RU2099947C1

RU2099947C1 - Biopreparation phytosporin for plant protection from illnesses

Info

Publication number: RU2099947C1
Application number: RU96121980/13A
Authority: RU
Inventors: Валерий Вениаминович Смирнов; Ua]; Ирина Борисовна Сорокулова; Татьяна Григорьевна Бережницкая; Георгий Моисеевич Ваньянц; Тать на Григорьевна Бережницка; Магдан Янфаевич Менликиев; Владимир Дмитриевич Недорезков; нц Георгий Моисеевич Вань; Михаил Иванович Минеев; Ru]; Венер Абсаттарович Вахитов; Фаниля Абузаровна Байгузина; Фанил Абузаровна Байгузина
Original assignee: Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины; Научно-производственное объединение "Башкирское"
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1996-11-15
Publication date: 1997-12-27

Abstract

FIELD: biotechnology, agriculture. SUBSTANCE: biopreparation has the strain of bacterium Bacillus subtilis VNIISHM-128 at concentration $$$ cells/1 ml physiological solution at amount 92-98 vol.% and filling agent at amount 2-8 vol. %. Above indicated strain shows high antagonistic activity with respect to broad spectrum of phytopathogenic bacteria and fungi and can be used for protection of different plant species. Phytosporin is ecologically pure and harmless preparation. EFFECT: improved quality, enhanced effectiveness of biopreparation. 6 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития фитопатогенных микроорганизмов. The invention relates to biotechnology, and in particular to biological products intended to inhibit the development of phytopathogenic microorganisms.

В настоящее время известны биопрепараты, подавляющие развитие фитопатогенных бактерий (1), грибов (2,3). Однако неизвестны препараты на основе живых микробных культур, которые обладали бы одновременно высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов. Currently known biological products that inhibit the development of phytopathogenic bacteria (1), fungi (2,3). However, drugs based on living microbial cultures that would have simultaneously high antagonistic activity against a wide range of phytopathogenic bacteria and fungi are unknown.

Наиболее близким к изобретению является препарат бактофит (4), основу которого составляет штамм Bacillus subtilis. Бактофит применяется для обработки огурцов защищенного грунта против грибных поражений, однако этот препарат не оказывает действия при бактериальных заболеваниях растений. Closest to the invention is the preparation bactofit (4), the basis of which is a strain of Bacillus subtilis. Bactofit is used to treat cucumbers of protected soil against fungal infections, but this drug does not have an effect on bacterial diseases of plants.

Задачей изобретения является создание биопрепарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными бактериями и грибами. The objective of the invention is the creation of a biological product to protect plants from diseases caused by phytopathogenic bacteria and fungi.

Поставленная задача решается применением препарата фитоспорин, который содержит в качестве основы культуру Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, характеризующуюся выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов. The problem is solved by the use of the drug phytosporin, which contains as a basis the culture of Bacillus subtilis VNIISKHM 128, characterized by pronounced antagonistic activity against a wide range of phytopathogenic bacteria and fungi.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки B. subtilis ВНИИСХМ 128 и наполнитель,об. The preparation contains living cells of B. subtilis VNIISCHM 128 and a filler, vol.

Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10⁹ 1•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 92-98
Наполнитель 8 2
Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.B. subtilis biomass VNIISKhM 128 1 • 10 ⁹ 1 • 10 ¹⁰ live microbial cells in 1 ml of physiological saline 92-98
Filler 8 2
The need for a filler is due to its protective effect for bacterial cells during further freeze drying of the drug.

В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат и т.д. предпочтительно сахарозожелатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). As a filler, the drug may contain bovine serum (cattle), milk, reverse, etc. preferably a sugar gelatin mixture (4% sucrose, 1% gelatin).

Культура, составляющая основу биопрепарата характеризуется следующими свойствами:
B. subtilis ВНИИСХМ 128 грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Через 18 ч роста на МПА в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки с закругленными краями размером 1,9х0,5 мкм, расположенные одиночно, попарно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно эндоспоры, которые не раздувают клетку и расположены центрально. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-β-оксимасляной кислоты. При культивировании штамма на МПА, среде Громыко, сусло-агаре в течении 24 ч при 37^oC образуются складчатые колонии с изрезанным краем, вязкой консистенции, телесного цвета. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных условиях, не образует индол и сероводород. Не обладает лецитиназной, коагулазной, гиалуронидазной активностью.The culture that forms the basis of a biological product is characterized by the following properties:
B. subtilis VNIISCHM 128 gram-positive aerobic spore-forming bacilli producing catalase. After 18 hours of growth on MPA, straight rod-shaped cells with rounded edges of 1.9x0.5 μm in size, located singly, in pairs or in the form of chains, are found in culture smears. Cells are motile, form aerobic endospores that do not inflate the cell and are located centrally. After growth on glucose agar, inclusions of poly-β-hydroxybutyric acid are not detected in the protoplasm. When the strain is cultivated on MPA, Gromyko medium, wort agar for 24 hours at 37 ^° C, folded colonies with a cut edge, viscous consistency, and flesh color are formed. The culture ferments glucose, arabinose, xylose, maltose, galactose, lactose, mannitol, sucrose to form an acid without gas. It gives a positive Foges-Proskauer reaction, hydrolyzes starch, gelatin, does not hydrolyze urea, utilizes citrate, and does not use propionate. It does not grow under anaerobic conditions, does not form indole and hydrogen sulfide. It does not have lecithinase, coagulase, hyaluronidase activity.

Пример 1 На основе штамма B. subtilis ВНИИСХМ 128 с типичными морфологическими, культурными, биохимическими свойствами приготовлены пять вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата. Example 1 Based on the B. subtilis strain VNIISKhM 128 with typical morphological, cultural, biochemical properties, five variants of the preparation were prepared with different contents of microbial cells in the composition of the preparation.

Вариант 1. Option 1.

Препарат, содержащий, об%
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 0,5•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 92
Наполнитель (сыворотка крови КРС) 8
Вариант 2
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 94
Наполнитель (молоко) 6
Вариант 3
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 95
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 5
Вариант 4
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 97
Наполнитель (сыворотка крови КРС) 3
Вариант 5
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 5•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 98
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 2
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы, высушивали лиофильно, ампулы запаивали.A drug containing,%
B. subtilis biomass VNIISKhM 128 0.5 • 10 ⁸ live microbial cells in 1 ml of physiological saline 92
Filler (cattle serum) 8
Option 2
B. subtilis biomass VNIISKhM 128 1 • 10 ⁹ live microbial cells in 1 ml of physiological saline 94
Filler (milk) 6
Option 3
B. subtilis biomass VNIISKhM 128 5 • 10 ⁹ live microbial cells in 1 ml of physiological saline 95
Filler (4% sucrose + 1% gelatin) 5
Option 4
B. subtilis biomass VNIISKhM 128 1 • 10 ¹⁰ living microbial cells in 1 ml of physiological saline 97
Filler (cattle serum) 3
Option 5
B. subtilis biomass VNIISKhM 128 5 • 10 ¹⁰ live microbial cells in 1 ml of physiological saline 98
Filler (4% sucrose + 1% gelatin) 2
The prepared versions of the drug were poured into sterile ampoules, freeze-dried, and the ampoules were sealed.

Проверяли безвредность для животных полученных вариантов препарата, а также специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп фитопатогенных бактерий и грибов. We tested the harmlessness of the obtained drug variants for animals, as well as the specific antagonistic activity against test cultures - representatives of various groups of phytopathogenic bacteria and fungi.

Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 16 18 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения. To determine the safety, the contents of the ampoule were diluted in 0.5 ml of physiological saline and this dose was administered orally to the mouse. At least 10 mice weighing 16–18 g were used for each variant of the drug. The drug was considered harmless if all the mice remained alive for five days of observation.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 (для изучения активности в отношении бактериальных тест-культур) и на картофельный агар (для исследования антагонистической активности в отношении тест-культур грибов). Посевы инкубировали в термостате при 28^oC в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур бактерий и суспензии грибных спор в физиологическом растворе). Чашки с тест-культурами бактерий инкубировали в термостате при 37^oC в течение 18 ч, с грибными тест-культурами при 28^oC в течение 5 сут. Учет результатов проводили по величине зон подавления роста тест-культур. Контролем роста тест-кукльтур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 и картофельным агаром без культуры-антагониста.To determine the specific activity, the antagonistic activity of the drug variants with respect to test cultures was investigated. The study was carried out by the method of delayed antagonism. For this, the contents of the ampoule were dissolved in 1 ml of physiological saline. The resulting suspension was seeded with a loop in the center of a Petri dish with agarized Gauze medium No. 2 (for studying activity against bacterial test cultures) and on potato agar (for studying antagonistic activity against fungal test cultures). Crops were incubated in a thermostat at 28 ^° C for 72 hours. Then, test microorganisms (500 million suspension of daily bacterial cultures and suspension of fungal spores in physiological saline) were seeded to the grown culture. Cups with bacterial test cultures were incubated in an incubator at 37 ^° C for 18 hours, with mushroom test cultures at 28 ^° C for 5 days. The results were taken into account by the size of the zones of inhibition of growth of test cultures. The growth of test dolls was controlled by their parallel growth on plates with agarized Gauze medium No. 2 and potato agar without an antagonist culture.

Полученные данные в результате испытаний представлены в табл. 1. The data obtained as a result of the tests are presented in table. one.

Как видно из представленных в таблице данных, оптимальные количества живых микробных клеток B. subtilis ВНИИСХМ 128 в 1 мл физиологического раствора составляют 1•10⁹ 1•10¹⁰ клеток при их объемном содержании 92-98% Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.As can be seen from the data presented in the table, the optimal amounts of living microbial cells of B. subtilis VNIISXM 128 in 1 ml of physiological saline are 1 • 10 ⁹ 1 • 10 ¹⁰ cells with a volume content of 92-98%. Further increase in the number of microbial cells does not change significantly specific activity of the drug against test cultures of microorganisms.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата фитоспорин безвредны для животных и характеризуются специфической антагонистической активностью в отношении тест-культур фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому предлагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются. Thus, the data obtained indicate that the studied variants of the drug phytosporin are harmless to animals and are characterized by specific antagonistic activity against test cultures of phytopathogenic microorganisms. Therefore, the proposed quantitative characteristics of living microbial cells in the preparation are experimentally confirmed.

Пример 2. Препарат фитоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов (табл. 2 и 3). Example 2. The drug phytosporin is characterized by high antagonistic activity against a wide range of phytopathogenic bacteria and fungi (Tables 2 and 3).

Пример 3. Фитоспорин безвреден для лабораторных животных. Введение препарата животным различными способами даже в значительных дозах не вызывает гибели и патологических изменений внутренних органов. Результаты исследования безвредности штамма B. subtilis ВНИИСХМ 128, составляющего основу препарата, представлены в табл. 4. Example 3. Phytosporin is harmless to laboratory animals. The introduction of the drug to animals in various ways, even in significant doses, does not cause death and pathological changes in internal organs. The results of the study of the harmlessness of the B. subtilis strain VNIISKHM 128, which forms the basis of the drug, are presented in table. 4.

Пример 4. Препарат фитоспорин применен для защиты растений от бактериальных и грибных болезней. Вегетационный опыт проводили в гончарных вазонах емкостью 3 л с почвенно-песчаной смесью. Повторность опыта пятикратная. Глубина заделки семян, густота всходов соответствует видовым особенностям каждого растения. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% от полной влагоемкости. Семена пшеницы сорта "Мироновская 808", ячменная сорта "Ида", гороха сорта "Уладовский" замачивали 12 ч в суспензии фитоспорина из расчета 1 доза препарата (1•10⁹ живых микробных клеток) в 1 мл водопроводной воды. В контроле семена замачивали в водопроводной воде. Учет поражаемости корневыми гнилями и фузариозным увяданием зерновых проводили в фазу колошения, а для гороха в фазу цветения. Результаты представлены в табл. 5.Example 4. The drug phytosporin is used to protect plants from bacterial and fungal diseases. The vegetation experiment was carried out in pottery flowerpots with a capacity of 3 l with a soil-sand mixture. The repetition of the experiment fivefold. The depth of seed placement, the density of seedlings corresponds to the species characteristics of each plant. Soil moisture was maintained at 60% of total moisture capacity. Mironovskaya 808 wheat seeds, Ida barley seeds, Uladovsky peas were soaked for 12 hours in a phytosporin suspension at the rate of 1 dose of the preparation (1 • 10 ⁹ live microbial cells) in 1 ml of tap water. In the control, the seeds were soaked in tap water. The account of root rot susceptibility and Fusarium wilting of cereals was carried out in the earing phase, and for peas in the flowering phase. The results are presented in table. 5.

Изучали также эффективность фитоспорина для защиты голосеменных растений от фузариоза корневой шейки. Семена растений замачивали в течении 18 ч в суспензии фитоспорина (из расчета 1 доза препарата в 1 мл водопроводной воды). Затем семена высевали в сильнозараженную почву теплиц с пленочным покрытием. В табл. 6 представлены результаты проведенных испытаний. We also studied the effectiveness of phytosporin for the protection of gymnosperms from fusarium of the root neck. Plant seeds were soaked for 18 hours in a suspension of phytosporin (at the rate of 1 dose in 1 ml of tap water). Then the seeds were sown in highly contaminated soil of film-coated greenhouses. In the table. 6 presents the results of the tests.

Таким образом фитоспорин может быть использован в качестве средства защиты растений от фитопатогенных бактерий и грибов. Thus, phytosporin can be used as a means of protecting plants from phytopathogenic bacteria and fungi.

Литература
1. Кузнецова М.А. Филиппов А.В. Ризоплан и фитофтороз картофеля // Защита растений, 1995, N 8, с. 19-20.Literature
1. Kuznetsova M.A. Filippov A.V. Rhizoplan and late blight of potato // Plant Protection, 1995, N 8, p. 19-20.

2. Биофунгицидный споровый препарат против фузариозов кукурузы // Авторское свидетельство СССР N 256150. 2. Biofungicidal spore preparation against corn fusariosis // USSR author's certificate N 256150.

3. Средство профилактической защиты семян, клубней и наземных частей растений, содержащее Bacillus subtilis IBE 711 и его метаболиты с повышенной фунгицидной активностью // Авторское свидетельство СССР N 262504. 3. A means of preventive protection of seeds, tubers and terrestrial parts of plants, containing Bacillus subtilis IBE 711 and its metabolites with increased fungicidal activity // USSR Author's Certificate N 262504.

4. Список химических и биологических средств борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками, регуляторов роста и феромонов, разрешенных для применения в сельском, в том числе фермерском, лесном и коммунальном хозяйствах на 1992-1996 г. // Защита растений. 1993, N 3, с. 68-72. 4. List of chemical and biological agents for controlling pests, plant diseases and weeds, growth regulators and pheromones approved for use in agriculture, including farming, forestry and communal services for 1992-1996 // Plant Protection. 1993, N 3, p. 68-72.

Claims

A biological product for protecting plants from diseases, including the living biomass of Bacillus subtilis bacteria and an excipient, characterized in that it contains the biomass of the Bacillus subtilis VNIISCHM 128 strain of bacteria in the following ratio of components, vol.

The biomass of the bacterial strain B. subtilis VNIISKHM 128 (1 • 10 ⁹ 1 • 10 ¹⁰ live microbial cells in 1 ml of physiological saline) - 92 98
Filler 2 8o