RU2188419C2

RU2188419C2 - Method for studying anti-aggregation action of preparations by determining blood platelet aggregation in vitro

Info

Publication number: RU2188419C2
Application number: RU2000116475A
Authority: RU
Inventors: В.Г. Ионова; З.А. Суслина; Е.Г. Демина
Original assignee: Научно-исследовательский институт неврологии РАМН
Priority date: 2000-06-27
Filing date: 2000-06-27
Publication date: 2002-08-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves taking blood sample, stabilizing the sample, separating plasma reach in blood platelets by means of centrifuging, adding anti-aggregation agent, mixing and incubating plasma with and without the preparation at 36.5-37.5 C. Test system having anti-aggregation preparations of various mechanisms anti- aggregation activity with respect to blood platelets is applied. Preparation concentration in the test system is selected starting from the taken single dose. Blood platelets aggregation level index is to be determined before and after introducing the anti-aggregation preparation as adenosine diphosphate-induced blood platelets aggregation. Adenosine diphosphate-induced blood platelets aggregation of a preparation being by 50% and more different from the control sample, the preparation is considered to be efficient. EFFECT: enhanced effectiveness in individually selecting preparations.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованиям патологических процессов в артериальной системе кровоснабжения человека для улучшения профилактики и лечения больных в ангионеврологических и кардиологических клиниках путем применения антитромбоцитарных препаратов. The invention relates to medicine, namely to research of pathological processes in the arterial system of human blood supply to improve the prevention and treatment of patients in angioeurological and cardiological clinics through the use of antiplatelet drugs.

Известен способ исследования активации тромбоцитов (патент RU 2108579, кл. G 01 N 33/49, 1996), согласно которому данные характеристики тромбоцитов исследуются по интенсивности светорассеяния при различных условиях разбавления плазмы крови. Последние позволяют варьировать среду и проводить исследования при значениях концентрации ионов кальция в среде, близких к физиологическим. Однако в данном способе не задействована оценка многообразных механизмов активации тромбоцитарной клетки. A known method for studying platelet activation (patent RU 2108579, class G 01 N 33/49, 1996), according to which these characteristics of platelets are studied by light scattering intensity under various conditions of dilution of blood plasma. The latter allows you to vary the environment and conduct research at values of the concentration of calcium ions in the environment, close to physiological. However, in this method, the assessment of the diverse mechanisms of platelet activation is not involved.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ исследования внутрисосудистой агрегеции тромбоцитов in vitro с помощью дезагрегантов (патент RU 2102754, кл. G 01 N 33/48, G 01 N 33/49, 1996), включающий забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, инкубации плазмы при 36,5-37,5^oС с последующим перемешиванием и введением антиагрегационного препарата. О величине внутрисосудистой агрегации судят по кривой дезагрегации.Closest to the proposed method is a method of studying intravascular platelet aggregation in vitro using antiplatelet agents (patent RU 2102754, class G 01 N 33/48, G 01 N 33/49, 1996), including blood sampling, stabilization after collection, separation to obtain platelet-rich plasma by centrifugation, plasma incubation at 36.5-37.5 ^o With subsequent mixing and the introduction of anti-aggregation drug. The magnitude of intravascular aggregation is judged by the disaggregation curve.

Однако данным способом невозможно определить степень индивидуальной чувствительности человека к тому или иному антиагрегационному препарату. However, in this way it is impossible to determine the degree of individual sensitivity of a person to a particular anti-aggregation drug.

В механизмах действия антиагрегационных препаратов на тромбоцитарные клетки ведущую роль играет изменение рецепторной чувствительности мембран тромбоцитов. Эти пути, как правило, включают связывание индуктора агрегации со своим рецептором на внешней мембране тромбоцита и передачу сигнала внутри клетки путем изменения концентрации внутриклеточных метаболитов. Эти два процесса приводят к активации рецепторов фибриногена, вследствие чего происходит его рецепция и связывание клеток друг с другом фибриногеновыми мостиками с образованием клеточных агрегатов. Это сопровождается образованием активированных форм тромбоцитов и их агрегатов. In the mechanisms of action of antiplatelet drugs on platelet cells, the leading role is played by a change in the receptor sensitivity of platelet membranes. These pathways typically involve binding of the aggregation inducer to its receptor on the outer platelet membrane and signal transmission within the cell by changing the concentration of intracellular metabolites. These two processes lead to the activation of fibrinogen receptors, as a result of which its reception and binding of cells to each other by fibrinogen bridges occurs with the formation of cell aggregates. This is accompanied by the formation of activated forms of platelets and their aggregates.

Активация тромбоцитов может быть вызвана множеством агонистов (АДФ, адреналином, коллагеном, и т.д.), которые действуют через специфические рецепторы на поверхности тромбоцитов. Platelet activation can be caused by many agonists (ADP, adrenaline, collagen, etc.) that act through specific receptors on the surface of platelets.

Формирование клеточного ответа заключается в последовательной активации систем регуляции концентраций вторичных посредников с образованием цепи передач сигнала и является общим для различных клеток. Существование в кровяных пластинках многочисленных мембрано-связанных внутриклеточных механизмов активации позволяет вовлекать многоступенчатую модуляцию активности клеток в процессе тромбообразования. Все это определяет существование и многообразие биологически активных соединений, обладающих способностью изменять функцию тромбоцитов и способствующих вовлечению в процесс как активаторных, так и ингибиторных внутри клеточных механизмов. К числу биологически активных соединений, в том числе, используемых в качестве лекарственных средств, относятся препараты, обладающие способностью модулировать функцию тромбоцитов посредством вовлечения в процессы ингибирования фософолипазы А2 циклооксигеназы, тромбоксансинтетазы, изменение фосфолипидной композиции мембран клеток, образования внутриклеточных посредников - циклических аденозин- и гуанозинфосфатов и оксидазота, а также блокирование специфических рецепторов на мембране клеток. The formation of the cellular response consists in the sequential activation of systems for regulating the concentrations of secondary intermediaries with the formation of a signal transmission chain and is common to various cells. The existence of numerous membrane-bound intracellular activation mechanisms in blood plates allows the involvement of multistage modulation of cell activity during thrombosis. All this determines the existence and variety of biologically active compounds that have the ability to change the function of platelets and contribute to the involvement in the process of both activator and inhibitory mechanisms within the cell. Biologically active compounds, including those used as medicines, include drugs that are able to modulate platelet function by involving cyclooxygenase, thromboxane synthetase, phospholipid synthesis of cell membranes, and the formation of intracellular mediators, cyclic adenosine and guanosine phosphates, in the inhibition of phosphosolipase A2. and oxidase, as well as blocking specific receptors on the cell membrane.

Исследование эффективности антиагрегантов с различными механизмами действия дает возможность выявлять индивидуальную резистентность к ним у отдельных больных. Это открывает пути повышения эффективности антиагрегационнного действия препаратов посредством индивидуального подбора лекарственных средств на основе данных предварительного исследования чувствительности к ним тромбоцитов крови больных. The study of the effectiveness of antiplatelet agents with various mechanisms of action makes it possible to identify individual resistance to them in individual patients. This opens up ways to increase the effectiveness of the antiplatelet action of drugs through individual selection of drugs based on data from a preliminary study of the sensitivity of blood platelets to patients.

Техническим результатом является повышение эффективности антиагрегационного действия препаратов за счет определения индивидуальной чувствительности больных к антиагрегантам с использованием методики агрегации тромбоцитов in vitro. The technical result is to increase the effectiveness of the antiplatelet action of drugs by determining the individual sensitivity of patients to antiplatelet agents using in vitro platelet aggregation techniques.

Он достигается тем, что в способе исследования антиагрегационного действия препаратов с помощью определения агрегации тромбоцитов in vitro, включающем забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, введение антиагрегационного препарата с последующим перемешиванием, инкубации плазмы с препаратом и без него при 36,5-37,5^oC, определения информационного показателя до введения антиагрегационного препарата, после его введения и анализ полученных данных, по которым судят об эффективности ингибирующего действия, дополнительно используют тест-систему из антиагрегационных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного воздействия на тромбоциты, концентрацию препарата в тест-системе выбирают, исходя из принятой однократной его дозы, информационный показатель рассчитывают по каждому тесту и по результатам расчета выбирают наиболее эффективный препарат для назначения больному, а при отрицательном информационном показателе назначают омега-3-полиненасыщенные жирные кислоты.It is achieved by the fact that in the method for studying the antiplatelet effect of drugs by determining platelet aggregation in vitro, including blood sampling, stabilizing it after collection, separation to obtain platelet-rich plasma by centrifugation, the introduction of an antiplatelet drug, followed by mixing, plasma incubation with the drug and without at 36,5-37,5 ^o C, determining the information rate to administration antiagregatsionnogo drug after administration and analysis of the data, which appears on the effectiveness of the inhibitory effect, additionally use a test system of anti-aggregation drugs that have different mechanisms of anti-aggregation effects on platelets, the concentration of the drug in the test system is selected based on the accepted single dose, the information indicator is calculated for each test and the most effective are selected according to the calculation results a drug for prescribing to a patient, and with a negative information indicator, omega-3-polyunsaturated fatty acids are prescribed.

Кроме того, в качестве информационного показателя используют показатель степени агрегации тромбоцитов-АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (АДФ-АТ), разовую дозу антиагрегационного агента выбирают в случае снижения АДФ-АТ по сравнению с измеренным без воздействия препарата на 50 и более процентов, а в случае отсутствия эффективного снижения АДФ-AT в качестве дополнительного антиагреганта в виде омега-3-полиненасыщенных жирных кислот используют эйконол. In addition, platelet aggregation-ADP-induced platelet aggregation (ADP-AT) is used as an information indicator, a single dose of an anti-aggregation agent is chosen in the case of a decrease in ADP-AT compared to that measured without exposure to the drug by 50 percent or more, and in in the absence of an effective reduction in ADP-AT, eikonol is used as an additional antiplatelet agent in the form of omega-3 polyunsaturated fatty acids.

Тест-система для определения агрегации тромбоцитов является удобной моделью для оценки ингибирования процесса агрегации различными биологически активными соединениями, в том числе, лекарственными препаратами. До сих пор не было попыток внедрить модельные тромбоцитарные тест-системы в каждодневную лабораторную клиническую диагностику с целью индивидуальной оценки воздействия лекарственных средств на функцию тромбоцитов. Это представляется важной задачей, поскольку, несмотря на широкий спектр препаратов с антиагрегантными свойствами. До сих пор остается не ясной эффективность их применения для лечения и профилактики состояний у больных с цереброваскулярной патологией. The test system for determining platelet aggregation is a convenient model for assessing the inhibition of the aggregation process by various biologically active compounds, including drugs. So far, there have been no attempts to introduce model platelet test systems in everyday laboratory clinical diagnostics in order to individually assess the effect of drugs on platelet function. This seems to be an important task, because, despite a wide range of drugs with antiplatelet properties. The effectiveness of their use for the treatment and prevention of conditions in patients with cerebrovascular pathology remains unclear.

Исследования действия препаратов с антиагрегантными свойствами в опытах in vitro с помощью тромбоцитарной тест-системы проведено у 722 больных с цереброваскулярной патологией. Оценивали ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов ряда препаратов (аспирин, кавинтон, трентал, сермион, вазобрал, БАД-алликор) в сопоставлении степени АДФ-АТ после инкубации с препаратом с параллельной пробой без лекарственного средства. При этом рассматривали как антиагрегантный, так и проагрегантный эффекты препаратов. Соответственно проводился учет частоты встречаемости in vitro резистентности тромбоцитов к воздействию вышеперечисленных препаратов. Studies of the action of drugs with antiplatelet properties in in vitro experiments using a platelet test system were performed in 722 patients with cerebrovascular pathology. The inhibitory effect on platelet aggregation of a number of drugs (aspirin, cavinton, trental, sermion, vazobral, dietary supplement allicor) was evaluated in comparison with the degree of ADP-AT after incubation with the drug with a parallel sample without a drug. At the same time, both antiaggregant and proaggregant effects of the drugs were considered. Accordingly, the incidence of in vitro platelet resistance to the effects of the above drugs was taken into account.

Установлено, что у более одной четверти больных эти препараты в дозировках, принятых для однократного приема лекарств, оказываются не только не эффективны, но и оказывают проагрегантный эффект на тромбоциты. В этом случае, а также во всех случаях, когда информационный показатель АДФ-АТ агрегации тромбоцитов по сравнению с измеренным без воздействия препаратов не снижается на 50 или более процентов, или даже, наоборот, повышается, используют омега-3 ПНЖК. Данные соединения с одной стороны, оказывают мягкое антиагрегационное действие на клетки крови пациента, и с другой - способны потенцировать антиагрегационное действие таких лекарственных средств, как аспирин, кавинтон, вазобрал и т.д. Данные результаты открывают новые возможности в антиагрегационной терапии. It was found that in more than one quarter of patients, these drugs in dosages taken for a single dose of drugs are not only ineffective, but also have a pro-aggregate effect on platelets. In this case, as well as in all cases when the information indicator of ADP-AT of platelet aggregation as compared with that measured without drug exposure does not decrease by 50 or more percent, or even, on the contrary, increases, use omega-3 PUFAs. These compounds, on the one hand, have a mild antiaggregation effect on the patient’s blood cells, and on the other hand, they are able to potentiate the antiaggregation effect of drugs such as aspirin, cavinton, vazobral, etc. These results open up new possibilities in antiplatelet therapy.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. The inventive method is as follows.

Кровь забирают в пластиковую центрифужную пробирку объемом более 10 мл с 1 мл раствора антикоагулянта (цитрата натрия). Стабилизируют после забора 130 мМ раствором цитрата натрия в отношении 1/9 и медленно перемешивают. Центрифугируют при 200 g (1400 оборотов в минуту) в течение 10 минут для получения богатой тромбоцитами плазмы. Далее 2,5 мл супернатанта отбирают. Оставшуюся кровь центрифугируют при 3000 оборотов в минуту для получения бедной тромбоцитами плазмы, которая используется для разведения богатой тромбоцитами плазмы до фиксированной объемной концентрации тромбоцитов. Blood is collected in a plastic centrifuge tube with a volume of more than 10 ml with 1 ml of an anticoagulant solution (sodium citrate). After sampling, stabilize with a 130 mM sodium citrate solution in a ratio of 1/9 and mix slowly. Centrifuge at 200 g (1400 rpm) for 10 minutes to obtain platelet-rich plasma. Next, 2.5 ml of the supernatant is collected. The remaining blood is centrifuged at 3000 rpm to obtain platelet-poor plasma, which is used to dilute platelet-rich plasma to a fixed volumetric platelet concentration.

Вводят один из антиагрегационных препаратов тест-системы и пробы с препаратами инкубируют при температуре 36,5-37,5^oС в течение 5 минут до проведения измерения. Добавляют индуктор агрегации, в частности АДФ, записывают кривую агрегации тромбоцитов в агрегометре в течение 5 минут. Таким образом измеряют АДФ-АТ в параллельных пробах до введения препарата и после его введения.One of the anti-aggregation preparations of the test system is introduced and samples with the preparations are incubated at a temperature of 36.5-37.5 ^o C for 5 minutes before the measurement. Aggregation inductor, in particular ADP, is added, and the platelet aggregation curve is recorded in an aggregometer for 5 minutes. Thus, ADP-AT is measured in parallel samples before and after administration of the drug.

Затем в параллельную пробу вводят другой антиагрегационный препарат, пользуясь той же последовательностью операций. Анализируют изменения АДФ-АТ под влиянием препарата в сравнении с пробой без лекарственного средства (контроль). Хороший эффект действия препарата считается при снижении АДФ-AT на 50% и более от контрольной пробы. В данном случае препарат рекомендуется больному. Then, another anti-aggregation drug is introduced into the parallel sample using the same sequence of operations. Analyze changes in ADP-AT under the influence of the drug in comparison with a sample without a drug (control). A good effect of the drug is considered with a decrease in ADP-AT by 50% or more from the control sample. In this case, the drug is recommended to the patient.

В случаях отсутствия эффекта или проявления проагрегантного действия нескольких препаратов больным назначают препарат омега-3 ПНЖК. Последний влияет на липидный состав плазмы и мембран клеток крови, оказывает антиагрегационное действие, в частности, это относится и к эйконолу. Последний содержит до 30% омега-3 ПНЖК. Нами установлено, что он cпособствует восстановлению чувствительности тромбоцитов к воздействию антиагрегантов у больных с хронической цереброваскулярной патологией на фоне выраженного атеросклеротического поражения магистральных артерий головы. Это подтверждается тестированием чувствительности тромбоцитов к препаратам до курса лечения и после него. Так, после курса лечения препаратами омега-3 ПНЖК при тестировании эффекта препаратов, таких, как аспирин, кавинтон, трентал, сермион и др. установлено снижение АДФ-AT на 22% (р<0,05). In cases where there is no effect or manifestation of the aggregate action of several drugs, patients are prescribed an omega-3 PUFA preparation. The latter affects the lipid composition of plasma and blood cell membranes, has an anti-aggregation effect, in particular, this applies to eikonol. The latter contains up to 30% omega-3 PUFAs. We found that it contributes to the restoration of platelet sensitivity to the effects of antiplatelet agents in patients with chronic cerebrovascular pathology against the background of severe atherosclerotic lesions of the main arteries of the head. This is confirmed by testing the sensitivity of platelets to drugs before and after treatment. So, after a course of treatment with omega-3 PUFAs, when testing the effect of drugs such as aspirin, cavinton, trental, sermion, etc., a decrease in ADP-AT by 22% (p <0.05) was found.

Claims

A method for studying the anti-aggregation effect of drugs by determining platelet aggregation in vitro, including blood sampling, stabilization after blood sampling, separation to obtain platelet-rich plasma by centrifugation, administration of an anti-aggregation drug, followed by mixing, plasma incubation with and without plasma at 36.5 -37.5 ^o C, determining the information indicator before the introduction of the anti-aggregation drug, after the introduction and analysis of the data obtained, which judge the effectiveness of the drug for prescribing to a patient, characterized in that a test system of anti-aggregation preparations having different mechanisms of anti-aggregation action on platelets is used as a test drug, and an indicator of the degree of platelet aggregation - ADP-induced platelet aggregation (ADP-AT) is used as an information indicator and calculated it for each test, in the case of a decrease in the ADP-AT of the drug by 50% or more of the control sample, the drug is determined as effective.