RU2067767C1

RU2067767C1 - Method of preparing subunit gene engineering vaccine against hepatitis b

Info

Publication number: RU2067767C1
Authority: RU
Inventors: Ф.С. Носков; Н.В. Железнова; С.Л. Мукомолов; А.Д. Альтштейн; А.Б. Жебрун; И.И. Малкова; В.А. Плотникова; Е.П. Шаргородская; Т.О. Грюнберг
Original assignee: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера
Priority date: 1992-01-09
Filing date: 1992-01-09
Publication date: 1996-10-10

Abstract

FIELD: gene engineering, medicine, vaccines. SUBSTANCE: gene engineering HBs Ag is accumulated in developing chicken embryos which were infected with recombinant pox-virus in allantois cavity or in cultured cells. HBs Ag is isolated and purified by diaphragm filtration on diaphragm cascade at pore size of one of which does not exceed 0.15-0.22 mcm and affinity chromatography on immune sorbent (polyclonal specific antibodies to HBs Ag immobilized on agarose 4B activated by CNBr) and elution with citrate-phosphate buffer (pH 2.0-2.4) and 8M urea (pH 2.0-2.4). Method ensures to obtain vaccine preparation at HBs Ag yield 80-90% and at inert protein content 5-7%. Vaccine is used for hepatitis B prophylaxis and sensitive diagnostica making. EFFECT: improved method of vaccine preparing.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к вакцинному производству, и может быть использовано для создания высокочувствительных диагностикумов для выявления вируса гепатита В и для специфической профилактики гепатита В. The invention relates to biotechnology and medicine, in particular to vaccine production, and can be used to create highly sensitive diagnostics for the detection of hepatitis B virus and for specific prevention of hepatitis B.

Известны способы приготовления вакцины против гепатита В на основе препарата инактивированного НВs Ag, полученного из плазмы или сыворотки крови хронических носителей НВs Ag (4). Эти способы имеют ряд существенных недостатков, основными среди которых являются многочисленные трудоемкие приемы выделения, очистки, в особенности от белков сыворотки человека, и инактивации НВs Ag, а также возможность контаминации исходного обрабатываемого сырья (плазмы крови) сопутствующими вирусами (вирусами гепатита на А-ни В, вирусом иммунодефицита человека и др.). Существует риск заражения вирусным гепатитом В среди лиц, осуществляющих технологический процесс выделения и очистки НВs Ag из плазменного сырья. Кроме этого имеет место достаточно низкий выход целевого продукта 10%
Известен способ получения живой оспенно-гепатитной В вакцины для профилактики гепатита В и натуральной оспы с использованием рекомбинантов вируса оспо-вакцины (РВОВ), которые последовательно дважды пассируют в различных биологических системах и полученный на завершающей стадии из соскоба кожи теленка вируссодержащий материал гомогенизируют, очищают, концентрируют и лиофилизуют (2). Целевой продукт живая оспенно-гепатитная В вакцина - индуцирует НВs Ag в культуре клеток и антитела к НВs Ag у кроликов, однако не может быть использована для специфической профилактики гепатита В у людей, в особенности в группах риска, в силу своей нейровирулентности, вызванной присутствием живого РВОВ. Кроме того для получения защитных титров анти-НВs антител необходимо многократное введение препарата, а как известно, вирус оспо-вакцины плохо репродуцируется в иммунном организме, что исключает возможность эффективного использования живой оспенно-гепатитной В вакцины для профилактики гепатита В у людей (5).Known methods for the preparation of a hepatitis B vaccine based on an inactivated HBs Ag preparation obtained from plasma or serum of chronic HBs Ag carriers (4). These methods have a number of significant drawbacks, the main ones being the many laborious methods of isolation, purification, in particular of human serum proteins, and inactivation of HBs Ag, as well as the possibility of contamination of the processed raw materials (blood plasma) with concomitant viruses (hepatitis A viruses B, human immunodeficiency virus, etc.). There is a risk of contracting viral hepatitis B among people performing the process of isolation and purification of HBs Ag from plasma raw materials. In addition, there is a fairly low yield of the target product 10%
A known method of producing live smallpox-hepatitis B vaccines for the prevention of hepatitis B and smallpox using smallpox vaccine recombinants (PBOV), which are subsequently passaged twice in various biological systems and obtained at the final stage from scraping the skin of a calf, the virus-containing material is homogenized, cleaned, concentrated and lyophilized (2). The target product is live smallpox-hepatitis B vaccine - induces HBs Ag in cell culture and antibodies to HBs Ag in rabbits, but cannot be used for specific prophylaxis of hepatitis B in humans, especially in risk groups, due to its neurovirulence caused by the presence of live MOUTH. In addition, to receive protective titers of anti-HBs antibodies, repeated administration of the drug is necessary, and as you know, the smallpox vaccine virus is poorly reproduced in the immune system, which excludes the possibility of the effective use of live smallpox hepatitis B vaccine for the prevention of hepatitis B in humans (5).

Наиболее близким по сущности к заявляемому решению является способ получения вакцины к гепатиту B описанный в работе в Wampler D.E. et al. PNA 9, 1985, v. 82 6830-6834. The closest in essence to the claimed solution is a method of obtaining a vaccine for hepatitis B described in the work in Wampler D.E. et al. PNA 9, 1985, v. 82 6830-6834.

Предлагаемое изобретение заключается в том, что в способе получения субъединичной генно-инженерной вакцины против гепатита В, включающем накопление генно-инженерного НВs Ag, выделение и его очистку, для накопления НВs Ag используют развивающиеся куриные эмбрионы при непосредственном их заражении РВОВ в аллантоисную полость или культуру клеток, а выделение и очистку НВs Ag осуществляют последовательно методом каскадной мембранной фильтрации, причем размер пор одной из мембран не превышает 0,15 0,22 мкм, и аффинной хроматографией на иммуносорбенте, в качестве которого используют иммобилизованные на СNBr активированной агарозе 4В поликлональные специфические антитела к НВs Ag, а элюцию проводят цитратно-фосфатным буфером pН 2,0-2,4 и 8М мочевиной pН 2,0-4,2. The present invention consists in the fact that in the method of producing a subunit genetic engineering vaccine against hepatitis B, which includes the accumulation of genetically engineered HBs Ag, isolation and purification, developing chicken embryos are used to accumulate HBs Ag when they are directly infected with PBBs in an allantoic cavity or culture cells, and the isolation and purification of НВs Ag is carried out sequentially by cascade membrane filtration, the pore size of one of the membranes not exceeding 0.15 0.22 μm, and by affinity chromatography on immunosorb polyethylene-specific antibodies to HBs Ag immobilized on CNBr-activated agarose 4B are used, and elution is performed with citrate-phosphate buffer pH 2.0-2.4 and 8M urea pH 2.0-4.2.

Использование каскада мембран на этапе предварительной очистки вируссодержащего материала позволяет удалить инфекционный РВОВ, растворимые поксвирусные антигены и примесные белки хозяина с выделением в фильтрат НВs Ag с полным сохранением биологической и антигенной активности целевого продукта НВs Ag, а использование специфического иммуносорбента на основе поликлональных антител анти-НВs в оптимальных условиях элюции цитратно-фосфатным буфером pН 2,2 и 8М мочевиной pН 2,2 обеспечивает высокую степень очистки НВs Ag от контаминирующих примесных белков (в 3000 раз), содержание примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не превышает 5-7% и в частности специфического белка системы-хозяина овальбумина в дозе вакцины не более 60 нг и позволяет получать на этом этапе до 80-90% НВs Ag. The use of a cascade of membranes at the stage of preliminary purification of virus-containing material makes it possible to remove infectious RABO, soluble poxvirus antigens and host impurity proteins with the release of HBs Ag into the filtrate with complete preservation of the biological and antigenic activity of the target HBs Ag product, and the use of a specific immunosorbent based on polyclonal antibodies anti-HBs under optimal elution conditions with citrate-phosphate buffer pH 2.2 and 8M urea pH 2.2 provides a high degree of purification of HBs Ag from contaminating protein content (3,000 times), the impurity content according to the polyacrylamide gel electrophoresis does not exceed 5-7% and, in particular, the specific protein of the ovalbumin host system in a vaccine dose of not more than 60 ng and allows to obtain up to 80-90% НВs at this stage Ag.

Отличительные от прототипа признаки и их свойства порознь являются известными. Каждый из них вносит определенный результат в получаемый эффект. Distinctive features from the prototype and their properties separately are known. Each of them contributes a certain result to the resulting effect.

Так известно использование системы развивающихся 9-11 дневных куриных эмбрионов, при котором заражение РВОВ производится непосредственно в аллантоисную полость эмбриона, или культуры клеток для накопления генно-инженерного НВs Ag (1, 3). Thus, it is known to use a system of developing 9-11 day old chicken embryos, in which PBOV infection is carried out directly into the allantoic cavity of the embryo, or cell culture for the accumulation of genetically engineered HBs Ag (1, 3).

Также известным является применение методов мембранной микрофильтрации и аффинной хроматографии в вирусологической практике на различных этапах очистки биологических суспензий (7, 9). Однако не было обнаружено информации об использовании всех этих признаков вместе. Поэтому совместное использование системы куриных эмбрионов или культуры клеток и методом мембранной каскадной фильтрации и специфической иммунноаффинной хроматографии в выбранных режимах является новым признаком и дает новый сверхсуммарный результат: позволяет получить высокоочищенный генно-инженерный НВs Ag с более высоким выходом целевого продукта (до 90% ) и содержанием не более 5-7% примесных белков; Морфологическая однородность НВs Ag (размер частиц 25-27 нм) и чистота подтверждены методом электронной микроскопии на JAM при 100 кВ и увеличении 50000 и 100000 и данными электрофореза в полиакриламидном геле (менее 7% примесных белков). Also known is the use of membrane microfiltration and affinity chromatography methods in virological practice at various stages of purification of biological suspensions (7, 9). However, no information was found on the use of all these features together. Therefore, the combined use of a chicken embryo system or cell culture and membrane cascade filtration method and specific immuno-affinity chromatography in the selected modes is a new sign and gives a new ultimately total result: it allows to obtain highly purified genetically engineered НВs Ag with a higher yield of the target product (up to 90%) and content of not more than 5-7% impurity proteins; The morphological homogeneity of НВs Ag (particle size 25-27 nm) and purity were confirmed by JAM electron microscopy at 100 kV and magnifications of 50,000 and 100,000 and polyacrylamide gel electrophoresis data (less than 7% impurity proteins).

Пример 1. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, содержащей НВs Ag. Заражают 400 развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) в возрасте 9-10 дней непосредственно в аллантоисную полость дозой 0,1 мл, содержащей 10^7,0 ООЕ в 1 мл рекомбинантного ВОВ, экспрессирующего НВs Ag. После заражения РКЭ инкубируют при температуре 37^o в течение 72 часов, охлаждают при температуре +4^o в течение 18 часов и вскрывают. Аллантоисную жидкость собирают в специальные флаконы и тестируют на НВs Ag. Объем собранной аллантоисной жидкости составляет 2000 мл. Определение концентрации НВs Ag проводится методом иммунно-ферментного анализа (коммерческая тест-система Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии) с использованием стандартного раствора НВs Ag производства фирмы Abbott (США). Концентрация НВs Ag составляет 300 нг/мл. Собранную аллантоисную жидкость замораживают до -18^oC.Example 1. Obtaining a virus-containing allantoic fluid containing HBs Ag. 400 developing chicken embryos (RKE) are infected at the age of 9-10 days directly into the allantoic cavity with a dose of 0.1 ml containing 10 ^7.0 OOE in 1 ml of recombinant BOB expressing HBs Ag. After infection, RKE incubated at a temperature of 37 ^o for 72 hours, cooled at a temperature of + 4 ^o for 18 hours and opened. Allantoic fluid is collected in special bottles and tested for HBs Ag. The volume of collected allantoic fluid is 2000 ml. Determination of HBs Ag concentration is carried out by the method of immuno-enzyme analysis (commercial test system of the Gorky Research Institute of Epidemiology and Microbiology) using a standard solution of HBs Ag manufactured by Abbott (USA). The concentration of HBs Ag is 300 ng / ml. The collected allantoic fluid is frozen to -18 ^o C.

Получение полуфабриката вакцины. Obtaining a prefabricated vaccine.

Аллантоисную жидкость в объеме 2000 мл, содержащую 300 нг/мл НВs Ag, размораживают, фильтруют через стеклянные воронки с восьмислойными марлевыми фильтрами и пропускают последовательно через каскад мембран из картонного фильтра типа КФБЖ и синтетической мембраны "Владипор" с диаметром пор 0,22 мкм. Производительность процесса микрофильтрации 1,5-2 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 5-6 л/час на фильтрующих модулях БФД размером 293 мм при давлении эффективном до 4 кГС/см². Получают 2000 мл осветленной аллантоисной жидкости с концентрацией НВs Ag 295 нг/мл. Далее полученный фильтрат аллантоисной жидкости концентрируют по объему в 4 раза до 500 мл на мембране типа УПМ-П с диаметром пор 0,05 мкм в ячейке ФМО 2-1000 или на полых волокнах с пределом задержания до 15 тыс.дальтон на АР-0,2 в установке УПЛ-06 (производство Кириши, Ленинград). К полученным 500 мл концентрата аллантоисной жидкости добавляют 0,01 М фосфатный буферный раствор, pН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl до общего объема исходного 2000 мл и проводят диаконцентрирование НВs Ag до конечного объема 500 мл. Полученный полуфабрикат вакцины содержит 1000 нг/мл НВs Ag и не содержит РВОВ (по данным РНГА с антительным диагностикумом на антиген ортопоксвирусов и определения инфекционной активности РВОВ на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов). Выход НВs Ag составляет 83%
Иммуноаффинная хроматография.Allantoic fluid in a volume of 2000 ml containing 300 ng / ml HBs Ag is thawed, filtered through glass funnels with eight-layer gauze filters and passed sequentially through a cascade of membranes from a cardboard filter of the KFBZh type and a Vladipor synthetic membrane with a pore diameter of 0.22 μm. The microfiltration process productivity is 1.5-2 l / h on a cell of type FMO 2-1000 and 5-6 l / h on BFD filtering modules with a size of 293 mm at an effective pressure of up to 4 kGS / cm ² . Get 2000 ml of clarified allantoic fluid with a concentration of HBs Ag 295 ng / ml Next, the resulting allantoic fluid filtrate is concentrated by 4 times up to 500 ml in volume on a UPM-P membrane with a pore diameter of 0.05 μm in a FMO cell 2-1000 or on hollow fibers with a retention limit of up to 15 thousand daltons on AP-0, 2 in the installation UPL-06 (production of Kirishi, Leningrad). To the obtained 500 ml of the allantoic fluid concentrate, 0.01 M phosphate buffer solution, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl to the total volume of the initial 2000 ml was added, and HBs Ag was deconcentrated to a final volume of 500 ml. The resulting prefabricated vaccine contains 1000 ng / ml HBs Ag and does not contain PBOM (according to RNGA with antibody diagnostics for the orthopoxvirus antigen and determination of the infection activity of PBOM on the chorionallantoic membrane of chicken embryos). The output of HBs Ag is 83%
Immunoaffinity chromatography.

Для приготовления иммуносорбента используют специфические поликлональные анти-НВs антитела, выделенные из гипериммунной козьей или ослиной сыворотки. Для выделения иммуноглобулинов к 10 мл гипериммунной сыворотки прибавляют равный объем дистиллированной воды и по каплям, при постоянном помешивании, 13,3 мл насыщенного раствора сульфата аммония (до 40% насыщения). Смесь перемешивают 15 минут на магнитной мешалке и оставляют при комнатной температуре на ночь. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 минут и растворяют в 10 мл 0,15 М раствора хлорида натрия. Объем полученного раствора доводят до 20 мл дистиллированной водой и при перемешивании добавляют 13,3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Смесь перемешивают 15 минут при комнатной температуре, центрифугируют 15 минут со скоростью 4000 об/мин. Осадок растворяют в минимальном количестве 0,01 М фосфатного буфера, pН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl. Получают 4,5 мл раствора иммуноглобулинов с концентрацией 50 мг/мл. Далее раствор иммуноглобулинов подвергают обессоливанию, пропуская через колонку, заполненную 15 см³ геля сефадекса G-75 и уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером, pН 7,2, содержащим 0,15 ММ NaCl. После полного вхождения раствора глобулинов в гель сефадекса на колонку наносят 0,01 М фосфатный буферный раствор, pН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl. Эффлюент контролируют на наличие белка с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты, на наличие сернокислого аммония с помощью 10% раствора хлористого бария, визуально по помутнению капли на предметном стекле. Собранную белоксодержащую фракцию гель-фильтрата объемом 4,4 мл диализуют сутки против 0,02 М фосфатного буферного раствора, pН 6,6 и подвергают дальнейшей очистке на сефадексе ДЕАЕ-А-50. Для этого диализованный раствор белка центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 минут. Осадок удаляют, а центрифугат объемом 3,0 мл наносят на колонку с ДЕАЕ-А-50 (диаметр колонки 3,5 см, высота 14 см), предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буферным раствором, pН 6,6. После полного вхождения раствора белка в гель его вытесняют 0,02 М фосфатным буферным раствором, pН 6,6, содержащим 0,17 М NaCl. Отбирают пиковую фракцию белка объемом 3 мл, в которой содержится 17 мг иммуноглобулинов.For the preparation of an immunosorbent, specific polyclonal anti-HBs antibodies isolated from hyperimmune goat or donkey serum are used. To isolate immunoglobulins, an equal volume of distilled water is added to 10 ml of hyperimmune serum and 13.3 ml of a saturated solution of ammonium sulfate (up to 40% saturation) are added dropwise with constant stirring. The mixture is stirred for 15 minutes on a magnetic stirrer and left at room temperature overnight. The precipitate formed is separated by centrifugation at 4000 rpm for 20 minutes and dissolved in 10 ml of a 0.15 M sodium chloride solution. The volume of the resulting solution was adjusted to 20 ml with distilled water, and 13.3 ml of a saturated solution of ammonium sulfate was added with stirring. The mixture is stirred for 15 minutes at room temperature, centrifuged for 15 minutes at a speed of 4000 rpm. The precipitate is dissolved in a minimum amount of 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl. Obtain 4.5 ml of a solution of immunoglobulins with a concentration of 50 mg / ml. The immunoglobulin solution is then desalted by passing through a column filled with 15 cm ^{3 of} Sephadex G-75 gel and equilibrated with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 MM NaCl. After the globulins solution has completely entered the Sephadex gel, 0.01 M phosphate buffer solution, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl is applied to the column. The effluent is monitored for the presence of protein with a 10% trichloroacetic acid solution, for the presence of ammonium sulfate with a 10% solution of barium chloride, visually by the clouding of a drop on a glass slide. The collected protein-containing fraction of the gel filtrate with a volume of 4.4 ml was dialyzed per day against 0.02 M phosphate buffer solution, pH 6.6, and subjected to further purification on Sephadex DEAE-A-50. For this, the dialyzed protein solution is centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes. The precipitate is removed and a 3.0 ml centrifugate is applied to a DEAE-A-50 column (column diameter 3.5 cm, height 14 cm), previously equilibrated with 0.02 M phosphate buffer solution, pH 6.6. After the protein solution has completely entered the gel, it is displaced with a 0.02 M phosphate buffer solution, pH 6.6, containing 0.17 M NaCl. A peak fraction of 3 ml of protein is taken, which contains 17 mg of immunoglobulins.

Иммуносорбент готовят на основе СN-Br-активированной агарозы 4 В. Для этого 2 мл набухшей агарозы трижды промывают на фильтре Шотта 100 мл 0,001 НСl, суспендируют в 2 мл пришивочного буфера (0,15 М фосфатный буферный раствор, pН 8,2, содержащий 0,5 М NaCl). Буфер декантируют и добавляют к агарозе 2 мл предварительно забуференного 0,15 М Na₂HPO₄ раствора иммуноглобулинов. После двухчасовой инкубации на роторной мешалке при комнатной температуре и в течение ночи при 4^oС агарозу переносят на фильтр Шотта и отмывают несвязавшийся белок пришивочным буфером (0,15 М фосфатный буферный раствор, pН 8,2, содержащий 0,5 М MaCl). Иммуносорбент суспендируют в 2 мл 0,5 М глицина на пришивочном буфере. После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре агарозу переносят на фильтр Шотта и отмывают от нековалентно связанного белка пятикратно последовательным добавлением по 20 мл пришивочного буфера (0,15 М фосфатный буфер, pН 8,2, содержащий 0,5 М NaCl), глицинового буфера (глицин HCl, pН 3,0). Последнюю промывку осуществляют 0,15 М фосфатным буферным раствором, pН 7,2. Полученный иммуносорбент содержит 4,1 мг иммуноглобулинов.An immunosorbent is prepared on the basis of CN-Br-activated agarose 4 V. For this, 2 ml of swollen agarose is washed three times with a Schott filter 100 ml of 0.001 Hcl, suspended in 2 ml of inoculation buffer (0.15 M phosphate buffer, pH 8.2, containing 0.5 M NaCl). The buffer is decanted and 2 ml of pre-buffered 0.15 M Na ₂ HPO ₄ immunoglobulin solution is added to agarose. After two hours of incubation on a rotary stirrer at room temperature and overnight at 4 ^° C, the agarose was transferred to a Schott filter and the unbound protein was washed with sewing buffer (0.15 M phosphate buffer solution, pH 8.2, containing 0.5 M MaCl). The immunosorbent is suspended in 2 ml of 0.5 M glycine on sewing buffer. After an incubation for 2 hours at room temperature, the agarose was transferred to a Schott filter and washed from non-covalently bound protein by five-fold sequential addition of 20 ml of sewing buffer (0.15 M phosphate buffer, pH 8.2, containing 0.5 M NaCl), glycine buffer (glycine HCl, pH 3.0). The final washing was carried out with 0.15 M phosphate buffered saline, pH 7.2. The resulting immunosorbent contains 4.1 mg of immunoglobulins.

Приготовленный иммуносорбент помещают в колонку с диаметром 0,55 см и высотой 6,3 см и наносят со скоростью 10 мл/час 500 мл полуфабриката вакцины с концентрацией НВs Ag 1000 нг/мл. Колонку промывают со скоростью 10 мл/час 0,15 М фосфатным буферным раствором, pН 7,2, содержащим 0,15 М NaCl, в объеме, равном 10-ти объемам колонки, т.е. 15 мл буфера, затем промываем последовательно с той же скоростью 15 мл 0,15 М Na₂HPO₄, pН 9,5 и 15 мл 0,15 М KH₂PO₄ pН 5,0. После этого сорбированный НВs Ag элюируют с иммуносорбента цитратно-фосфатным буфером pН 2,2 со скоростью 4 мл/час. Собранные фракции (по 3 мл) нейтрализуют добавлением 0,5 М NaOH до нейтральной реакции (pН 7,0), анализируют на содержание НВs Ag (РНГА, ИФА), овальбуминовых и неовальбуминовых примесей (РНГА и РИЭФ). Завершающую стадию десорбции НВs Ag с иммуносорбента проводят 8 М мочевиной, pН 2,2. Собранные на этом этапе фракции (по 3 мл) нейтрализуют добавлением 0,5 М NaOH до pН 7,0, объединяют и диализуют двое суток против физиологического раствора при 4^oC, анализируют на содержание НВs Ag (РНГА, ИФА), овальбуминовых и неовальбуминовых примесей (РНГА, РИЭФ). Полученные фракции очищенного НВs Ag объединяют и получают препарат объемом 30 мл с активностью НВs Ag 22,5 мкг/мл. Выход НВs Ag 90% от исходного полуфабриката. В препарат добавляют стерильно гидроокись алюминия до конечной концентрации 10 мкг/мл и суспензию разводят стерильно физраствором до 67 мл. Из полученного раствора отбирают аликвоты (объемом 3 мл) на анализ, остальное разливают в ампулы.The prepared immunosorbent is placed in a column with a diameter of 0.55 cm and a height of 6.3 cm and applied at a rate of 10 ml / hour to 500 ml of a semi-finished vaccine with a concentration of HBs Ag 1000 ng / ml. The column is washed at a rate of 10 ml / hour with 0.15 M phosphate buffered saline, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, in a volume equal to 10 column volumes, i.e. 15 ml of buffer, then washed sequentially with the same speed of 15 ml of 0.15 M Na ₂ HPO ₄ , pH 9.5 and 15 ml of 0.15 M KH ₂ PO ₄ pH 5.0. After that, the sorbed НВs Ag is eluted from the immunosorbent with citrate-phosphate buffer pH 2.2 at a rate of 4 ml / h. The collected fractions (3 ml each) are neutralized by adding 0.5 M NaOH to a neutral reaction (pH 7.0), analyzed for the content of HBs Ag (RNGA, ELISA), ovalbumin and neovalbumin impurities (RNGA and RIEF). The final stage of desorption of HBs Ag from the immunosorbent is carried out with 8 M urea, pH 2.2. The fractions collected at this stage (3 ml each) are neutralized by adding 0.5 M NaOH to pH 7.0, combined and dialyzed for two days against physiological saline at 4 ^° C, analyzed for the content of HBs Ag (RNGA, ELISA), ovalbumin and neovalbumin impurities (RNGA, RIEF). The obtained fractions of purified НВs Ag are combined and a preparation with a volume of 30 ml is obtained with an activity of НВs Ag of 22.5 μg / ml. The yield of HBs Ag is 90% of the initial semi-finished product. Sterile aluminum hydroxide is added to the preparation to a final concentration of 10 μg / ml, and the suspension is diluted with sterile saline to 67 ml. Aliquots (3 ml) were taken from the resulting solution for analysis, the rest was poured into ampoules.

Вакцинная партия содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет не более 5% Выход НВs Ag 73% от исходного материала. The vaccine lot contains 10 μg / ml HBs Ag. The amount of protein impurities according to polyacrylamide gel electrophoresis is not more than 5%. HBs Ag yield 73% of the starting material.

Пример 2. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят по примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану со средним диаметром пор 0,05-0,15 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 450 мл с концентрацией НВs Ag 800 нг/мл. Выход НВs Ag составляет 76% Производительность процесса 0,5-1 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 2-3 л/час на фильтрующих модулях БФД размером 293 мм при эффективном давлении до 4 кГС/см². Иммуноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют по примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 40 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей не более 5% по данным электрофореза в полиакриламидном геле.Example 2. Obtaining a virus-containing allantoic fluid and a semi-finished vaccine is carried out according to example 1, but the filtration of the starting material is carried out through a membrane with an average pore diameter of 0.05-0.15 microns. A 450 ml prefabricated vaccine was obtained with a HBs Ag concentration of 800 ng / ml. The output of НВs Ag is 76%. The productivity of the process is 0.5-1 l / h on a cell of type FMO 2-1000 and 2-3 l / h on BFD filtering modules with a size of 293 mm at an effective pressure of up to 4 kGS / cm ² . Immunoaffinity chromatography of the obtained intermediate product and preparation of the vaccine preparation are carried out as in Example 1. A vaccine batch of the preparation of 40 ml volume is obtained, which contains 10 μg / ml HBs Ag. The amount of protein impurities is not more than 5% according to polyacrylamide gel electrophoresis.

Выход НВs Ag 70% от исходного материала (или 85% от исходного полуфабриката). The yield of HBs Ag is 70% of the starting material (or 85% of the starting material).

Пример 3. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят по примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану МФА-МА N 3 со средним диаметром пор 0,25-0,35 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 470 мл с содержанием НВs Ag 745 нг/мл. Производительность процесса фильтрации 1,5-1,8 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 4,5-5,5 л/час на фильтрующих модулях БФД (диаметр мембраны 293 мм) при эффективном давлении до 4 кГС/см². Иммуноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют аналогично примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 29,9 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Выход НВs Ag 60% Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет 7%
Пример 4. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят аналогично примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану МФА-МА N6 со средним диаметром пор 0,55-0,65 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 490 мл с содержанием НВs Ag 900 нг/мл. Выход НВs Ag составляет 72% Производительность процесса 1,8-2 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 5-6 л на фильтрующих модулях (диаметр мембраны 293 мм) при эффективном давлении 4 кГС/см². Иммунноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют по примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 33 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Выход НВs Ag 47% от исходного материала (75% от исходного полуфабриката). Количество примесных белков до 10%
Пример 5. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят по примеру 1. В качестве буферов для элюирования НВs Ag используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,0 и 8М мочевину pН 2,2 последовательно. Получают продукт объемом 42,5 мл, содержание НВs Ag в котором 10 мгк/мл. Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не более 5% Выход НВs Ag составляет 85% от исходного полученного полуфабриката.Example 3. Obtaining a virus-containing allantoic fluid and a semi-finished vaccine is carried out according to example 1, but the filtration of the starting material is carried out through an MFA-MA membrane N 3 with an average pore diameter of 0.25-0.35 μm. A 470 ml prefabricated vaccine was obtained with an HBs Ag content of 745 ng / ml. The productivity of the filtration process is 1.5-1.8 l / h on a cell of the FMO type 2-1000 and 4.5-5.5 l / h on the BFD filter modules (membrane diameter 293 mm) at an effective pressure of up to 4 kGS / cm ² . Immunoaffinity chromatography of the obtained semi-finished product and preparation of the vaccine preparation is carried out analogously to example 1. A vaccine batch of the preparation is obtained with a volume of 29.9 ml, which contains 10 μg / ml HBs Ag. The yield of HBs Ag 60% The amount of protein impurities according to the polyacrylamide gel electrophoresis is 7%
Example 4. Obtaining a virus-containing allantoic fluid and a semi-finished vaccine is carried out analogously to example 1, but the filtration of the starting material is carried out through an MFA-MA N6 membrane with an average pore diameter of 0.55-0.65 μm. A 490 ml prefabricated vaccine was obtained with a HBs Ag content of 900 ng / ml. The yield of НВs Ag is 72%. The productivity of the process is 1.8-2 l / h on a cell of the FMO type 2-1000 and 5-6 l on filtering modules (membrane diameter 293 mm) at an effective pressure of 4 kGS / cm ² . Immuno-affinity chromatography of the obtained semi-finished product and preparation of the vaccine preparation are carried out as in Example 1. A 33 ml vaccine batch of the preparation is obtained, which contains 10 μg / ml HBs Ag. The yield of HBs Ag is 47% of the starting material (75% of the starting material). The amount of impurity proteins up to 10%
Example 5. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine and immuno-affinity chromatography was carried out as in Example 1. Citrate-phosphate buffer pH 2.0 and 8M urea pH 2.2 were used as elution buffers for HBs Ag. A product of 42.5 ml is obtained, the content of HBs Ag in which is 10 mg / ml. The amount of protein impurities according to the data of polyacrylamide gel electrophoresis is not more than 5%. The yield of HBs Ag is 85% of the initial semi-finished product obtained.

Пример 6. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунно-аффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. В качестве элюирующего буфера используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,4 и 8М мочевину, pН 2,2 последовательно. Получают продукт объемом 43,7 мл с концентрацией НВs Ag 10 мгк/мл. и содержанием белковых примесей не более 6% Выход НВs Ag составляет 87% от исходного полуфабриката. Example 6. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine and immuno-affinity chromatography is carried out analogously to example 1. As an elution buffer, citrate-phosphate buffer pH 2.4 and 8M urea, pH 2.2 are used in series. A product of 43.7 ml was obtained with a concentration of HBs Ag of 10 μg / ml. and the content of protein impurities is not more than 6%. The yield of HBs Ag is 87% of the initial semi-finished product.

Пример 7. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины, иммуноаффинную хроматографию проводят по примеру 1. В качестве элюирующего буфера используют цитратно-фосфатный буфер pH 1,5 и 8М мочевину, pН 2,2. Получают продукт НВs Ag в объеме 39 мл с концентрацией 10 мгк/мл. Количество белковых примесей составляет не более 7% выход НВs Ag 78% от исходного полуфабриката. Example 7. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine, immunoaffinity chromatography is carried out as in example 1. As an elution buffer, citrate-phosphate buffer pH 1.5 and 8M urea, pH 2.2 are used. Receive the product HBs Ag in a volume of 39 ml with a concentration of 10 mg / ml. The amount of protein impurities is not more than 7%; HBs Ag yield 78% of the initial semi-finished product.

Пример 8. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. В качестве элюирующих буферов используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,2 и 8М мочевину pН 2,0 последовательно. В полученном вакцинном препарате объемом 44,7 мл содержание НВs Ag составляет 10 мкг/мл, концентрация белковых примесей не более 5% Выход НВs Ag от исходного полуфабриката вакцины. Example 8. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine and immuno-affinity chromatography is carried out analogously to example 1. As elution buffers, citrate-phosphate buffer pH 2.2 and 8M urea pH 2.0 are used in series. In the obtained vaccine preparation with a volume of 44.7 ml, the content of НВs Ag is 10 μg / ml, the concentration of protein impurities is not more than 5%. The yield of НВs Ag from the initial prefabricated vaccine.

Пример 9. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунно-аффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. Элюцию НВs Ag с иммунносорбента осуществляют цитратно-фосфатным буфером, pН 2,2 и 8М мочевиной, pН 4,2. Объем полученного вакцинного препарата 35 мл, концентрация НВs Ag 10 мкг/мл, содержание белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не выше 7% Выход НВs Ag 70% от исходного полуфабриката. Example 9. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine and immuno-affinity chromatography is carried out analogously to example 1. Elution of HBs Ag from the immunosorbent is carried out with citrate-phosphate buffer, pH 2.2 and 8M urea, pH 4.2. The volume of the obtained vaccine preparation is 35 ml, the concentration of НВs Ag is 10 μg / ml, the content of protein impurities according to the polyacrylamide gel electrophoresis is not higher than 7%. The yield of НВs Ag is 70% of the initial semi-finished product.

Пример 10. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. Элюцию НВs Ag с иммуносорбента осуществляют последовательно цитратно-фосфатным буфером, pН 2,2 и 8М мочевиной, pН 6,2. Полученный вакцинный препарат в объеме 28 мл содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей около 10% выход НВs Ag составляет 57% по отношению к исходному полуфабрикату. Example 10. Obtaining a virus-containing allantoic fluid, a semi-finished vaccine and immuno-affinity chromatography is carried out analogously to example 1. Elution of HBs Ag from the immunosorbent is carried out sequentially with citrate-phosphate buffer, pH 2.2 and 8M urea, pH 6.2. The resulting vaccine preparation in a volume of 28 ml contains 10 μg / ml HBs Ag. The amount of protein impurities of about 10% yield of HBs Ag is 57% relative to the initial semi-finished product.

Пример 11. Получение вируссодержащей культуральной жидкости. Example 11. Obtaining a virus-containing culture fluid.

Приготовление маточного вируса в культуре клеток. Preparation of uterine virus in cell culture.

Используют культуру трипсинизированных клеток 10-11 дневных куриных эмбрионов в 1-1,5 л матрицах. Клетки выращивают на среде 199 или Игла с добавлением 10% бычьей сыворотки. Концентрация клеток при посадке 400-450 тыс./мл. Монослой формируется через 24-48 час. Качество культуры оценивают макро- и микроскопически. Перед заражением среду удаляют, отмывают монослой раствором Хэнкса или Игла и вносят в матрац содержимое одной ампулы исходного вируса, растворенное в 2 мл среды 199 или Игла, распределяют его по монослою покачиванием. Адсорбцию вируса ведут 1 час при комнатной температуре, вносят поддерживающую среду 199 или Игла с антибиотиками (100 ед./мл) на 1 л матрац 80 мл, на 1,5 л матрац 100 мл. Зараженные культуры инкубируют при 37^oC до наступления полной специфической дегенерации (обычно 48-72 ч). Матрицы трижды замораживают и оттаивают, вируссодержащую жидкость собирают, фасуют и хранят при -20^oC.A trypsinized cell culture of 10-11 day old chicken embryos in 1-1.5 L matrices was used. Cells are grown on 199 medium or Needle supplemented with 10% bovine serum. The concentration of cells during planting 400-450 thousand / ml. A monolayer is formed after 24-48 hours. The quality of the culture is evaluated macro- and microscopically. Before infection, the medium is removed, washed with a monolayer of Hanks or Eagle's solution and the contents of one ampoule of the original virus dissolved in 2 ml of 199 medium or Eagle are introduced into the mattress, and it is distributed over the monolayer by wiggling. The virus is adsorbed for 1 hour at room temperature, a support medium 199 or a needle with antibiotics (100 units / ml) is added to 1 liter mattress 80 ml, to 1.5 liter mattress 100 ml. The infected cultures are incubated at 37 ^° C. until complete specific degeneration occurs (usually 48-72 hours). The matrices are thrice frozen and thawed, the virus-containing liquid is collected, packaged and stored at -20 ^o C.

Приготовление посевного вируса в культуре клеток. Preparation of seed virus in cell culture.

Осуществляют по описанной выше методике, матрацы заражают маточным вирусом. Carried out according to the method described above, the mattresses are infected with a uterine virus.

Получение полуфабриката вакцины. 2000 мл вируссодержащей культуральной жидкости с концентрацией НВs Ag 600 нг/мл подвергают осветлению и концентрированию как в примере 1. Получают 500 мл полуфабриката вакцины, содержащего 1500 нг/мл НВs Ag и не содержащего вируса оспо-вакцины (по данным РНГА и определения инфекционной активности на хорианаллантоистой оболочке куриных эмбрионов).Иммунноаффинную очистку и приготовление вакцинного препарата проводят аналогично примеру 1.Получают препарат объемом 27 мл,который содержит 26,9 мкг/мл HBs Ag. В препарат добавляют стерильно гидроокись алюминия до 1% и суспензию разводят стерильно физраствором до 72 мл. Из полученного раствора отбирают аликвоты (объемом 3 мл) на анализ,остальное разливают в ампулы. Вакцинная партия содержит 10 мкг/мл HBs Ag, содержание белковых примесей не выше 5% Выход HBs Ag от исходного полуфабриката составляет 90%
Вакцинный препарат (конечный продукт) имеет следующие характеристики: иммунизирующая доза 1 мл; pH препарата 7,0-7,3;количество HBs Ag (10± 0,1) мкг/мл; содержание примесных белков не более 7% от общего количества белка; содержание гидроокиси алюминия не более 1% и мертиолата не более 1:10000 в конечной концентрации.Getting the prefabricated vaccine. 2000 ml of virus-containing culture fluid with a concentration of HBs Ag 600 ng / ml is subjected to clarification and concentration as in example 1. Receive 500 ml of a semi-finished vaccine containing 1500 ng / ml HBs Ag and not containing the smallpox virus (according to RNGA and determination of infectious activity on the chorianallantoids shell of chicken embryos). Immunoaffinity purification and preparation of the vaccine preparation is carried out analogously to example 1. A preparation of 27 ml is obtained, which contains 26.9 μg / ml HBs Ag. Sterile aluminum hydroxide up to 1% is added to the preparation and the suspension is diluted sterile with saline to 72 ml. Aliquots (3 ml) were taken from the resulting solution for analysis, the rest was poured into ampoules. The vaccine lot contains 10 μg / ml HBs Ag, the content of protein impurities is not higher than 5%. The yield of HBs Ag from the initial semi-finished product is 90%.
The vaccine preparation (final product) has the following characteristics: immunizing dose of 1 ml; the pH of the drug is 7.0-7.3; the amount of HBs Ag (10 ± 0.1) μg / ml; impurity protein content of not more than 7% of the total amount of protein; the content of aluminum hydroxide is not more than 1% and merthiolate is not more than 1: 10000 in a final concentration.

Препарат стерилен, неинфекционен, нетоксичен. Препарат способен индуцировать синтез антител у человека и животных. The drug is sterile, non-infectious, non-toxic. The drug is able to induce antibody synthesis in humans and animals.

Таким образом,предлагаемое решение обеспечивает получение высокоспецифического, безвредного и высокоочищенного препарата HBs Ag c более высоким выходом (75- 90%) по сравнению с более б лизким по сущности аналогом, где параметры составляют: выход до 67% и количество белковых примесей не ниже 10%
Кроме того, включение полученного указанным способом HBs Ag в качестве основы в субъединичную генноинженерную вакцину против гепатита В обеспечивает также снижение 50% иммунизирующей дозы вакцинного препарата ( по крайней мере, для беспородных белых мышей) до 200-250 нг, что 1,5-3 раза ниже, чем для вакцинных препаратов на основе HBs Ag из плазменного или дрожжевого сырья, а более высокая степень очистки от примесных белков обеспечивает низкую токсичность, безвредность и специфичность вакцины.Thus, the proposed solution provides a highly specific, harmless and highly purified HBs Ag preparation with a higher yield (75-90%) compared to a more similar analogue in essence, where the parameters are: yield up to 67% and the amount of protein impurities is not lower than 10 %
In addition, the inclusion of the obtained HBs Ag as a basis in the subunit gene vaccine against hepatitis B also provides a 50% reduction in the immunizing dose of the vaccine preparation (at least for outbred white mice) to 200-250 ng, which is 1.5-3 times lower than for vaccines based on HBs Ag from plasma or yeast raw materials, and a higher degree of purification from impurity proteins provides low toxicity, safety and specificity of the vaccine.

Предлагаемый способ получения вакцины может быть реализован в производстве вакцинных препаратов для профилактики гепатита В, а полученный в процессе приготовления вакцины высокоочищенный HBs Ag может быть использован для диагностики инфекции вирусом гепатита В. The proposed method for producing a vaccine can be implemented in the production of vaccines for the prevention of hepatitis B, and the highly purified HBs Ag obtained during the preparation of the vaccine can be used to diagnose hepatitis B virus infection.

Claims

A method for producing a subunit genetic engineering vaccine against hepatitis B, comprising accumulating the genetically engineered hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), isolating and purifying HBsAg, characterized in that developing chicken embryos that infect recombinant poxvirus directly into the allantoic virus are used to accumulate HBsAg or cell culture, and the isolation and purification of HBsAg is carried out sequentially by membrane filtration on a cascade of membranes, the pore size of one of which does not exceed 0.15 0.22 μm, and affi hydrochloric immunosorbent chromatography, which is used as immobilized on CNBr activated agarose 4B polyclonal antibodies specific to HBsAg, wherein the elution is carried citrate-phosphate buffer pH 2.0 2.4 and 8M urea pH 2.0 4.2.