RU2073714C1 - Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы - Google Patents
Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2073714C1 RU2073714C1 SU5029173A RU2073714C1 RU 2073714 C1 RU2073714 C1 RU 2073714C1 SU 5029173 A SU5029173 A SU 5029173A RU 2073714 C1 RU2073714 C1 RU 2073714C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- luciferase
- escherichia coli
- producer
- bacterial luciferase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Сущность изобретения: штамм получен клонированием генов Lux A, B Photobacterium leiognathi, кодирующих α и β субъединицы люциферазы в Escherichia coli. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" под регистрационным номером ВКПМ В-5520. Штамм продуцирует люциферазу, содержание которой составляет до 50% от растворимого белка, и может полностью заменить прототип в получении фермента для биотехнологических целей.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма продуцента бактериальной люциферазы.
Указанный фермент применяется для аналитического определения никотинамидадениндинуклеотидов и ферментов, использующих их в качестве субстратов. Поэтому получение люциферазы в препаративных количествах имеет важное значение для целей медицинской биохимии, микробиологии и экологии.
Известен природный штамм-продуцент люциферазы Photobacterium leiognathi, содержание люциферазы в котором составляет до 5% от растворимого белка. Поэтому для получения люциферазы в препаративном количестве требуется много бактериальной биомассы.
Целью изобретения является получение рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего высокоактивную люциферазу Photobacterium leiognathi.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента использован рекомбинантный штамм Escherichia coli SL60, в котором клонированы гены Lux A, B Photobacterium leiognathi в составе единого фрагмента ДНК, ограниченного сайтами рестрикции Есо 47III Hin 1.I под контролем Lac промотора векторной плазмиды pUC18.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" под регистрационным номером ВКПМ В-5520.
Рекомбинантный штамм Escherichia coli SL60 обладает следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размеры (1 2)х(3 6) мкм, подвижные, не образуют эндоспор. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 37oC. Колонии на СПА округлые, края ровные, четкие.
Физиолого-биохимические признаки. Грамотрицателен, не сбраживает лактозу и арабинозу, ауксотроф по тиамину и пролину, обладает устойчивостью к ампициллину в концентрациях до 50 мг/л.
Хранение штамма осуществляют в 30%-ном глицерине при -70oC.
Биотехнологические свойства. При исследовании разрушенной биомассы из нее выделена люцифераза, по специфической активности и электрофоретической подвижности подобная люциферазе Photobacterium leiognathi.
Определяющим отличием предлагаемого штамма Escherichia coli SL60 является высокое содержание люциферазы, составляющее до 50% от растворимого белка (в 10 раз выше, чем у штамма-прототипа).
Пример. Получение биомассы и выделение фермента.
Штамм-продуцент Е. соli SL60 выращивают на жидкой питательной среде LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлористого натрия), содержащей антибиотик ампициллин (50 мг/л), при температуре 37oC до плотности клеточной суспензии 2 4 опт. ед. (λ 550 нм). Клетки отделяют от среды центрифугированием, осадок промывают 100 мкМ К-Na-фосфатным буфером (рН 7,0) и взвешивают. Для получения люциферазы 2 г сырой биомассы суспендируют в этом же буфере из расчета 10 мл буфера на 1 г биомассы. Клетки разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т импульсами по 20 секунд с 10-секундными интервалами. Общая продолжительность обработки составляет 3 минуты. Клеточные обломки удаляют центрифугированием при 20000g в течение 30 минут. Супернатант, содержащий люциферазу, наносят на колонку Моno Q (1 х 10 см) в системе FPLC (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,01 М К-Na-фосфатным буфером (рН 7,0). Скорость нанесения составляет 2 4 мл/мин. После нанесения колонку промывают 0,1 М раствором NaCl и элюируют люциферазу линейным градиентом NaCl в пределах концентраций 0,2 0,4 М. Объем собираемых фракций составляет 2 мл. Люцифераза выходит в объеме 8 10 мл в пределах 0,3 0,36 М NaCl. Хроматографические процедуры проводят при комнатной температуре.
Выход фермента составляет до 95% от начального количества.
Активность полученного препарата измеряли по методике, описанной в известной работе. Активность полученного препарата люциферазы с миристиновым альдегидом и ФМНН2 составила 2,5 х 1015 квант с-1мг-1.
Claims (1)
- Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5520 продуцент бактериальной люциферазы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5029173 RU2073714C1 (ru) | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5029173 RU2073714C1 (ru) | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2073714C1 true RU2073714C1 (ru) | 1997-02-20 |
Family
ID=21597805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5029173 RU2073714C1 (ru) | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2073714C1 (ru) |
-
1992
- 1992-01-23 RU SU5029173 patent/RU2073714C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Авторское свидетельство CCCР N 761554, кл. C 12 N 9/02, 1980. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Steiert et al. | A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans | |
| McGenity et al. | Proposal of a new halobacterial genus Natrinema gen. nov., with two species Natrinema pellirubrum nom. nov. and Natrinema pallidum nom. nov. | |
| Perry et al. | Cloning and regulation of Erwinia herbicola pigment genes | |
| US4348477A (en) | Method for preparing a recombinant DNA phage | |
| Palop et al. | Isolation and characterization of an anaerobic, cellulolytic bacterium, Clostridium celerecrescens sp. nov. | |
| JP2799380B2 (ja) | 新規酵素 | |
| Nasser et al. | Analysis of three clustered polygalacturonase genes in Erwinia chrysanthemi 3937 revealed an anti‐repressor function for the PecS regulator | |
| Dobrynina et al. | Disruption of bacterial biofilms using recombinant dispersin B | |
| CN101463358B (zh) | 一种腈水合酶基因簇及其应用 | |
| US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
| Yamaguchi et al. | Genetic control of the rate of α-amylase synthesis in Bacillus subtilis | |
| Inouye et al. | Alkaline phosphatase synthesis in a cell-free system using DNA and RNA templates | |
| Walsh et al. | Genetic construction of lactose-utilizing Xanthomonas campestris | |
| US5883244A (en) | Lytic β-1,3-glucanase gene | |
| RU2073714C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент бактериальной люциферазы | |
| Mikesell et al. | Isolation of plasmids in Legionella pneumophila and Legionella-like organisms | |
| EP0420894B1 (en) | Large scale method for purification of high purity heparinase | |
| CA1338605C (en) | Gene encoding insecticidal protein and production of said protein using said gene | |
| EP0506262B1 (en) | Production of L-fucose dehydrogenase | |
| Kim et al. | Fermentation strategy to enhance plasmid stability during the cultivation of Escherichia coli for the production of recombinant levansucrase | |
| Iijima et al. | Effects of nutrients on α‐amyiase production and plasmid stability in fed‐batch culture of recombinant bacteria | |
| RU2180351C2 (ru) | Новый мутант e.coli с супрессированной продукцией органической кислоты | |
| US4962055A (en) | Plasmid, method for construction of the same, microorganisms carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism | |
| JP2005500851A (ja) | ビタミンｂ１２の製造方法 | |
| RU2103363C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвтn ii, определяющая синтез кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина cry iiia-типа, способ ее конструирования и штамм бактерий pseudomonas putida, содержащий рекомбинантную плазмиду днк рвтn ii-продуцент кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина cry iiia-типа, активного против насекомых отряда coleoptera |