KR0181517B1

KR0181517B1 - Non-a, non-b hepatitis-specific antigen and its use in hepatitis diagnosis

Info

Publication number: KR0181517B1
Application number: KR1019910011632A
Authority: KR
Inventors: 노보루 마끼; 겐지로 야마구찌; 아유미 도요시마; 미찌노리 고하라
Original assignee: 나까하라 노부유끼; 토넨 가부시끼가이샤
Priority date: 1990-07-09
Filing date: 1991-07-08
Publication date: 1999-04-01
Also published as: EP0468657A2; US5641654A; EP0468657A3; US5662906A

Abstract

본 발명은 비-A 비-B형 간염 환자의 혈장으로 부터 직접 단리된 비-A 비-B형 간염 비루스 RNA로 부터 유전 공학적 수법으로 수득되고 비-A 비-B형 간염-특히항원 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편, DNA 단편의 발현에 사용하기 위한 발현 벡타 및 형질전환제, PCR 프라이머용 단일가닥의 DNA 서열, 및 비-A 비-B형 간염 비루스의 검출에서 상기 폴리펩티드와 단일가닥 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. 제조합 폴리펩티드 및 PCR 프라이머용 단일가닥 DNA 서열은 매우 높은 정확도로 비-A 비-B형 간염 비루스 검출을 가능하게 한다.The present invention is obtained by genetic engineering techniques from non-A non-B hepatitis virus RNA isolated directly from the plasma of a non-A non-B hepatitis B patient, and provides a non-A non-B hepatitis-specific antigen polypeptide. DNA fragments comprising base sequences encoding, expression vectors and transformants for use in the expression of DNA fragments, single-stranded DNA sequences for PCR primers, and non-A non-B hepatitis virus It relates to the use of single stranded DNA sequences. Single-stranded DNA sequences for recombinant polypeptides and PCR primers enable detection of non-A hepatitis B viruses with very high accuracy.

Description

Non-A Non-Hepatitis B-Specific Antigens and Their Uses in the Diagnosis of Hepatitis

제1도는 클론 C11-7에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.1임).Figure 1 shows the nucleotide sequence of a non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C11-7 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.1).

제2도는 클론 C10-11에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.2임).Figure 2 shows the nucleotide sequence of non-A non-Hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-11 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.2).

제3도는 클론 C10-13에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.3임).Figure 3 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-13 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.3).

제4도는 클론 C10-14에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.4임).4 shows the nucleotide sequence of non-A non-B hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-14 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.4).

제5도는 클론 C10-15에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.5임).FIG. 5 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-15 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.5).

제6도는 클론 C10-6에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.6임).Figure 6 shows the nucleotide sequence of a non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-6 and an amino acid sequence deduced from that sequence (SEQ ID NO.6).

제7도는 클론 C10-17에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.7임).Figure 7 shows the nucleotide sequence of non-A non-Hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-17 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.7).

제8도는 클론 C10-18에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.8임).Figure 8 shows the nucleotide sequence of non-A non-Hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-18 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.8).

제9도는 클론 C10-19에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.9임).Figure 9 shows the nucleotide sequence of non-A non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-19 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.9).

제10도는 클론 C10-21에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.10임).Figure 10 shows the nucleotide sequence of a non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-21 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.10).

제11도는 클론 C10-22에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.11임).Figure 11 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-22 and the amino acid sequence deduced from that sequence (SEQ ID NO.11).

제12도는 클론 C10-23에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.12임).Figure 12 shows the nucleotide sequence of a non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-23 and the amino acid sequence deduced from that sequence (SEQ ID NO.12).

제13도는 클론 C10-35에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.13임).Figure 13 shows the nucleotide sequence of non-A non-B hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-35 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.13).

제14도는 클론 C10-21에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.14임).Figure 14 shows the nucleotide sequence of a non-A hepatitis B-specific cDNA encoded in clone C10-21 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.14).

제15도는 클론 C10-E12에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.15임).Figure 15 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clones C10-E12 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.15).

제16도는 클론 C10-E13에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.16임).Figure 16 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clones C10-E13 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.16).

제17도는 클론 C10-E24에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.17임).Figure 17 shows the nucleotide sequence of non-A non-Hepatitis B-specific cDNA encoded in clones C10-E24 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.17).

제18도는 클론 C10-E15에서 코딩되는 비-A 비-B형 간염 - 특이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그 서열로부터 추론된 아미노산 서열(SEQ ID NO.18임).Figure 18 shows the nucleotide sequence of non-A non-hepatitis B-specific cDNA encoded in clones C10-E15 and the amino acid sequence deduced from the sequence (SEQ ID NO.18).

제19도는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7을 작성하기 위한 공정도임.19 is a process diagram for preparing the expression plasmid Trp.TrpE.C11-7.

제20도는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21을 작성하기 위한 공정도임.20 is a flow chart for preparing the expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21.

제21도는 정상인 또는 비-A 및 비-B형 간염 환자로부터 취한 혈청을 사용하여 발현 산물TrpE.C11-7을 웨스턴 블러팅 분석한 결과를 나타내는 사진이고 이때 사용된 항원은 A에서는 정제 항원, B에서는 발현 세포의 추출물 및 C에서는 비발현 세포의 추출물임.FIG. 21 is a photograph showing the results of Western blotting analysis of the expression product TrpE.C11-7 using serum taken from normal or non-A and non-B hepatitis patients. In extracts of expressing cells and in C extracts of non-expressing cells.

제22도는 2명의 정상인 또는 비-A 및 비-B형 간염 환자로부터 취한 혈청(A,B)을 사용하여 발현 산물 TrpE.C11-C21을 웨스턴 블러팅한 결과를 나타내는 사진임.22 is a photograph showing the results of Western blotting of the expression product TrpE.C11-C21 using serum (A, B) taken from two normal or non-A and non-B hepatitis patients.

제23도는 표4에서 ELISA-측정된 양성 수자를 나타내는 그래프임.FIG. 23 is a graph showing ELISA-measured positive numbers in Table 4.

본 발명은 비-A 비-B형 간염 감염 또는 발병시 발견되는 비-A 비-B형The present invention is directed to non-A non-B non-A hepatitis B infection or onset.

간염-특이 항원 폴리펩티드를 코딩하는 신규 DNA 단편에 관한 것이다.A novel DNA fragment encoding a hepatitis-specific antigen polypeptide.

본 발명은 또한 상기 DNA 단편을 함유하는 발현 벡타, 상기 발현 벡타로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양함으로써 수득된 발현 폴리펩티드에 관한 것이다.The present invention also relates to an expression vector containing said DNA fragment, a transformant transformed with said expression vector, and an expression polypeptide obtained by culturing said transformant.

본 발명은 또한 상기 DNA 단편의 부분적 염기 서열을 기본으로 하여 합성된 PCR 프라이머용 단일 가닥 DNA 서열에 관한 것이다.The invention also relates to a single stranded DNA sequence for a PCR primer synthesized based on the partial nucleotide sequence of said DNA fragment.

본 발명은 또한 비-A 비-B형 간염 비루스의 검출에 있어서 상기 발현 폴리펩티드와 상기 단일 가닥 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use of said expression polypeptide and said single stranded DNA sequence in the detection of non-A non-hepatitis B viruses.

비-A 비-B형 간염은 A 및 B형 간염 비루스 이외의 마스크된(masked) 비루스에 의해 유발된 전염병이지만 환자 체내에서 이 비루스-특이 항원과 항-비루스 항체의 양이 매우 적기 때문에 이 비루스를 확인하는 것은 쉽지 않다. 따라서 비-A 비-B형 간염의 진단은 환자의 혈청에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제 및 아스파테이트아미노트랜스퍼라제 양의 증가를 측정하여 간염이 A형 간염, B형 간염 , D형 감염 및 CMV, EBV등과 같은 공지의 간질환 유발 비루스에 의한 기타 간염 증세에 속하는지 진단하고, 그 진단의 결과가 상기 간염 범주에 속하지 않으면 비-A 비-B형 간염으로 확인하는 공지의 제외진단법에 의해 혈청학적으로 실행되어 왔다. 그러나 ALT값과 비-A 비-B형 간염 사이에 아무런 관계가 없기 때문에 이러한 방법으로 비-A 비-B형 간염을 임상학적으로 진단하는 것은 곤란하다. 또한 믿음직한 진단수단이 없는 심각한 문제 때문에 비-A 비-B형 간염 비루스를 갖는 건강한 보균자의 혈액을 타인에게 수혈함으로써 유발될 수 있는 비-A 비-B형 간염 비루스와의 이차 감염을 거의 예방할 수 없다. 그러므로 비-A 비-B형 간염은 수혈에 의해 유발된 간염의 90% 이상 즉 일년에 전체로 약 백만명을 차지하는 것으로 생각된다.Non-A non-B hepatitis is an infectious disease caused by masked viruses other than hepatitis A and B viruses, but due to the very low amounts of these virus-specific antigens and anti-virus antibodies in the patient's body It is not easy to check. Therefore, the diagnosis of non-A non-B hepatitis measured the increase in alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels in the serum of patients, and hepatitis B, hepatitis B, D infection and CMV, EBV, etc. Performed serologically by a known exclusion diagnostic method that diagnoses whether he belongs to other hepatitis symptoms caused by the same known hepatic disease-inducing virus, and confirms as non-A non-hepatitis B if the result of the diagnosis does not belong to the hepatitis category. Has been. However, there is no relationship between ALT and non-A non-B hepatitis, so it is difficult to clinically diagnose non-A non-B hepatitis B in this way. Also, due to serious problems without reliable diagnostic measures, secondary infection with non-A hepatitis B viruses, which can be caused by transfusion of blood from healthy carriers with non-A hepatitis B viruses, can be almost prevented. none. Therefore, non-A non-B hepatitis is thought to account for more than 90% of hepatitis-induced transfusions, or about one million people a year.

이러한 상황을 개선하고 또 비-A 비-B형 간염 진단의 정확성을 증가시키기 위해 NIH의 알터 일행에 의해 표준 혈청이 사용되는 알터 판넬이 개발되었다. 알터 판넬을 통과할 수 있는 진단 물질은 아리마 일행[JIKKEN IGAKU(일본국), 1(2), 196 내지 201(1989)] 및 치론 코포레이숀의 엠. 호돈 일행(WO 89/04669, PCT/JP90/500880)에 의해 거의 동시에 수득되었다. 아리마 일행은 비-A 비-B형 간염 환자의 혈청으로부터 얻은 비루스성 RNA로부터 유도한 λgt11(단백질 발현 벡타)를 사용하여 간염 환자의 혈청을 조사하였다. 또한 치론 코포레이숀은 환자의 혈장을 원숭이에게 접종하여 만성 감염을 유발하고, 역가가 높은 항-비루스 항체를 포함하는 발병된 동물로부터 혈장을 얻은 다음 아리마 일행과 동일한 방식으로 검사하였다. 치론 코포레이숀 일행은 간염C 비루스(HCV, 치론 코포레이숀에 의해 명명됨) 유전자의 전 부분을 클로닝하는데 성공하고 또 HCV 유전자의 일부를 발현시킴으로써 수득된 항원 단백질을 포함하는 진단 키트를 개발하였다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 이 질병의 원인과 그의 수가 아직까지 완전히 밝혀지지 않고 있다.In order to ameliorate this situation and increase the accuracy of non-A non-B hepatitis diagnosis, an alter panel has been developed in which standard serum is used by NIH's Alter party. Diagnostic materials that can pass through the alter panel are Arima Group (JIKKEN IGAKU (Japan), 1 (2), 196 to 201 (1989)) and M. Chiron Corp. Obtained almost simultaneously by the hodon party (WO 89/04669, PCT / JP90 / 500880). Arima group examined the serum of hepatitis patients using λgt11 (protein expression vector) derived from viral viruses obtained from the sera of non-A non-B hepatitis patients. In addition, Chiron Corp. was inoculated with the monkey's plasma to cause chronic infection, and plasma was obtained from a diseased animal containing a high titer of anti-virus antibody and tested in the same manner as Arima's party. The Chiron Corporation Cohort has developed a diagnostic kit comprising an antigenic protein obtained by cloning the entire portion of the Hepatitis C virus (HCV, designated by Chiron Corportion) gene and expressing a portion of the HCV gene. . Despite these efforts, however, the cause and number of these diseases are not yet fully understood.

상술한 바와 같이, 알터 판넬을 통과할 수 있는 2개 물질은 제외 진단법을 대신할 새로운 진단 수법을 초래할 수 있지만, 환자의 혈청을 별도로 이들 물질과 스크리닝하는 것은 아리마 일행 및 치론 코포레이숀의 물질이 환자의 혈청과 각각 약 60 내지 80% 및 약 50 내지 70%의 낮은 양성 비율로 반응하기 때문에 충분한 정도로 결과를 내지 않는다. 즉 어떤 경우 이들 물질은 비-A 비-B형 간염으로 임상학적 진단된 환자로부터 얻은 혈청과 반응하지 않을 수 없다. 비루스는 보통 생존하기 위해 숙주 세포에서 돌연변이를 일으키는 기능을 갖고 있으므로 치론 코포레이숀이 미국 환자로부터 단리한 비루스성 유전자는 감염 중간체로부터 원숭이에게 익숙한 여러 형태로 돌연변이되어왔을 것이다.As mentioned above, the two substances that can pass through the alternating panel may lead to new diagnostic techniques to replace the exclusion diagnostics, but screening the patient's serum separately with these substances is not possible with the materials of Arima and Chiron Corporation. Results are not sufficient to the extent that they react with the patient's serum at low positive rates of about 60-80% and about 50-70%, respectively. That is, in some cases these substances are forced to react with serum obtained from patients clinically diagnosed with non-A non-B hepatitis. Since viruses usually have the ability to mutate in host cells in order to survive, the viral genes that Chiron Corportion has isolated from US patients may have been mutated from infectious intermediates to monkeys.

따라서 비-A 비-B형 간염 환자 또는 보균자를 증명할 수 있는 반응성 항원을 다량 제조할 필요가 증대되어 왔기 때문에 다수의 비-A 비-B형 간염 환자로부터 다양하게 돌연변이된 비루스성 RNA를 단리하고 정제하는 것에 의해 효과적인 cDNA클론을 작성할 필요가 있다.Therefore, there has been a growing need to produce large amounts of reactive antigens that can prove to be non-A non-B hepatitis B carriers or carriers, so that various mutated viral viruses can be isolated from many non-A non-A hepatitis B patients. It is necessary to prepare effective cDNA clones by purification.

또한 항체 검출계를 사용하는 믿음직한 진단법에 사용하지 못하는 혈청의 경우, 또는 감염 직후에 수거되어 항체 역가가 높지 않은 혈청의 경우, 유전자 증식법(PCR)은 미량의 비루스 유전자를 검출할 수 있기 때문에 질병의 확인에 유용할 수 있다. 또한 PCR법에 의해 유전자를 효과적으로 클론할 수 있다. 그러나 PCR법이 공지된 유전자 서열로부터 합성된 프라이머를 사용하여 실행되기 때문에, 상기 치론 코포레이숀의 HCV 유전자와 환자가 갖고 있는 비루스 유전자 사이의 돌연 변이가 심하면 치론 코포레이숀에 의해 결정된 HCV 유전자 서열을 기본으로 하여 작성된 프라이머를 사용하여 환자의 체액에서 비-A 비-B형 간염 비루스 유전자를 언제나 검출 할 수 있는 것은 아니다.In addition, for serum that cannot be used for reliable diagnostics using antibody detection systems, or for serum that is collected immediately after infection and does not have high antibody titers, gene proliferation (PCR) can detect trace virus genes because May be useful for identification. In addition, genes can be cloned effectively by PCR. However, since PCR is performed using primers synthesized from known gene sequences, if the mutation between the HCV gene of Chiron Corporation and the virus gene of the patient is severe, the HCV gene sequence determined by Chiron Corporation Based on the primers prepared on the basis of the non-A hepatitis B virus gene in the body fluids of the patient can not always be detected.

그러므로 비-A 비-B형 간염 비루스로 감염된 것을 효과적으로 검출하기 위해서는 고도의 특이성으로 비루스 유전자를 검출할 수 있는 한개 이상의 프라이머를 제조할 필요가 있다. 이러한 목적은 다수의 cDNA 클론을 단리하고, 이들의 유전자 서열중 비교적 보존된 영역으로 프라이머를 합성하고, 또 이 프라이머를 PCR법을 통하여 스크리닝 시키는 것에 의해 달성될 수 있다.Therefore, to effectively detect infection with non-A hepatitis B virus, it is necessary to prepare one or more primers capable of detecting the virus gene with high specificity. This object can be achieved by isolating a large number of cDNA clones, synthesizing primers into relatively conserved regions of their gene sequences, and screening these primers by PCR.

본 발명은 비-A 비-B형 간염 비루스의 비-구조 또는 구조 단백질로부터 유래하고 비-A 비-B형 간염 감염 또는 발병시 형성될 수 있는 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드를 코딩하는 신규한 DNA 단편을 제공하는데 있다.The present invention is a non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide derived from a non-structural or structural protein of a non-A Hepatitis B virus and that can be formed upon infection or onset of a non-A non-B hepatitis B virus. To provide a novel DNA fragment that encodes.

본 발명은 또한 상기 DNA 단편을 함유하는 발현 벡타, 이 발현 벡타로 형질 전환된 형질전환체, 형질전환체를 배양함으로써 수득된 발현 폴리펩티드, 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다.The present invention also provides an expression vector containing the DNA fragment, a transformant transformed with the expression vector, an expression polypeptide obtained by culturing the transformant, and a method for producing the same.

본 발명은 비-A 비-B형 간염 비루스 유전자의 검출에 사용하기 위한 프라이머를 제공하는데 있다.The present invention provides a primer for use in the detection of a non-A hepatitis B virus gene.

본 발명은 또한 비-A 비-B형 간염 비루스의 검출에서 발현 폴리펩티드 또는 단일 가닥 DNA 프라이머의 용도, 및 비-A 비-B형 간염 비루스 유전자 및 항-비-A 비-B형 간염 비루스 항체의 검출 방법을 제공하는데 있다.The invention also relates to the use of expression polypeptides or single-stranded DNA primers in the detection of non-A hepatitis B viruses, and non-A non-B hepatitis virus genes and anti-non-A hepatitis B virus antibodies. It is to provide a detection method of.

본 발명의 많은 목적과 이점은 하기한 본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명에 의해 이 기술 분야의 기술자가 잘 알 수 있을 것이다.Many objects and advantages of the invention will be apparent to those skilled in the art from the following detailed description of the preferred embodiments of the invention.

본 발명은 비-A 및 비-B형 간염 비루스의 비-구조적 또는 구조 단백질로부터 유래하는 비-A 및 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 특수한 DNA 단편을 제공하는데 있다.The present invention provides specific DNA fragments comprising base sequences encoding non-A and non-hepatitis B-specific antigen polypeptides derived from non-structural or structural proteins of non-A and non-B hepatitis viruses. have.

본 발명의 DNA 단편의 제조에서, 병원성 비루스의 다양하게 돌연변이된 유전자가 다수의 비-A 및 비-B형 간염 환자의 신선한 혈장 푸울로부터 직접 수거되는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 제조는 비-A 비-B형 간염 비루스 RNA를 포함한 전체 RNA분자를 혈장 푸울로부터 단리하고, 단리한 RNA 분자를 기본으로 하여 잘 공지된 랜덤 프라이머법으로 cDNA를 합성한 다음 수득한 cDNA를 λ파아지에 혼입시켜 cDNA 라이브러리를 제조한다. cDNA 라이브러리를 비-B 비-B형 간염 환자로 부터 취한 혈청을 사용하여 면역스크리닝하여 소망하는 DNA 단편을 수득한다. 그후, 생성한 DNA 단편을 프로브로 사용하고 수명의 만성비-A 비-B형 간염 환자로 부터 취한 혈장으로 부터 수득한 cDNA 라이브러리를 혼성화 에세이 처리시켜 공지된 부분과 상이한 상동성을 갖고 비-A 비-B형 간염 환자에 특이적인 cDNA를 단리한다.In the preparation of the DNA fragments of the present invention, the various mutated genes of pathogenic viruses are harvested directly from fresh plasma pools of many non-A and non-B hepatitis patients. More specifically, the preparation is isolated from plasma pools containing whole RNA molecules, including non-A non-B hepatitis virus RNA, and then synthesized cDNA by well-known random primer method based on the isolated RNA molecules. One cDNA is incorporated into lambda phage to prepare a cDNA library. The cDNA library is immunoscreened using sera taken from non-B non-B hepatitis B patients to obtain the desired DNA fragments. The resulting DNA fragments were then used as probes and hybridized assays of cDNA libraries obtained from plasma taken from patients with chronic non-A non-hepatitis B lifespan resulted in hybridization assays with different homology to known portions. CDNA specific for non-hepatitis B patients is isolated.

이러한 방법은 다양하게 돌연변이된 비루스를 갖는 비-A 비-B형 간염 환자의 진단과 비-A 및 비-B형 간염 비루스를 갖고 있는 많은 잠재적 보균자로 부터 수집한 수혈용 혈액에 함유된 간염 비루스를 정확하게 검출하는데 매우 유용한 비루스성 항원을 제공할 수 있다.This method is useful for the diagnosis of non-A hepatitis B patients with variously mutated viruses and for hepatitis viruses in blood transfusions collected from many potential carriers with non-A and non-B hepatitis viruses. It is possible to provide a virulent antigen which is very useful for accurately detecting.

다음은 cDNA 라이브러리의 제조, DNA 단편의 단리와 서열화, 폴리펩티드의 발현과 단리, 및 효소결합된 면역흡착측정법(ELISA) 또는 PCR법을 이용하여 비-A 비-B형 간염을 진단하기 위한 그의 용도에 관하여 본 발명을 상세하게 설명한다.Following is the preparation of cDNA libraries, isolation and sequencing of DNA fragments, expression and isolation of polypeptides, and their use for diagnosing non-A hepatitis B using enzymatic immunosorbent assay (ELISA) or PCR. The present invention will be described in detail.

[cDNA 라이브러리의 제조][Preparation of cDNA Library]

먼저, 새로 수집한 수명의 비-A 및 비-B형 간염 환자의 혈장 시료로 부터 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거하고 생성한 상층액을 다시 고속 회전으로 원심분리처리시켜 펠릿을 수득한다. 이 펠릿을 세슘 트리플루오토아세테이트를 사용하여 평형 밀도 구배 원심분리시켜 전체 RNA를 침전물로 수득하고, 또 전체 RNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전화에 의해 정제시킨다.First, cell debris is removed from the plasma samples of freshly collected non-A and non-B hepatitis patients by centrifugation, and the resulting supernatant is centrifuged again at high speed to obtain pellets. The pellet is equilibrated density gradient centrifugation using cesium trifluorotoacetate to give total RNA as precipitate, and the total RNA is purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.

랜덤 프라이머를 사용하는 구블러와 호프만의 방법에 의해, 상기 RNA 분획으로부터 cDNA를 합성한다. cDNA를 DNA 메틸라제(예컨대 EcoRI 메틸라제)로 메틸화시키고, DNA 링커(예컨대 EcoRI 링커) 또는 DNA 어뎁터(예컨대 EcoRI 어뎁터)로 연결한 다음 λ파이지(예컨대 λgt10 또는 λgt11)와 같은 클로닝 벡타에 클로닝킨다.CDNA is synthesized from the RNA fraction by Gubler and Hoffmann's method using random primers. The cDNA is methylated with DNA methylase (such as EcoRI methylase), linked with a DNA linker (such as EcoRI linker) or DNA adapter (such as EcoRI adapter), and then cloned into cloning vectors such as λ fiji (such as λgt10 or λgt11). .

[DNA 단편의 단리 및 서열화][Isolation and Sequencing of DNA Fragments]

이어, 대장균을 λ파아지 cDNA 라이브러리로 감염시키고 또 한천판에서 배양하여 플라크를 형성시킨다. 이들 플라크를 니트로셀룰로오스 필터로 옮기고, 비-A 및 비-B형 간염 혈청을 사용하여 면역스크리닝함으로써 차단시켜 양성 클론을 확인한다. 다르게는, 스크리닝의 효율을 향상시키기 위해 , 수득한 양성 클론을 플리스미드와 같은 클로닝 벡타에 클론시키고 또³²P-라벨링된 DNA 프로브를 랜덤 프라이머 수법으로 제조한 다음 이 프로브를 사용하여 상술한 cDNA 라이브러리로 부터 앙성 플라크를 확인한다.Escherichia coli is then infected with lambda phage cDNA library and cultured in agar plate to form plaque. These plaques are transferred to nitrocellulose filters and blocked by immunoscreening with non-A and non-B hepatitis serum to identify positive clones. Alternatively, in order to improve the efficiency of screening, the obtained positive clones were cloned into cloning vectors such as plasmids and ³² P-labeled DNA probes were prepared by random primer technique and then the cDNA library described above using this probe. Check for plaques from.

상술한 과정으로 부터 총 18개 클론을 수득하고 그들을 C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, C10-23, C10-35, C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15로 명명하였다.From the above procedure, a total of 18 clones were obtained and they were C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10. -21, C10-22, C10-23, C10-35, C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15.

cDNA 시료를 전통적인 방식으로 각 18개 클론의 λ파아지 DNA로 부터 수득하고 또 EcoRI 및 BamHI과 같은 적합한 제한 효소로 분해시킨다. 수득한 각 cDNA 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제하고, 서열화 벡타(M13 파아지)로 혼입시킨 다음 디데옥시 사슬 종결법[Sanger 일행 : Proc.Natl.Acad.Sci., USA,74,5463(1977)]으로 처리하여 각 cDNA 단편의 염기 서열을 결정한다.cDNA samples are obtained from λ phage DNA of each of 18 clones in a conventional manner and digested with suitable restriction enzymes such as EcoRI and BamHI. Each obtained cDNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis, incorporated into sequencing vector (M13 phage), followed by dideoxy chain termination [Sanger et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74,5463]. (1977) to determine the base sequence of each cDNA fragment.

이들 클론의 뉴클레오타이드 서열과 그로 부터 추론된 아미노산 서열을 제1내지 제18도 및 SEQ ID NO. 1 내지 18로 표시한 후술한 서열 목록에 나타낸다. 즉 SEQ ID NO. 1 내지 18은 각각 클론 C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, C10-23, C10-35, C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15의 뉴클레오타이드와 그로부터 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 또한 이들 DNA 단편의 염기쌍(BP)수는 각각 763 BP, 615 BP, 771 BP, 630 BP, 1426 BP, 855 BP, 315 BP, 911 BP, 489 BP, 1076 BP, 284 BP, 641 BP, 432 BP, 369 BP, 932 BP, 559 BP, 276 BP, 742 BP이다.The nucleotide sequences of these clones and the amino acid sequences inferred therefrom are shown in FIGS. 1 to 18 and SEQ ID NO. It is shown to the following sequence list which is shown to 1-18. Ie SEQ ID NO. 1 to 18 are clones C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, Nucleotides of C10-23, C10-35, C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15 and amino acid sequences deduced therefrom are shown. In addition, the number of base pairs (BP) of these DNA fragments was 763 BP, 615 BP, 771 BP, 630 BP, 1426 BP, 855 BP, 315 BP, 911 BP, 489 BP, 1076 BP, 284 BP, 641 BP, 432 BP, respectively. , 369 BP, 932 BP, 559 BP, 276 BP, 742 BP.

18개 클론 모두는 연속적인 오픈 해독 프레임을 함유하지만 종결 코돈은 갖지 않는다.All 18 clones contain a continuous open reading frame but no stop codon.

게놈 RNA의 분석은 간염 C 비루스(HCV)가 일본 뇌염 비루스[Protein, Nucliec Acid and Enzyme (Japan), 35(12),2117-2127 (1990]와 같은 플라비비루스(Flavivirus)속의 비루스와 유사한 종류이라는 것을 밝혀내었다. 플라비비루스의 보고된 유전자와 폴리펩티드 및 본 발명의 유전자와 폴리펩티드 간의 유사성을 비교하여, 클론 C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15는 비-A 및 비-B형 간염 비루스의 구조 단백질을 코딩한다는 것을 밝혀내었다. 보다 상세하게는, 클론 C11-C12는 비-A 및 비-B형 간염의 코어를 코딩하는 유전자이고, 또 클론 C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15는 비루스 코어의 후반부로부터 env에 이르는 영역 또는 env로부터 하류 영역을 코딩하는 유전자이다. 다른 클론은 비루스의 비-구조 단백질을 코딩하는 유전자로 밝혀졌다.Genomic RNA analysis shows that hepatitis C virus (HCV) is similar to the virus of the genus Flavivirus, such as Protein, Nucliec Acid and Enzyme (Japan), 35 (12), 2117-2127 (1990). Comparing the similarity between the reported genes of the Flaviviridae and the polypeptides and the genes and polypeptides of the invention, clones C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15 are non- Was found to encode structural proteins of hepatitis A and non-B hepatitis B. More specifically, clones C11-C12 are genes that encode cores of non-A and non-hepatitis B and clone C10-E12. , C10-E13, C10-E24, and C10-E15 are genes encoding regions from the latter part of the virus core to env or downstream regions from env. Other clones have been identified as genes encoding non-structural proteins of the virus.

상기 18개 클론의 뉴클레오타이드 서열과 오픈 해독 프레임을 따라 번역된 아미노산 서열은 호돈 일행(EP-A-318, 216, 1988)에 의해 보고된 간염 C비루스(HCV)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 상동성을 나타내었다. 즉 클론 C11-7, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22 및 C10-23은 HCV와 비교적 높은 상동성을 나타낸다. : 헥산 수준으로는 80 내지 82% 상동성을 나타내고 또 아미노산 수준에서는 91% 내지 94% 상동성을 나타낸다. 또한 이들 클론은 미야무라 일행에 의해 보고된 서열 J1(Nuc. Aci. Res., 17, 10367-10372, 1989)과 보다 높은 상동성, 즉 헥산 수준으로 85 내지 95% 또 아미노산 수준으로 87 내지 100%의 상동성을 나타낸다. 이들 클론은 중복 영역에서 높은 상동성 때문에 1군으로 분류한다. 이와 반대로 클론 C10-11, C10-13, C10-14, C10-15 및 C10-35는 HCV 및 J1의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열과 비교하여 낮은 상동성, 즉 핵산 수준으로 69% 내지 70% 또 아미노산 수준으로 75 내지 80%의 상동성을 나타낸다. 따라서 이들을 2군으로 분류한다.The nucleotide sequences of the 18 clones and the amino acid sequences translated along the open translation frame were homologous to the nucleotide and amino acid sequences of hepatitis C virus (HCV) as reported by Hodon's party (EP-A-318, 216, 1988). Indicated. That is, clones C11-7, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22 and C10-23 show relatively high homology with HCV. : 80-82% homology at the hexane level and 91% -94% homology at the amino acid level. These clones also had higher homology with sequence J1 (Nuc. Aci. Res., 17, 10367-10372, 1989) reported by Miyamura et al., Ie 85-95% at the hexane level and 87-100 at the amino acid level. % Homology. These clones are classified in group 1 because of their high homology in the overlapping region. In contrast, clones C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, and C10-35 have low homology, ie, nucleic acid levels from 69% to 70% and amino acid levels compared to the nucleotide and amino acid sequences of HCV and J1. To 75 to 80% homology. Therefore, they are classified into two groups.

비루스의 구조 단백질을 코딩하는 C11-C21클론의 369 BP 뉴클레오타이드 및 그로부터 추론된 123개 아미노산 서열(SEQ ID NO. 14)을 호돈 일행(WO 90/11089)에 의해 보고된 HCV와 중복된 부분을 비교하면, 81.8%의 핵산 상동성 및 87%의 아미노산 상동성을 나타낸다. 또한 일본인 환자로부터 수득한 HCV 클론, HC-J1 및 HC-J4(오까모토 일행: Japan J. Exp.Med., 60, 3, p.167-177, 1990)와 비교하면, 핵산 수준에서 82.1% 및 82.7%의 상동성 및 아미노산 수준에서 87.8% 및 89.4%를 나타내었다. 보고된 3개 클론(호돈 일행에 의해 보고된 HCV 및 오까모토 일행에 의해 보고된 HC-J1 및 HC-J4)중 동일한 영역은 핵산 수준에서 92.1 내지 97.6%의 상동성 및 아미노산 수준에서 95.5 내지 96.7%의 상동성을 나타내기 때문에, 본 발명자들에 의해 수득된 클론 C11-C21이 상동성 면에서 보고된 클론과는 거리가 있기 때문에 비루스성 유전자 군과 상이하다는 것이 밝혀졌다. 나머지 4개 클론, C10-E12, C10-E13 및 C10-E15는 HCV, HC-J1 및 HC-J4와 비교하면 핵산 수준에서 83 내지 93%의 상동성 및 아미노산 수준에서 82 내지 95%의 상동성을 나타내는 반면, C10-E24는 핵산 수준에서 약 63% 및 아미노산 수준에서 약 60% 상동성을 나타내었다.369 BP nucleotides of the C11-C21 clone encoding the structural protein of the virus and the 123 amino acid sequences deduced therefrom (SEQ ID NO. 14) were compared to the overlapped portions of HCV reported by Hodon's party (WO 90/11089) Lower nucleic acid homology of 81.8% and amino acid homology of 87%. Also 82.1% at the nucleic acid level compared to HCV clones, HC-J1 and HC-J4 (Okamoto et al .: Japan J. Exp.Med., 60, 3, p.167-177, 1990) obtained from Japanese patients. And 87.8% and 89.4% at an homology and amino acid level of 82.7%. The same regions of the three clones reported (HCV reported by the Hodon party and HC-J1 and HC-J4 reported by the Okamoto party) had a homology of 92.1 to 97.6% at the nucleic acid level and 95.5 to 96.7 at the amino acid level. Since it shows% homology, it has been found that clones C11-C21 obtained by the present inventors differ from the virus group because they are far from clones reported in terms of homology. The remaining four clones, C10-E12, C10-E13 and C10-E15, have 83-93% homology at the nucleic acid level and 82-95% homology at the amino acid level compared to HCV, HC-J1 and HC-J4. Whereas, C10-E24 showed about 63% homology at the nucleic acid level and about 60% homology at the amino acid level.

그러나 본 발명의 DNA 단편을 일본국 공개 특허 제 89/2576호 및 동 제 89/124387호에 기재된 비-A 및 비-B형 간염 항원을 코딩하는 DNA 단편과 비교하면 핵산 수준 또는 아미노산 수준에서 아무런 상동성도 발견되지 않았다.However, compared to the DNA fragments encoding the non-A and non-hepatitis B antigens described in Japanese Patent Application Publication Nos. 89/2576 and 89/124387, the DNA fragments of the present invention are not at the nucleic acid level or the amino acid level. No homology was found.

따라서, 클론 C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-35, C11-C12 및 C10-E24는 보고된 클론과 비교할 때 핵산 및 아미노산 수준에서 상동성이 낮았다. 다른 클론도 보고된 클론으로부터 구별가능하다.Thus, clones C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-35, C11-C12 and C10-E24 had low homology at the nucleic acid and amino acid levels when compared to the reported clones. Other clones are also distinguishable from the reported clones.

따라서, 본 발명은 오픈 해독 프레임을 따라 코드화되며 또 SEQ ID NO. 1 내지 18중의 하나로 표시되는 아미노산 서열 전체 또는 일부로 구성된 비-A 및 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제공한다.Thus, the present invention is coded along an open reading frame and further comprises SEQ ID NO. Provided are DNA fragments comprising base sequences encoding non-A and non-hepatitis B-specific antigen polypeptides consisting of all or part of an amino acid sequence represented by one of 1 to 18.

자연히 본 발명에 따른 염기 서열은 각각 아미노산에 상응하는 다른 코돈을 포함하는 다른 염기 서열을 포함한다.Naturally, base sequences according to the invention comprise different base sequences, each comprising a different codon corresponding to an amino acid.

상술한 클론중에서, C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18 및 C10-19는 대장균 HB101균주로 형질전환되어 일본국 305 이바라끼껜쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1-3에 소재하는 퍼멘테이숀 리서치 인스티튜트, 에이젼시오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 각각 대장균 HB101/C11-7(수탁 번호: FERM P-11589), 대장균 HB101/C10-11(FERM P-11581), 대장균 HB101/C10-13(FERM P-11582), 대장균 HB101/C10-14(FERM P-11583), 대장균 HB101/C10-15(FERM P-11584), 대장균 HB101/C10-16(FERM P-11585), 대장균 HB101/C10-17(FERM P-11586), 대장균 HB101/C10-18(FERM P-11587) 및 대장균 HB101/C10-19(FERM P-11588)로서 1990년 7월 6일 기탁되었다. 이들 기탁은 부다페스트 조약에 기재된 국제 기탁 당국인 동일 기탁 기관에 의해 부타페스트 조약하의 국제 기탁으로 1991년 6월 13일 하기에 주어진 수탁번호로 이관되었다.Among the clones described above, C11-7, C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18 and C10-19 were transformed with E. coli HB101 strains. E. coli HB101 / C11-7 (Accession No .: FERM P-11589) and E. coli HB101 / C10- at the Performance Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, located at 1-3, Higashi Ibaraki, 305, Ibaraki 11 (FERM P-11581), E. coli HB101 / C10-13 (FERM P-11582), E. coli HB101 / C10-14 (FERM P-11583), E. coli HB101 / C10-15 (FERM P-11584), E. coli HB101 / 1990 as C10-16 (FERM P-11585), E. coli HB101 / C10-17 (FERM P-11586), E. coli HB101 / C10-18 (FERM P-11587) and E. coli HB101 / C10-19 (FERM P-11588) It was deposited on 6 July. These deposits were transferred by the same Depositary, the International Depositary Authority described in the Budapest Treaty, to an accession number given on 13 June 1991 below as an International Deposit under the Butafest Treaty.

또한 클론 C11-C21, C10-E12, C10-13, C10-E24 및 C10-E15는 대장균 JM109균주로 형질전환되어 상기와 동일 주소의 피멘테이숀 리서치 인스티튜트, 에이젼시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 수탁 번호 FERM P-11892, FERM P-11894, FERM P-11895, FERM P-11896 및 FERM P-11897로 1990년 12월 11일에 기탁되었다. 이들 기탁은 또한 클론 C11-C12에 대해서는 1991년 6월 17일 또 다른 클론에 대해서는 1991년 6월 13일에 같은 방식으로 부다페스트 조약하의 국제기탁으로 이관되었다. 다음은 새로운 수탁 번호이다:In addition, clones C11-C21, C10-E12, C10-13, C10-E24 and C10-E15 were transformed with E. coli JM109 strains and assigned to Pimentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology at the same address as FERM. P-11892, FERM P-11894, FERM P-11895, FERM P-11896 and FERM P-11897 were deposited on December 11, 1990. These deposits were also transferred to the International Deposit under the Budapest Treaty in the same way on June 17, 1991 for clones C11-C12 and on June 13, 1991 for another clone. Here is the new accession number:

상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 단편은 다른 종래의 DNA 단편과는 상이하다. 비-A 비-B형 간염 비루스는 간염 비루스의 비-구조 영역을 코딩하는 클론 사이의 상동성을 기준으로 해서 1군과 2군으로 분류되지만, 이 비루스는 숙주 세포에서 돌연변이되기 쉬워서 중간군 또는 제3의 군이 존재할 수 있다. 따라서 오직 한종의 DNA 단편으로 제조한 항원 단백질을 사용하여 비-A 비-B형 간염 환자 모두를 정확하게 진단하기는 곤란하다. 이러한 문제를 극복하고 또 진단 효율을 개선시키기 위해, 다수의 효과적인 클론이 용이하게 수득될 수 있는 유용한 DNA 제조 방법을 확립하고 또 이 진단법에 몇종의 클론을 함께 사용하는 것이 필요할 있다.As described above, the DNA fragments according to the present invention are different from other conventional DNA fragments. Non-A non-B hepatitis viruses are classified into groups 1 and 2 based on homology between the clones encoding the non-structural regions of the hepatitis virus, but these viruses are susceptible to mutations in the host cell, There may be a third group. Therefore, it is difficult to accurately diagnose all non-A hepatitis B patients using antigen proteins made from only one DNA fragment. In order to overcome this problem and improve the diagnostic efficiency, it is necessary to establish a useful method for preparing DNA in which many effective clones can be easily obtained and to use several clones together in this diagnosis.

[비-A 비-B형 간염 특이 항원 폴리펩티드의 발현][Expression of Non-A Non-Hepatitis B Specific Antigen Polypeptides]

본 발명은 상술한 DNA 단편을 벡타내의 프로모터 유전자의 클로닝 부위 하류에 도입시킴으로써 작성될 수 있는 발현 벡타를 제공한다.The present invention provides expression vectors that can be prepared by introducing the above-described DNA fragments downstream of the cloning site of the promoter gene in the vector.

플라스미드, 파아지등과 같은 종래의 벡타가 사용될 수 있다. 발현 벡타는 이 기술 분야에서 잘 공지된 수법에 의해 작성될 수 있다. 다음에 본 발명의 발현 벡타를 작성하는 몇가지 방법을 설명한다.Conventional vectors such as plasmids, phages and the like can be used. Expression vectors can be prepared by techniques well known in the art. Next, some methods for producing the expression vector of the present invention will be described.

[발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7의 작성][Preparation of Expression Plasmid Trp.TrpE.C11-7]

발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7을 작성하기 위한 공정도는 제19도에 도시되어 있다.A process diagram for constructing the expression plasmid Trp.TrpE.C11-7 is shown in FIG. 19.

먼저, 클론C11-7을 pUC119에 도입하여 수득한 플라스미드 pUC.C11-7 DNA를 제한 효소 BamHI 및 ScaI으로 분해시키고, 생성한 BamHI-ScaI 단편을 아가로오스 겔전기 영동에 의해 단리한 다음 유리 분말 수법으로 정제시킨다. 이와 별도로, 발현 벡타 Trp.TrpE DNA를 BamHI 및 ScaI으로 분해시키고, 세균 알칼리성 포스파타제(BAP)로 처리시킨 다음 페놀로 추출시킨다. 수득한 수성층을 에탄올 침전처리시켜 처리된 벡타 DNA를 수득한다. 이 벡타 DNA를 T4 DNA 리가제 존재하에서 상술한 C11-7 DNA 단편과 연결시킴으로써, DNA의 전사가 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 비-A 비-B형 간염 특이적 항원을 코딩하는 DNA가 프로모터의 하류에 존재하는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7을 수득한다.First, the plasmid pUC.C11-7 DNA obtained by introducing clone C11-7 into pUC119 was digested with restriction enzymes BamHI and ScaI, and the resulting BamHI-ScaI fragment was isolated by agarose gel electrophoresis, followed by free powder. Purification by the technique. Separately, the expression vector Trp.TrpE DNA is digested with BamHI and ScaI, treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP) and then extracted with phenol. The obtained aqueous layer was subjected to ethanol precipitation to obtain treated vector DNA. By linking this vector DNA with the C11-7 DNA fragment described above in the presence of T4 DNA ligase, the DNA encoding the non-A non-hepatitis B specific antigen can be expressed by the promoter so that transcription of the DNA can be regulated by the promoter. The expression plasmid Trp.TrpE.C11-7 present downstream is obtained.

[발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21의 작성][Preparation of Expression Plasmid Trp.TrpE.C11-C21]

발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21을 작성하기 위한 공정도는 제20도에 도시되어있다.A process diagram for constructing the expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21 is shown in FIG. 20.

먼저, 3′말단에 중지 코돈을 함유하는 DNA 단편은 C11-C21 클론을 pUC119에 혼입시킴으로써 수득한 플라스미드 pUC.C11-C21 DNA로부터 2개의 프라이머(5′-TTACGAATTCATGGGCACGAATCCT-3′ 및 5′-TTAATCGATGACCTTACCCACATTGCG-3′)를 사용하는 유전자 증식법( PCR)으로 제조한다. 이렇게 하여 제조한 DNA 단편을 SmaI으로 미리 분해된 pUC118을 사용하여 결찰시켜 플라스미드 pUC118.C11-C21를 수득한다. 이 플라스미드를 EcoRI 및 BamHI으로 분해시키고 또 생성한 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 단리한 다음 유리 분말 수법으로 정제시킨다. 이와 별도로, 발현 벡타 Trp.TrPE DNA(일본국 특허 출원 제90/180889호)를 BamHI 및 EcoRI으로 분해시키고, 세균 알칼리성 포스파타제(BAP)로 처리시킨 다음 페놀로 추출시킨다. 수득한 수성층을 에탄올 침전처리시켜 처리된 벡타 DNA를 수득한다. 이 벡타 DNA를 결찰 완축액중의 T4 DNA 리가제 작용하에서 상술한 C11-C21 DNA 단편과 연결시킴으로써, 비-A 비-B형 간염 비루스의 구조 단백질에 유래하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 프로모터의 하류에 위치하여 DNA의 전사가 프로모터에 의해 조절되는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21를 수득한다.First, the DNA fragment containing the stop codon at the 3 'end was prepared from two primers (5'-TTACGAATTCATGGGCACGAATCCT-3' and 5'-TTAATCGATGACCTTACCCACATTGCG- 3 ') is used for gene proliferation (PCR). The DNA fragment thus prepared was ligated using pUC118 previously digested with SmaI to obtain plasmid pUC118.C11-C21. This plasmid is digested with EcoRI and BamHI and the resulting DNA fragments are isolated by agarose gel electrophoresis and purified by glass powder technique. Separately, expression vector Trp.TrPE DNA (Japanese Patent Application No. 90/180889) is digested with BamHI and EcoRI, treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP) and then extracted with phenol. The obtained aqueous layer was subjected to ethanol precipitation to obtain treated vector DNA. By linking this vector DNA with the above-mentioned C11-C21 DNA fragment under the action of T4 DNA ligase in ligation contraction, DNA encoding the polypeptide derived from the structural protein of the non-A non-hepatitis B virus is downstream of the promoter. Located at yields the expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21 in which transcription of DNA is regulated by a promoter.

다른 클론들도 각 클론을 적합한 제한 효소로 처리시키고 또 처리된 단편을 발현 벡타로 도입시킴으로써 상응하는 발현 플라스미드로 제조될 수 있다.Other clones can also be prepared with the corresponding expression plasmids by treating each clone with a suitable restriction enzyme and introducing the treated fragments into the expression vector.

원핵 생물을 숙주 세포로 사용하면, 본 발명에 사용될 수 있는 프로모터는 대장균, 파아지등에서 유래한 프로모터 예컨대 트립토판 합성 효소 오페론(trp), 락토오스 오페론(lac), λ파아지PL, λ파아지PR등으로부터 선정될 수 있다.When prokaryotes are used as host cells, promoters that can be used in the present invention can be selected from promoters derived from E. coli, phage, etc. such as tryptophan synthase operon (trp), lactose operon (lac), λ phage PL, λ phage PR, and the like. Can be.

효모와 같은 진핵 생물이 숙주 세포로 사용되면, 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 작용 연관 효소(Holland 일행; Biochemistry, 17: 4900, 1978)에 대한 프로모터를 사용할 수 있다. 언제나 필요한 것은 아니지만, 전사 종결 인자가 발현 벡타에 존재하는 것이 바람직할 수 있다.If eukaryotic organisms such as yeast are used as host cells, promoters for 3-phosphoglycerate kinase and other glycolysis-associated enzymes (Holland et al., Biochemistry, 17: 4900, 1978) can be used. Although not always necessary, it may be desirable for transcription termination factors to be present in the expression vector.

벡타는 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 가능하게 하는 암피실린 또는 테트라시클린 내성 유전자와 같은 마커(marker) 서열을 함유할 수 있다.The vector may contain marker sequences such as ampicillin or tetracycline resistance genes that allow for phenotypic selection in the transformed cells.

본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡타를 숙주 세포에 도입함으로써 수득된 형질전환체를 제공한다. 대장균, 고초균, 호모 균주등과 같은 이 분야에서 흔히 사용되는 미생물이 숙주 세포로 사용될 수 있다.The invention also provides a transformant obtained by introducing the expression vector of the invention into a host cell. Microorganisms commonly used in this field, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Homo strains, etc., can be used as host cells.

형질전환은 발현 벡타를 숙주 세포로 혼입시키기 위해 사용된 수단에 의해 실행될 수 있다. 세균(예컨대 대장균)이 숙주 세포로 사용되면, 염화 칼슘을 사용한 직접 혼입 수법(Mandel, M. 및 Higa, A; J. Mol. Bio., 53, 159-162, 1970)을 적용할 수 있다.Transformation can be effected by the means used to incorporate the expression vector into the host cell. If bacteria (such as E. coli) are used as host cells, a direct incorporation method using calcium chloride (Mandel, M. and Higa, A; J. Mol. Bio., 53, 159-162, 1970) can be applied.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 발현 벡타를 함유하는 적합한 숙주 세포를 암피실린-함유 2YT 배지와 같은 적합한 배지에 접종하여 배양한 다음 이들을 암피실린-함유 포스페이트 배지로 교대배양함으로써 발현 세포를 증식시키는 것에 의해 제조할 수 있다.In addition, the polypeptides of the present invention can be prepared by inoculating suitable host cells containing the expression vector in a suitable medium such as ampicillin-containing 2YT medium, and then culturing them with ampicillin-containing phosphate medium to propagate the expression cells. Can be.

[재조합 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드의 제조 및 정제][Preparation and Purification of Recombinant Non-A Hepatitis B-Specific Antigen Polypeptides]

본 발명은, 본 발명의 상술한 DNA 단편을 적합한 숙주 세포에서 발현할 수 있는 복제성 발현 벡타를 작성하고; 상기 발현 벡타를 숙주 세포로 도입시켜 형질전환체를 수득하며 ; DNA 단편이 발현될 수 있는 조건하에서 상기 형질전환체를 배양함으로써 재조합 폴리펩티드를 제조하고; 또 재조합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는 데 있다.The present invention provides a replicative expression vector capable of expressing the above-described DNA fragment of the present invention in a suitable host cell; Introducing the expression vector into a host cell to obtain a transformant; Preparing a recombinant polypeptide by culturing the transformant under conditions such that a DNA fragment can be expressed; It is also to provide a method for producing a non-A hepatitis B-specific antigen polypeptide comprising the step of recovering the recombinant polypeptide.

숙주 세포로부터 얻은 조 폴리펩티드 산물은 숙주 세포를 초음파 분해처리시키고, 분해된 세포를 원심분리시켜 시그널 펩티드인 TrpE 사이에 있는 융합 폴리펩티드 및 비-A 비-B형 간염 비루스 RNA로부터 합성된 cDNA에 의해 코딩된 폴리펩티드를 함유하는 불용성 분획을 수득하며, 용해성 형태중에 있는 융합 폴리펩티드를 우레아-함유 완충액으로 추출한 다음 추출 폴리펩티드를 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(S-세파로오스, 예컨대)에 의해 정제처리시키는 것에 의해 정제될 수 있다.The crude polypeptide product obtained from the host cell is subjected to sonication of the host cell and centrifuged to encode the cDNA synthesized from the fusion polypeptide and non-A hepatitis B virus RNA between the signal peptide TrpE. An insoluble fraction containing the purified polypeptide is obtained and purified by extracting the fusion polypeptide in soluble form with urea-containing buffer and then purifying the extracted polypeptide by ion exchange column chromatography (S-Sepharose, such as). Can be.

따라서 본 발명은 SEQ ID No. 1 내지 18중 어느 하나로 표시된 아미노산 서열 전체 또는 그의 일부로 구성된, 상기 발현 공정에 의해 수득된 재조합 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드를 제공하는데 있다.Therefore, the present invention is SEQ ID No. To provide a recombinant non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide obtained by the above expression process, consisting of all or part of an amino acid sequence represented by any one of 1 to 18.

여기서 사용된 재조합 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드라는 용어는 벡타에서 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 발현시킴으로써 수득한 폴리펩티드 자체, 및 상기 폴리펩티드를 시그널 펩티드와 같은 다른 펩티드와 융합시켜 수득한 융합 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해되어진다.As used herein, the term recombinant non-A non-hepatitis B-specific antigen polypeptide refers to a polypeptide obtained by expressing a DNA fragment encoding a non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide in vector, and the polypeptide itself. It is understood to include fusion polypeptides obtained by fusion with other peptides such as signal peptides.

[비-A 비-B형 간염의 진단에서 적용][Applied in the Diagnosis of Non-A Non-Hepatitis B]

본 발명의 발현 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 처리시킨 다음 정상인 또는 비-A 비-B형 간염 환자로부터 채취한 각 2개의 혈청 시료와 웨스턴 블러팅법에 의해 항원-항체 반응을 실행하면 상기 폴리펩티드는 제21도 및 제22도에 도시한 바와 같이 환자의 혈청에만 강하게 반응한다. 따라서 발현 폴리펩티드가 비-A 비-B형 간염-특이 항원으로 작용한다는 것이 확인되었다.The expression polypeptides of the present invention were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and then subjected to antigen-antibody reactions by Western blotting with two serum samples taken from normal or non-A non-A hepatitis B patients. The polypeptide responds strongly only to the serum of the patient, as shown in FIGS. 21 and 22. Thus, it was confirmed that the expression polypeptide acts as a non-A hepatitis B-specific antigen.

따라서, 본 발명은 항 비-A 비-B형 간염 비루스 항체를 함유하는 시료를 항원이 항체와 면역학적으로 반응할 수 있는 조건하에서 본 발명의 재조합 비-A 비-B형 간염-특이 항원 폴리펩티드와 함께 배양하고; 또 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 비-A 비-B형 간염 비루스 항원에 대한 항체를 면역학적으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, the present invention provides a recombinant non-A non-B hepatitis B-specific antigen polypeptide of the present invention under conditions in which an antigen may immunologically react with the antibody in a sample containing an anti-A non-A hepatitis B virus antibody. Incubated with; The present invention also provides a method for immunologically detecting an antibody against a non-A hepatitis B virus antigen, comprising detecting an antigen-antibody complex.

발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21을 발현시킴으로써 수득한 발현 폴리펩티드 TrpE.C11-C12, 상응하는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7을 발현시킴으로써 수득한 다른 발현 폴리펩티드 TrpE. C11-7 및 치론 코포레이숀의 측정키크(ORTHO HCV Ab ELISA 키트)의 진단 작용(양성)은 상기 발현 항원과 비-A 비-B형 간염으로 임상학적으로 진단된 환자로부터 취한 혈청 시료와의 반응을 통한 통상적인 효소 면역측정법에 의해 조사한다. 그 결과로서 치론 코포레이숀의 키트의 양성은 69.7%(23/33 경우)인 반면 1군에 속하는 TrpE.C11-7은 78.8%(26/33) 경우)의 양성을 나타내었다. 발현 폴리펩티드 TrpE.C11-C21의 경우, 치론 키트의 경우보다 더 높은 84.8%(28/33 경우)의 양성을 나타내었다. 1군의 구성원인 발현 폴리펩티드 TrpE.C11-7과 2군의 구성원인 TrpE.C11-C21을 조합하여 사용하면, 양성은 93.9%(30/31 경우; 표 1 및 제 23도 참조)로 증가하였다.An expression polypeptide TrpE.C11-C12 obtained by expressing the expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21, another expression polypeptide TrpE obtained by expressing the corresponding expression plasmid Trp.TrpE.C11-7. The diagnostic action (positive) of the C11-7 and Chiron Corporation Kit (ORTHO HCV Ab ELISA Kit) is based on the use of the expressed antigen and serum samples taken from patients clinically diagnosed with non-A non-A hepatitis B. Investigations are carried out by conventional enzyme immunoassays through the reaction. As a result, the kit positive of Chiron Corporation was 69.7% (23/33 cases), whereas TrpE.C11-7 belonging to group 1 was 78.8% (26/33) cases. For the expression polypeptides TrpE.C11-C21, they showed a higher positive of 84.8% (case 28/33) than for the Chiron kit. Using a combination of the expression polypeptide TrpE.C11-7, which is a member of Group 1, and TrpE.C11-C21, which is a member of Group 2, the positive increased to 93.9% (case 30/31; see Table 1 and Figure 23). .

그러므로 본 발명의 구체예에 따르면, 면역 검출법에 사용하기 위한 간염-특이 항원 폴리펩티드로서 1군 및 2군-관련 발현 폴리펩티드의 조합물이 제공된다.Therefore, according to embodiments of the present invention, there is provided a combination of group 1 and group 2 -associated expression polypeptides as hepatitis-specific antigen polypeptide for use in immunodetection.

본 발명은 본발명의 DNA 서열을 기준으로 해서 합성된 센스 및/또는 안티센스 서열을 사용하여 비-A 비-B형 간염 비루스 유전자를 증식시키는 것을 포함하는 유전자 증식법을 제공하는데 있다.The present invention provides a gene propagation method comprising propagating a non-A hepatitis B virus gene using sense and / or antisense sequences synthesized based on the DNA sequence of the present invention.

PCR 프라이머용 합성 염기 서열로서는 하기의 단일 가닥 DNA 서열을 사용할 수 있다.As the synthetic nucleotide sequence for a PCR primer, the following single-stranded DNA sequence can be used.

5′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3′(센스 SEQ ID NO. 19);5′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3 ′ (sense SEQ ID NO. 19);

5′-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3′(아티센스 SEQ ID NO. 20);5'-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3 '(Artisense SEQ ID NO. 20);

5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′(센스 SEQ ID NO. 21); 및5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3 ′ (sense SEQ ID NO. 21); And

5′-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3′(안티센스 SEQ ID NO. 22), 이들 서열은 전술한 2개의 프라이머에 대하여는 SEQ ID NO. 5로 표시되고 또 후술한 2개의 프라이머에 대하여는 SEQ ID NO. 2, 4, 5 또는 13으로 표시되는 부분적인 염기 서열의 센스 또는 안티센스이다. 이들 특수한 프라이머는 본 발명의 범위내에 든다.5'-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3 '(antisense SEQ ID NO. 22), these sequences are SEQ ID NO. For the two primers indicated by 5 and described later, SEQ ID NO. Sense or antisense of the partial base sequence represented by 2, 4, 5 or 13. These special primers are within the scope of the present invention.

단일 가닥 DNA 서열은 인산법, 포스포트리에스테르법, 고체상 방법등과 같은 통상의 방법에 의해 합성될 수 있으나, DNA 합성기의 사용이 가장 유리하다.Single-stranded DNA sequences can be synthesized by conventional methods such as phosphoric acid method, phosphoester ester method, solid phase method and the like, but the use of DNA synthesizer is most advantageous.

PCR 프라이머로 사용되면, 상술한 단일 가닥 DNA 서열은 1군 비루스 유전자에 비해 2군 비루스 유전자에 대해 더 높은 특이성을 나타낸다(표 2 및 표 3 참조).When used as a PCR primer, the single-stranded DNA sequence described above exhibits higher specificity for group 2 viral genes as compared to group 1 viral genes (see Table 2 and Table 3).

따라서, 본 발명은 시료로부터 RNA를 단리하고, 수득한 RNA를 역전사 효소로 처리하여 cDNA 합성하며; 수득한 cDNA를 적어도 한 개의 상기 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응시키고; 증식된 비-A 비-B형 간염 비루스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는, 혈청과 같은 체액 시료중에서 비-A 비-B형 간염 비루스에 유래하는 유전자를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.Therefore, the present invention isolates RNA from a sample and treats the obtained RNA with reverse transcriptase to synthesize cDNA; Polymerase chain reaction of the obtained cDNA using at least one of said primers; The present invention provides a method for detecting a gene derived from a non-A hepatitis B virus in a bodily fluid sample such as serum, comprising detecting the propagated non-A non-B hepatitis virus virus.

본 발명은 또한 비-A 비-B형 간염 비루스의 검출에서 본 발명의 PCR 프라이머용 발현 폴리펩티드 또는 단일 가닥 DNA 서열의 사용을 제공하는 데 있다.The invention also provides for the use of an expression polypeptide or single stranded DNA sequence for a PCR primer of the invention in the detection of a non-A non-hepatitis B virus.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 주어진 것이고 본 발명을 그로써 제한하고자 하는 것은 아니다.The following examples are given to illustrate the invention in more detail and are not intended to limit the invention thereby.

[실시예]EXAMPLE

[비-A 비-B형 간염 환자의 혈장으로부터 cDNA 라이브러리의 제조][Preparation of cDNA Library from Plasma of Non-A Non-Hepatitis B Patients]

만성 비-A 비-B형 간염 일본인 환자 수명으로 부터 채취한 혈장 푸울로 부터 하기한 바와 같이 RNA 분획을 제조한 후 λgt10 및 λgt11파아지를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조한다.Chronic Non-A Non-Hepatitis B Hepatitis A DNA fraction was prepared from plasma pools taken from the life of a Japanese patient as described below and cDNA libraries were prepared using λgt10 and λgt11 phage.

혈장 5리터를 1mM EDTA를 함유하는 동 부피의 50mM 트리스-HCl(pH 8.0)를 사용하여 희석시키고, 희석 시료중에 있는 세포부스러기를 3,500g에서 20분간 원심분리시켜 제거한 다음 생성한 상층액을 다시 40℃, 45,000rpm(약 100,000g)에서 4시간 동안 원심분리시켜 펠릿을 수득한다. 펠릿을 통상의 방법에 따라 단백질 변성제인 6M 구아니듐 티오시아네이트에 용해시키고, 세슘 트리플루오로아세테이트 용액위로 층을 이룬 다음 베크만 SW50 로터를 사용하여 20℃에서 33,000rpm으로 18시간 동안 원심분리처리시킨다. 생성한 펠릿을 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 용해시키고 또 페놀:클로로포름 1:1 용매계로 2회 추출한 다음 유기층을 1/10 부피의 5M NaCl 및 2.5부피의 에탄올과 혼합시킨다. 혼합물을 -20℃에서 2시간동안 방치한 후, 15,000g에서 20분간 원심분리시키고 또 펠릿을 디에틸파이로카르보네이트-처리된 물에 용해시켜 RNA 시료로 사용한다.5 liters of plasma was diluted with an equal volume of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, the cell debris in the diluted sample was removed by centrifugation at 3,500 g for 20 minutes, and the resulting supernatant was again 40. Pellets are obtained by centrifugation at 45,000 rpm (about 100,000 g) for 4 hours. The pellet was dissolved in 6M guanidium thiocyanate, a protein denaturant according to a conventional method, layered onto cesium trifluoroacetate solution and centrifuged at 33,000 rpm for 18 hours at 20 ° C. using a Beckman SW50 rotor. Let's do it. The resulting pellet was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 1 mM EDTA and extracted twice with phenol: chloroform 1: 1 solvent system and then the organic layer was mixed with 1/10 volume of 5M NaCl and 2.5 volumes of ethanol. . The mixture is left for 2 hours at −20 ° C., then centrifuged at 15,000 g for 20 minutes and the pellet is dissolved in diethylpyrocarbonate-treated water to use as RNA sample.

구블러 및 호프만 방법에 따라서, 시판되고 있는 키트(아메르삼 또는 BRL 제조)를 이용하여 랜덤 프라이머 수법으로 RNA 시료로 부터 cDNA를 합성한다. 이 cDNA를 EcoRI 메틸라제로 처리하고, EcoRI 링커 또는 EcoRI 어뎁터를 사용하여 결찰시킨 다음 λgt10 및 λgt11 파아지의 EcoRI 부위에 클론시킨다. 이렇게 하여 제조한 cDNA 라이브러리는 평균 10⁶내지 10⁷PFU의 재조합 파아지를 함유한다.According to the Gubler and Hoffman method, cDNA is synthesized from an RNA sample by a random primer method using a commercially available kit (manufactured by Amersam or BRL). This cDNA is treated with EcoRI methylase, ligated using an EcoRI linker or EcoRI adapter and cloned into EcoRI sites of λgt10 and λgt11 phage. The cDNA library thus prepared contains, on average, 10 ⁶ to 10 ⁷ PFU of recombinant phage.

[실시예 2]Example 2

[비-A 비-B형 간염-특이 cDNA의 단리][Isolation of Non-A Non-Hepatitis B-specific cDNA]

실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리로 부터 비-A 비-B형 간염 특이적 cDNA를 면역스크리닝 및 혼성화 측정법에 의해 단리하는 시도를 행하였다.Attempts have been made to isolate non-A non-hepatitis B specific cDNAs from the cDNA library prepared in Example 1 by immunoscreening and hybridization assay.

먼저, HBc 및 HBs 항체에 대해 음성이고 또 간염을 유발하는 비루스에 대해 특이적인 항체를 함유하는 비-A 비-B형 간염 환자로 부터 취한 2개의 혈청 시료를 사용하여 λgt11 라이브러리를 면역스크리닝하였다. 면역스크리닝은 β-갈락토시다제-융합 재조합 펩티드와 비-A 비-B형 간염(이후 NANBH라 칭함) 환자의 혈청 시료와의 특수 반응을 조사하는 통상의 방식으로 실행하였다.First, λgt11 libraries were immunoscreened using two serum samples taken from non-A non-A hepatitis B patients containing antibodies that are negative for HBc and HBs antibodies and specific for viruses that cause hepatitis. Immunoscreening was carried out in a conventional manner to investigate the special response of the β-galactosidase-fusion recombinant peptide to serum samples of patients with non-A non-B hepatitis (hereinafter referred to as NANBH).

대장균 Y1090균주를 일정 비율로 λgt11 cDNA 라이브러리와 혼합하고, 적합한 밀도로 한천 배지에 플레이팅한 다음 43℃에서 3시간 동안 배양하여 플라크를 형성시킨다. 이어, 한천 플레이트를 10mM IPTG로 적셔진 하이본드-C 니트로셀룰로오스 필터로 씌우고 또 필터로 씌워진 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 발현을 유발시킨다. 이어, 3% 젤라틴 용액을 사용하여 니트로셀룰로오스 필터를 차단시키고, 4℃에서 NANBH 환자의 혈청 시료와 하룻밤 동안 반응시킨 다음 세척하고, 퍼옥시다제-라벨링된 항-사람 IgG(염소 항체)와 반응시킨다. 필터를 디디아미노벤지딘 및 H₂O₂의 혼합물과 반응시키면 양성 신호가 관찰된다. 이 클론 C11-7은 HBc 및 HBs 항체와 반응하지 않는다.E. coli strain Y1090 is mixed with the λgt11 cDNA library in a proportion, plated in agar medium at a suitable density and incubated at 43 ° C. for 3 hours to form plaque. The agar plate was then covered with a High Bond-C nitrocellulose filter moistened with 10 mM IPTG and the plate covered with the filter was incubated at 37 ° C. for 3 hours to induce expression. The nitrocellulose filter is then blocked using 3% gelatin solution, reacted with serum samples of NANBH patients overnight at 4 ° C., then washed and reacted with peroxidase-labeled anti-human IgG (chlorine antibody). . A positive signal is observed when the filter is reacted with a mixture of didiaminobenzidine and H ₂ O ₂ . This clone C11-7 does not react with HBc and HBs antibodies.

이어, 스크리닝의 효율을 향상시키기 위해, 클론 C11-7을 pUC119에 제클론시키고 또 랜덤 프라이머법으로 프로브로 만든다. 프로브를 사용하는 혼성화 측정법에 의해 λgt10 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 스크리닝은 5×104 PFU의 제조합 파아지를 L-플레이트(150mm 접시)상에 대장균 C-600 hfl(-)과 함께 플레이팅하는 종래의 방법으로 실행한다. 37℃에서 플레이트를 하룻밤 동안 배양한 후 플라크가 나타나면, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 보관한 다음 플레이트를 하이본드-N 필터로 30분간 씌운다. 이 필터를 변성용액(0.5M NaOH 및 1.5M NaCl)으로 미리 습윤된 필터상에 1분간 겹쳐 놓고, 변성 용액(0.5M 트리스-HCl, pH 7.0 및 1.5M NaCl)에서 5분간 담그며, 2×SSC로 세척한 다음 건조시킨다. 이 필터를 UV선(340nm)에 2분간 노출시킴으로써 가교시킨다. 이어 하기한 바와 같이, NANBH환자의 혈청을 사용하여 면역스크리닝시켜 수득한 C11-7 클론으로부터 랜덤 프라이머법으로 제조한³²p- 라벨링된 DNA프로브를 사용하는 혼성화 측정법에 의해 상기 필터를 스크리닝시킨다.Then, to improve the efficiency of screening, clone C11-7 was cloned into pUC119 and probed by random primer method. The λgt10 cDNA library is screened by hybridization assay using probes. Screening is carried out by conventional methods of plating preparative phages of 5 × 10 4 PFU with E. coli C-600 hfl (−) on an L-plate (150 mm dish). After incubation of the plate at 37 ° C. overnight, when plaques appear, the plate is stored at 4 ° C. for 1 hour and the plate is covered with a High Bond-N filter for 30 minutes. The filter is superposed for 1 minute on a filter previously wetted with a denatured solution (0.5M NaOH and 1.5M NaCl), immersed for 5 minutes in a denatured solution (0.5M Tris-HCl, pH 7.0 and 1.5M NaCl), 2 × SSC Washed with and then dried. The filter is crosslinked by exposure to UV rays (340 nm) for 2 minutes. The filter is then screened by hybridization assay using ³² p-labeled DNA probes prepared by random primers from C11-7 clones obtained by immunoscreening with serum of NANBH patients as described below.

이 필터를 65℃의 1×SSC에서 하룻밤 동안 배양하고, 65℃에서 1×SSC로 2회 세척(각각 10분간)한 다음 -70에서 방사선자기법처리하여 양성 플라크를 검출한다. 각 양성 플라크를 SM 완충액으로 전달하고 파아지 원액으로 사용한다. 수득한 클론은 일련의 스크리닝을 실행하기 위한 마커 프로브로 사용된다. 그 결과, 총 13개 클론을 단리하고 C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, C10-23 및 C10-35로 표시한다.The filter is incubated overnight at 1 × SSC at 65 ° C., washed twice with 1 × SSC at 65 ° C. (10 min each) and then radiomagnetized at −70 to detect positive plaques. Each positive plaque is transferred to SM buffer and used as phage stock. The clones obtained are used as marker probes for performing a series of screenings. As a result, a total of 13 clones were isolated and C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, It is represented by C10-23 and C10-35.

[실시예 3]Example 3

[2군 비-A 비-B형 간염-특이 cDNA의 선택적 단리][Selective Isolation of Group 2 Non-A Non-Hepatitis B-specific cDNA]

만성 상태의 비-A 비-B형 간염의 일본인 환자의 혈장을 실시예 1 및 2에서 단리한 1군의 cDNA 클론 C11-7 및 2군의 cDNA 클론 C10-14의 발현 산물을 사용하여 ELISA-기본 스크리닝계로 처리시켜 C10-14 클론에만 반응할 수 있는 혈장 시료를 수득한다. 혈장 시료를 1군 및 2군의 잘 보존된 프라이머를 사용한 유전자 증식법(PCR법)에 처리시킨다. PCR 법은 95℃에서 1.5분간 DNA 변성; 55℃에서 2분간 어닐링(annealing); 및 70℃에서 3분간 DNA 합성하는 조건하에서 유전자 Amp^TM(DNA 증식 시약 키트, Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 실행한다. 이들 조건하에서 2군 프라이머를 사용하여야만 유전자 증식이 발견되는 혈장 시료를 모아서 다음에 사용한다. 이 새로운 혈장 시료 1리터를 사용하여 실시예 1에서와 동일한 방식으로 RNA 분획을 제조하고 또 λgt10 및 λgt11 파아지를 사용하여 cDNA 라이브러리(cDNA 라이브러리 A로 칭함)를 작성한다. cDNA라이브러리 A는 평균 10⁶내지 10⁷PFU개의 재조합 파아지를 함유한다.Plasma plasma of Japanese patients with chronic non-A non-B hepatitis B was isolated using the expression products of group 1 cDNA clone C11-7 and group 2 cDNA clone C10-14 isolated in Examples 1 and 2. Treatment with a basic screening system yields a plasma sample capable of reacting only with C10-14 clones. Plasma samples are subjected to gene proliferation (PCR) using groups 1 and 2 well-preserved primers. PCR method was denatured for 1.5 minutes at 95 ℃; Annealing at 55 ° C. for 2 minutes; And gene Amp ^™ (DNA Growth Reagent Kit, Perkin Elmer Cetus) under conditions of DNA synthesis at 70 ° C. for 3 minutes. Under these conditions, group 2 primers should be used to collect plasma samples for gene proliferation and to be used next. Using 1 liter of this new plasma sample, RNA fractions were prepared in the same manner as in Example 1 and cDNA libraries (called cDNA library A) were prepared using λgt10 and λgt11 phage. cDNA Library A contains an average of 10 ⁶ to 10 ⁷ PFU recombinant phages.

한편, 수명의 비-A 비-B형 간염 환자로부터 출발물질로 수득하고 또 상술한 바와 같은 방식으로 ELISA/PCR법에 처리되지 않은 새로운 혈장 시료 5리터로부터 λgt10 파아지를 사용하여 cDNA 라이브러리 B를 작성한다. 이 cDNA 라이브러리 B는 또한 평균 10⁶내지 10⁷PFU의 재조합 파아지를 함유한다.On the other hand, cDNA library B was prepared using λgt10 phage from 5 liters of fresh plasma samples obtained as starting material from non-life hepatitis B patients and not treated in the ELISA / PCR method as described above. do. This cDNA Library B also contains an average of 10 ⁶ to 10 ⁷ PFU of recombinant phage.

실시예 2에서와 동일한 방식으로 면역스크리닝하여 cDNA 라이브러리A로부터 비-A 비-B형 간염-특이 cDNA를 클로닝하고 또 양성 플라크(클론 C11-C21)를 수득한다. 클론 C11-C21은 HBc 및 HBs 항체와 양성 반응을 나타내지 않는다.Immunoscreening in the same manner as in Example 2 clones non-A non-hepatitis B-specific cDNA from cDNA Library A and yields positive plaques (clones C11-C21). Clone C11-C21 does not test positive with HBc and HBs antibodies.

스크리닝 효율을 개선하기 위해, 수득한 클론 C11-C21를 pUC119에 재클론시키고, 제한 효소로 분해시킨 다음 실시예 2에서와 동일한 방식으로 랜덤 프라이머 라벨링법으로³²P-라벨링된 프로브로 만든다. 수득한 프로브를 사용하여, 혼성화 측정법으로 cDNA 라이브러리 B를 스크리닝한다. 일련의 스크리닝을 실행한 후 4개의 클론을 단리하며 이들을 C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15로 명명하였다.To improve screening efficiency, the resulting clones C11-C21 were recloned in pUC119, digested with restriction enzymes and made into ³² P-labeled probes by random primer labeling in the same manner as in Example 2. Using the probes obtained, cDNA Library B is screened by hybridization assay. After running a series of screening, four clones were isolated and named C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15.

[실시예4]Example 4

[비-A 비-B형 간염-특이 cDNA의 서열화][Sequencing of Non-A Non-Hepatitis B-Specific cDNA]

대장균 세포를 실시예 2 및 3에서 수득한 18개 클론의 λgt11 또는 λgt10 파아지로 감염시켜 각 파아지를 다량으로 회수한다. 통상의 알칼리법으로 파아지로부터 DNA를 추출하고, 제한 효소 EcoRI, BamHI 또는 KpnI으로 분해시키고, 또 생성한 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제시킨다. 이와 별도로, M13파아지(Messing J.; Methods in Enzymology, 101, 20-78)의 서열화 벡타 mp18 및 mp19 또는 pUC118 및 pUC119(Vieira, J. and Messing, J.; Methods in Enzymology, 153, 3-11)를 제한 효소 EcoRI, BamHI 또는 KpnI으로 분해하여 직쇄의 벡타 단편을 수득한다. 완충액중의 T4리가제를 사용하여 cDNA 단편과 벡타 DNA를 서로 결합시키고, 또 생성한 반응 산물을 형질전환법 또는 형질감염법으로 대장균 HB101 또는 JM109에 혼입시킨다. 그에 따른 대장균 세포를 배양하고 또 DNA를 알칼리법으로 회수한다. 수득한 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 생거 일행의 디데옥시 사슬 종결법에 따라 결정한다.E. coli cells are infected with λgt11 or λgt10 phage of the 18 clones obtained in Examples 2 and 3 to recover a large amount of each phage. DNA is extracted from the phage by conventional alkaline methods, digested with restriction enzymes EcoRI, BamHI or KpnI, and the resulting DNA fragments are purified by agarose gel electrophoresis. Separately, sequencing vectors of M13 phage (Messing J .; Methods in Enzymology, 101, 20-78) or mp18 and mp19 or pUC118 and pUC119 (Vieira, J. and Messing, J .; Methods in Enzymology, 153, 3-11). ) Is digested with the restriction enzymes EcoRI, BamHI or KpnI to obtain a linear vector fragment. The cDNA fragment and the vector DNA are bound to each other using T4 ligase in the buffer, and the resulting reaction product is incorporated into E. coli HB101 or JM109 by transformation or transfection. Escherichia coli cells are cultured accordingly, and DNA is recovered by alkali method. The nucleotide sequence of the obtained DNA is determined according to the endemic chain termination method of Sanger.

클론 C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, C10-23, C10-35, C10-21, C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15의 뉴클레오타이드 서열 및 그로부터 추론된 아미노산을 SEQ ID NO. 1 내지 18로 서열표에 나타내고 또 이것을 제1도 내지 제18도로 도시한다.Clone C10-11, C10-13, C10-14, C10-15, C10-16, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22, C10-23, C10-35, C10 The nucleotide sequences of -21, C10-E12, C10-E13, C10-E24, and C10-E15 and the amino acids deduced therefrom are set forth in SEQ ID NO. 1 to 18 are shown in the sequence table and shown in FIGS. 1 to 18.

이들 서열과 호돈 일행(WO89/04669호, PCT/JP90/500880) 및 미야무라 일행(Nuc. Aci. Res., 17, 10372(1989))에 의해 기술된 뉴클레오타이드와 그로부터 추론된 아미노산 서열을 비교한 것을 기준으로 하여, 실시예2에서 수득한 클론 C11-7, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22 및 C10-23은 상기 정의한 바와 같은 1군 클론으로 분류되는 반면, 클론 C10-11, C10-13, C10-14, C10-15 및 C10-35는 2군 클론으로 분류된다. 이들 13개 클론 모두는 비-A 비-B형 간염 비루스의 비-구조적 단백질을 코딩한다. 그러나 호돈 일행(WO90/11089) 및 오까모토 일행(Japan J. Exp.Med.,60,3, pp.167-177(1990)에 의해 기재된 서열과의 상동성을 비교한 것으로부터 실시예3에서 수득한 클론 C10-C21은 2군으로 분류되지만, 실시예3에서 수득한 클론 C10-E12, C10-E13, C10-E24 및 C10-E15의 분류는 아직 분명치 않다. 그러나, 플라비비루스의 보고된 게놈(Protein, Nucleic Acid and Enzyme(Japan),35(12), 2117-2127(1990))과 상동성을 비교하면 상기 5개 클론이 비-A 비-B형 간염 비루스의 구조 단백질을 코딩한다는 것을 알 수 있다.A comparison of these sequences with the nucleotides described by the Hodon group (WO89 / 04669, PCT / JP90 / 500880) and Miyamura Group (Nuc. Aci. Res., 17, 10372 (1989)) and the amino acid sequences deduced therefrom Based on this, the clones C11-7, C10-17, C10-18, C10-19, C10-21, C10-22 and C10-23 obtained in Example 2 were classified as group 1 clones as defined above. In contrast, clones C10-11, C10-13, C10-14, C10-15 and C10-35 are classified as group 2 clones. All 13 of these clones encode the non-structural proteins of the non-A hepatitis B virus. However, in Example 3, the homology with the sequences described by Hodon Group (WO90 / 11089) and Okamoto Group (Japan J. Exp.Med., 60, 3, pp.167-177 (1990)) was compared. The obtained clones C10-C21 are classified into two groups, but the classification of the clones C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15 obtained in Example 3 is not yet clear. Comparing homology with the genome (Protein, Nucleic Acid and Enzyme (Japan), 35 (12), 2117-2127 (1990)), the five clones encode structural proteins of non-A hepatitis B virus. It can be seen that.

[실시예5]Example 5

[비-A 비-B형 간염 비루스 cDNA에 의하코딩된 폴리펩티드의 발현 및 정제][Expression and Purification of Polypeptides Encoded by Non-A Non-Hepatitis B Virus cDNA]

(i) 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7의 작성(i) Preparation of expression plasmid Trp.TrpE.C11-7

단리된 클론중의 하나인 C11-7은 Trp 프로모터 조절하의 대장균에서 TrpE와 함께 융합 폴리펩티드로 발현된다(제19도 참조).One of the isolated clones, C11-7, is expressed as a fusion polypeptide with TrpE in E. coli under Trp promoter control (see Figure 19).

먼저, C11-7클론을 pUC119에 혼입시켜 수득한 플라스미드 pUC.C11-7 DNA 1㎍을 37℃의 제한 효소 반응 용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.9), 6mM MgCl₂, BamHI 효소 15단위체 및 ScaI 효소 15 단위체] 20㎕에서 1시간 동안 배양함으로써 분해시킨다. 그후, 상기 반응 용액을 0.8% 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 약 700bp의 BamHI-ScaI 단편을 수득하고, 또 유리 분말법(Gene Clean^TM, Bio-101)으로 이 단편을 정제한다.First, 1 µg of the plasmid pUC.C11-7 DNA obtained by incorporating C11-7 clone into pUC119 was added to a restriction enzyme reaction solution [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl ₂ , BamHI enzyme 15 at 37 ° C. And 15 units of ScaI enzyme] by incubation for 20 hours in 20 μl. The reaction solution is then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to obtain a BamHI-ScaI fragment of about 700 bp, which is then purified by the glass powder method (Gene Clean ^™ , Bio-101).

발현 벡타인 Trp.TrpE DNA1㎍을 37℃의 반응 용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM MgCl₂, BamHI 효소 15단위체 및 ScaI 효소 15단위체] 20㎍중에서 1시간 동안 배양함으로써 분해시킨다. 물 39㎕를 부가한 후, 반응 용액을 70℃에서 5분간 열 처리한 다음 세균 알칼리성 포스파타제(BAP) 1㎕(250U/㎕)와 혼합한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이 반응 용액을 페놀로 추출하고, 수성층을 에탄올 침전처리시킨 다음 침전물을 건조시킨다. 수득한 BamHI-ScaI-처리된 벡타 DNA 1㎍ 및 상기 C11-7 DNA 단편을 10X리가제 완충액[660mM 트리스-HCl(pH 7.5), 66mM MgCl₂, 100mM 디티오트레이톨 및 1mM ATP] 5㎕ 및 T4 DNA 리가제 1㎕(350U/㎕)에 부가하고, 또 그 혼합물에 물을 부가하여 최종 부피를 50㎕로 만든다. 이후 이렇게 제조된 혼합물을 16℃에서 하룻밤 동안 배양하여 결찰을 완성시킨다.1 μg of expression vector Trp.TrpE DNA was digested by incubating for 1 hour in 20 μg of a reaction solution [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl ₂ , 15 units of BamHI enzyme and 15 units of ScaI enzyme] at 37 ° C. Let's do it. After adding 39 μl of water, the reaction solution was heat treated at 70 ° C. for 5 minutes and then mixed with 1 μl (250 U / μl) bacterial alkaline phosphatase (BAP) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution is extracted with phenol, the aqueous layer is ethanol precipitated and the precipitate is dried. 1 μg of the obtained BamHI-ScaI-treated vector DNA and the C11-7 DNA fragment were mixed with 5 μl of 10 × ligase buffer [660 mM Tris-HCl (pH 7.5), 66 mM MgCl ₂ , 100 mM dithiothitol and 1 mM ATP]; Add to 1 μl of T4 DNA ligase (350 U / μl) and add water to the mixture to bring the final volume to 50 μl. The thus prepared mixture is then incubated overnight at 16 ° C. to complete the ligation.

대장균 HB101균주를 상기 반응 용액 10㎕를 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환 반응에 사용하기 위한 수용성 대장균 균주는 염화칼슘 수법[Mandel, M 및 Higa, A.; J.Mol.Biol., 53, 159-162(1970)]으로 제조한다. 형질전환된 대장균 균주 세포를 암피실린 25㎍/ml을 함유하는 LB-플레이트(1% 트립토판, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl 및 1.5% 한천)상에 놓고 37℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 플레이트상에서 생장한 각 콜로니 1루프량을 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지로 옮기고 37℃에서 하룻밤동안 배양한다. 1.5ml의 배양 배지중에 있는 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 플라스미드 DNA(미니프렙(miniprep)을 알칼리법(마니아티스 일행; Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 1982)으로 실행한다. 수득한 플라스미드 DNA 1㎕를 37℃의 반응액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM MgCl₂, BamHI 15단위체 및 ScaI 15단위체] 20㎕에서 1시간 동안 분해시킨다. 그후, 분해된 용액을 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 700bp의 BamHI-ScaI 단편을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7을 수득한다. 이 플라스미드를 대장균 HB101 균주로 형질전환시켜서 일본국 305 이바라끼껜 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1-3에 소재하는 퍼멘테이숀 리서치 인스티튜트에 1990년 7월 6일 수탁 번호 FERM P-11590(대장균 HB101/Trp.TrpE.C11-7로 명명)로 기탁하였다. 이 기탁은 부다페스트 조약에 기술된 국제 기탁기관인 동일 기관에 의해 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로 1991년 6월 13일 새로운 수탁 번호 FERM BP-3443로 이관되었다.E. coli HB101 strain is transformed using 10 µl of the reaction solution. Water soluble E. coli strains for use in the transformation reactions include calcium chloride methods [Mandel, M and Higa, A .; J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970). Transformed E. coli strain cells are placed on LB-plates (1% tryptophan, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1.5% agar) containing 25 μg / ml of ampicillin and incubated overnight at 37 ° C. One loop of each colony grown on the plate is transferred to liquid LB medium containing 25 μg / ml of ampicillin and incubated overnight at 37 ° C. Cells in 1.5 ml of culture medium are collected by centrifugation and plasmid DNA (miniprep) is run by alkaline method (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982). [Mu] l was digested in 20 [mu] l of reaction solution [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl ₂ , 15 units of BamHI and 15 units of ScaI] at 37 ° C. The digested solution was then agarose. Gel electrophoresis yielded an expression plasmid Trp.TrpE.C11-7 capable of producing a 700 bp BamHI-ScaI fragment, which was transformed with E. coli HB101 strain and transformed into E. coli HB101 strain 305 Ibaraki Tsukubashi Higashi 1chome 1 Was deposited with the Permanence Research Institute at -3 under accession number FERM P-11590 (named Escherichia coli HB101 / Trp.TrpE.C11-7) on July 6, 1990. This deposit was made in the international treaty described in the Budapest Treaty. By the same institution as the depositary An international deposit under the Budapest Treaty was transferred to the new accession number FERM BP-3443 on June 13, 1991.

(ⅱ) 클론 C11-7에 의해 코딩된 폴리텝티드의 발현 및 정제(Ii) Expression and purification of polypeptides encoded by clone C11-7

발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-7로 형질전환된 대장균 HB101균주를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 액체 2YT배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출액 및 0.5% NaCl) 3ml에 접종시키고 또 37℃에서 9시간 동안 배양한다. 배양된 육즙 1ml 부분을 암피시린 50㎍/ml를 함유하는 액체 M9/CA 배지(0.6% Na₂HPO₄, 0.5% KH₂PO₄, 0.5% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 0.1mM CaCl₂, 2Mm MgSO₄, 0.5% 카사민산 및 0.2% 글루코오스) 100ml에 접종시키고 또 37℃에서 21시간 동안 배양한다. 배양 육즙의 18ml부분을 M9-CA 배지 1.2리터에 접종시키고 또 37℃에서 배양한다. 배양 육즙의 OD₆₀₀에서 혼탁도가 0.3에 도달하면, 인돌 아크릴레이트를 최종 농도 40mg/l로 부가하고, 또 추가로 16시간 동안 배양을 계속한다. 원심분리에 의해 최종 배양 육즙으로부터 수거한 세포를 완충액A[50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA 및 30mM NaCl] 20ml에 현탁시키고 또 세포 현탁액을 원심분리시켜 발현 세포 2.6g을 수득한다. 이렇게 하여 수득한 세포를 완충액 A 10ml에 현탁시키고, 초음파 처리로 분해시킨 다음 원심분리처리하여 비-A 비-B형 간염 비루스 cDNA에 의해 코딩된 폴리펩티드와 함께 TrpE의 융합 폴리펩티드를 함유하는 불용성 분획을 수득한다. 불용성 분획중에 있는 융합 폴리펩티드를 용해시키고 9M 우레아를 함유하는 완충액 A 10ml를 사용하여 추출시킨다. 그후 용해된 추출물을 0M 내지 0.5M 구배의 NaCl을 사용하여 S-세파로오스 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리시켜 융합 폴리펩티드를 정제한다.E. coli HB101 strain transformed with the expression plasmid Trp.TrpE.C11-7 was inoculated in 3 ml of liquid 2YT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract and 0.5% NaCl) containing 50 μg / ml of ampicillin and Incubate for 9 hours at. A portion of the cultured juicy broth was prepared in liquid M9 / CA medium (0.6% Na ₂ HPO ₄ , 0.5% KH ₂ PO ₄ , 0.5% NaCl, 0.1% NH ₄ Cl, 0.1 mM CaCl ₂₎ containing 50 μg / ml of ampicillin. , 2 Mm MgSO ₄ , 0.5% casamic acid and 0.2% glucose) and incubated at 37 ° C. for 21 hours. 18 ml portions of the culture broth are inoculated in 1.2 liters of M9-CA medium and incubated at 37 ° C. When the turbidity reaches 0.3 at OD ₆₀₀ of the culture broth, indole acrylate is added at a final concentration of 40 mg / l and the incubation is continued for another 16 hours. The cells harvested from the final culture broth by centrifugation are suspended in 20 ml of Buffer A [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA and 30 mM NaCl] and the cell suspension is centrifuged to give 2.6 g of expressing cells. The cells thus obtained are suspended in 10 ml of buffer A, sonicated and then centrifuged to obtain an insoluble fraction containing the fusion polypeptide of TrpE together with the polypeptide encoded by the non-A hepatitis B virus cDNA. To obtain. The fusion polypeptide in the insoluble fraction is dissolved and extracted using 10 ml of Buffer A containing 9M urea. The soluble polypeptides are then purified by S-Sepharose ion exchange column chromatography using NaM with a gradient of 0M to 0.5M.

(iii) 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21의 작성(iii) Construction of expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21

클론 C11-C21은 프로모터 조절하의 대장균중에서 TrpE 및 융합 폴리펩티드로 발현된다(제20도 참조).Clones C11-C21 are expressed as TrpE and fusion polypeptides in E. coli under promoter control (see also FIG. 20).

먼저, C11-C21 클론을 pUC119에 혼입시켜 수득한 플라스미드 pUC.C11-C21 DNA 1ng을 2개의 프라이머(5′-TTACGAATTCATGGGCACGAATCCT-3′ 및 5′-TTAATCGATGACCTTACCCACATTGCG-3′)를 사용한 PCR법에 처리시킨다. PCR법은 반응 조건(DNA 변성, 95℃에서 1.5분간; 어닐링, 50℃에서 2분간; 또 DNA 합성, 70℃에서 3분간)하에서 Gene Amp^TM키트(DNA 증식 시약 키트, 퍼어킨 얼머 세투스)를 사용하여 실행한다. 이렇게 하여 수득한 DNA 단편을 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하고 또 유리 분말 수법에 의해 정제한다. 이와 별도로, pUC118을 제한 효소 SmaI으로 분해시킨 다음 T4 리가제를 함유하는 완충액중에서 PCR법으로 수득한 DNA 단편과 함께 결찰시켜 플라스미드 pUC118.C11-C21.Sma를 수득한다. 수득한 이 플라스미드 DNA 1㎍을 37℃의 효소 반응액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl(pH 7.9), 6mM MgCl₂, EcoRI 15단위체 및 BamHI 15단위체]에서 1시간 동안 분해시킨다.First, 1 ng of the plasmid pUC.C11-C21 DNA obtained by incorporating the C11-C21 clone into pUC119 is subjected to PCR using two primers (5'-TTACGAATTCATGGGCACGAATCCT-3 'and 5'-TTAATCGATGACCTTACCCACATTGCG-3'). The PCR method was performed under the reaction conditions (DNA denaturation, 1.5 minutes at 95 ° C; annealing, 2 minutes at 50 ° C; and DNA synthesis, 3 minutes at 70 ° C). Gene Amp ^™ kit (DNA growth reagent kit, Perkin Ulmer Setus) Run with The DNA fragments thus obtained are separated by 0.8% agarose gel electrophoresis and purified by the glass powder technique. Separately, pUC118 is digested with restriction enzyme SmaI and then ligated with DNA fragments obtained by PCR in a buffer containing T4 ligase to obtain plasmid pUC118.C11-C21.Sma. 1 μg of this plasmid DNA obtained was digested in an enzyme reaction solution of 37 ° C. [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl ₂ , 15 EcoRI units and 15 BamHI units) for 1 hour.

이후 생성한 반응 혼합물을 0.8% 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 약 380bp의 EcoRI-BamHI 단편을 단리하고 또 유리 분말법[Gene Clean^TM, Bio-101)으로 정제시킨다.The resulting reaction mixture is then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to isolate EcoRI-BamHI fragment of about 380bp and purified by glass powder method [Gene Clean ^™ , Bio-101).

이어, 발현 벡타 Trp.TrpE DNA의 제한 분해를 BamHI 및 ScaI 대신 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 실행한 이외에는 상기 과정(ⅰ)에 기술된 바와 동일한 방식으로 결찰 및 형질전환 반응을 실행한다. 이후, 약 380bp의 EcoRI-BamHI 단편을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21을 아가로오스 겔 전기영동 정제에 의해 선별한다. 이 플라스미드를 대장균 HB101 균주로 형질전환시켜 상기 주소의 퍼멘테이숀 리서치 인스티튜트, 에이젼시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지에 1990년 12월 11일 수탁 번호 FERM P-11893(대장균 HB101/Trp.TrpE.C11-C21)으로 기탁하였다. 이 기탁은 또한 부다페스트 조약에 기술된 국제 기탁 기관인 동일 기탁 기관에 의해 1991년 6월 17일 수탁 번호 FERM BP-3451로 이관되었다.The ligation and transformation reaction is then carried out in the same manner as described in the procedure (iii), except that restriction digestion of the expression vector Trp.TrpE DNA was performed using EcoRI and BamHI instead of BamHI and ScaI. The expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21, which can produce an EcoRI-BamHI fragment of about 380 bp, is then selected by agarose gel electrophoresis purification. This plasmid was transformed into E. coli HB101 strain and submitted to the Persistent Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Dec. 11, 1990, FERM P-11893 (E. coli HB101 / Trp.TrpE.C11-C21) Was deposited. This deposit was also transferred to accession number FERM BP-3451 on 17 June 1991 by the same depository, the international depositing body described in the Budapest Treaty.

(iv) 클론C11-C21에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 및 정제(iv) Expression and Purification of Polypeptides Encoded by Clone C11-C21

융합 폴리펩티드의 발현과 정제는 Trp.TrpE.C11-7 대신 상기 과정(ⅲ)에 의해 수득한 발현 플라스미드 Trp.TrpE.C11-C21를 사용한 이외에는 상술한 과정(ⅱ)에서와 동일한 방식으로 실행한다.Expression and purification of the fusion polypeptide is carried out in the same manner as in the above-mentioned process (ii) except that the expression plasmid Trp.TrpE.C11-C21 obtained by the above procedure (iii) is used instead of Trp.TrpE.C11-7.

[실시예6]Example 6

[비-A 비-B형 간염 환자의 혈청에서 항-비-A 항-비-B형 간염 비루스 항체의 측정][Measurement of Anti-Non-A Anti-Non-B Hepatitis Virus Antibodies in Serum of Non-A Non-Hepatitis B Patients]

(i) 웨스턴 블러팅 측정(i) Western blotting measurement

실시예 5에서 수득되어 정제된 발현 산물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[Laemmli; Nature, 277, 680(1970)]처리시키고 또 통상의 방식으로 니트로셀룰로오스 필터(Bio-Rad, 트랜스-블럿)상에 블러팅한다. 이 필터를 3% 젤라틴 용액으로 차단시킨 다음 정상인 또는 비-A 비-B형 간염 환자의 혈청 시료와 반응시킨다. 세척한 후, 필터를 퍼옥시다제-라벨링된 사람의 IgG(염소 항체)와 반응시킨다. 그후 필터를 다시 세척하고 반응 기질로 디아미노벤지딘을 함유하는 용액에 담궈서 발색 반응을 확인한다.The expression product obtained and purified in Example 5 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Laemmli; Nature, 277, 680 (1970)] and blot onto nitrocellulose filters (Bio-Rad, trans-blot) in a conventional manner. The filter is blocked with 3% gelatin solution and then reacted with serum samples from normal or non-A hepatitis B patients. After washing, the filter is reacted with peroxidase-labeled human IgG (goat antibody). The filter is then washed again and immersed in a solution containing diaminobenzidine as the reaction substrate to confirm the color reaction.

결과를 제21도 및 제22도에 나타낸다. 제21도에서는, 실시예 5-(ⅱ)에서 수득된 발현 폴리펩티드 TrpE.C11-7(1군)을 항원으로 사용하고, 또 제22도, 실시예 5-(ⅳ)에서 수득한 발현된 폴리펩티드 TrpE.C11-C21(2군)을 사용한다. 각 경우에서, 정상인 혈청 시료와는 반응을 나타내지 않지만 환자의 혈청 시료와는 강한 반응을 나타내는 특수한 밴드가 발견되었다.The results are shown in FIGS. 21 and 22. In FIG. 21, the expressed polypeptide obtained in Example 5- (ii) using TrpE.C11-7 (Group 1) as the antigen, and in FIG. 22, the expressed polypeptide obtained in Example 5- (iii). TrpE.C11-C21 (group 2) is used. In each case, a special band was found that did not react with a normal serum sample but with a strong response with the patient's serum sample.

(ii) 효소-결합된 면역흡착 측정법(ELISA)에 의한 측정(ii) measurement by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

ELISA는 웨스턴 블러팅법의 경우와 대조적으로 다수의 혈청 시료를 진단하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. ELISA는 다음과 같이 실행한다; 정제된 항원 시료를 PBS(-)를 사용하여 5㎍/ml 농도로 희석시키고 또 4℃ 또는 실온의 마이크로플레이트에 고정시킨다. 세척액으로 수회 세척한 후, 검출될 희석 혈청 시료를 플레이트에 부가하고 또 37℃ 또는 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세척한 후 퍼옥시다제-라벨링된 항-사람 IgG(염소 항체)를 부가하고 또 37℃ 또는 실온에서 배양하여 반응을 완료시킨다. 수회 세척한 후, 디아미노벤지딘 용액 50㎕를 부가하고 또 37℃에서 배양하여 발색 반응시킨다. 그후, 발색 반응을 2M H₂SO₄로 중지시키고 또 색을 비색계로 측정한다.ELISA can be used as a means for diagnosing a large number of serum samples as opposed to Western blotting. ELISA is executed as follows; Purified antigen samples are diluted to 5 μg / ml concentration using PBS (−) and fixed on microplates at 4 ° C. or room temperature. After washing several times with the wash solution, the diluted serum sample to be detected is added to the plate and incubated for 1 hour at 37 ° C or room temperature. After washing, peroxidase-labeled anti-human IgG (goat antibody) is added and incubated at 37 ° C. or room temperature to complete the reaction. After washing several times, 50 µl of diaminobenzidine solution was added, followed by incubation at 37 ° C for color reaction. The color reaction is then stopped with 2M H ₂ SO ₄ and the color is measured with a colorimeter.

본 발명의 발현 폴리펩티드 항원인 TrpE.C11-7(1군)과 TrpE.C11-C21(2군)을 사용한 경우의 양성비율과 시판되고 있는 치론 코포레이숀의 키트(오르토 HCV Ab ELISA 시험)를 사용한 경우를 비교한다. 표1에 나타낸 바와 같이, 치론의 키트를 사용한 경우는 69.7%의 양성비율을 나타낸 반면, TrpE.C11-7과 TrpE.C11-C21을 사용한 경우는 78.8%와 84.8%의 양성비율을 나타내었다. 또한 본 발명의 이들 2개의 발현 폴리펩티드를 조합하여 사용하면 양성 비율은 98.9%(30/31 경우)로 증가하였다(제23도 참조).Positive ratios using TrpE.C11-7 (group 1) and TrpE.C11-C21 (group 2), the expression polypeptide antigens of the present invention, and a commercially available kit of Chiron Corporation (ortho HCV Ab ELISA test) Compare the cases used. As shown in Table 1, the use of Chiron's kit showed a positive rate of 69.7%, whereas the use of TrpE.C11-7 and TrpE.C11-C21 showed 78.8% and 84.8%. In addition, the use of these two expression polypeptides of the present invention in combination increased the positive rate to 98.9% (30/31) (see Figure 23).

[실시예 7]Example 7

[비-A 비-B형 간염 환자의 혈장에서 RT-PCR에 의해 비-A 비-B형 간염 비루스 2군 유전자의 검출][Detection of Non-A Non-Hepatitis B Virus Group 2 Gene by RT-PCR in Plasma of Non-A Non-Hepatitis B Patients]

RT-PCR은 다음과 같이 실행한다 : 비-A 비-B형 간염 환자로부터 취한 혈장 시료 100㎕에 6M GTC용액(6M구아니딘 티오시아네이트, 25mM 나트륨 시트레이트, 0.5% 사코실 및 0.2M 2-메르캅토에탄올) 300㎕를 부가하고 그 혼합물을 교반한다. 여기에 2M 나트륨 아세테이트(pH 5.2) 40㎕, 페놀 400㎕ 및 클로로포름/이소아밀 알코올(49:1) 80㎕를 부가하고 또 완전히 교반한다. 혼합물로부터 분리된 수성층을 이소프로필 알코올과 혼합하고 또 원심분리시킨다. RNA 공급원으로서 펠릿을 사용하여 cDNA의 합성을 실행한다. cDNA 합성을 위하여, 10mM 트리스-HCl, 0.01% 젤라틴, 1mM의 각 dNTP, 4mM MgCl₂, 1mM DTT 및 100피코몰의 각 프라이머를 함유하는 반응 용액에 RNase 억제제와 역전사효소를 부가하고, 그 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양하여 반응을 완료시킨다. cDNA를 사용하여 PCR을 실행한다. 밴드 검출의 감도와 특이성을 증가시키기 위해, 2단계의 PCR법 즉 먼저 2개의 프라이머를 사용하는 PCR(제1단계 PCR)에 이어 제1 PCR 산물 내부에 존재하는 2개의 프라이머를 사용하는 PCR(제2단계 PCR)을 하여 한다. PCR 반응을 실행하기 위하여, 하기 반응 조건하에서 cDNA, 10mM 트리스-HCl, 0.01% 젤라틴, 2mM 각 dNTP, 1.5mM MgCl₂및 50피코몰의 각 프라이머를 함유하는 반응액 100㎕를 사용하여 각 증식 사이클을 실행한다.RT-PCR was performed as follows: 6M GTC solution (6M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.5% sacosyl and 0.2M 2- in 100 μL of plasma samples taken from non-A non-A hepatitis B patients). Mercaptoethanol) is added and the mixture is stirred. To this was added 40 μl 2M sodium acetate, pH 5.2, 400 μl phenol and 80 μl chloroform / isoamyl alcohol (49: 1) and stirred thoroughly. The aqueous layer separated from the mixture is mixed with isopropyl alcohol and centrifuged. The synthesis of cDNA is carried out using the pellet as an RNA source. For cDNA synthesis, an RNase inhibitor and reverse transcriptase were added to a reaction solution containing 10 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin, 1 mM each dNTP, 4 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT and 100 picomolar primers, and the mixture was added. Incubate at 37 ° C. for 2 hours to complete the reaction. PCR is performed using cDNA. In order to increase the sensitivity and specificity of band detection, a two-step PCR method, first using two primers (first step PCR) followed by two primers present inside the first PCR product 2 step PCR). To carry out the PCR reaction, each propagation cycle using 100 μl of a reaction solution containing cDNA, 10 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin, 2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl ₂ and 50 picomolar primers under the following reaction conditions: Run

변성, 94℃에서 1.5분간; 어닐링, 50℃에서 2분간; 사슬 연장 반응, 70℃에서 2분간, 증식 사이클을 35회 반복한다. 수개의 프라이머의 효과를 측정한다. 결과로서, 2군 특이적 DNA 단편이 하기의 4개 프라이머를 사용하여 검출될 수 있는 것이 밝혀졌다:Denaturation at 94 ° C. for 1.5 minutes; Annealing at 50 ° C. for 2 minutes; The chain extension reaction, propagation cycle is repeated 35 times at 70 ° C. for 2 minutes. The effect of several primers is measured. As a result, it was found that group 2 specific DNA fragments can be detected using the following four primers:

제1단계 PCRFirst Step PCR

kk21 : 5′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3′kk21: 5′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3 ′

kk22 : 5′-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3′kk22: 5′-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3 ′

제 2단계 PCRSecond Step PCR

kk26 : 5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′kk26: 5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3 ′

kk27 : 5′-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3′kk27: 5′-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3 ′

이들 4개 프라이머를 PCR법에 적용함으로써 206bp의 DNA 단편을 검출할 수 있다. 대조용으로, J1 염기서열로부터 프라이머를 합성하고 또 1군 DNA 단편의 검출을 시도한다. 비-A 비-B형 간염 환자의 혈장 시료로 행한 PCR의 결과를 표2에 나타낸다.By applying these four primers to the PCR method, a DNA fragment of 206 bp can be detected. For control, primers are synthesized from the J1 sequence and attempted to detect group 1 DNA fragments. Table 2 shows the results of PCR performed on the plasma samples of non-A non-B hepatitis patients.

비-A 비-B형 간염 비루스로부터 얻은 DNA 단편은 1군 프라이머(즉 1군 PCR) 및 2군 프라이머(즉 2군 PCR)를 사용한 양쪽 PCR에 의해 검출될 수 있고, 따라서 1군 및 2군 관련 비루스 모두를 포함하는 것으로 사고되는 2개 시료 3번 및 5번을 비루스성 유전자에 대해 서열화시킨다. 표3에 나타낸 바와 같이, 2군 PCR으로 수득된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 2군 클론인 C10-13과 비교하면, 85내지 88%의 상동성이 관측되는데 이는 2군 유전자의 검출 요구를 지시하는 것이다.DNA fragments obtained from non-A non-B hepatitis virus can be detected by both PCRs using Group 1 primers (ie Group 1 PCR) and Group 2 primers (ie Group 2 PCR), thus Group 1 and Group 2 Two samples 3 and 5, which are thought to contain all of the relevant viruses, are sequenced for the viral virus. As shown in Table 3, comparing the nucleotide sequence of the DNA fragments obtained by group 2 PCR with group 2 clone C10-13, homology between 85 and 88% was observed, indicating the need to detect group 2 genes. will be.

2개의 뉴클레오타이드 서열을 전술한 1군 클론 J1(미야무라 일행, 상기 동일)과 비교 하면, 64.8% 내지 68%의 상동성이 관측된다. 상동성 평가 결과는 2군 PCR에 사용된 프라이머가 선택적으로 2군 비루스성 유전자를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.Comparing the two nucleotide sequences with Group 1 clone J1 described above (Miyamura et al., Above), homology between 64.8% and 68% is observed. The homology evaluation results indicate that the primers used for group 2 PCR can selectively detect group 2 viral genes.

주 : NK 및 NP는 음성 대조용임.Note: NK and NP are for negative control.

상기 실시예로부터 알 수 있듯이, 본 발명은 하기와 같은 이점을 갖고 있다: 본 발명에 따른 cDNA 서열은 비-A 비-B형 간염에 특이적이고, 또 이들 유전자를 대장균등과 같은 미생물 숙주 세포중의 단백질 발현 시스템에 혼입시켜 수득한 폴리펩티드는 다수의 비-A 비-B형 간염 환자로부터 취한 혈청 시료와 면역학적으로 반응할 수 있으므로 고도의 감도와 판단 정확도를 갖는 비-A 비-B형 간염 진단 키트를 제조할 수 있다. 또한 이들 서열을 기준으로 하여 합성된 고도의 특이성을 갖는 서열을 프로브 또는 다른 프로브로 직접적으로 사용하여 상기 질병을 진단할 수 있다. 또한 이들 질병의 진단뿐만 아니라 비-A 비-B형 간염 특이 유전자의 단리도 유전자의 단리도 유전자 증식법(PCR법)을 적용함으로써 달성될 수 있다.As can be seen from the above examples, the present invention has the following advantages: The cDNA sequences according to the present invention are specific for non-A non-B hepatitis, and these genes are expressed in microbial host cells such as E. coli. Polypeptides obtained by incorporation into the protein expression system of the non-A hepatitis B have high sensitivity and judgment accuracy because they can immunologically react with serum samples taken from a number of non-A hepatitis B patients. Diagnostic kits can be prepared. It is also possible to use the highly specific sequences synthesized based on these sequences directly as probes or other probes to diagnose the disease. In addition, the diagnosis of these diseases as well as the isolation of non-A non-B hepatitis B specific genes can also be achieved by applying the gene proliferation method (PCR method).

서열목록Sequence Listing

Claims

Encodes a non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide derived from a non-structural protein of a non-A non-Hepatitis B virus, the polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO.1 DNA fragments.

Encodes a non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide derived from a non-structural protein of a non-A non-Hepatitis B virus, the polypeptide comprising a DNA comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO.14 snippet.

Expression vector plasmid Trp.TrpE.C11-C21.

Expression Vector Plasmid Trp.TrpE.C11-C7

E. coli transformed with the expression vector according to claim 3 or 4.

Constructing a replicative expression vector capable of expressing the DNA fragment in a suitable host cell; Introducing the expression vector into a host cell to obtain a transformant; Producing the recombinant polypeptide by culturing the transformant under conditions in which DNA fragments can be expressed; A method for producing a recombinant non-A non-Hepatitis B-specific antigen polypeptide obtained by expression of a DAN fragment according to claim 1, further comprising recovering the recombinant polypeptide.

A method for preparing a recombinant non-A non-B hepatitis-specific antigen polypeptide obtained by expression of a DAN fragment according to claim 1.

A method for propagating non-A hepatitis B-specific antigen virus genes using sense and / or antisense sequences synthesized based on partial base sequences of the DAN fragment according to claim 1.

Single stranded DNA sequence for PCR primers represented by SEQ ID NO.19.

Single stranded DNA sequence for PCR primers represented by SEQ ID NO.20.

Single stranded DNA sequence for PCR primers represented by SEQ ID NO.21.

Single stranded DNA sequence for PCR primers represented by SEQ ID NO.22.

Isolating RNA from a bodily fluid sample to be tested; This RNA is treated with reverse transcriptase to synthesize cDNA; 13. A polymerase chain reaction treatment of cDNA using any of the other single stranded DNA sequences in any one of claims 9-12; And detecting the non-A non-A hepatitis B virus gene that has been propagated.

A sample of a bodily fluid that may contain a non-A hepatitis B virus antibody may be subjected to an antigen-antibody reaction in the presence of at least one recombinant non-A non-B hepatitis B-specific antigen polypeptide according to claim 7. An immunological method for detecting an antibody that responds to a non-A hepatitis B virus antigen, which comprises cultivating under conditions capable of detecting and detecting the antigen-antibody complex.

A mixture of non-A non-hepatitis B specific antigen polypeptide that is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1 or 14.

A sample of a bodily fluid that may contain a non-A hepatitis B virus antibody may be subjected to an antigen-antibody reaction in the presence of a mixture of the recombinant non-A non-B hepatitis B-specific antigen polypeptide according to claim 15. Incubated under conditions that can be used; And immuno-method for detecting an antibody in response to the non-A hepatitis B virus antigen, comprising detecting the antigen-antibody complex.