RU2102754C1

RU2102754C1 - Method of examination of intravascular platelet aggregation in vitro

Info

Publication number: RU2102754C1
Application number: RU96102105A
Authority: RU
Inventors: Е.И. Иконникова; П.Я. Довгалевский; Л.А. Черноусова; И.Р. Мошкина
Original assignee: Саратовский научно-исследовательский институт кардиологии при СГМУ МЗ и МП России
Priority date: 1996-02-05
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 1998-01-20

Abstract

FIELD: medicine, hematology. SUBSTANCE: method involves blood taking off, its stabilization, separation for plasma and erythrocytes, preparing platelet-enriched plasma, platelet disaggregation and analysis of data obtained. Blood is stabilized with sodium citrate (concentration is 3.8%) at ratio = 9:1. Separation of blood components is carried out by centrifugation and enriched and depleted fractions with respect to platelets content were obtained. For each patient blood sample extreme values of light transparency were determined: 100% for platelet-depleted plasma and 0% - for platelet-enriched plasma. Degree of intravascular platelet disaggregation is determined using disaggregation curve where maximal value of disaggregation radius is measured. Sample temperature is 36.5-37.5 C followed by stirring that increases precision of method. EFFECT: simplified and increased precision of method. 3 cl, 2 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, к области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для диагностики заболеваний с повышенной тромбогенной опасностью. The invention relates to medicine, to the field of hematology, namely to hemostasis, and can be used to diagnose diseases with increased thrombogenic hazard.

Известен способ определения микроагрегатов тромбоцитов, основанный на определении микроагрегатов крови по электропроводности ее, при этом микроагрегаты рассматриваются как дисперсная фаза, а кровь как гетерогенная среда, состоящая с одной стороны из плазмы и форменных элементов, с другой - из микроагрегатов (авт. св. СССР N 899039, кл. A 61 B 5/14. А.С.Осьмак, В.В. Петраш и др.). Данное изобретение использует чувствительный кондуктометрический способ измерения, позволяющий независимо от исходных свойств крови получать достоверные данные об объеме микроагрегатов. Однако описанный способ вместе с заявляемым устройством не позволяет получать достоверные данные об объеме микроагрегатов диаметром ниже 20 25 мкм. Если учесть, что размер тромбоцита составляет в среднем 1,5 4 мкм (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М. 1968, с. 86), то более мелкие скопления тромбоцитов данным способом выявить невозможно. A known method of determining platelet microaggregates based on the determination of blood microaggregates by its electrical conductivity, while microaggregates are considered as a dispersed phase, and blood as a heterogeneous medium, consisting on the one hand of plasma and uniform elements, on the other hand of microaggregates (ed. St. USSR N 899039, class A 61 B 5/14. A.S. Osmak, V.V. Petrash and others). This invention uses a sensitive conductometric method of measurement, allowing, regardless of the initial properties of the blood to obtain reliable data on the volume of microaggregates. However, the described method together with the inventive device does not allow to obtain reliable data on the volume of microaggregates with a diameter below 20 25 microns. If you consider that the size of the platelet is an average of 1.5 to 4 μm (Handbook of clinical laboratory research methods. M. 1968, p. 86), then smaller accumulations of platelets in this way cannot be detected.

Известен также турбидиметрический способ исследования агрегации тромбоцитов, предложенный в 1962 г. Born G.V.R. (Born G.V.R. Nature, 1962. - Vol 194, р. 927). Метод Борна широко используется как инструмент исследования, однако светопропускание суспензии тромбоцитов зависит от большого числа недостаточно учитываемых параметров формы тромбоцитов, поглощения света плазмой крови, распределения агрегатов по размерам и т.д. (Born G.V.R. Hume M. Nature, 1967. Vol 215. P 1027; Latimer P. Born G.V.R. Michal F.Arch. biochem. biophys. 1977. Vol 180, p 151: O'Brien Y.R. Acta med. scand. - 1967. Vol 525. Suppl. P 43). При этом возможны случаи, когда два образца различаются количеством вошедших в агрегаты тромбоцитов и размером образующихся агрегатов и в то же время обладают одинаковой оптической плотностью, т.е. светопропускание неоднозначно характеризует размер образующихся агрегатов. (Nichols A.R. Bosmann H.B. Thrombos. Heamostas. Stuttq. 1979. 42. S 679). Also known is a turbidimetric method for studying platelet aggregation, proposed in 1962 by Born G.V.R. (Born G.V.R. Nature, 1962. - Vol 194, p. 927). The Born method is widely used as a research tool, however, the light transmission of a platelet suspension depends on a large number of insufficiently taken into account platelet shape parameters, light absorption by blood plasma, aggregate size distribution, etc. (Born GVR Hume M. Nature, 1967. Vol 215. P 1027; Latimer P. Born GVR Michal F. Arch. Biochem. Biophys. 1977. Vol 180, p 151: O'Brien YR Acta med. Scand. - 1967. Vol 525. Suppl. P 43). In this case, there may be cases when two samples differ in the number of platelets entering the aggregates and the size of the formed aggregates and at the same time have the same optical density, i.e. light transmission ambiguously characterizes the size of the aggregates formed. (Nichols A.R. Bosmann H. B. Thrombos. Heamostas. Stuttq. 1979. 42. S 679).

Для изучения внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro использован метод, позволяющий получать информацию о процессе агрегации тромбоцитов, который в корне отличается от данных стандартного турбидиметрического метода (Габбасов З. А. Попов Е.Г. и др. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro. БЭБМ, 1989, N10, с. 437 439). Однако данный способ недостаточно информативен, поскольку не учитывает внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов. To study intravascular platelet aggregation in vitro, a method was used that allows obtaining information about the platelet aggregation process, which is fundamentally different from the data of the standard turbidimetric method (Gabbasov Z. A. Popov E.G. et al. A new methodological approach to the study of platelet aggregation in vitro BEBM, 1989, N10, p. 437 439). However, this method is not sufficiently informative, since it does not take into account intravascular platelet aggregation.

Известен также способ исследования спонтанной агрегации тромбоцитов (З. Т. Сабиржанова. Воздействие сезонного колебания метеофакторов на агрегацию тромбоцитов у больных гипертонической болезнью в условиях жаркого климата с учетом параметров центральной и периферической гемодинамики. Автореф. канд. дисс. Ташкент, 1993). Автор изучает спонтанную агрегацию тромбоцитов, не зависящую от какого-либо из механизмов запуска агрегационного процесса. Однако недостатком этого способа является отсутствие информации об агрегации тромбоцитов, которая уже имеется в сосудистом русле пациента. There is also a method for studying spontaneous platelet aggregation (Z. T. Sabirzhanova. The effect of seasonal fluctuations of meteorological factors on platelet aggregation in patients with hypertension in a hot climate, taking into account the parameters of central and peripheral hemodynamics. Abstract. Cand. Diss. Tashkent, 1993). The author studies spontaneous platelet aggregation, which is independent of any of the mechanisms of triggering the aggregation process. However, the disadvantage of this method is the lack of information on platelet aggregation, which is already available in the vascular bed of the patient.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ исследования спонтанной агрегации тромбоцитов по Wu K.K. Hoak J.C. (Lancet, 1974, v. 2, p. 924) в модификации Н.И. Тарасовой (В кн. В.П.Балуда, З.С.Баркаган и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск, 1980). По данному способу, механизм которого сходен с заявляемым, о степени внутрисосудистой агрегации тромбоцитов судят по степени дезагрегации. Осуществляют забор крови в две пробирки: в 1 в формалин ЭДТА-раствор, который немедленно фиксирует как имевшиеся в циркуляции агрегаты, так и отдельно лежащие тромбоциты, во 2
с дезагрегантом ЭДТА, далее в камере Горяева проводят подсчет тромбоцитов из 1 и 2 пробирок, по разнице тромбоцитов судят о спонтанной внутрисосудистой агрегации. Недостатком способа является субъективизм анализа, вызванный погрешностью счета в камере Горяева под микроскопом, трудоемкость способа, поскольку для каждого пациента необходимо просчитать количество тромбоцитов в двух пробах: с дезагрегатом и с фиксатором, неравномерность заполнения камеры Горяева тромбоцитами. Сами авторы отмечают, что причиной ошибок может быть позднее смешивание крови с растворами-стабилизаторами, что приводит к свертыванию крови, которая исследованию не подлежит, неправильный подсчет тромбоцитов, неточности отмеривания и т.д.Closest to the proposed method is a method for studying spontaneous platelet aggregation according to Wu KK Hoak JC (Lancet, 1974, v. 2, p. 924) in the modification of N.I. Tarasova (In the book. V.P. Baluda, Z.S. Barkagan and other Laboratory methods for studying the hemostasis system. Tomsk, 1980). According to this method, the mechanism of which is similar to the claimed, the degree of intravascular platelet aggregation is judged by the degree of disaggregation. Blood sampling is carried out in two test tubes: in 1 in formalin, an EDTA solution, which immediately fixes both the aggregates available in the circulation and separately lying platelets, in 2
with the EDTA disaggregant, then in the Goryaev’s chamber platelets from 1 and 2 tubes are counted, spontaneous intravascular aggregation is judged by the difference in platelets. The disadvantage of this method is the subjectivity of the analysis, caused by the error in the account in the Goryaev’s chamber under a microscope, the complexity of the method, since for each patient it is necessary to calculate the number of platelets in two samples: with a disaggregate and with a fixer, the unevenness of filling the Goryaev’s chamber with platelets. The authors themselves note that the cause of errors may be later mixing of blood with stabilizing solutions, which leads to blood coagulation, which cannot be investigated, incorrect platelet counts, inaccurate measurements, etc.

Целью изобретения является упрощение способа при повышении точности с получением документальных данных. The aim of the invention is to simplify the method while increasing accuracy with obtaining documentary data.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе исследования внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro, включающем забор крови, стабилизацию ее, разделение крови на плазму и эритроциты с получением богатой тромбоцитами плазмы, дезагрегацию ее, анализ полученных данных, по которому судят о степени агрегации, стабилизацию крови после забора осуществляют цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, разделение крови с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП), проводят центрифугирование до введения дезагреганта, из части БТП получают обедненную тромбоцитами плазму (ОТП), для проб каждого пациента определяют экстремальные значения светопропускания: по ОТП 100% светопропускания, по БТП 0% после введения дезагреганта снимают кривую дезагрегации, на которой фиксируют величину максимального значения радиуса дезагрегации, по которой судят о степени внутрисосудистой агрегации. The essence of the proposed method lies in the fact that in a method for studying intravascular platelet aggregation in vitro, including blood sampling, stabilization, separation of blood into plasma and red blood cells to produce platelet-rich plasma, its disaggregation, analysis of the data obtained, which judge the degree of aggregation, blood stabilization after sampling is carried out with sodium citrate 3.8% in a 9: 1 ratio, blood is separated to obtain platelet-rich plasma (BTP), centrifugation is carried out before the introduction of the disaggregant, from the part of BTP the floor platelet-depleted plasma (OTP) is studied, extreme light transmission values are determined for each patient’s samples: 100% light transmission from OTP, 0% after BTP after disaggregant administration, the disaggregation curve is recorded, on which the value of the maximum value of the disaggregation radius is recorded, which determines the degree of intravascular aggregation .

Кроме того, модификацией способа является обеспечение точности исследования за счет проведения способа в условиях, максимально приближенных к тем, которые соответствуют живому организму, а именно: до введения дезагреганта обеспечивают температуру пробы 36,5 37,5^oC.In addition, a modification of the method is to ensure the accuracy of the study by carrying out the method under conditions as close as possible to those that correspond to a living organism, namely: prior to the introduction of the disaggregant, the sample temperature is 36.5 37.5 ^o C.

Способ отличается еще и тем, что исследование идет при постоянном перемешивании, кривую дезагрегации снимают графопростроением, непрерывно, в динамике. The method also differs in that the study is carried out with constant stirring, the disaggregation curve is removed by graph-forming, continuously, in dynamics.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для получения БТП. 0,35 мл БТП центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин для получения ОТП. Для каждого образца крови пациента определяют экстремальные значения светопропускания: по 0,3 мл ОТП 100% светопропускания, по 0,3 мл БТП 0% причем к 0,3 мл БТП добавляют 0,01 мл физиологического раствора хлорида натрия для уравнивания сравниваемых объемов. Затем 0,3 мл БТП помещают в кювету прибора, 3 мин прогревают при 37^oC, опускают мешалку, включают перемешивание, через 30 с добавляют 0,01 мл 0,1 М раствора динатриевой соли ЭДТА и получают графически зарегистрированную в течение 6 мин кривую дезагрегации, по максимальной величине радиуса дезагрегации судят о величине внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.The inventive method is as follows. Blood is taken with sodium citrate 3.8% in a 9: 1 ratio, centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm to obtain BTP. 0.35 ml of BTP is centrifuged for 20 minutes at 5,000 rpm to obtain OTP. For each patient’s blood sample, extreme light transmission values are determined: 0.3 ml of OTP of 100% light transmission, 0.3 ml of BTP 0%, and 0.3 ml of BTP add 0.01 ml of physiological sodium chloride solution to equalize the compared volumes. Then 0.3 ml of BTP is placed in a cuvette of the device, 3 minutes are heated at 37 ^° C, the mixer is lowered, stirring is turned on, after 30 seconds 0.01 ml of 0.1 M solution of EDTA disodium salt is added and a curve is obtained that is graphically recorded for 6 minutes disaggregation, the maximum value of the radius of the disaggregation is judged on the value of intravascular platelet aggregation.

Пример 1. Больная К. 59 лет, поступила в клинику НИИ кардиологии в первые сутки острого трансмурального переднебокового инфаркта миокарда в тяжелом состоянии с гемодинамическими нарушениями. Сразу при поступлении у больной взята кровь для исследования. Цель исследования: в соответствии с описанием заявляемого способа определить внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов у больной К. Забор крови в количестве 5 мл проводили из локтевой вены с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, сразу же однократно перемешивали опрокидыванием пробирки, центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин для получения БТП. 0,35 мл БТП отбирали и вновь центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин (на центрифуге ОПН-8) для получения ОТП. Далее по 0,3 мл ОТП устанавливали 100% светопропускания, к 0,3 мл БТП добавляли 0,01 мл 0,9% раствора хлорида натрия и устанавливали 0% светопропускания. Затем вновь отбирали 0,3 мл БТП в кювету, помещали ее в прибор, 3 мин прогревали плазму при 37^oC, опускали мешалку в кювету, включали перемешивание. На 30-й секунде добавляли 0,01 мл 0,1 М раствора динатриевой соли ЭДТА, в течение 6 мин проводили графическую регистрацию процесса дезагрегации. Находили максимальную величину радиуса дезагрегации на двухканальном лазерном анализаторе тромбоцитов, модель 230LA НПФ БИОЛА. У больной К. он составил 3,38.Example 1. Patient K., 59 years old, was admitted to the clinic of the Research Institute of Cardiology on the first day of acute transmural anterolateral myocardial infarction in serious condition with hemodynamic disorders. Immediately upon admission, the patient took blood for research. The purpose of the study: in accordance with the description of the proposed method, to determine the intravascular platelet aggregation in patient K. Blood sampling in an amount of 5 ml was performed from the ulnar vein with sodium citrate 3.8% in a ratio of 9: 1, immediately mixed once by capsizing the tube, centrifuged for 10 min at 1000 rpm to obtain BTP. 0.35 ml of BTP was collected and centrifuged again for 20 min at 5000 rpm (in an OPN-8 centrifuge) to obtain an OTP. Then, 0.3 ml of OTP was set to 100% light transmission, to 0.3 ml of BTP, 0.01 ml of 0.9% sodium chloride solution was added, and 0% light transmission was set. Then 0.3 ml of BTP was again taken into the cuvette, placed in the device, the plasma was heated at 37 ^° C for 3 min, the mixer was lowered into the cuvette, and stirring was turned on. At the 30th second, 0.01 ml of a 0.1 M solution of EDTA disodium salt was added, and the disaggregation process was graphically recorded over 6 minutes. We found the maximum value of the radius of disaggregation on a two-channel laser platelet analyzer, model 230LA NPF BIOLA. Patient K., he amounted to 3.38.

На фиг. 1 представлена кривая дезагрегации больной К. На фиг. 2 представлена кривая дезагрегации здорового донора А. 20 лет, радиус дезагрегации у данного исследуемого составил 0,13. In FIG. 1 shows a disaggregation curve of patient K. FIG. Figure 2 shows the disaggregation curve of a healthy donor A. 20 years, the radius of disaggregation in this study was 0.13.

Примеры 2 20. По вышеизложенной технологии исследования проверена внутрисосудистая агрегация тромбоцитов у 10 здоровых доноров и у 20 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в возрасте 48 70 лет. Examples 2 20. According to the foregoing research technology, intravascular platelet aggregation was verified in 10 healthy donors and in 20 patients with coronary heart disease (CHD) aged 48 70 years.

Внутрисосудистая агрегация тромбоцитов изучена у 10 здоровых лиц в возрасте 19 21 года и у 20 больных ИБС в возрасте 48 70 лет. Результаты полученных исследований представлены в табл. 1. Intravascular platelet aggregation was studied in 10 healthy individuals aged 19 to 21 years and in 20 patients with coronary heart disease aged 48 to 70 years. The results of the studies are presented in table. one.

По радиусу дезагрегации судят о внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. При контрольной проверке другими методами получено совпадение результатов, что свидетельствует о пригодности предлагаемого способа в лечебной практике. The intravascular platelet aggregation is judged by the radius of the disaggregation. During the control check by other methods, a coincidence of the results was obtained, which indicates the suitability of the proposed method in medical practice.

Claims

1. A method of studying intravascular platelet aggregation in vitro, including blood sampling, stabilization, separation into plasma and red blood cells to obtain platelet-rich plasma, platelet disaggregation, analysis of the data obtained, which judge the degree of aggregation, characterized in that blood stabilization after sampling carry out sodium citrate 3.8% in a ratio of 9 1, the blood is separated to obtain platelet-rich plasma by centrifugation, before the introduction of the disaggregant from part of the platelet-rich plasma I get depleted, for the sample of each patient, the extreme values of light transmission are determined, 100% light transmission from platelet-poor plasma, 0% from platelet-rich plasma after the introduction of the disaggregant, the disaggregation curve is recorded, on which the value of the maximum value of the disaggregation radius is recorded, according to which the degree of intravascular aggregation is measured .

2. The method according to p. 1, characterized in that prior to the introduction of the disaggregant provide a sample temperature of 36.5 37.5 ^o With subsequent mixing.

3. The method according to claim 1 or claims 1 and 2, characterized in that the disaggregation curve is removed by graph construction, continuously, in dynamics.