, the restriction enzyme isolated from this strain is not able to cleave the sequence of non-cleotides 5 ' -CCNNNNNNNGG-3 ' .
Наиболее близким к заявляемому штамму прототипом, является штамм Bacillus stearothermophilus, продуцирующий рестриктазу Bsi Y I, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3' [3]
Для культивирования этого штамма требуется традиционная богатая среда, культивирование ведется при температуре 60oС. Продуцируемая им рестриктаза является термостабильной. Недостатками данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 1000 ед/г сырой биомассы.The closest to the claimed strain of the prototype, is a strain of Bacillus stearothermophilus, producing the restriction enzyme Bsi YI, recognizing and cleaving the sequence of nucleotides 5 ' -CCNNNNNNNGG-3 ' [3]
The cultivation of this strain requires a traditional rich medium, cultivation is carried out at a temperature of 60 o C. The restriction enzyme produced by it is thermostable. The disadvantages of this strain is that the yield of restrictase does not exceed 1000 u / g of raw biomass.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CCNNNNNNN- 3', с высоким выходом фермента.An object of the invention is to obtain a strain that produces thermostable restrictase, recognizing and cleaving the nucleotide sequence of 5 ' -CCNNNNNNN-3 ' , with a high yield of the enzyme.
Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus schlegelii 4 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bsc 4 I. This goal is achieved by the identification and use of a strain of Bacillus schlegelii 4 producer site-specific restriction enzyme Bsc 4 I.
Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. The proposed strain isolated from the soil as a result of a search for restriction enzyme producers.
Полученный штамм Basillus chilegelii 4 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6310, а продуцируемая им рестриктаза названа Bsc4 I согласно общепринятой номенклатуре. The obtained strain of Basillus chilegelii 4 was deposited in VKPM All-Russian Research Institute of Genetics under registration number B-6310, and the restriction enzyme produced by it was named Bsc4 I according to the generally accepted nomenclature.
Штамм Bacillus schlegelii характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.The strain of Bacillus schlegelii is characterized by the following features:
Morphological signs.
Клетки палочковидные, прямые, 0,5 0,6 х 1,5 2 мкл, очень подвижные. Расположены одиночно, парами и в коротких цепочках. Образуют эндоспоры сферической формы, расположенные преимущественно терминально или субтерминально, превышают размеры вегетативной клетки, напоминают по форме барабанную палочку. The cells are rod-shaped, straight, 0.5 0.6 x 1.5 2 μl, very mobile. Located singly, in pairs and in short chains. They form endospores of a spherical shape, located mainly terminally or subterminally, exceed the size of the vegetative cell, resemble the shape of a drumstick.
Окраска по Граму грамположительны. Gram stain is gram-positive.
Культуральные признаки. Cultural signs.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует округлые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем, на влажных агаризованных пластинах образуют равномерный газон. The strain is undemanding to growth factors, grows well on ordinary nutrient media (SPA, MPA, MPB). On agarized media forms rounded, non-pigmented colonies, shiny, with a smooth edge, on wet agarized plates form a uniform lawn.
Оптимальная температура роста 60oС, но наблюдается рост и при 37oС, рН 7,0 7,2.The optimum growth temperature is 60 o C, but growth is also observed at 37 o C, pH 7.0 7.2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70oС или в лиофильно-высушенном состоянии.The culture is maintained by reseeding on solid media, stored in a solution of glycerol at 70 o C or in a freeze-dried state.
Физиологические признаки. Physiological signs.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин; каталазоположителен; не растет при концентрации NaCl 5% на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре. Does not reduce nitrates, negative in reaction with methyl red and Voges-Proskauer; does not hydrolyze starch, casein; catalase positive; does not grow at 5% NaCl concentration on 0.002% sodium azide and on Saburo medium; no growth was observed in anaerobic agar.
Для культивирования Bacillus schlegelii В-6310 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 3, глюкоза 5, вода дистиллировання остальное. Культивирование проводят при 60oС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.For the cultivation of Bacillus schlegelii B-6310, the following composition is used (g / l): peptone 10, yeast extract 3, glucose 5, and the rest is distilled water. The cultivation is carried out at 60 o C and intensive aeration until the growth retardation phase is reached.
Выход целевого фермента 5000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл. The yield of the target enzyme is 5,000 u / g crude biomass with a specific activity of 10,000 u / ml.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются его высокая продуктивность. The defining difference of the proposed strain from the strain of the prototype is its high productivity.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CCNNNNNNNGG- 3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".Since the proposed strain was obtained for the first time and was never used to isolate a restriction enzyme having the recognition site 5 ′ -CCNNNNNNNGG-3 ′ , we can conclude that the proposed strain meets the criteria of the invention of “novelty” and “inventive step”.
Изобретение иллюстрируется следующей фигурой графического изображения. The invention is illustrated by the following figure of a graphic image.
На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bsc4 I (дор.1), Bsc4 I и Bsl I (New England Biolabs, сайт узнавания 5'-CCNNNNNNNGG- 3') (дор.2), Bsl I (дор. 3), фаг лямбда (дор. 4).The drawing shows an electrophoregram of the products of hydrolysis of DNA of phage lambda enzyme Bsc4 I (d.1), Bsc4 I and Bsl I (New England Biolabs, recognition site 5 ' -CCNNNNNNNGG-3 ' ) (d.2), Bsl I (d. 3 ), phage lambda (dor. 4).
Как видно из представленной фигуры, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию. As can be seen from the presented figure, the identity of the splitting bands in parallel and joint hydrolysis confirms their isoshisomerism.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента. Example 1. Obtaining biomass and isolation of the enzyme.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60oС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л):
пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 3, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60oС с аэрацией 1,5 объем/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4oС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.Before starting work, the cells of the producer strain are subcultured with a bacteriological loop on an agar medium. Petri dishes are placed in a thermostat at 60 o C. After a 10-hour incubation, the grown cells are transplanted into flasks with fresh nutrient medium consisting of (g / l):
peptone 10, yeast extract (Difco) 3, glucose 5, distilled water the rest. The cultivation is carried out at 60 o With aeration of 1.5 vol / min, with stirring 150 rpm, until the phase of growth retardation. Cells are harvested by centrifugation at 1500 g and a temperature of 4 o C. Disintegration, isolation and purification were carried out according to the method of Bickle, Pirotta, Imber [4]
Example 2. Determination of the specificity and activity of the enzyme.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3'.The specificity of the enzyme is determined by the picture of parallel and joint hydrolysis of substrate DNA (drawing). The identity of the hydrolysis patterns on 1–3 paths suggests that these enzymes recognize and cleave the same nucleotide sequence 5 ′ -CCNNNNNNNGG-3 ′ .
Выход фермента Bsc 4 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60oС. Выход фермента составляет 5.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.The yield of the Bsc 4 I enzyme is determined by the electrophoretic picture of hydrolysis of lambda phage DNA. The unit of activity is the minimum amount of enzyme necessary for complete cleavage of 1 μg of lambda phage DNA for 1 h at a temperature of 60 o C. The enzyme yield is 5.000 u / g of raw biomass, specific activity is 10.000 u / ml.
Фермент хранится при -20oС в глицерине.The enzyme is stored at -20 o C in glycerol.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнением с известным:
высокая продуктивность штамма;
Поскольку рестриктаза Bsc 4 I имеет сайт узнавания 5'- CCNNNNNNNGG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Bsi Y I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.Thus, the obtained strain having the following advantage in comparison with the known:
high strain productivity;
Since the restriction enzyme Bsc 4 I has a 5 ' recognition site - CCNNNNNNNGG-3 ' identical to the Bsi YI restriction enzyme recognition site, it can replace the prototype in all genetic engineering activities.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94005709A RU2073717C1 (en) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94005709A RU2073717C1 (en) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94005709A RU94005709A (en) | 1995-10-20 |
| RU2073717C1 true RU2073717C1 (en) | 1997-02-20 |
Family
ID=20152650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94005709A RU2073717C1 (en) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2073717C1 (en) |
-
1994
- 1994-02-08 RU RU94005709A patent/RU2073717C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1.Catalog New England Biolabs.- USA, 1988/89. 2.Bingham A.H.A., Atkinson T., Sciaky D., Roberts R.J. Nucl. Acids Res. - 1978, v. 5, p. 3457 - 3467. 3. Catalog New England Biolabs.- USA, 1992. 4. Bickle T.A., Pirotta V., Ymber R. Nucl. Acids Res.- 1977, v.4, p. 2561 - 2572. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdel-Fattah et al. | Biodegradation of feather waste by keratinase produced from newly isolated Bacillus licheniformis ALW1 | |
| RU2288263C2 (en) | Strain bacillus coagulants sim-7 dsm 14043 for preparing l-(+)-lactate and method for preparing l-(+)-lactate | |
| Hashimoto et al. | Thermostable acid protease produced by Penicillium duponti K1014, a true thermophilic fungus newly isolated from compost | |
| RU2073717C1 (en) | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' | |
| RU2057806C1 (en) | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-gatnnnn-atc-3′ | |
| RU2046142C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilus - a producer of restriction endonuclease bpu 19-1 | |
| RU2021373C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilis producing restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′- cctnagc- 3′ | |
| RU2037522C1 (en) | Strain of bacterium bacillus species - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5'-(a/g)-ccgg-(t/c)-3' | |
| RU2054040C1 (en) | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of site-specific endonuclease which recognizes and splits the nucleotide sequence 5′-ctcttc-3′ | |
| RU2040540C1 (en) | Strain of bacteria bacillus coagulants being producer of side specific endonuclease which is enable to identify and to cleave series of 5′-ct(a/g)(t/c)ag-3′ nucleotides | |
| RU2053299C1 (en) | Strain of bacterium bacillus badius - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-(a/t)ccgg(a/t)-3′ | |
| RU2115728C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ggtnacc-3' | |
| RU2110573C1 (en) | Strain of bacterium photobacterium phosphoreum - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-gg(t/c)(ag)cc-3' | |
| RU2034922C1 (en) | Strain of bacterium acinetobacter calcoaceticus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ggtacc-3' | |
| RU2038380C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′-cc(a/t)-gg-3′ | |
| RU2266323C2 (en) | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence | |
| RU2105811C1 (en) | Strain of bacterium deleya aquamarina - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5'-gtgcac-3' | |
| RU1806191C (en) | Strain of bacterium micrococcus species - a producer of restrictase msp | |
| RU2135581C1 (en) | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' | |
| SU1694647A1 (en) | Strain of bacteria bacillus brevis - a producer of restrictase bbvi 21 | |
| JP3514799B2 (en) | Lipase and microorganism producing the same | |
| Umar et al. | Production of Fibrinolytic Enzyme by Soil Actinobacteria: Production of Fibrinolytic Enzyme by Soil Actinobacteria | |
| SU1532583A1 (en) | Strain of paracoccus denitrificans bacteria as producer of endonuclease of restriction pde 12 i | |
| SU1659480A1 (en) | Strain of bacterium klebsiella pneumoniae - a producer of restrictase kpn 378 1 | |
| KR100511048B1 (en) | Bacillus licheniformis mutant gn-m10 and production method of protease with it |