RU2096458C1 - Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 - Google Patents
Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2096458C1 RU2096458C1 RU94022863A RU94022863A RU2096458C1 RU 2096458 C1 RU2096458 C1 RU 2096458C1 RU 94022863 A RU94022863 A RU 94022863A RU 94022863 A RU94022863 A RU 94022863A RU 2096458 C1 RU2096458 C1 RU 2096458C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- toxin
- receptor
- fragment
- hybrid
- hybrid receptor
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология и медицина. Сущность: получение гибридного рецепторотоксина S304, состоящего из двух фрагментов. Первый фрагмент является фрагментом дифтерийного токсина, а второй - фрагментом CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека. Гибридный белок ингибирует цитопатическое действие вируса иммунодефицита человека. Кроме того, сущность изобретения заключается в получении фрагмента ДНК NS304, кодирующего данный рецепторотоксин. 2 с.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и вирусологии и представляет собой гибридный полипептид рецепторотоксин, в котором токсическая часть представляет собой А-фрагмент и неполный B-фрагмент дифтерийного токсина (DT), а рецепторная часть N-концевой фрагмент CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека. Полипептид проявляет антивирусную (вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)) активность в системе in vitro и является потенциальным терапевтическим агентом при синдроме приобретенного иммунодефицита, вызываемого ВИЧ. ВИЧ при попадании в организм человека поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Основным путем проникновения ВИЧ в клетку является взаимодействие гликопротеина оболочки вируса gp120 с CD4-рецептором. В этом взаимодействии ключевую роль играют первые два иммуноглобулинподобных домена CD4, расположенных на N-конце молекулы (первые 180 аминокислот) (Nature, 312, 159 161, 1988; 331, 82 84, 1988). На поверхности зараженной клетки экспрессируется gp120 ВИЧ. Показано, что различные растворимые рекомбинантные формы CD4-рецептора, связываясь с ВИЧ, ингибируют как процесс проникновения вируса в чувствительные клетки, так и вирусиндуцированное образование синцитий (Nature, 331, 76 78, 1988; 331, 78 81, 1988). Это предполагает, что различные рекомбинантные формы CD4-рецептора могут быть потенциальными антивирусными агентами при лечении ВИЧ-инфекции. Действие рецепторотоксина основано не только на конкурентном связывании ВИЧ, но и на направленном элиминировании зараженных клеток, так как на поверхности последних экспрессируется вирусный гликопротеин gp120. Например, было показано, что рецепторотоксин на основе CD4-рецептора и экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa блокирует развитие ВИЧ-инфекции in vitro и активен против клеток, экспрессирующих гликопротеины оболочки от различных ретровирусов иммунодефицита приматов (PNAS USA, 86, 9539 9543, 1989).
Дифтерийный токсин принадлежит к группе токсинов, способных инактивировать белоксинтезирующий аппарат эукариотической клетки. В DT каталитической активностью обладает N-концевая часть молекулы А-фрагмент (J. Biolog. Chem. 4265, 7331 7337, 1990).
Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид S304, состоящий из полипептида продукта фрагмента гена дифтерийного токсина и полипептида продукта фрагмента гена CD4-рецептора, обладающий анти-ВИЧ активностью in vitro; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид S304.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение и экспрессия в Escherichia coli гибридного полипептида S304.
Гибридный полипептид синтезируется в бактериальной системе E. coli с использованием экспрессирующих плазмидных векторов. В качестве штаммов-продуцентов были использованы трансформированные экспрессирующими векторами производные штаммов TG1 и BL21(DE3). Внедрение плазмидной ДНК в клетки E. coli проводили путем их трансформации с использованием хлорида кальция (J. Mol. Biol. 166, 557 580, 1983).
Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей гибридный полипептид, была получена путем объединения в составе экспрессирующих векторов последовательностей ДНК, кодирующих фрагменты CD4-рецептора и дифтерийного токсина. Из Т-лимфоцитов периферической крови человека выделяли ДНК (Eur. J. Biochem. 36, 32, 1973), которую затем амплифицировали с помощью цепной полимеразной реакции (Meth. Enzymol. 155, 335, 1987) с использованием олигодезоксирибонуклеотидных зондов: 5'-GCGAGATCTAGTGGAACTGACCTG-3' и 5'-GCGGGATCCTCCAGCTGAGACAC-3' и после обработки эндонуклеазами рестрикции BgIII и BaMHI выделяли из 1% -ной легкоплавкой агарозы фрагмент ДНК, кодирующий участок CD4-рецептора. Аналогичный метод использовали для выделения фрагмента ДНК, кодирующего участок DT. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали аминофосфитным триэфирным методом в твердофазном варианте с использованием дезоксирибонуклеид-3'- О(β-цианэтил-N, N-диизопропиламино)фосфитов (Nucleic Acids Res. 12, 4539, 1984). Определенная методом Сэнгера (PNAS USA, 474, 15463 15467, 1977) первичная структура ДНК, кодирующей гибридный полипептид S304, представлена на фиг. 1.
Приведенная на фиг. 1 последовательность соответствует следующей аминокислотной последовательности, приведенной на фиг. 2.
В гибридном полипептиде присутствуют, таким образом, фрагменты двух белков: дифтерийного токсина и CD4-рецептора. Дифтерийный токсин представлен полным A-фрагментом и B-фрагментом без 50 C-концевых аминокислотных остатков и имеет следующую первичную структуру, приведенную на фиг. 3.
Фрагмент CD4 с Val 14 по Glu 152 представляет собой следующую полипептидную последовательность, приведенную на фиг. 4.
Пример 2. Приготовление лизатов клеток.
Ночную культуру клеток E. coli разводят в 100 раз свежей средой LB и выращивают при постоянной аэрации при 30oC. После достижения культурой оптической плотности 0,5 при длине волны 530 нм индуцируют экспрессию гибридных генов добавлением изопропилтиогалактозида до конечной концентрации 0,005% После индуцирующего воздействия культуру выращивают при 30oC и постоянной аэрации в течение 90 мин. Затем клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин и лизируют путем обработки ультразвуком в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 8,0, 10 мМ EDTA и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида.
Пример 3. Применение гибридного полипептида S304 в качестве ингибитора цитопатического действия вируса иммунодефицита человека в системе in vitro.
Степень ингибирования рекомбинантным рецепторотоксином цитопатического действия вируса иммунодефицита человека 1 типа определяют следующим образом. Сначала определяют токсичность бактериального лизата для линии клеток SEM (T-лимфоциты человека). Для этого суспензию клеток инкубируют на плашке с различными разведениями лизата в среде RPMI-1640. При этом исходная концентрация клеток составляет 0,5 млн./мл. Затем с использованием витального красителя (трепановой синий) проводят подсчет количества погибших и выживших клеток и выбирают такую концентрацию лизата, при которой нет отличия от клеточного контроля (КК клетки без лизата). При концентрации лизата 0,1 - 0,2 мг суммарного белка/мл не было отличий между опытом и КК ни в проценте погибших клеток (1 2%), ни в значении индекса пролиферации (около 2). Для определения антивирусной активности рекомбинантного рецепторотоксина клетки инкубируют в тех же условиях, добавляя бактериальный лизат, содержащий рецепторотоксин, до конечной концентрации 0,15 мг/мл и 1 ЦТД50 ВИЧ1 (цитотоксическая доза вируса для клеток линии SEM). В качестве контроля используют клеточный контроль (КК), вирусный контроль (ВК суспензия клеток SEM с вирусом без лизата) и контроль лизата (КЛ суспензия клеток SEM с вирусом с добавлением лизата бактерий E. coli, не экспрессирующих рекомбинантный рецепторотоксин, в концентрации 0,15 мг/мл). В контрольных лунках (ВК и КЛ) наблюдали более 30% погибших клеток, а в КК и опыте практически все клетки выжили (менее 1% погибших клеток). Таким образом, рекомбинантный рецепторотоксин практически полностью ингибирует цитопатическое действие вируса иммунодефицита человека in vitro.
Claims (2)
1. Гибридный рецепторотоксин S 304, полученный путем экспрессии в бактериальной системе E.coli, состоящий из фрагмента дифтерийного токсина и фрагмента CD4 рецептора Т-лимфоцитов человека, имеющий первичную структуру I, приведенную в конце текста формулы и подавляющий цитопатическое действие вируса иммунодефицита человека первого типа in vitro.
2. Фрагмент ДНК NS 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин S 304 и имеющий первичную структуру II.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94022863A RU2096458C1 (ru) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94022863A RU2096458C1 (ru) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94022863A RU94022863A (ru) | 1996-01-27 |
RU2096458C1 true RU2096458C1 (ru) | 1997-11-20 |
Family
ID=20157287
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94022863A RU2096458C1 (ru) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2096458C1 (ru) |
-
1994
- 1994-06-14 RU RU94022863A patent/RU2096458C1/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6221355B1 (en) | Anti-pathogen system and methods of use thereof | |
JP3587538B2 (ja) | Hiv−1 のインヒビターとしての合成ポリペプチド | |
Swingler et al. | The Nef protein of human immunodeficiency virus type 1 enhances serine phosphorylation of the viral matrix | |
JP3100005B2 (ja) | ヒト免疫不全ウィルス感染・増殖抑制剤 | |
EP1137664A2 (en) | Protein transduction system and methods of use thereof | |
CA2364690A1 (en) | Novel transduction molecules and methods for using same | |
McPhee et al. | Engineering human immunodeficiency virus 1 protease heterodimers as macromolecular inhibitors of viral maturation. | |
US7306944B2 (en) | Advanced cell-transducing transport domain-target protein-transport domain fusion protein and uses thereof | |
JP2007517522A (ja) | HIVgp41HR2由来の合成ペプチド、およびヒト免疫不全ウイルスの伝播を阻止する治療におけるその使用 | |
AU2005203173B2 (en) | Super-antigen fusion proteins and the use thereof | |
US7067134B1 (en) | HIV vaccine | |
WO2009095500A1 (en) | Inhibitors of lentiviral replication | |
RU2096458C1 (ru) | Гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304 | |
JPH05502868A (ja) | レトロウィルス感染症を治療又は予防する薬学的組成物 | |
Mori et al. | Construction and Enhanced Cytotoxicity of a [Cyanovirin-N]-[PseudomonasExotoxin] Conjugate against Human Immunodeficiency Virus-Infected Cells | |
JPH01193299A (ja) | 組替htlv−3蛋白質及びその用途 | |
CA2339850C (en) | A non-cytolytic recombinant hiv-1 vaccine | |
KR100472937B1 (ko) | 세포침투성 티에이티-사이토신 디아미네이즈 융합단백질및 그 용도 | |
WO1995004546A1 (en) | Novel mutated human and simian immunodeficiency viruses and vaccines containing said viruses | |
KR100509398B1 (ko) | 세포침투성 티에이티-박테리아 사이토신 디아미네이즈융합단백질 및 그 용도 | |
KR100490363B1 (ko) | 세포침투 효율이 향상된 수송도메인-니트로리덕타제 융합단백질 및 그 용도 | |
Green | The development and use of antigen-antibody-LTB (Ag-MAb-LTB) complexes as immunogens | |
Honda | I Approval | |
EP1544212A1 (en) | Modified antiviral proteins with an increased negative charge | |
WO1996037235A1 (en) | Methods for inhibition of hiv |