RU2322503C1 - Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum - Google Patents
Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2322503C1 RU2322503C1 RU2006126555/13A RU2006126555A RU2322503C1 RU 2322503 C1 RU2322503 C1 RU 2322503C1 RU 2006126555/13 A RU2006126555/13 A RU 2006126555/13A RU 2006126555 A RU2006126555 A RU 2006126555A RU 2322503 C1 RU2322503 C1 RU 2322503C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- immunization
- rabies
- virus
- dose
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 83
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 39
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 14
- -1 aluminum ions Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229940049155 rabies serum Drugs 0.000 claims description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 12
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 8
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims description 4
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 27
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 abstract description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 abstract 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 7
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000191926 Rabies virus vnukovo-32 Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229940036105 rabies immunoglobulin Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 206010053317 Hydrophobia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, в частности к способу получения гипериммунной гетерологичной антирабической сыворотки, и может быть использовано для получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина.The invention relates to biotechnology and immunology, in particular to a method for producing hyperimmune heterologous anti-rabies serum, and can be used to obtain heterologous anti-rabies immunoglobulin.
Бешенство до сих пор остается значимой медицинской и экономической проблемой. Это обусловлено тем, что сохраняется постоянная угроза заражения людей вирусом бешенства в связи с существованием природных очагов заболевания и распространением этой инфекции среди диких и домашних животных [1, 2, 3]. По данным ВОЗ, в мире в среднем каждый год регистрируется 500000 случаев активно-пассивной обработки и 35000-50000 смертей от бешенства [4, 5, 6].Rabies is still a significant medical and economic problem. This is due to the fact that there is a constant threat of human infection with rabies virus due to the existence of natural foci of the disease and the spread of this infection among wild and domestic animals [1, 2, 3]. According to the WHO, in the world on average each year 500,000 cases of active-passive treatment and 35,000-50000 deaths from rabies are recorded [4, 5, 6].
Бешенство - острая нейроинфекция теплокровных животных, вызываемая рабдовирусом бешенства, без специального лечения приводит к смерти. В комплексе мероприятий профилактики и лечения гидрофобии ведущее место занимает специфическая активно-пассивная иммунизация. Комитет ВОЗ по бешенству рекомендовал местное применение антител во всех случаях заражения гидрофобией, в особенности при тяжелых заражениях [7].Rabies - acute neuroinfection of warm-blooded animals caused by rabies virus rhabdovirus, without special treatment leads to death. In the complex of measures for the prevention and treatment of hydrophobia, the leading place is occupied by specific active-passive immunization. The WHO rabies committee recommended topical use of antibodies in all cases of hydrophobic infection, especially in severe infections [7].
Поскольку существующие методы очистки и концентрации гетерологичных сывороток еще не позволяют добиться высокой степени очистки и концентрации антител, важное значение имеет разработка способов получения исходных высокоспецифичных иммунных сывороток.Since existing methods of purification and concentration of heterologous sera do not yet allow a high degree of purification and concentration of antibodies to be achieved, it is important to develop methods for obtaining the initial highly specific immune sera.
Исследования по получению антирабической сыворотки были начаты еще в 1889 г., когда Babes и Lepp обнаружили в крови иммунизированных собак нейтрализующие вирус бешенства антитела, с тех пор многие работы были направлены на получение сыворотки, обладающей высокой активностью.Research on rabies serum was started back in 1889, when Babes and Lepp discovered rabies virus neutralizing antibodies in the blood of immunized dogs. Since then, many studies have focused on obtaining serum with high activity.
Получение нативных сывороток с высокой концентрацией антител добиваются гипериммунизацией животных, т.е. применением интенсивных схем иммунизации, состоящих из многих циклов и инъекций антигена. Количество циклов, число инъекций в каждом цикле, дозы и способы введения антигенов определяются в каждом конкретном случае, исходя из особенностей антигена, его состояния, вида животных-продуцентов и целевого назначения сывороточного препарата. Существует прямая связь между силой антигенного раздражения и качеством антигена с уровнем накопления специфических антител в крови животных. В то же время качество антигена в значительной мере зависит от штамма вируса, методов его культивирования и очистки.Obtaining native sera with a high concentration of antibodies is achieved by hyperimmunization of animals, i.e. using intensive immunization regimens consisting of many cycles and antigen injections. The number of cycles, the number of injections in each cycle, the doses and methods of administration of antigens are determined in each case, based on the characteristics of the antigen, its condition, the type of animal producers and the intended use of the serum preparation. There is a direct correlation between the strength of antigenic irritation and the quality of antigen with the level of accumulation of specific antibodies in the blood of animals. At the same time, the quality of the antigen largely depends on the strain of the virus, methods of cultivation and purification.
Известны способы получения антирабической сыворотки путем иммунизации животных-продуцентов мозговой взвесью фиксированного вируса бешенства, где в качестве субстрата репродукции вируса бешенства используют мозг жеребят, собак, овцы, крупного рогатого скота (КРС) и т.д. Недостатком использования инфицированной мозговой взвеси различных видов животных является образование и накопление в крови продуцентов антител к мозговой ткани (цитотоксинов), которые при введении человеку могут вызвать серьезные побочные реакции [8]. Известно, что антирабические вакцины, изготовленные из мозга новорожденных и взрослых животных, могут вызывать у привитых осложнения со стороны нервной системы [9]. Доказано, что мозговая ткань обладает не только энцефалитогенной активностью, но и снижает защитные свойства организма. Кроме того, очистка вируса от балластных мозговых веществ химическими (фреоном, протамином) и физическими методами (центрифугированием) оказались не пригодными для практического применения. Уменьшение содержания мозгового вещества путем разведения антирабической вакцины тоже не дало положительных результатов. Было показано, что антирабическая вакцина иммуногенна при пороговой концентрации мозгового вещества 2,5%, ниже этой концентрации вакцина не создавала в организме иммунизированных животных иммунитета достаточной напряженности [10].Known methods for producing anti-rabies serum by immunizing animal producers with a brain suspension of a fixed rabies virus, where the foals, dogs, sheep, cattle (cattle) brain, etc. are used as a substrate for rabies virus reproduction. The disadvantage of using infected cerebral suspension of various animal species is the formation and accumulation in the blood of producers of antibodies to brain tissue (cytotoxins), which, when administered to humans, can cause serious adverse reactions [8]. It is known that rabies vaccines made from the brain of newborns and adult animals can cause complications in the vaccinated nervous system [9]. It is proved that brain tissue has not only encephalitogenic activity, but also reduces the protective properties of the body. In addition, the cleaning of the virus from ballast brain substances by chemical (freon, protamine) and physical methods (centrifugation) was not suitable for practical use. Reducing the content of the brain substance by diluting the rabies vaccine also did not give positive results. It was shown that the rabies vaccine is immunogenic at a threshold concentration of brain substance of 2.5%; below this concentration, the vaccine did not create sufficient tension in the body of immunized animals [10].
М.А.Селимов с соавторами предложил для иммунизации лошадей-продуцентов применять фиксированный вирус бешенства, выращенный в культуре первичных клеток почки сирийских хомяков (ПСХ) или новорожденных морских свинок [11].MA Selimov et al suggested using fixed rabies virus grown in the culture of primary cells of the kidney of Syrian hamsters (PSC) or newborn guinea pigs for immunization of production horses [11].
В известном способе не раскрыта очистка антигена от бычьей сыворотки и клеточного детрита, использование адъюванта и схема иммунизации. Балластные белки и другие антигенные вещества, имеющие источником происхождения питательную среду, на которой происходил рост вируса, являясь часто полноценными антигенами, вызывают при иммунизации образование соответствующих неспецифических по отношению к антигену вакцины антител, чем усиливают реактогенность препарата и их сенсибилизирующие свойства [12].In the known method is not disclosed the purification of antigen from bovine serum and cellular detritus, the use of an adjuvant and the immunization schedule. Ballast proteins and other antigenic substances having a source of nutrient medium on which the virus grew, being often complete antigens, cause immunization to produce the corresponding antibodies that are specific for the vaccine antigen, which increase the reactogenicity of the drug and their sensitizing properties [12].
На культуре ткани почек сирийских хомяков вирус накапливается в меньшем титре и обладает меньшей иммуногенностью, чем полученный на мозговом субстрате, что требует применения больших доз антигена или использования адъюванта. Большие дозы антигена индуцируют образование низкоафинных антител, синтез которых продолжается длительный период времени.In the tissue culture of Syrian hamster kidneys, the virus accumulates in a lower titer and has less immunogenicity than that obtained on the brain substrate, which requires the use of large doses of antigen or the use of an adjuvant. Large doses of antigen induce the formation of low affinity antibodies, the synthesis of which continues for a long period of time.
Известен способ получения антирабической сыворотки, предложенный Т.Luekrajang с соавторами [13]. Инактивированный антиген вируса бешенства на протяжении 105 дней вводят подкожно с интервалом 7 дней, первую инъекцию делают с полным адъювантом Фрейнда. Недостатком данного способа является то, что при подкожном пути введения вирус бешенства меньше контактирует с сетью нервных рецепторов и вызывает меньший иммунитет, чем при внутрикожном и внутримышечном пути введения [14, 15].A known method for producing anti-rabies serum proposed T. T. Luekrajang et al. [13]. Inactivated rabies antigen for 105 days is administered subcutaneously with an interval of 7 days, the first injection is done with complete Freund's adjuvant. The disadvantage of this method is that with a subcutaneous route of administration, rabies virus is less likely to contact the network of nerve receptors and induces less immunity than with an intradermal and intramuscular route of administration [14, 15].
Прототипом настоящего изобретения является способ, заключающийся в 5-кратной иммунизации овец инактивированным антигеном вируса бешенства с 14-дневным интервалом, используя внутрикожное и внутримышечное введение антигена с адъювантами (адъюванты Фрейнда и 0,3% гидроокись алюминия) в 3-42 точки животного [16]. В качестве антигена применяют 5%-ную суспензию мозга овец, инфицированных вирусом бешенства референс-штаммом CVS, инактивированную β-пропиолактоном.A prototype of the present invention is a method consisting in 5-fold immunization of sheep with an inactivated rabies virus antigen at a 14-day interval using intracutaneous and intramuscular administration of antigen with adjuvants (Freund's adjuvants and 0.3% aluminum hydroxide) at 3-42 points of the animal [16 ]. A 5% suspension of the brain of sheep infected with rabies virus with the reference strain of CVS inactivated with β-propiolactone is used as antigen.
Недостатком указанного способа является использование для иммунизации неочищенной 5% мозговой суспензии овец. Использование мозговой ткани приводит к образованию и накоплению цитотоксических антимозговых антител в сыворотке овец. Кроме того, мозговая субстанция обладает тромбокиназной активностью и может вызвать шок у животных-продуцентов. Попадая в кровоток, она вызывает тромбоз сосудов внутренних органов и мозга [8, 9]. Следует также отметить, что применяемый для иммунизации антиген не оттитрован и не очищен от балластных белков.The disadvantage of this method is the use for immunization of crude 5% cerebral suspension of sheep. The use of brain tissue leads to the formation and accumulation of cytotoxic anti-brain antibodies in sheep serum. In addition, the brain substance has thrombokinase activity and can cause shock in animal producers. Once in the bloodstream, it causes vascular thrombosis of the internal organs and brain [8, 9]. It should also be noted that the antigen used for immunization is not titrated and not purified from ballast proteins.
Другим недостатком прототипа является использование адъюванта Фрейнда, который имеет невысокую сорбционную емкость, и нестандартность эмульсионной смеси антигена и адъюванта. Адъювант Фрейнда обладает высокой реактогенностью и возможностью аллергизации и аутоаллергизации. По данным А.Х.Канчурина [17] микробные компоненты водно-масляных адъювантов типа Фрейнда, независимо от их природы, могут вызывать у сенсибилизированных животных клинические проявления, имеющие специфическую аллергическую природу. Применение адъювантов типа смесей Фрейнда, по мнению экспертов ВОЗ (18), таит в себе потенциальную опасность индуцирования опухолей. Используемая в качестве адъюванта гидроокись алюминия не обладает высоким иммуномодулирующим действием [19, 20]. Высокое содержание 0,3% гидроокиси алюминия в сорбированном антигене увеличивает площадь патолого-анатомического очага на месте инъекции [21]. По рекомендации ВОЗ в сорбированных препаратах, предназначенных для людей, должно содержаться не более 1,25 мг/мл ионов алюминия (в 1 мл геля может содержаться от 6 до 22 мг гидроокиси алюминия).Another disadvantage of the prototype is the use of Freund's adjuvant, which has a low sorption capacity, and the non-standard emulsion mixture of antigen and adjuvant. Freund's adjuvant has a high reactogenicity and the ability to allergize and autoallergize. According to A.Kh. Kanchurin [17], the microbial components of water-oil adjuvants of the Freund type, regardless of their nature, can cause clinical manifestations of a specific allergic nature in sensitized animals. The use of adjuvants such as Freund mixtures, according to WHO experts (18), poses a potential danger of tumor induction. Aluminum hydroxide used as an adjuvant does not have a high immunomodulating effect [19, 20]. The high content of 0.3% aluminum hydroxide in the sorbed antigen increases the area of the pathological anatomical focus at the injection site [21]. According to the WHO recommendation, sorbed preparations intended for humans should contain no more than 1.25 mg / ml of aluminum ions (1 ml of gel may contain from 6 to 22 mg of aluminum hydroxide).
Кроме того, данный способ получения антирабической сыворотки предусматривает использование кратковременной схемы иммунизации и позволяет получить невысокий титр специфических антител, поэтому рекомендуется для получения диагностических сывороток. Недостатком метода является и кратковременное использование продуцентов, в результате чего появляется необходимость в частом приобретении новых животных, их карантировании и дополнительном расходовании антигена, что делает данный метод нерентабельным. Использование овец в качестве доноров антирабической плазмы не позволяет получить большого количества иммунной сыворотки, к тому же их кровь может быть контаминирована вирусами скрепи.In addition, this method of producing rabies serum involves the use of a short-term immunization schedule and allows you to get a low titer of specific antibodies, therefore, it is recommended for diagnostic sera. The disadvantage of this method is the short-term use of producers, as a result of which there is a need for the frequent purchase of new animals, their quarantine and additional consumption of antigen, which makes this method unprofitable. The use of sheep as donors of rabies plasma does not allow to obtain a large amount of immune serum, in addition, their blood can be contaminated with scrapie viruses.
Таким образом, проблема использования очищенного вируса бешенства для иммунизации животных-продуцентов не разрешена до сих пор. Содержащиеся в неочищенном вирусе посторонние белковые компоненты способны вызывать у продуцентов развитие шоковых, анафилактоидных и пирогенных реакций. Качество антигена вируса бешенства должно оцениваться не только по иммуногенности, но и по его потенциальной опасности. Известные схемы иммунизации не безопасны и не позволяют получить антирабическую сыворотку с высокой специфичностью.Thus, the problem of using purified rabies virus to immunize animal producers has not been resolved so far. Foreign protein components contained in the crude virus can cause shock, anaphylactoid and pyrogenic reactions in producers. The quality of the rabies virus antigen should be evaluated not only by its immunogenicity, but also by its potential danger. Known immunization schemes are not safe and do not allow to obtain rabies serum with high specificity.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение гетерологичной антирабической сыворотки с высокой специфической активностью.The problem to which the invention is directed, is to obtain heterologous anti-rabies serum with high specific activity.
Технический результат предлагаемого способа заключается в разработке в промышленных масштабах эффективного и безопасного способа гипериммунизации животных-продуцентов очищенным, высокоиммуногенным антигеном вируса бешенства с низким содержанием примесных белковых компонентов и получение больших объемов гипериммунной высокоспецифичной антирабической сыворотки с высоким содержанием γ-глобулиновой фракции и минимальным содержанием неспецифических антител.The technical result of the proposed method consists in the development on an industrial scale of an effective and safe method of hyperimmunization of animal producers with a purified, highly immunogenic rabies virus antigen with a low content of protein impurities and the production of large volumes of hyperimmune highly specific anti-rabies serum with a high content of γ-globulin fraction and a minimum content of non-specific antibodies .
Сущность изобретения заключается в следующем: для получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки в качестве антигена используют вирус бешенства штамм Внуково-32, полученный на культуре перевиваемых клеток Vero и/или на первичной культуре клеток ПСХ, фильтрованный, инактивированный, очищенный и концентрированный адсорбцией на геле фосфата алюминия при рН=5,0-8,0 с концентрацией ионов алюминия 0,2-1,25 мкг/мл или ультрацентрифугированием или методами ультрафильтрации с последующей очисткой через пористые кремнеземы или ионообменной хроматографии. В качестве адъюванта используют гель фосфата алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,2-1,25 мкг/мл и/или нуклеинат натрия в количестве 0,002-0,5 мг/мл. Для иммунизации используют антиген с индексом иммуногенности не менее 9,5 МЕ/мл, содержащий белок меньше 200 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - менее 0,5 мкг/мл, клетки ПСХ и Vero - менее 0,5 мкг/мл, клеточную ДНК в вирусе, полученном на культуре перевиваемых клеток Vero, - 5,0-10,0 нг/мл. В качестве животных-продуцентов используют лошадей или КРС. Грундиммунизация состоит из 1-3 внутрикожных и/или внутримышечных инъекций антигена дозой 3-15 мл с интервалом 14-30 дней, после завершения которой, на 45-60 день, начинается основной цикл иммунизации, состоящий из 10-15 инъекций антигена дозой 5-70 мл с интервалом 5-15 дней, внутрикожно и/или внутримышечно в несколько точек. Основной цикл завершается кровопусканием с последующим предоставлением отдыха в течение месяца. После чего продуцентов иммунизируют раз в месяц дозой 20-70 мл, в зависимости от иммуногенности вакцины, внутрикожно и/или внутримышечно. Раз в полгода проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из 2-4 внутрикожных и/или внутримышечных инъекций антигена дозой 20-70 мл с интервалом 5-15 дней и вновь производят крововзятие. Кровопускание делают на 7-30-е сутки после завершения каждого цикла. В полученной антирабической плазме определяют специфическую активность в тесте протективной защиты in vivo на белых беспородных мышах.The essence of the invention is as follows: to obtain a highly specific heterologous rabies anti-rabies serum, the rabies virus Vnukovo-32, obtained on a culture of transplantable Vero cells and / or on a primary culture of PX cells, filtered, inactivated, purified and concentrated by adsorption on aluminum phosphate gel, is used as an antigen at pH = 5.0-8.0 with an aluminum ion concentration of 0.2-1.25 μg / ml or by ultracentrifugation or ultrafiltration methods, followed by purification through porous silicas, or noobmennoy chromatography. An aluminum phosphate gel with an aluminum ion concentration of 0.2-1.25 μg / ml and / or sodium nucleate in an amount of 0.002-0.5 mg / ml is used as adjuvant. For immunization use an antigen with an immunogenicity index of at least 9.5 IU / ml, containing protein less than 200 μg / ml, bovine serum albumin - less than 0.5 μg / ml, PX and Vero cells - less than 0.5 μg / ml, cell The DNA in the virus obtained from Vero transplantable cell culture is 5.0-10.0 ng / ml. As animal producers use horses or cattle. Grundimmunization consists of 1-3 intradermal and / or intramuscular injections of antigen with a dose of 3-15 ml with an interval of 14-30 days, after which, on days 45-60, the main immunization cycle begins, consisting of 10-15 injections of antigen with a dose of 5- 70 ml with an interval of 5-15 days, intradermally and / or intramuscularly at several points. The main cycle ends with a bloodletting followed by rest for a month. After that, producers are immunized once a month with a dose of 20-70 ml, depending on the immunogenicity of the vaccine, intradermally and / or intramuscularly. Once every six months, a shortened immunization cycle is carried out, consisting of 2-4 intradermal and / or intramuscular injections of antigen with a dose of 20-70 ml with an interval of 5-15 days and blood collection is again performed. Bloodletting is done on the 7-30th day after the completion of each cycle. In the obtained anti-rabies plasma, specific activity is determined in an in vivo protective protection test on outbred mice.
Данный способ позволяет получить высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку с минимальным содержанием антител к примесным компонентам антигена, в которой специфическая активность составляет не менее 75 МЕ/мл, γ-фракция - не менее 40%, антитела к клеткам Vero и ПСХ - менее 0,5 мкг/мл.This method allows to obtain highly specific heterologous anti-rabies serum with a minimum content of antibodies to impurity components of the antigen, in which the specific activity is at least 75 IU / ml, the γ fraction is at least 40%, the antibodies to Vero cells and PX are less than 0.5 μg / ml
В отличие от прототипа в заявляемом способе для иммунизации используют вирус бешенства, выращенный на культуре перевиваемых клеток Vero (22) и/или на первичной культуре клеток ПСХ. Вирус концентрируют и очищают сорбцией на геле фосфата алюминия при рН=5,0-8,0 с концентрацией ионов алюминия 0,2-1,25 мкг/мл или ультрацентрифугированием или методами ультрафильтрации с последующей очисткой через пористые кремнеземы или ионообменной хроматографии. В качестве адъюванта используют гель фосфата алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,2-1,25 мкг/мл и/или нуклеинат натрия 0,002-0,5 г/мл. Введены методы контроля иммуногенности вируса и содержания примесных веществ в антигене. Индекс иммуногенности составляет не менее 9,5 МЕ/мл, белок - менее 200 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - менее 0,5 мкг/мл, клетки ПСХ и Vero - менее 0,5 мкг/мл, клеточная ДНК - 5,0-10,0 нг/мл. Продуцентом антирабической плазмы являются лошадь и КРС. Схема иммунизации, состоящая из грундиммунизации, основного, поддерживающего и укороченного циклов, позволяет длительное время эксплуатировать одних и тех же животных-продуцентов и получать от них высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку, свободную от цитотоксинов, с титром протективных антител не менее 75 МЕ/мл, фракцией γ-глобулинов - не менее 40%, в которой антитела к клеткам Vero и ПСХ - менее 0,5 мкг/мл, пригодную для получения антирабического гетерологичного иммуноглобулина. Заявляемый способ безопасен и высокоэффективен.In contrast to the prototype, the claimed method uses rabies virus grown on a culture of transplantable Vero cells (22) and / or on a primary culture of PX cells for immunization. The virus is concentrated and purified by sorption on aluminum phosphate gel at pH = 5.0-8.0 with an aluminum ion concentration of 0.2-1.25 μg / ml or by ultracentrifugation or ultrafiltration methods, followed by purification through porous silicas or ion exchange chromatography. As an adjuvant, an aluminum phosphate gel with an aluminum ion concentration of 0.2-1.25 μg / ml and / or sodium nucleate 0.002-0.5 g / ml is used. Methods have been introduced to control the immunogenicity of the virus and the content of impurities in the antigen. The immunogenicity index is at least 9.5 IU / ml, protein is less than 200 μg / ml, bovine serum albumin is less than 0.5 μg / ml, PX and Vero cells are less than 0.5 μg / ml, cell DNA is 5, 0-10.0 ng / ml. The producer of rabies plasma are horse and cattle. The immunization schedule, consisting of gross immunization, the main, supporting and shortened cycles, allows one to use the same animal producers for a long time and obtain highly specific heterologous anti-rabies serum free of cytotoxins with a protective antibody titer of at least 75 IU / ml, fraction γ-globulins - not less than 40%, in which antibodies to Vero cells and PSC are less than 0.5 μg / ml, suitable for obtaining rabies heterologous immunoglobulin. The inventive method is safe and highly effective.
Совокупность отличительных признаков заявляемого способа позволила получить следующие преимущества: культивирование вируса бешенства на культуре перевиваемых клеток Vero и на первичной культуре клеток ПСХ, позволяет получить безопасный и эффективный антиген. Клетки Vero экономичны в получении, стандартны и стабильны, воспроизводство культуры клеток осуществляется при постоянных условиях с контролируемыми параметрами. Перевиваемые гетероплоидные клетки Vero могут выращиваться в больших объемах и позволяют получать вирус с высоким титром за достаточно короткий срок. Использование методов концентрирования и очистки позволяют получить безопасный, высокоочищенный и концентрированный вирус бешенства. Метод концентрации и очистки адсорбцией вируса на геле фосфата алюминия прост в исполнении и экономичен, сорбция вируса на гель с концентрацией ионов алюминия 0,2-1,25 мкг/мл при рН=5,0-8,0 позволяет полностью адсорбировать и стабилизировать неустойчивый вирус. Используемые в качестве адъюванта фосфат алюминия и нуклеинат натрия, стимулируя напряженность иммунного ответа, значительно повышает иммуногенность очищенного вируса. Нуклеинат натрия нетоксичен и неаллергеннен [23]. Полученный антиген может быть лиофилизирован для получения сухой формы, более устойчивой к воздействию физических и химических факторов, что увеличивает срок его использования. Антиген контролируют на иммуногенность и содержание примесных компонентов, что позволяет получить высокоактивную и высокоспецифичную антирабическую сыворотку с минимальным содержанием неспецифичных антител. Грундиммунизация позволяет повысить не только специфическую активность антирабической сыворотки, но и выход иммунологически реактивных продуцентов. Введение 1-3 инъекций антигена с интервалом 14-30 дней в период грундиммунизации и начало ревакцинации на 45-60 день позволяет организму продуцента полностью перестроиться и в достаточной мере стимулировать антителообразование. Длительное введение антигена и возрастающая антигенная нагрузка в период основного цикла позволяет получить максимальное количество специфических антител, при этом повторное введение антигена осуществляется через оптимальный интервал времени с учетом динамики формирования антител. Комбинированное введение антигена, внутрикожное и внутримышечное, способствует получению большего титра антирабических антител вследствие большего контакта вируса с сетью нервных рецепторов. Предоставление продуцентам отдыха в течение месяца, когда животных не подвергают никаким манипуляциям, ведет к восстановлению иммунологической реактивности организма, его гематологических и биохимических показателей крови. Однократная ежемесячная ревакцинация небольшой дозой антигена способствует повышению специфической активности антирабической сыворотки. Укороченный цикл гипериммунизации, который проводится раз в полгода и состоит из 2-4 внутримышечных и/или внутрикожных инъекций с увеличением антигенной нагрузки с интервалом 5-15 дней, способствует поддержанию и повышению титра специфических антител на достаточном уровне в течение продолжительного времени. При иммунизации учитывается, что доза вводимого антигена зависит от его иммуногенности. Маленькие дозы высокоиммуногенного антигена позволяют получить высокоактивную сыворотку, содержащую высокоавидные антитела, и не вызывают рефракторность организма, что удлиняет срок эксплуатации продуцента. Использование лошадей и крупного рогатого скота в качестве продуцентов антирабической сыворотки позволяет получить большие количества крови, от 160 до 200 литров, от одного животного в год. Кроме того, антирабическая сыворотка, полученная от крупного рогатого скота, является хорошей альтернативой для реципиентов, сенсибилизированных к лошадиному белку. Следует отметить, что специфическая активность антирабической сыворотки определяется в тесте биологической протективной защиты in vivo. Кроме этого, полученная антирабическая сыворотка контролируется на наличие антител к клеткам ПСХ и Vero, т.е. субстрату, на котором происходил рост вируса.The set of distinctive features of the proposed method allowed to obtain the following advantages: cultivation of rabies virus on the culture of transplantable Vero cells and on the primary culture of PX cells, allows you to get a safe and effective antigen. Vero cells are economical to obtain, standard and stable, cell culture reproduction is carried out under constant conditions with controlled parameters. Vero transplantable heteroploid cells can be grown in large volumes and can produce high titer virus in a relatively short time. Using the methods of concentration and purification allows you to get a safe, highly purified and concentrated rabies virus. The method of concentration and purification by adsorption of the virus on an aluminum phosphate gel is simple and economical, the sorption of the virus on a gel with an aluminum ion concentration of 0.2-1.25 μg / ml at pH = 5.0-8.0 allows you to completely adsorb and stabilize the unstable virus. Used as adjuvant, aluminum phosphate and sodium nucleinate, stimulating the strength of the immune response, significantly increases the immunogenicity of the purified virus. Sodium nucleinate is non-toxic and non-allergenic [23]. The resulting antigen can be lyophilized to obtain a dry form that is more resistant to physical and chemical factors, which increases the period of its use. The antigen is monitored for immunogenicity and content of impurity components, which allows to obtain highly active and highly specific anti-rabies serum with a minimum content of non-specific antibodies. Grundimmunization can increase not only the specific activity of rabies serum, but also the output of immunologically reactive producers. The introduction of 1-3 injections of antigen with an interval of 14-30 days during the course of immunization and the start of revaccination on 45-60 days allows the producer's body to completely rebuild and sufficiently stimulate antibody formation. Long-term administration of antigen and increasing antigenic load during the period of the main cycle allows you to get the maximum number of specific antibodies, with repeated administration of the antigen through the optimal time interval taking into account the dynamics of antibody formation. The combined administration of antigen, intradermal and intramuscular, helps to obtain a greater titer of rabies antibodies due to greater contact of the virus with the network of nerve receptors. Providing producers with rest for a month, when the animals are not subjected to any manipulation, leads to the restoration of the immunological reactivity of the body, its hematological and biochemical blood parameters. A single monthly revaccination with a small dose of antigen helps to increase the specific activity of rabies serum. A shortened cycle of hyperimmunization, which is carried out every six months and consists of 2-4 intramuscular and / or intradermal injections with an increase in antigenic load with an interval of 5-15 days, helps to maintain and increase the titer of specific antibodies at a sufficient level for a long time. During immunization, it is taken into account that the dose of the administered antigen depends on its immunogenicity. Small doses of a highly immunogenic antigen make it possible to obtain a highly active serum containing highly avid antibodies and do not cause refractoriness of the body, which prolongs the life of the producer. The use of horses and cattle as producers of rabies serum allows you to get large amounts of blood, from 160 to 200 liters, from one animal per year. In addition, rabies serum obtained from cattle is a good alternative for horse protein sensitized recipients. It should be noted that the specific activity of anti-rabies serum is determined in an in vivo biological protective protection test. In addition, the obtained rabies serum is monitored for the presence of antibodies to PX and Vero cells, i.e. the substrate on which the virus has grown.
Антигены вируса бешенства контролировались по следующим методикам.Rabies virus antigens were monitored by the following methods.
Антигенную активность вируса бешенства исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Иммуногенную активность определяли в тесте NIH (США) в волуметрической модификации на белых беспородных мышах массой (11±1) г с отраслевым стандартным образцом (ОСО) иммуногенной активности концентрированной очищенной культуральной антирабической вакцины. Бычий сывороточный альбумин контролировали методом ракетного иммуноэлектрофореза (по ФС 42-3874-99, с.46). Клетки почек сирийского хомячка и клетки Vero контролировали методом ракетного иммуноэлектрофореза, чувствительность метода 0,5 мкг/мл. Содержание белка в антигене определяли по методу Лоури (по ФС 42-3874-99, с.7). Содержание клеточной ДНК в вирусном материале, полученном на культуре перевиваемых клеток Vero - методом дот-гибридизации (по МУК 4.1/4.2.588-96, с.15). Содержание ионов алюминия определяли с помощью реакции комплексообразования ионов алюминия с трилоном-Б и последующем обратном титровании избытка трилона-Б (по ФС 42-3874-99, с.61).The antigenic activity of rabies virus was studied by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Immunogenic activity was determined in the NIH test (USA) in volumetric modification on outbred mice weighing (11 ± 1) g with an industry standard sample (CCA) of the immunogenic activity of a concentrated purified culture rabies vaccine. Bovine serum albumin was monitored by missile immunoelectrophoresis (FS 42-3874-99, p. 46). Syrian hamster kidney cells and Vero cells were monitored by missile immunoelectrophoresis, the sensitivity of the method was 0.5 μg / ml. The protein content in the antigen was determined by the Lowry method (according to FS 42-3874-99, p.7). The content of cellular DNA in the viral material obtained on the culture of transplantable Vero cells was determined using the dot hybridization method (according to MUK 4.1 / 4.2.588-96, p.15). The content of aluminum ions was determined using the complexation reaction of aluminum ions with Trilon-B and subsequent back titration of the excess Trilon-B (according to FS 42-3874-99, p.61).
Антирабическую сыворотку контролировали на специфическую активность в тесте протективной защиты in vivo на белых беспородных мышах массой (10±1) г с фиксированным вирусом бешенства штамм CVS против 100-1000 LD50 относительно отраслевого стандартного образца специфической активности антирабического гаммаглобулина (ОСО 42-28-200-92). Электрофоретическую однородность методом электрофореза на пленках из ацетат целлюлозы (по ФС 42-3874-99, с.20). Содержание антител к ПСХ и клеткам Vero в полученной антирабической плазме контролировали методом ракетного иммуноэлектрофореза, чувствительность метода 0,5 мкг/мл.The anti-rabies serum was monitored for specific activity in the in vivo protective protection test on white outbred mice weighing (10 ± 1) g with fixed rabies virus strain CVS versus 100-1000 LD 50 relative to the industry standard specimen of specific activity of anti-rabies gammaglobulin (OSO 42-28-200 -92). Electrophoretic homogeneity by electrophoresis on films of cellulose acetate (according to FS 42-3874-99, p.20). The content of antibodies to PLC and Vero cells in the obtained rabies plasma was monitored by the method of missile immunoelectrophoresis, the sensitivity of the method was 0.5 μg / ml.
Примеры конкретного выполненияCase Studies
Пример 1. В качестве антигена используют вирус бешенства штамм Внуково-32 адаптированный к перевиваемым гетероплоидным клеткам Vero, который добавляют из расчета 0,1 ЛД50/кл к культуре клеток Vero в концентрации 100 тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки соединяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После смены ростовой среды на поддерживающую среду делают сборы вируссодержащей жидкости. Полученные сборы фильтруют через фильтр Кулагина с диаметром пор 0,45 мкм и инактивируют с помощью аппарата-иррадиатора ультрафиолетовых лучей. В полученной вируссодержащей жидкости индекс иммуногенности составил - 1,13 МЕ/мл, количество белка - 300 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 1,2 мг/мл. Концентрацию вируса и очистку от балластных белков осуществляют сорбцией вируса на геле фосфата алюминия при рН=7,3 с концентрацией ионов алюминия 1,0 мг/мл. Экспозицию ведут 3 ч при температуре 4°С и постоянном перемешивании. Сорбированный вирус промывают буфером для адсорбции с рН=7,3. В полученном антигене индекс иммуногенности составляет 16,6 МЕ/мл, белок - 170 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,4 мкг/мл, клеточная ДНК - 5 нг/мл, клетки Vero - 0,2 мкг/мл. Этим антигеном иммунизируют лошадь массой (325±25) кг. Грундиммунизация состоит из двух внутрикожных инъекций антигена дозой 5 и 10 мл с интервалом 20 дней. Основной цикл начинается на 50 день и состоит из пяти инъекций антигена с интервалом 14 дней и восьми инъекций с интервалом 7 дней, с увеличением вводимой дозы антигена от 5 до 70 мл. Антиген вводят внутрикожно и внутримышечно, в несколько точек на шее и крупе лошади. Затем в течение полугода лошадь иммунизируют с интервалом 30 дней дозой 30-50 мл внутрикожно и внутримышечно, после чего проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из четырех инъекций антигена дозой 20, 30, 40, 50 мл с интервалом 7 дней. Антиген вводят в несколько точек внутрикожно и внутримышечно. Забор крови делают на 14 день после завершения основного цикла и на 14 день после ревакцинации. Специфическую активность полученной антирабической сыворотки определяют в тесте протективной защиты in vivo на белых беспородных мышах.Example 1. As an antigen, the rabies virus Vnukovo-32 strain adapted to transplantable Vero heteroploid cells is used, which is added at the rate of 0.1 LD 50 / cell to Vero cell culture at a concentration of 100 thousand cells / ml. Virus-infected cells are combined with growth medium and cultured in a bioreactor using microcarriers. After the growth medium is replaced by a support medium, virus-containing fluid is collected. The collected fees are filtered through a Kulagin filter with a pore diameter of 0.45 μm and inactivated using an ultraviolet irradiator. In the resulting virus-containing fluid, the immunogenicity index was 1.13 IU / ml, the amount of protein was 300 μg / ml, bovine serum albumin was 1.2 mg / ml. The concentration of the virus and purification from ballast proteins is carried out by sorption of the virus on an aluminum phosphate gel at pH = 7.3 with an aluminum ion concentration of 1.0 mg / ml. Exposure is carried out for 3 hours at a temperature of 4 ° C with constant stirring. Sorbed virus is washed with adsorption buffer with pH = 7.3. In the resulting antigen, the immunogenicity index is 16.6 IU / ml, protein is 170 μg / ml, bovine serum albumin is 0.4 μg / ml, cellular DNA is 5 ng / ml, Vero cells are 0.2 μg / ml. A horse weighing (325 ± 25) kg is immunized with this antigen. Grundimmunization consists of two intradermal antigen injections with a dose of 5 and 10 ml with an interval of 20 days. The main cycle begins on day 50 and consists of five injections of antigen with an interval of 14 days and eight injections with an interval of 7 days, with an increase in the administered dose of antigen from 5 to 70 ml. The antigen is administered intradermally and intramuscularly, at several points on the neck and croup of the horse. Then, within six months, the horse is immunized with an interval of 30 days with a dose of 30-50 ml intradermally and intramuscularly, after which a shortened immunization cycle is carried out, consisting of four injections of antigen at a dose of 20, 30, 40, 50 ml with an interval of 7 days. The antigen is administered at several points intradermally and intramuscularly. Blood sampling is done on the 14th day after the completion of the main cycle and on the 14th day after revaccination. The specific activity of the obtained rabies serum is determined in an in vivo protective protection test on outbred mice.
На 140-й день после завершения основного цикла иммунизации в полученной антирабической сыворотке специфическая активность была 133,7 МЕ/мл, γ-фракция - 44,5%, антитела к клеткам Vero не выявлялись. На 230-й день ревакцинации, после трех однократных ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 168,2 МЕ/мл, γ-фракция - 48,7%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 348 день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 177,9 МЕ/мл, γ-фракция - 52,5%, антитела к клеткам Vero - менее 0,5 мкг/мл. Полученные результаты представлены в таблице.On the 140th day after completion of the main immunization cycle, the specific activity in the obtained rabies serum was 133.7 IU / ml, the γ fraction was 44.5%, and antibodies to Vero cells were not detected. On the 230th day of revaccination, after three single monthly injections of antigen, the titer of specific antibodies was 168.2 IU / ml, the γ-fraction was 48.7%, and antibodies to Vero cells were not detected. On the 348th day of immunization, after a shortened immunization cycle, the specific activity was 177.9 IU / ml, the γ fraction was 52.5%, the antibodies to Vero cells were less than 0.5 μg / ml. The results are presented in the table.
Пример 2. Получают вируссодержащую жидкость с использованием штамма вируса бешенства Внуково-32 на культуре перевиваемых клеток Vero, как описано в примере 1. Полученная вируссодержащая жидкость содержит белок в количестве 570 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 1,6 мг/мл, индекс иммуногенности составляет - 2,01 МЕ/мл. Концентрацию и очистку вируса проводят ультрафильтрацией с последующей очисткой на колонке с пористым кремнеземом в трис-фосфатном буфере с рН=7,8. К очищенному вирусу добавляют фосфат алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,6 мг/мл и стабилизаторы: лошадиный сывороточный альбумин в конечной концентрации 0,5%, сахарозу 7,5%, желатозу 1% и лиофильно высушивают. Перед использованием антиген разводят в воде для инъекций. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 19,8 МЕ/мл, количество белка - 98 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,2 мкг/мл, клеточная ДНК - 3 нг/мл. Этим антигеном иммунизируют лошадь массой (330±25) кг. Грундиммунизация состоит из двух внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5 и 10 мл с интервалом 30 дней. Основной цикл начинается на 45 день и состоит из трех внутрикожных инъекций антигена дозой 5, 10, 15 мл с интервалом 14 дней и семи инъекций с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы антигена от 20 до 50 мл, который вводят внутрикожно и внутримышечно. Затем в течение полугода лошадь иммунизируют раз в месяц дозой 20-30 мл внутрикожно и внутримышечно, после чего проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из трех инъекций антигена дозой 20, 25, 30 мл с интервалом 14 дней внутрикожно и внутримышечно. Кровь брали на 20-й день после каждого цикла иммунизации. На 110-й день после завершения основного цикла в полученной антирабической сыворотке специфическая активность была 120,1 МЕ/мл, γ-фракция - 43,8%, антитела к клеткам Vero отсутствовали. На 230-й день ревакцинации, после четырех однократных ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 172,1 МЕ/мл, γ-фракция - 50,6%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 333 день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 183,0 МЕ/мл, γ-фракция - 56,3%, антитела к клеткам Vero - около 0,2 мкг/мл. Полученные результаты представлены в таблице.Example 2. A virus-containing liquid is obtained using the Vnukovo-32 rabies virus strain on a Vero transplant cell culture as described in Example 1. The resulting virus-containing liquid contains 570 μg / ml protein, 1.6 mg / ml bovine serum albumin, and immunogenicity is 2.01 IU / ml. The concentration and purification of the virus is carried out by ultrafiltration, followed by purification on a column of porous silica in Tris-phosphate buffer with pH = 7.8. Aluminum phosphate with an aluminum ion concentration of 0.6 mg / ml and stabilizers are added to the purified virus: horse serum albumin at a final concentration of 0.5%, sucrose 7.5%, gelatin 1% and freeze-dried. Before use, the antigen is diluted in water for injection. In the resulting antigen, the immunogenicity index was 19.8 IU / ml, the amount of protein was 98 μg / ml, bovine serum albumin was 0.2 μg / ml, and cellular DNA was 3 ng / ml. A horse weighing (330 ± 25) kg is immunized with this antigen. Grundimmunization consists of two intradermal and intramuscular injections of antigen with a dose of 5 and 10 ml with an interval of 30 days. The main cycle begins on day 45 and consists of three intradermal injections of antigen with a dose of 5, 10, 15 ml with an interval of 14 days and seven injections with an interval of 7 days with an increase in the administered dose of antigen from 20 to 50 ml, which is administered intradermally and intramuscularly. Then, within six months, the horse is immunized once a month with a dose of 20-30 ml intracutaneously and intramuscularly, after which a short immunization cycle is carried out, consisting of three injections of antigen with a dose of 20, 25, 30 ml with an interval of 14 days intracutaneously and intramuscularly. Blood was drawn on the 20th day after each immunization cycle. On the 110th day after completion of the main cycle, the specific activity in the obtained rabies serum was 120.1 IU / ml, the γ fraction was 43.8%, and antibodies to Vero cells were absent. On the 230th day of revaccination, after four single monthly injections of antigen, the titer of specific antibodies was 172.1 IU / ml, the γ-fraction was 50.6%, and antibodies to Vero cells were not detected. On the 333th day of immunization, after a shortened immunization cycle, the specific activity was 183.0 IU / ml, the γ fraction was 56.3%, and the antibodies to Vero cells were about 0.2 μg / ml. The results are presented in the table.
Пример 3. Получают вируссодержащую жидкость с использованием штамма вируса бешенства Внуково-32 на культуре перевиваемых клеток Vero, как описано в примере 1. Полученная вируссодержащая жидкость с индексом иммуногенности 5,0 МЕ/мл содержит белок в количестве 430 мкг/мл и бычий сывороточный альбумин - 1,3 мг/мл. Отделенную от клеток вируссодержащую жидкость концентрируют ультрацентрифугированием при 50000 q в течение 60 мин при температуре +4°С. Осадок ресуспендируют на магнитной мешалке в течение 20 мин с последующим воздействием ультразвуком 1 мГц в течение 60 сек и осветляют центрифугированием при 700 q в течение 15 мин. К очищенному вирусу добавляют фосфат алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,3 мг/мл. Сорбированный вирус инактивируют ультрафиолетовыми лучами. Добавляют стабилизаторы и лиофильно высушивают. Перед использованием к антигену добавляют нуклеинат натрия в количестве 0,25 мг/мл и разводят в воде для инъекций. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 25,2 МЕ/мл, количество белка - 70 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,2 мкг/мл, клеточная ДНК - 2,5 нг/мл. Этим антигеном иммунизируют лошадь массой (330±25) кг. Грундиммунизация состоит из одной внутрикожной инъекции антигена дозой 10 мл. Основной цикл начинается на 60-й день и состоит из десяти инъекций антигена с интервалом 14 дней с увеличением дозы антигена от 5 до 50 мл и трех инъекций с интервалом 7 дней дозой антигена 30 мл, который вводят внутрикожно и внутримышечно. Затем в течение полугода лошадь иммунизируют раз в месяц дозой 20-25 мл внутрикожно и внутримышечно, после чего проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из двух инъекций антигена дозой 20-30 мл с интервалом 14 дней внутрикожно и внутримышечно. На 175-й день после завершения основного цикла специфическая активность в полученной антирабической сыворотке составила 149,7 МЕ/мл, γ-глобулиновая фракция - 46,6%, антитела к клеткам Vero отсутствовали. На 268-й день ревакцинации, после четырех однократных ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 192,3 МЕ/мл, γ-фракция - 57,2%, антитела к клеткам Vero не выявлялись. На 383-й день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 211,2 МЕ/мл, γ-фракция - 58,0%, антитела к клеткам Vero - около 0,2 мкг/мл. Полученные результаты представлены в таблице.Example 3. A virus-containing liquid is obtained using the Vnukovo-32 rabies virus strain on a Vero transplant cell culture as described in Example 1. The resulting virus-containing liquid with an immunogenicity index of 5.0 IU / ml contains 430 μg / ml protein and bovine serum albumin - 1.3 mg / ml. The virus-containing liquid separated from the cells is concentrated by ultracentrifugation at 50,000 q for 60 min at a temperature of + 4 ° C. The precipitate was resuspended in a magnetic stirrer for 20 minutes, followed by ultrasound at 1 MHz for 60 seconds and clarified by centrifugation at 700 ° C for 15 minutes. Aluminum phosphate with an aluminum ion concentration of 0.3 mg / ml is added to the purified virus. Sorbed virus is inactivated by ultraviolet rays. Stabilizers are added and freeze-dried. Before use, 0.25 mg / ml sodium nucleinate is added to the antigen and diluted in water for injection. In the resulting antigen, the immunogenicity index was 25.2 IU / ml, the amount of protein was 70 μg / ml, bovine serum albumin was 0.2 μg / ml, and cellular DNA was 2.5 ng / ml. A horse weighing (330 ± 25) kg is immunized with this antigen. Grundimmunization consists of one intradermal injection of antigen at a dose of 10 ml. The main cycle begins on the 60th day and consists of ten injections of antigen with an interval of 14 days with an increase in the dose of antigen from 5 to 50 ml and three injections with an interval of 7 days with a dose of antigen of 30 ml, which is administered intracutaneously and intramuscularly. Then, within six months, the horse is immunized once a month with a dose of 20-25 ml intracutaneously and intramuscularly, after which a short immunization cycle is carried out, consisting of two injections of antigen with a dose of 20-30 ml with an interval of 14 days intracutaneously and intramuscularly. On the 175th day after the completion of the main cycle, the specific activity in the obtained rabies serum was 149.7 IU / ml, the γ-globulin fraction was 46.6%, and antibodies to Vero cells were absent. On the 268th day of revaccination, after four single monthly injections of antigen, the titer of specific antibodies was 192.3 IU / ml, the γ-fraction was 57.2%, and antibodies to Vero cells were not detected. On the 383rd day of immunization, after a shortened immunization cycle, specific activity was 211.2 IU / ml, γ-fraction - 58.0%, antibodies to Vero cells - about 0.2 μg / ml. The results are presented in the table.
Пример 4. Штаммом вируса бешенства Внуково-32, с множественностью заражения 0,01 ЛД50/кл заражают трипсинизированные клетки почек сирийского хомяка в концентрации 500±100 тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки соединяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После смены ростовой среды на поддерживающую делают сборы вируссодержащей жидкости. Полученные сборы фильтруют и инактивируют. В исходной вируссодержащей жидкости иммуногенная активность составляет 0,55 МЕ/мл, белка - 500 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина - 1,8 мкг/мл. Концентрацию и очистку вируса осуществляют методом ультрафильтрации с последующей очисткой ионообменной хроматографией на анионите ДЭАЭ-целлюлозе. Добавляют нуклеинат натрия в количестве 0,5 мг/мл, стабилизаторы и подвергают лиофильной сушке. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 10,3 МЕ/мл, белок - 100 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,3 мкг/мл, клетки ПСХ - 0,1 мкг/мл. Этим антигеном, разведенным в воде для инъекций, иммунизируют быка массой (335±25) кг. Грундиммунизация состоит из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5, 10 и 15 мл с интервалом 20 дней. На 45 день начинают основной цикл иммунизации, состоящий из 10 инъекций антигена с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы от 5 до 50 мл и 5-ти инъекций антигена дозой 50 мл с интервалом 14 дней. Антиген вводят внутрикожно и/или внутримышечно, в несколько точек на шее и крупе. В течение полугода быка иммунизируют раз месяц дозой 25-45 мл внутрикожно и внутримышечно, затем проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 20, 30 и 40 мл с интервалом 14 дней.Example 4. The strain of the rabies virus Vnukovo-32, with a multiplicity of infection of 0.01 LD 50 / cell infect trypsinized kidney cells of the Syrian hamster at a concentration of 500 ± 100 thousand cells / ml. Virus-infected cells are combined with growth medium and cultured in a bioreactor using microcarriers. After changing the growth medium to a supporting one, collections of virus-containing liquid are made. The resulting fees are filtered and inactivated. In the initial virus-containing fluid, the immunogenic activity is 0.55 IU / ml, protein - 500 μg / ml, bovine serum albumin - 1.8 μg / ml. The concentration and purification of the virus is carried out by ultrafiltration followed by purification by ion exchange chromatography on DEAE cellulose anion exchange resin. Add 0.5 mg / ml sodium nucleinate, stabilizers and freeze drying. In the obtained antigen, the immunogenicity index was 10.3 IU / ml, protein - 100 μg / ml, bovine serum albumin - 0.3 μg / ml, PSC cells - 0.1 μg / ml. A bull weighing 335 ± 25 kg is immunized with this antigen diluted in water for injection. Grundimmunization consists of three intradermal and intramuscular injections of antigen with a dose of 5, 10 and 15 ml with an interval of 20 days. On day 45, the main immunization cycle begins, consisting of 10 injections of antigen with an interval of 7 days with an increase in the administered dose from 5 to 50 ml and 5 injections of antigen with a dose of 50 ml with an interval of 14 days. The antigen is administered intracutaneously and / or intramuscularly, at several points on the neck and croup. Within six months, the bull is immunized once a month with a dose of 25-45 ml intradermally and intramuscularly, then a shortened immunization cycle is carried out, consisting of three intradermal and intramuscular injections of antigen at a dose of 20, 30 and 40 ml with an interval of 14 days.
На 150-й день после завершения основного цикла иммунизации получили антирабическую сыворотку со специфической активностью 83,1 МЕ/мл, в которой γ-фракция составляла 40,8%, антитела к клеткам ПСХ не выявлялись. На 240-й день ревакцинации, после трех ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 114,0 МЕ/мл, γ-фракция - 42,9%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 375 день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 119,6 МЕ/мл, γ-фракция глобулина - 43,2%, антитела к ПСХ - менее 0,5 мкг/мл. Полученные результаты представлены в таблице.On the 150th day after completion of the main immunization cycle, rabies serum was obtained with a specific activity of 83.1 IU / ml, in which the γ fraction was 40.8%, and antibodies to PX cells were not detected. On the 240th day of revaccination, after three monthly injections of antigen, the titer of specific antibodies was 114.0 IU / ml, the γ-fraction was 42.9%, and antibodies to Vero cells were not detected. On the 375th day of immunization, after a shortened immunization cycle, the specific activity was 119.6 IU / ml, the γ-fraction of globulin - 43.2%, antibodies to PLC - less than 0.5 μg / ml. The results are presented in the table.
Таким образом, предлагаемый способ иммунизации позволяет в производственных условиях получить высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку со специфической активностью не менее 75 МЕ/мл, в которой γ-глобулиновая фракция составляет не менее 40%, антитела к клеткам субстрата, на котором происходил рост вируса, - менее 0,5 мкг/мл, пригодную для получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Предлагаемый способ безопасен и высокоэффективен.Thus, the proposed method of immunization allows under production conditions to obtain highly specific heterologous anti-rabies serum with a specific activity of at least 75 IU / ml, in which the γ-globulin fraction is at least 40%, antibodies to the cells of the substrate on which the virus grew, less 0.5 μg / ml, suitable for the preparation of heterologous anti-rabies immunoglobulin. The proposed method is safe and highly effective.
Характеристика антирабической сыворотки, полученной заявляемым способомTable
Characterization of rabies serum obtained by the claimed method
Источники информацииInformation sources
1. Величко М.А. Бешенство - актуальная проблема здравоохранения // Воен. - мед. журн. - 1994. - № 2. - С.47-49.1. Velichko M.A. Rabies is an urgent public health problem // Military. - honey. journal - 1994. - No. 2. - P.47-49.
2. Селимов М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспектива элиминации бешенства // Вопросы вирусологии. Москва, 1998, - № 5. - С.196-198.2. Selimov M.A. The modern epizootic situation and the prospect of eliminating rabies // Questions of Virology. Moscow, 1998, No. 5. - S.196-198.
3. Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Ведерников В.А. и др. Эпидемиология и эпизоотология бешенства на территории бывшего СССР // Журн. микробиол. - 1995. - № 1. - С.21-26.3. Cherkassky B. L., Knop A. G., Vedernikov V. A. et al. Epidemiology and epizootology of rabies in the territory of the former USSR // Zh. microbiol. - 1995. - No. 1. - P.21-26.
4. Baer, G.M. In: Kurstares Control of Virus Diseases. - New York, Marcel Dekker, - 1984. - P.86.4. Baer, G.M. In: Kurstares Control of Virus Diseases. - New York, Marcel Dekker, - 1984. - P.86.
5. Connelly K.P. Pets and pests: Misconceptions about Zoonotic infections. // Infect Med. - 2004. - 21(11). - Р.557-65.5. Connelly K.P. Pets and pests: Misconceptions about Zoonotic infections. // Infect Med. - 2004 .-- 21 (11). - R.557-65.
6. Hashmi A, Parviz S, Moosvi В, Rehman A, Luby S. Rabies deaths in Karach // Proceeding of the 2nd National Symposium on Basic and Applied Resarch in Health Care and Social Development, Karachi: Aga Khan University, 1995. - P.151.6. Hashmi A, Parviz S, Moosvi B, Rehman A, Luby S. Rabies deaths in Karach // Proceeding of the 2nd National Symposium on Basic and Applied Resarch in Health Care and Social Development, Karachi: Aga Khan University, 1995 .-- P.151.
7. World Health Organization (WHO). Recommendations on rabies postexposure treatment and the correct technique of intradermal immunization against rabies. Geneva: WHO.EMC.ZOO 96.6. - 1996.7. World Health Organization (WHO). Recommendations on rabies postexposure treatment and the correct technique of intradermal immunization against rabies. Geneva: WHO.EMC.ZOO 96.6. - 1996.
8. Селимов М.А. Материалы к ликвидации заболеваемости гидрофобией // Дисс. докт. М., 1962.8. Selimov M.A. Materials for the elimination of the incidence of hydrophobia // Diss. Doct. M., 1962.
9. Буковская С.Н. О частоте случаев шока при введении кроличьей и овечьей антирабических вакцин // Журнал Микробиол., Эпидемиол. и Иммунобиол. - М., 1965. - № 6. - С.134-136.9. Bukovskaya S.N. About the frequency of cases of shock with the introduction of rabbit and sheep rabies vaccines // Journal of Microbiol., Epidemiol. and Immunobiol. - M., 1965. - No. 6. - S.134-136.
10. Мамаладзе А.И., Курашвили В.Е. Сравнительное изучение эффективности сухой антирабической вакцины из мозга овец и новорожденных кроликов с различным содержанием мозгового вещества // Материалы к всесоюзной конференции по проблеме «Научные основы производства бактерийных и вирусных препаратов» Уфа, 1969. - С.179-180.10. Mamaladze A.I., Kurashvili V.E. A comparative study of the effectiveness of dry anti-rabies vaccine from the brain of sheep and newborn rabbits with different brain contents // Materials for the All-Union Conference on the Problem of “Scientific Basis for the Production of Bacterial and Viral Preparations” Ufa, 1969. - P.179-180.
11. Авторское свидетельство СССР № 200743. Способ производства антирабического гаммаглобулина. А 61 К 37/06. Опубл. 05.04.1977.11. USSR author's certificate No. 200743. Method for the production of anti-rabies gammaglobulin. A 61 K 37/06. Publ. 04/05/1977.
12. Воробьев А.А. // Журнал Микробиол., Эпидемиол. и Иммунобиол. - 1954. - № 8. - С.59.12. Vorobyov A.A. // Journal of Microbiol., Epidemiol. and Immunobiol. - 1954. - No. 8. - P.59.
13. Luekrajang Т., Wangsar. Т., Phanuphak P. Production of antirabies serum of equine origin // Laboratory techniques in rabies. - 1996. - P.401-403.13. Luekrajang T., Wangsar. T., Phanuphak P. Production of antirabies serum of equine origin // Laboratory techniques in rabies. - 1996. - P.401-403.
14. Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций // Дисс. докт. мед. наук. - М., 1993. - С.80.14. Gribencha S.V. Modern aspects of biology and prevention of lissavirus infections // Diss. Doct. honey. sciences. - M., 1993 .-- S.80.
15. Иванов B.C., Самуйленко А.Я., Титеричев В.И., Иванов И.В. Проявление иммуногенной потенции антирабической вакцины из штамма Щелково-51 в зависимости от места ее введения // Тезисы конф. - Щелково, 2000. - С.33-36.15. Ivanov B.C., Samuilenko A.Ya., Titerichev V.I., Ivanov I.V. Manifestation of the immunogenic potency of the rabies vaccine from the Shchelkovo-51 strain depending on the place of its administration // Abstracts conf. - Schelkovo, 2000. - S.33-36.
16. Патент РФ № 2196607. Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки. А61K 39/205, А61K 39/42, G01N 33/569. Опубл. 20.01.2003.16. RF patent No. 2196607. A method for producing hyperimmune anti-rabies serum. A61K 39/205, A61K 39/42, G01N 33/569. Publ. 01/20/2003.
17. Канчурин А.Х. // Материалы V Межинститутской конференции памяти И.И.Мечникова. М., 1966. - С.55.17. Kanchurin A.Kh. // Materials of the V Inter-Institute Conference in memory of I.I. Mechnikov. M., 1966. - P.55.
18. Исследования по иммунологии. ВОЗ. Женева, 1965. - С.119.18. Studies in immunology. WHO. Geneva, 1965 .-- P.119.
19. Ситник Н.П., Исрафилов А.Г., Крутилина Д.В., Шафеева Р.С., Кунцевич Ю.Г., Загидуллин Н.В., Кулагин В.Ф. Анительный ответ морских свинок на вакцинацию антирабической вакциной с различными адъювантами // Материалы Всероссийской научной конференции: «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке». Пермь, 2003. - С.56-57.19. Sitnik N.P., Israfilov A.G., Krutilina D.V., Shafeeva R.S., Kuntsevich Yu.G., Zagidullin N.V., Kulagin V.F. The relative response of guinea pigs to vaccination with rabies vaccine with various adjuvants // Materials of the All-Russian Scientific Conference: "Actual issues of vaccine-serum in the XXI century." Perm, 2003 .-- P.56-57.
20. Ситник Н.П., Исрафилов А.Г., Крутилина Д.В., Шафеева Р.С. Влияние различных адъювантов на величину гуморального ответа // Всероссийская научная конференция: «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов». Томск, 2004. - С.67-70.20. Sitnik N.P., Israfilov A.G., Krutilina D.V., Shafeeva R.S. The effect of various adjuvants on the size of the humoral response // All-Russian Scientific Conference: "Actual problems of the development, production and use of immunobiological and pharmaceutical preparations." Tomsk, 2004 .-- P.67-70.
21. Воробьев А.А. Рационально конструированные сорбированные анатаксины и закономерности иммуногенеза при их применении. Дисс. АМН СССР. Москва, - 1958.21. Vorobyov A.A. Rationally designed sorbed anataxins and patterns of immunogenesis during their use. Diss. USSR Academy of Medical Sciences. Moscow, - 1958.
22. Новые методы культуры животных тканей / Под редакцией проф. Ю.М.Оленова // М., 1978. - С.116-129.22. New methods of culture of animal tissues / Edited by prof. Yu.M. Olenova // M., 1978. - S.116-129.
23. Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и пременение в медицине / В.М.Земсков, М.Ю.Лидак, А.М.Земсков, У.Я.Микстайс // Рига, 1985. - С.39.23. Low molecular weight RNA: production, hydrolysis and use in medicine / V.M. Zemskov, M.Yu. Lidak, A.M. Zemskov, U.Ya. Mikstays // Riga, 1985. - P. 39.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006126555/13A RU2322503C1 (en) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006126555/13A RU2322503C1 (en) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2322503C1 true RU2322503C1 (en) | 2008-04-20 |
Family
ID=39454049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006126555/13A RU2322503C1 (en) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2322503C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609766C1 (en) * | 2015-11-09 | 2017-02-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) | Method of production of rabies diagnostic serum |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2166961C2 (en) * | 1999-06-30 | 2001-05-20 | Акционерное общество закрытого типа НПК "Комбиотех Лтд" | Method for treating virus hepatitis b |
| RU2191600C1 (en) * | 2001-12-20 | 2002-10-27 | Скичко Николай Данилович | Method for obtaining antirabic vaccine |
| RU2196607C2 (en) * | 2001-03-30 | 2003-01-20 | ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Method for obtaining hyperimmune antirabic sera |
| RU2004101284A (en) * | 2001-06-20 | 2005-06-27 | Чирон Срл. (It) | VACCINES BASED ON SOLUBILIZED AND COMBINED CAPSULAR POLYSACCHARIDES |
-
2006
- 2006-07-21 RU RU2006126555/13A patent/RU2322503C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2166961C2 (en) * | 1999-06-30 | 2001-05-20 | Акционерное общество закрытого типа НПК "Комбиотех Лтд" | Method for treating virus hepatitis b |
| RU2196607C2 (en) * | 2001-03-30 | 2003-01-20 | ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Method for obtaining hyperimmune antirabic sera |
| RU2004101284A (en) * | 2001-06-20 | 2005-06-27 | Чирон Срл. (It) | VACCINES BASED ON SOLUBILIZED AND COMBINED CAPSULAR POLYSACCHARIDES |
| RU2191600C1 (en) * | 2001-12-20 | 2002-10-27 | Скичко Николай Данилович | Method for obtaining antirabic vaccine |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609766C1 (en) * | 2015-11-09 | 2017-02-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) | Method of production of rabies diagnostic serum |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2010319047A1 (en) | Therapeutic agent for psoriasis or atopic dermatitis | |
| TW202144003A (en) | Vaccine containing immobilized virus particles | |
| RU2447898C2 (en) | Ipv-dpt vaccine | |
| RU2593718C1 (en) | Inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease types a, o, asia-1 | |
| CN102552898A (en) | Purification preparation method of human rotavirus inactivated vaccines by utilizing ion exchange chromatography | |
| EP0211001B1 (en) | Liver fluke antigens | |
| JPH09110719A (en) | Adjuvant vaccine substantially free of non-host albumin | |
| RU2322503C1 (en) | Method for preparing highly specific heterologous antirabies serum | |
| ES2636958T3 (en) | Improved vaccine against feline calicivirus | |
| KR20020020260A (en) | Method for growing or for removing circoviruses from biological material | |
| RU2549434C2 (en) | Method for making brucellosis diagnostic serum | |
| CN107375920A (en) | A kind of porcine reproductive and respiratory syndrome virus swine influenza virus reconstruct virosomes vaccine and its production and use | |
| WO2005014803A1 (en) | West nile virus vaccine | |
| JPH0341034A (en) | Peritonitis vaccine infectious for felid animal | |
| RU2817031C1 (en) | Aphtae epizooticae foot-and-mouth disease virus strain "o no 2222/taiwan/1/2012" for production of biopreparations for diagnosis and specific prevention of foot-and-mouth disease | |
| RU2802251C1 (en) | Vaccine composition for the prevention of enzootic abortion in sheep | |
| RU2196607C2 (en) | Method for obtaining hyperimmune antirabic sera | |
| KR920010872B1 (en) | Preparing vaccine against herpes simplex virus | |
| JP2843276B2 (en) | Production method of inactivated chicken tissue culture vaccine | |
| CN102335198B (en) | Production method for tick-borne encephalitis virus horse antiserum | |
| RU2609766C1 (en) | Method of production of rabies diagnostic serum | |
| RU2798283C1 (en) | Chlamydia vnitibp-21 chlamydia abortus strain for the production of immunobiological medicinal products | |
| George et al. | Route‐Related Variation in the Immunogenicity of Killed Salmonella enteritidis Vaccine: Role of Antigen Presenting Cells | |
| RU2457859C1 (en) | Cattle viral diarrhoeia vaccine | |
| CN106267177B (en) | Inactivated Vaccine of Forest Musk Pneumonia and Suppurative Disease Virus with Complete Freund's Adjuvant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180716 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |