RU2073718C1

RU2073718C1 - Dna fragment hc 280 prepared by chemical synthesis, recombinant polypeptide hc 280 at molecular mass 120-130 kda showing capability to bind antibodies to gene-encoding protein ns4 of hepatitis c virus prepared at cultivation of the strain of bacterium escherichia coli - strain of bacterium escherichia coli - a producer of recombinant polypeptide hc 280 showing capability to bind antibodies to gene-encoding protein ns4 of hepatitis c virus

Info

Publication number: RU2073718C1
Application number: RU93029440A
Authority: RU
Inventors: В.Н. Лопарев; В.Н. Красных; В.М. Блинов; В.А. Гольцов; В.В. Зверев; Л.Л. Суханова; Г.И. Алаторцева
Original assignee: Биотехнологическая компания "Биосервис"
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 1997-02-20

Abstract

FIELD: molecular biology, biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to preparing DNA fragment HC 280 that determines synthesis of polypeptide showing property of human hepatitis C virus protein NS4. Polypeptide is prepared using strain of bacterium Escherichia coli transformed with plasmid carrying DNA fragment HC 280. This polypeptide is able to bind antibodies to gene-encoding protein NS4 of hepatitis C virus. Invention can be used in medicine for immunodiagnosis of human hepatitis C virus. EFFECT: improved method of preparing. 3 cl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С. The invention relates to biotechnology, genetic engineering and immunology and can be used for serodiagnosis of hepatitis C.

Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит Д, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение вирусом гепатита С, как правило, осуществляется при переливании крови. Вирус гепатита С при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В, однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Hepatitis C occurs as a result of infection with the hepatitis C virus and differs from other forms of virus-associated liver diseases, including already known hepatitis A, hepatitis B, hepatitis D, as well as hepatitis caused by Epstein-Barr virus or cytomegalovirus. Hepatitis C virus infection is usually carried out with a blood transfusion. Hepatitis C virus, when ingested, infects liver cells. Clinically, hepatitis C proceeds more easily than hepatitis B, but it has been shown that in almost fifty percent of patients the disease takes a chronic course with a periodic exacerbation of the process and in twenty percent of chronic patients with hepatitis C the disease leads to cirrhosis.

Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени. Поэтому для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять людей, инфицированных вирусом гепатита С. In addition, there is evidence that hepatitis C virus infection is directly related to the occurrence of primary liver cancer. Therefore, for the implementation of anti-epidemic and preventive measures, it is extremely important to develop diagnostic drugs that can detect people infected with hepatitis C.

Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. Вирус гепатита С имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Геном вируса гепатита С содержит единственную открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010 3011 аминокислотных остатков, являющийся предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков. К структурным белкам вируса гепатита С относятся Cor (ядерный) антиген (молекулярная масса 19 кДа) и два гликопротеина с молекулярными массами 32 кДа и 72 кДа. Все они процессируются с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид вируса гепатита С. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита С, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита С (NS1). Белок NS2 вируса гепатита С размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает нуклеотид трифосфатсвязывающей геликазной активностью и, вероятно, участвует в репликации генома вируса гепатита С. Numerous studies of hepatitis C virus have made it possible to determine its structure, genome organization, and elucidate the expression mechanism and functions of individual viral proteins. Hepatitis C virus has a positive RNA genome of approximately 9,400 nucleotides. The genome of the hepatitis C virus contains a single open reading frame that covers most of the viral genome and can encode a large virus-specific polypeptide consisting of 3010 3011 amino acid residues, which is the precursor of individual structural and non-structural viral proteins. The structural proteins of hepatitis C virus include the Cor (nuclear) antigen (molecular weight 19 kDa) and two glycoproteins with molecular weights 32 kDa and 72 kDa. All of them are processed from the N-terminal portion of the virus-specific polyprotein. The Cor antigen has the ability to bind RNA and forms a hepatitis C virus nucleocapsid. A 32 kDa protein is thought to be the matrix or surface hepatitis C virus virion protein, and 72 kDa protein is either the virion surface protein or the first non-structural hepatitis C virus protein (NS1) . The 23 kD hepatitis C virus NS2 protein is associated with the membranes of virus-infected cells, but its functional role is unknown. 60 kD NS3 has triphosphate-binding helicase nucleotide activity and is likely involved in the replication of the hepatitis C virus genome.

Кроме того, он имеет ферментативную активность сериновой протеазы и, по-видимому, обеспечивает процессирование неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью и, вероятно, участвует в репликации вирусного генома. In addition, it has the enzymatic activity of a serine protease and, apparently, provides the processing of non-structural proteins. NS4 and NS5 gene expression products have not yet been characterized, but they can encode proteins of 52 and 116 kDa, respectively. Like the NS2 protein, the NS4 protein is hydrophobic and is probably a membrane-binding protein with unknown function. The NS5 gene expression product seems to be multifunctional, has RNA-dependent RNA polymerase activity, and is probably involved in the replication of the viral genome.

Большинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита С основано на определении антител к белкам вируса гепатита С в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита С, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вируса гепатита С вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов вируса гепатита С, и, в частности, рекомбинантного белка NS4 вируса гепатита С (патенты ЕР NO 445423 А2, кл. G 01 N 33/576, 1990; EP NO 419182 A1, кл. C 12 N 15/51, 1990; EP NO 388232 A1, кл. C 12 N 15/51, 1990; EP NO 406511 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 416725 A2, C 12 N 15/51, 1990 и др.). Most methods for diagnosing hepatitis C virus infection are based on the determination of antibodies to hepatitis C virus proteins in blood serum (serodiagnosis). For these purposes, various approaches are used that apply the principles of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), agglutination reactions (latex, red blood cells), immunofluorescence, immunoblotting and radioimmunoprecipitation. One of the most promising ways to improve all these diagnostic test systems is to use recombinant hepatitis C virus proteins synthesized in various expression systems as an antibody-binding substrate. The use of such recombinant proteins that preserve the antigenic determinants of hepatitis C virus instead of viral antigens not only increases the specificity and sensitivity of test systems, but also makes them safe to use. There are a significant number of developments aimed at creating recombinant protein products of hepatitis C virus genes, and in particular, recombinant hepatitis C virus NS4 protein (patents EP NO 445423 A2, CL G 01 N 33/576, 1990; EP NO 419182 A1 , CL C 12 N 15/51, 1990; EP NO 388232 A1, CL C 12 N 15/51, 1990; EP NO 406511 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 416725 A2, C 12 N 15/51, 1990 and others).

В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕР NO 388232), так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант (ЕР NO 455423) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов вируса гепатита С (ЕР NO 377303 А1, С 12 N 5/51, 1989). Currently, a search is underway for the polypeptides that are most promising for the diagnosis, treatment and prevention of hepatitis C. Studies are conducted both in the direction of selecting producer cells (EP NO 388232), and in the direction of selecting the most antigenic determinants (EP NO 455423) and the creation of recombinant polypeptides, hepatitis C virus gene products (EP NO 377303 A1, C 12 N 5/51, 1989).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный искусственно созданный полипептид, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома вируса гепатита С, слитного с бета-галактозидазой E. coli, связывающий антитела к продукту гена NS4 вируса гепатита С, кодирующий их фрагмент ДНК НС280, штамм E.coli НС88 ВКПМ N В-6598, трансформированный рекомбинантной плазмидой рНС280, содержащей фрагмент ДНК НС2820. The essence of this technical solution is that an original artificially created polypeptide is proposed, consisting of the expression product of a fragment of the hepatitis C virus genome fused with beta-galactosidase E. coli, binding antibodies to the hepatitis C virus NS4 gene product encoding their HC280 DNA fragment, E. coli strain HC88 VKPM N B-6598 transformed with the recombinant plasmid pH280 containing the HC2820 DNA fragment.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37 град. С колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30 32 град. С, колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37 град. С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30 32 град. С Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39 - 42 град.С. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4 град.С в течение 5 6 месяцев. The producer strain is characterized by the following features: cells are straight, rod-shaped, motile, with peritrichous flagella, gram-negative, non-spore. Cells grow on LB medium and other culture media used to cultivate Escherichia coli and simple culture media containing 10 μg / ml tetracycline and 50 μg / ml ampicillin. When grown on nutrient agar media at 37 degrees. The cell colony is smooth, round, shiny, pale yellow, transparent, the edges are even. With growth on the same media, but at 30 32 degrees. C, cell colonies have a “mucous” phenotype characteristic of cell colonies with lon mutations growing at low temperatures. When growing on liquid media, cells form a uniform intense turbidity. Cells grow well at temperatures from 4 to 37 degrees. C at optimum pH from 6.8 to 7.5. As a source of nitrogen, cells use both mineral salts in the ammonium and nitrate forms, and organic forms in the form of peptone and amino acids. Nitrates are reduced to nitrites. Gelatin is not liquefied. Maltose is not fermented. Urease activity is not formed. Transformation of cells with plasmids with bacteriophage promoters is carried out according to standard methods. The obtained clones of cells with plasmids are grown on LB medium at a temperature of 30 32 deg. C Preparative fermentation for the production of recombinant protein is carried out at a temperature of 39 - 42 degrees C. The strain productivity using plasmid expression vectors with bacteriophage promoters is about 500 μg of recombinant protein per 1 ml of cell suspension at a culture density of 1x10 cells / ml. Protein is stable at a temperature of 4 degrees C. for 5 to 6 months.

Полипептид, выделенный и очищенный из штамма-продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к NS4 антигену вируса гепатита С в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N ВКПМ В-6598. A polypeptide isolated and purified from a producer strain, immobilized on a solid carrier (polyvinyl chloride or polystyrene tablets, nitrocellulose, nylon, latexes, erythrocytes, etc.) binds antibodies to the hepatitis C virus antigen NS4 in blood serum and other biological fluids. The strain is deposited in the collection of industrial microorganisms of the Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms under N VKPM V-6598.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК НС280. Example 1. Obtaining a DNA fragment of HC280.

Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды:
cr1 5' -CCNCGGANCCTTGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTGTCTTGTCCGGAAGG - 3'
cr2 5' CCGGCCGTTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3'
cr3 5' CCAGGAATTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGGG 3'
cr4 5' AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3'
cr5 5' CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCTCCAAGCAACGGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3'
cr6 5' GAGTCCAAGTGGCGAGCACTTGAGGCATTCTAACTGCAGGTCCGC 3'
rc1 5' CTACCTACAATGACCACACAGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3'
rc2 5' - CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAACGGCCGGCCTTCCGGACAAGACAATC 3'
rc3 5' AAGGRGCGAGGAGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5' GCCGAGCGCCTTCTGCTTCAATTGCTGGCGAGCTGCATTCCTTGCTCGATGTAAGG 3'
rc5 5' CCTCCGCTTGCTTGGAGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5' GCGGACCTGCAGTTAGAATGCCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTGGAGCAAGCAG 3'
Олигонуклеотиды cr 1, 2, 3, 4, 5, 6 и rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фаза Т4. Для этого, в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмолей каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл десятикратного буфера для киназы (0,5М трис HCl, рН 7,6, 0,1М MgCl 50 мМ дитиотреитол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмолей (150 мкКИ) [гамма- Р] АТФ (удельная активность 3000 Ки/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т4, бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30 60 минут при 37 град.С. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98 град.С, охлаждают до 16 град.С. 100 мкл смеси, обработанных киназой олигонуклеотидов, смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66 М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl 12, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), добавляют 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4 град. С в течение 5 часов. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65 град. С в течение 15 минут для инактивирования фермента.To obtain a DNA fragment, oligonucleotides were used:
cr1 5 '-CCNCGGANCCTTGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTGTCTTGTCCGGAAGG - 3'
cr2 5 'CCGGCCGTTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3'
cr3 5 'CCAGGAATTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGGG 3'
cr4 5 'AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3'
cr5 5 'CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCTCCAAGCAACGGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3'
cr6 5 'GAGTCCAAGTGGCGAGCACTTGAGGCATTCTAACTGCAGGTCCGC 3'
rc1 5 'CTACCTACAATGACCACACAGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3'
rc2 5 '- CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAACGGCCGGCCTTCCGGACAAGACAATC 3'
rc3 5 'AAGGRGCGAGGAGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5 'GCCGAGCGCCTTCTGCTTCAATTGCTGGCGAGCTGCATTCCTTGCTCGATGTAAGG 3'
rc5 5 'CCTCCGCTTGCTTGGAGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5 'GCGGACCTGCAGTTAGAATGCCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTGGAGCAAGCAG 3'
The oligonucleotides cr 1, 2, 3, 4, 5, 6 and rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 are mixed and quenched with a T4 phase polynucleotide kinase. For this, 50 pmoles of each of the oligonucleotides, 50 μl of ten-fold kinase buffer (0.5 M Tris HCl, pH 7.6, 0.1 M MgCl 50 mM dithiothreitol, 1 mM spermidine and 1 mM EDTA), 250 pmoles (150 μCI) [gamma-R] ATP (specific activity 3000 Ci / mmol), 150 units of phage T4 polynucleotide kinase activity, bidistilled water to a volume of 500 μl and incubated for 30-60 minutes at 37 ° C. Then the reaction mixture is heated to a temperature of 98 deg. C, cooled to 16 deg. C. 100 μl of the oligonucleotide kinase-treated mixture was mixed with 12 μl of ten-fold ligation buffer (0.66 M Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM MgCl 12, 50 mM dithiothreitol and 10 mM ATP), 8 μl (50 units) activity) DNA ligase of phage T4 and incubated at 4 deg. C for 5 hours. Then the reaction mixture is heated to a temperature of 65 degrees. C for 15 minutes to inactivate the enzyme.

10 мкл раствора, обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 280 п.н.). 10 μl of the solution treated with kinase and ligase of oligonucleotides is used for DNA analysis in a 12% polyacrylamide gel (a fragment of about 280 bp is visible after radio-autography).

100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотреитол) в течение 5 часов при температуре 37 град.С. Ферменты инактивируют нагреванием при 70 град.С. 100 μl of the solution of the obtained DNA fragment is hydrolyzed with BamHI restriction enzymes in a restriction buffer solution (final concentration of 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1 mM dithiothreitol) for 5 hours at 37 ° C. Enzymes are inactivated by heating at 70 degrees C.

10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 280 п.н.). 10 μl of a solution of DNA fragments hydrolyzed by restriction endonucleases is used for DNA analysis in a 12% polyacrylamide gel (after a radio autograph, a fragment of about 280 bp is visible).

ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pUCl18, обработанной рестриктазами BamHI и PstI. DNA is precipitated with ethyl alcohol and dissolved in 20 μl of distilled water. 10 μl of the restriction endonuclease treated DNA fragment is ligated with the DNA of the vector plasmid pUCl18 treated with restriction enzymes BamHI and PstI.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5 альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма НСВК имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 280 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК НС280. The E. coli strain DH5 alpha is transformed with the obtained ligase mixture according to the usual procedure (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Transformed cells are plated on plates with 1.2% LB agar containing 50 μg / ml ampicillin. The grown colonies are checked for the presence of recombinant plasmids. For this, bacterial cells lyse and secrete plasmid DNA as described (Nature, 1981, 145, 1365). Plasmid DNA is digested with restriction enzymes BamHI and PstI and the hydrolyzate is examined by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel. The plasmid DNA hydrolyzate from the selected recombinant NSVK strain has 2 bands of 2686 and 280 bp DNA on the electrophoregram. which corresponds to the size of the vector and the HC280 DNA fragment synthesized by us.

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК НС280:
C C T C G G A T C C T T G A C A A C A G G C T G T G T G G T C A T T G T A G G
T A G G A T T G T C T T G T C C G G A A G G C C G G C C G T T G T T C C A G A
C A G A G A G C T T C T C T A C C A G G A A T T C G A T G A G A T G G A A G A
G T G C T C C T C G C A C C T T C C T T A C A T C G A G C A A G G A A T G C A
G C T C G C C G A G C A A T T C A A G C A G A A G G C G C T C G G C T T A C T
G C A A A C A G C C T C C A A G C A A G C G G A G G C T G C T G C T C C A G T
G G T G G A G T C C A A G T G G C G A G C A C T T G A G G C A T T C T A A C T
G C A G G T C C G C
Фрагмент ДНК, аналогичный НС280, был также получен известным методом цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc6.Using the Sanger method (PNAS, 1977, 74, 5463), the nucleotide sequence of the HC280 DNA fragment is determined:
CCTCGGATCCTTGACAACAGG CTGTGTGGTCATTGTAGG
TAGGATTGTCTTGTCCGGAAG GCCGGCCGTTGTTCCAGA
CAGAGAGCTTCTCTACCAGGA ATTCGATGAGATGGAAGA
GTGCTCCTCGCACCTTCCTTA CATCGAGCAAGGAATGCA
GCTCGCCGAGCAATTCAAGCA GAAGGCGCTCGGCTTACT
GCAAACAGCCTCCAAGCAAGC GGAGGCTGCTGCTCCAGT
GGTGGAGTCCAAGTGGCGAGC ACTTGAGGCATTCTAACT
GCAGGTCCGC
A DNA fragment similar to HC280 was also obtained by the known method of chain reaction of polymerization using oligonucleotides cr1 and rc6.

Пример 2. Получение плазмиды рНС280. Example 2. Obtaining the plasmid pH280.

Синтезированный фрагмент ДНК НС280 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды. 10 мкл фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A. The synthesized DNA fragment HC280 is digested with restriction enzymes PstI and BamHI. DNA is precipitated with ethyl alcohol and dissolved in 50 μl of distilled water. 10 μl of the DNA fragment is ligated with the DNA of the vector plasmid pEL5A.

Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1%-ным LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. ДНК обрабатывают рестриктазами PstI и BamHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2%-ном агарозе. The ligase mixture transform cells of E. coli strain PLT90. Transformed cells are plated on plates with 1% LB agar containing 50 μg / ml ampicillin. Colonies are checked for the presence of recombinant plasmids. For this, bacterial cells lyse and secrete plasmid DNA. DNA was digested with restriction enzymes PstI and BamHI and the hydrolyzate was examined by electrophoresis in 2% agarose.

Отбирают штамм, имеющий на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 280 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС280. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что фрагмент ДНК в плазмиде рНС280 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС280 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность NS4 белка вируса гепатита С, слитную с последовательностью бета-галактозидазы E.coli. A strain is selected that has 2 DNA bands of 6400 and 280 nucleotides on the electrophoregram, which corresponds to the sizes of the vector and the synthesized DNA fragment of HC280. When determining the nucleotide sequence of plasmid DNA, it was found that the DNA fragment in plasmid pH280 through the BamHI site is attached to the C-terminal portion of E. coli beta-galactosidase. Thus, the plasmid pH280 encodes a recombinant protein containing the amino acid sequence of the NS4 protein of the hepatitis C virus, fused with the beta-galactosidase sequence of E. coli.

Пример 3. Example 3

Выделение полипептида. Isolation of the polypeptide.

Штамм E. coli, содержащий плазмиду рНС280, выращивают в 100 мл среды LB при 30 град.С до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39 град.С и растят клетки еще в течение 2-х часов. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по одному из известных методов. The E. coli strain containing the plasmid pH280 is grown in 100 ml of LB medium at 30 deg. C to a density of 8x10 cells / ml. After that, the temperature is increased to 39 deg. C and the cells grow for another 2 hours. Cells are harvested by centrifugation at 4000 rpm for 15 minutes. Cells are lysed by ultrasound and proteins are isolated according to one of the known methods.

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий плазмиду рНС280. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli HC280, содержащий плазмиду рНС280, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 120 130 кД. Аминокислотная последовательность полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS4, представлена ниже:
X-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Gly-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val- Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Val-Val-Pro-Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln- Glu-Phe-Asp-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu- Gln-Gly-Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu- Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Lys-Gln-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Pro-Val-Val-Glu- Ser-Lys-Irp-Arg-Ala-Leu-Glu-Ala-Phe, где X аминокислотная последовательность β галактозидазы E.coli.The isolated proteins are analyzed in 10% PAG according to the standard Laemmli method. As markers of molecular masses of proteins, a Pharmacia kit containing molecular weight markers from 20 to 160 kD is used. As a control, a similarly obtained cell lysate of E. coli strain PLT90 containing the vector plasmid pEL5A and not containing the plasmid pH280 is used. A comparative analysis of the protein composition shows that the E. coli HC280 strain containing the plasmid pH280 expresses a hybrid polypeptide with a molecular weight of 120 130 kDa. The amino acid sequence of the polypeptide, determined on the basis of the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment encoding a portion of the NS4 gene, is presented below:
X-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Gly-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Val-Val-Pro- Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly- Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Lys-Gln-Ala-Glu-Ala-Ala- Ala-Pro-Val-Val-Glu-Ser-Lys-Irp-Arg-Ala-Leu-Glu-Ala-Phe, where X is the amino acid sequence of β galactosidase of E. coli.

Пример 4. Контроль антигенной активности. Example 4. Control of antigenic activity.

Контроль антигенной активности полипептида осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем переносят электрофоретически разделенные белки на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 часа. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером ТВS (0,15М NaCl, 20 mM трис-HCL, pH 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 час при 37 град.С обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к вирусу гепатита С, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конюъгатом при 37 град С в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полученный полипептид связывается с антителами к вирусу гепатита С. Control of the antigenic activity of the polypeptide is carried out by immunoblotting. For this, an electrophoresis procedure is carried out (as described in Example 3), then the electrophoretically separated proteins are transferred to the BH85 nitrocellulose membranes using an electroblotting apparatus in 24V, 400 mA mode for 1 hour. The quality of the transfer is checked by staining the membranes with a solution of 0.2% Ponso S in 3% TCA for 5 min at room temperature. The paint is washed twice for 30 min with TBS buffer (0.15 M NaCl, 20 mM Tris-HCL, pH 7.4) with 0.05% Tween-20 at room temperature. The next step is to block nitrocellulose membranes with immobilized proteins with a solution of 5% skimmed milk powder prepared in 0.1 M Na-phosphate buffer, pH 7.4, for 30 minutes at room temperature. After blocking the membrane for 1 hour at 37 ° C, it is treated with sera containing antibodies to hepatitis C virus at a dilution of 1: 100. Then, TBS membranes were washed three times with 0.05% Tween-20 for 30 min at room temperature. Identification of specific antibodies is carried out by incubating the filter with an antispecies peroxidase conjugate at 37 ° C for one hour. Next, repeat the procedure three times washing. The reaction is checked by adding 100 μl of 30% hydrogen peroxide and 50 ml of 4-chloro-1-naphthol solution (20 mg in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0). Analysis shows that the resulting polypeptide binds to antibodies to hepatitis C.

Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, взаимодействующий с антителами к белку NS4 вируса гепатита С, позволяющий определять антитела к вирусу гепатита С. Thus, this invention is a polypeptide that interacts with antibodies to the hepatitis C virus NS4 protein, which allows the determination of antibodies to hepatitis C virus.

Claims

1. A DNA fragment of HC 280, obtained using chemical synthesis, having the following nucleotide sequence:

containing a stop codon at the 3'-end and determining the synthesis of a HC 280 recombinant polypeptide with the ability to bind antibodies to the hepatitis C virus NS4 protein gene product

2. Recombinant polypeptide HC 280 mol. m. 120 130 KDa, with the ability to bind antibodies to the hepatitis C virus NS4 protein gene product, obtained by culturing the bacterial strain Escherichia coli VKPM B-6598 and having the following structure:

where X is the amino acid sequence of beta-galactosidase.

3. The bacterial strain Escherichia coli VKPM B-6598 producer of the recombinant HC 280 polypeptide with the ability to bind antibodies to the product of the hepatitis C virus NS4 protein gene.