EA040093B1

EA040093B1 - TECHNOLOGY FOR OBTAINING VACCINE AGAINST HEMORRHAGIC FEVER WITH RENAL SYNDROME

Info

Publication number: EA040093B1
Application number: EA201800511
Authority: EA
Inventors: Евгений Александрович Ткаченко; Тамара Казбековна Дзагурова; Айдар Айратович Ишмухаметов; Александра Александровна Синюгина; Мария Владимировна Баловнева; Мария Сергеевна Егорова; Светлана Сергеевна Курашова; Наталья Александровна Коротина
Original assignee: Фгану "Фнцирип Им. М.П. Чумакова Ран" (Институт Полиомиелита)
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2022-04-19

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению вакцины для профилактики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).The invention relates to the field of biotechnology, in particular to obtaining a vaccine for the prevention of viral infections, namely the infection of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS).

Уровень техникиState of the art

Возбудителями ГЛПС являются 4 ортохантавируса, относящиеся к семейству Hantaviridae, отряд Bunyavirales, ареал распространения которых совпадает с ареалом их резервуарных хозяев на территории Евразии. Вирусы ПУУМАЛА и ДОБРАВА вызывают тяжёлое заболевание на территории европейской части России и других европейских стран, в то время как два других вируса ХАНТААН и СЕУЛ распространены в азиатских странах, главным образом в Китае и Корее, а также на Дальнем Востоке России. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае и Корее, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России и других странах Европы, поскольку они производятся на основе вирусов ХАНТААН и СЕУЛ, которые не обладают защитным действием против вирусов ПУУМАЛА и ДОБРАВА [Yong-K Chu, et al., A vaccinia virusvectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus, Journal of virology, Oct. 1995, p. 6417-6423; Е.А.Ткаченко и С.Г.Дроздов. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки, Эпидимиология и вакцинопрофилактика 2002, 6, с. 14-18].The causative agents of HFRS are 4 orthohantaviruses belonging to the family Hantaviridae, order Bunyavirales, whose distribution area coincides with the area of their reservoir hosts in Eurasia. PUUMALA and DOBRAVA viruses cause severe disease in the European part of Russia and other European countries, while the other two viruses HANTAAN and SEOUL are common in Asian countries, mainly in China and Korea, as well as in the Russian Far East. Currently, commercial vaccines against HFRS are produced only in China and Korea, however, none of these vaccines can be used in the European regions of Russia and other European countries, since they are produced on the basis of HANTAAN and SEOUL viruses, which do not have a protective effect against PUUMALA viruses and GOOD [Yong-K Chu, et al., A vaccinia virusvectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus, Journal of virology, Oct. 1995, p. 6417-6423; E.A. Tkachenko and S.G. Drozdov. Hantaviruses and hantavirus fevers, Epidemiology and Vaccine Prevention 2002, 6, p. 14-18].

Для технологии изготовления вакцинных препаратов, которые могут быть использованы для специфической профилактики ГЛПС, известны нижеследующие аналоги.For the technology of manufacturing vaccine preparations that can be used for the specific prevention of HFRS, the following analogues are known.

Известен аналог [Y.Choi et al., Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells. Vaccine 21 (2003) 1867-1873], где клетки VERO E6 культивировали в спиннерных колбах на микроносителе Cytodex 3. После сбора вируссодержащей жидкости, проводили центрифугирование для удаления клеточного детрита. Концентрирование проводили на ультрафильтрационных кассетах (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 300000 Да и последующим ультрацентрифугированием при 80000g . Осадок ресуспендировали в трис-HCl буфере и проводили ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Недостаток данного метода получения и очистки вирусного концентрата состоит в том, что дважды используется центрифугирование. Применение высоко скоростного центрифугирования нельзя считать технологичным в масштабах промышленного производства вакцинных препаратов, т.к. требует больших временных затрат и дополнительных условий, обеспечивающих безопасность работы персонала с особо опасными вирусами, к которым относятся возбудители ГЛПС.Known analogue [Y. Choi et al., Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells. Vaccine 21 (2003) 1867-1873], where VERO E6 cells were cultured in spinner flasks on a Cytodex 3 microcarrier. After collecting the virus-containing fluid, centrifugation was performed to remove cell debris. Concentration was carried out on ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of 300,000 Da permeable particles and subsequent ultracentrifugation at 80,000g. The pellet was resuspended in Tris-HCl buffer and ultracentrifuged in a sucrose gradient. The disadvantage of this method for obtaining and purifying the viral concentrate is that centrifugation is used twice. The use of high-speed centrifugation cannot be considered technologically advanced on the scale of the industrial production of vaccine preparations, since requires a lot of time and additional conditions to ensure the safety of personnel working with especially dangerous viruses, which include HFRS pathogens.

Другим аналогом можно считать патент [Huang Yongcheng et al., Production of vaccine for epidemic hemorrhagic fever using prinmary kidney cills of golden hamster. CN 1109782], где субстратом для получения вируссодержащей культуральной жидкости служила первичная культура клеток почек золотистых хомячков. Собранную вируссодержащую жидкость фильтровали и инактивировали формальдегидом. Концентрирование вирусного антигена проводили при помощи ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы с последующей гель-фильтрацией с целью удаления сахарозы. Очистку осуществляли при помощи ионнобменной хроматографии на Cellufine Sulfate геле. Недостатками данного метода получения вирусного концентрата можно считать использование первичной культуры клеток почек золотистых хомячков. Применение первичных культур клеток связано с риском микробной и вирусной контаминации целевого продукта. Можно отметить, что использование первичной культуры клеток в производстве вирусных вакцин связано с использованием большого числа животных, и, следовательно, с удорожанием технологического процесса. Применение перевиваемых культур клеток в качестве субстрата для репродуцирования вирусов позволяет уменьшить риск микробной и вирусной контаминации целевого продукта и существенно снизить себестоимость конечного продукта. Перевиваемые культуры клеток позволяют получать более стандартные результаты по репродуцированию вирусов, по сравнению с первичными культурами клеток. Использование ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы требует дополнительной стадии очистки от сахарозы. Ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы концентратов вирусов позволяет эффективно разделять вирусные частицы от балластных белков, но требует большого числа единиц оборудования для работы в промышленных масштабах.Another analogue is the fever patent [Huang Yongcheng et al., Production of vaccine for epidemic hemorrhagic using prinmary kidney cills of golden hamster. CN 1109782], where the primary culture of golden hamster kidney cells served as a substrate for obtaining a virus-containing culture fluid. The collected virus-containing fluid was filtered and inactivated with formaldehyde. Concentration of viral antigen was performed by ultracentrifugation in a sucrose gradient followed by gel filtration to remove sucrose. Purification was carried out using ion exchange chromatography on Cellufine Sulfate gel. The disadvantages of this method for obtaining a viral concentrate can be considered the use of a primary cell culture of the kidneys of golden hamsters. The use of primary cell cultures is associated with the risk of microbial and viral contamination of the target product. It can be noted that the use of primary cell culture in the production of viral vaccines is associated with the use of a large number of animals, and, consequently, with an increase in the cost of the technological process. The use of continuous cell cultures as a substrate for virus reproduction makes it possible to reduce the risk of microbial and viral contamination of the target product and significantly reduce the cost of the final product. Continuous cell cultures provide more standard viral reproduction results than primary cell cultures. The use of sucrose gradient ultracentrifugation requires an additional sucrose purification step. Ultracentrifugation of virus concentrates in a sucrose gradient makes it possible to effectively separate viral particles from bulk proteins, but requires a large number of pieces of equipment to operate on an industrial scale.

В работе [Агафонов А.П. и др. Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью. RU 2029561] авторы культивируют вирус Марбург на культуре клеток фибробластов человека с добавлением человеческого сывороточного альбумина. Полученную вируссодержащую жидкость фильтруют на фильтрах МФА-С-0,6-1,5. После фильтрации её концентрируют на ультрафильтрационной системе в 20 раз. Очистку проводят при помощи диафильтрации с десятикратным объемом раствора Хэнкса. Существенным отличием данного примера получения вирусных концентратов и заявленного изобретения является тот, факт, что в процессе репродуцирования вирусов-возбудителей ГЛПС в клетках Vero не используется сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота. После проведения диафильтрации вирусного концентрата авторы определяют, что концентрация общего белка в препарате составляет 2,5±0,5 мг/мл, тогда как в способе, раскрытом в настоящем изобретении, после хроматографической очистки вируссодержащего материала содержание общего белка в нем составляет 40-70 мкг/мл. Использование хроматографической очистки в способе, раскрытом в настоящем изобретении, позволяет снизить концентрацию общего белка примерно в десять раз.In [Agafonov A.P. and others. A method for obtaining concentrates of viruses that cause hemorrhagic fevers and have immunogenic and protective activity. EN 2029561] the authors cultivate the Marburg virus in human fibroblast cell culture with the addition of human serum albumin. The resulting virus-containing liquid is filtered on MFA-S-0.6-1.5 filters. After filtration, it is concentrated on an ultrafiltration system 20 times. Purification is carried out by diafiltration with ten times the volume of Hanks solution. The essential difference between this example of obtaining viral concentrates and the claimed invention is the fact that in the process of reproduction of HFRS pathogen viruses in Vero cells, serum of bovine embryos is not used. After diafiltration of the virus concentrate, the authors determine that the total protein concentration in the preparation is 2.5 ± 0.5 mg/ml, while in the method disclosed in the present invention, after chromatographic purification of the virus-containing material, the total protein content in it is 40-70 mcg/ml. The use of chromatographic purification in the method disclosed in the present invention allows to reduce the concentration of total protein by about ten times.

- 1 040093- 1 040093

Также аналогом представленного изобретения можно считать статью [Immunization effect of purified bivalent vaccine to haemorrhagic fever with renal syndrome manufactured from primarycultured hamster kidney cells, Chin Med J. 2005 118(9), 766-768], где вирусные штаммы, выделенные на территории Китая, культивируют на первичной культуре клеток почек хомячков. Полученную вируссодержащую жидкость инактивируют формальдегидом и проводят очистку на колонке с Сефарозой 4 ФФ. Существенным отличием описанного выше способа от способа, раскрытого в настоящем изобретении, является: применение в качестве субстрата для репродуцирования вирусов первичной культуры клеток, а также отсутствие стадии концентрирования вируссодержащей жидкости. В заявленном способе используется перевиваемая культура клеток, что позволяет снизить риск микробной и вирусной контаминации вируссодержащей жидкости. Кроме того, применение предварительной стадии концентрирования вируссодержащей жидкости позволяет использовать вируссодержащую жидкость со средними и низкими значениями титра вируса, что в условиях промышленного производства позволяет увеличить эффективность технологического процесса. Хранение концентратов вирусов требует меньших площадей холодильных и морозильных камер, что является ещё одной положительной стороной применения стадии концентрирования вируссодержащей жидкости. Необходимо отметить, что хроматографическая очистка вирусных концентратов, индекс концентрирования которых может составлять 100-200 раз, требует, соответственно, меньших временных затрат по сравнению с хроматографической очисткой исходного объема вируссодержащей жидкости.Also, the article [Immunization effect of purified bivalent vaccine to haemorrhagic fever with renal syndrome manufactured from primarycultured hamster kidney cells, Chin Med J. 2005 118(9), 766-768] can be considered an analogue of the presented invention, where viral strains isolated in China , cultivated on the primary culture of hamster kidney cells. The resulting vaccinated liquid is inactivated with formaldehyde and purified on a Sepharose 4 FF column. The essential difference between the method described above and the method disclosed in the present invention is: the use of primary cell culture as a substrate for the reproduction of viruses, as well as the absence of the stage of concentrating the virus-containing liquid. The claimed method uses a continuous cell culture, which reduces the risk of microbial and viral contamination of the virus-containing fluid. In addition, the use of a preliminary stage of concentrating a virus-containing liquid makes it possible to use a virus-containing liquid with medium and low virus titer values, which, under industrial production conditions, makes it possible to increase the efficiency of the technological process. Storage of virus concentrates requires smaller areas of refrigeration and freezing chambers, which is another positive side of the use of the virus-containing liquid concentration stage. It should be noted that the chromatographic purification of virus concentrates, the concentration index of which can be 100-200 times, requires, respectively, less time compared to the chromatographic purification of the initial volume of the virus-containing liquid.

На сегодняшний день на рынке не существует разрешенных к применению вакцин для профилактики инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), вызванных ортохантавирусами, циркулирующими на территории Европы (в частности, вирусами ПУУМАЛА и ДОБРАВА). Данное изобретение использует полученные впервые в мире штаммы ортохантавирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, которые способны к размножению в разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток Vero с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.To date, there are no approved vaccines on the market for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) infection caused by orthohantaviruses circulating in Europe (in particular, PUUMALA and DOBRAVA viruses). This invention uses strains of orthohantaviruses PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN obtained for the first time in the world, which are capable of reproduction in a transplantable Vero cell culture permitted for vaccine production with the accumulation of viral mass in quantities sufficient for the manufacture of vaccine preparations for the specific prevention of HFRS.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Задачей настоящего изобретения является создание эффективной и безопасной трехвалентная вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вызванной ортохантавирусами ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, циркулирующими на территории Евразии. Указанная задача решается при помощи способа получения вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающего по меньшей мере следующие стадии: а) репродуцируют в перевиваемой культуре клеток линии Vero штаммы ортохантавирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, вызывающих геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, при этом данные штаммы адаптированы к размножению в перевиваемой культуре клеток линии Vero; б) отбирают вируссодержащую культуральную жидкость и производят осветляющую фильтрацию на фильтрах с размером пор 0,6 мкм для удаления клеточного детрита; в) производят концентрацию полученного после фильтрации материала, содержащего вирусные частицы; г) производят очистку концентрата, содержащего вирусные частицы и вирусные белки, от балластных клеточных компонентов и компонентов питательной среды; д) производят инактивацию репродуцированных вирусных частиц; е) предпочтительно, проводят стерилизующую фильтрацию на фильтрах с порами 0,22 мкм.The objective of the present invention is to create an effective and safe trivalent vaccine for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome caused by PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN orthohantaviruses circulating in Eurasia. This problem is solved using a method for obtaining a vaccine for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome, which includes at least the following stages: the strains are adapted for propagation in a transplanted cell culture of the Vero line; b) a virus-containing culture liquid is taken and a clarifying filtration is performed on filters with a pore size of 0.6 μm to remove cellular debris; c) produce a concentration obtained after filtration of the material containing viral particles; d) the concentrate containing viral particles and viral proteins is purified from ballast cellular components and components of the nutrient medium; e) produce inactivation of the reproduced viral particles; e) preferably, sterilizing filtration is carried out on filters with pores of 0.22 μm.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что используются либо штаммы вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, депонированные в Государственной коллекции вирусов под номерами №1026, №1283 и №1282, соответственно, либо производные этих штаммов.In some embodiments of the invention, this method is characterized by the fact that either PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN virus strains deposited in the State Virus Collection under numbers No. 1026, No. 1283 and No. 1282, respectively, or derivatives of these strains are used.

В предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что вирусы репродуцируют в перевиваемой культуре клеток линии Vero без добавления сыворотки крупного рогатого скота.In preferred embodiments of the invention, this method is characterized by the fact that the viruses are reproduced in a continuous culture of cells of the Vero line without the addition of bovine serum.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии б) вируссодержащую культуральную жидкость отбирают пять раз с одного монослоя клеток линии Vero и отобранные жидкости объединяют перед осветляющей фильтрацией. В других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии в) производят ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, используя систему концентрирования с пределом отсечения 100 кДа. В некоторых других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии г) очистку концентрата производят при помощи гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. В некоторых других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии д) инактивацию вирусных частиц производят раствором бетапропиолактона в концентрации 1:4000 при температуре (6±2)°С в течение 2 ч.In some embodiments of the invention, this method is characterized in that in step b) the virus-containing culture fluid is taken five times from one monolayer of Vero cells and the collected fluids are combined before clarifying filtration. In other embodiments of the invention, this method is characterized in that in step c) tangential flow ultrafiltration is performed using a concentration system with a cut-off of 100 kDa. In some other embodiments of the invention, this method is characterized in that at stage d) the purification of the concentrate is carried out using gel filtration and ion exchange chromatography. In some other embodiments of the invention, this method is characterized by the fact that at stage e) the inactivation of viral particles is carried out with a solution of betapropiolactone at a concentration of 1:4000 at a temperature of (6 ± 2) ° C for 2 hours.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что после инактивации вирусных частиц дополнительно проводят их сорбцию на гидроокись алюминия.In some embodiments of the invention, this method is characterized by the fact that after the inactivation of viral particles, they are additionally sorbed on aluminum hydroxide.

Указанная задача также решается путем получения комбинированной трехвалентной, концентрированной, инактивированной и очищенной вакцины, содержащей вирионы штаммов ортохантавирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, согласно описанному выше способу.This problem is also solved by obtaining a combined trivalent, concentrated, inactivated and purified vaccine containing virions of strains of orthohantaviruses PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN, for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome, according to the method described above.

- 2 040093- 2 040093

В предпочтительных вариантах изобретения данная вакцина характеризуется тем, что дополнительно содержит один или несколько компонентов, выбранных из следующего списка: фосфатный буфер, альбумин человека, сорбитол, желатоза, L-цистеин, L-тирозин, L-глутамин.In preferred embodiments of the invention, this vaccine is characterized in that it additionally contains one or more components selected from the following list: phosphate buffer, human albumin, sorbitol, gelatose, L-cysteine, L-tyrosine, L-glutamine.

В предпочтительных вариантах изобретения отличительными признаками заявляемого способа являются: репродуцирование хантавирусов в перевиваемой культуре клеток Vero без добавления сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (что улучшает показатели безопасности конечной вакцины), пятикратный сбор вируссодержащей жидкости с одного монослоя клеток (улучшает эффективность процесса получения вакцины), осветление вирус-содержащей жидкости от клеточного детрита на фильтрах с размером пор 0,6 мкм, концентрирование на ультрафильтрационных кассетах в 100-200 раз, хроматографическая очистка на колонках с Сефарозой 6 ФФ, инактивация бетапропиолактоном и стерилизующая фильтрация на фильтрах с порами 0,22 мкм.In the preferred embodiments of the invention, the distinguishing features of the proposed method are: reproduction of hantaviruses in a continuous culture of Vero cells without the addition of bovine embryonic serum (which improves the safety of the final vaccine), five-fold collection of virus-containing fluid from one cell monolayer (improves the efficiency of the vaccine production process), clarification virus-containing liquid from cellular detritus on filters with a pore size of 0.6 μm, concentration on ultrafiltration cassettes by 100-200 times, chromatographic purification on columns with Sepharose 6 FF, inactivation with betapropiolactone and sterilizing filtration on filters with pores of 0.22 μm.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение впервые в мире трехвалентной, концентрированной, инактивированной, очищенной вакцины против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН для эффективной специфической профилактики ГЛПС.The technical result of the present invention is to obtain for the first time in the world a trivalent, concentrated, inactivated, purified vaccine against PUUMALA, DOBRAVA and HANTAAN viruses for effective specific prevention of HFRS.

Подробное раскрытие изобретенияDetailed disclosure of the invention

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе. В описании данного изобретения термины включает и включающий интерпретируются как означающие включает, помимо всего прочего. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как состоит только из.Unless otherwise defined, the technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature. In the description of this invention, the terms includes and including are interpreted as meaning includes, among other things. These terms are not intended to be construed as consisting solely of.

Термин антиген обозначает любое вещество, которое организм субъекта рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм может индуцировать (запускать) иммунный ответ. Это могут быть цельные вирионы, сохранившие, хотя бы частично, присущую им структуру, а также компоненты инфекционного агента, такие как, например, белковые фрагменты вируса.The term antigen refers to any substance that the subject's body considers foreign or potentially dangerous and against which the body can induce (trigger) an immune response. These can be whole virions that have retained, at least partially, their inherent structure, as well as components of the infectious agent, such as, for example, protein fragments of the virus.

Термин производные для штаммов вирусов, депонированных в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России) под номерами №1026, №1283 и №1282, обозначает вирусы, полученные из исходных вирусов, депонированных под данными номерами, имеющие схожие характеристики репликации, но отличающиеся в одной или нескольких областях генома. Под характеристиками репликации следует понимать способность и скорость размножения в культуре клеток почек зелёной мартышки Vero. Культура клеток почек африканской зеленой мартышки линии Vero была получена из эпителия почки, взятой у африканской зеленой мартышки (Chlorocebus aethiops).The term derivatives for strains of viruses deposited in the State Collection of Viruses (Institute of Virology named after D.I. Ivanovsky of the Federal State Budgetary Institution National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of Russia) under numbers No. 1026, No. 1283 and No. 1282, denotes viruses obtained from the original viruses deposited under given numbers that have similar replication characteristics but differ in one or more regions of the genome. Under the characteristics of replication, one should understand the ability and rate of reproduction in the cell culture of the kidneys of the green monkey Vero. The Vero African green monkey kidney cell culture was obtained from the epithelium of the kidney taken from the African green monkey (Chlorocebus aethiops).

Под клеточным детритом понимают структурные компоненты клеток Vero (клеточный дебрис, апоптотические структуры и др), образующиеся в культуральной среде в процессе репродуцирования вирусных штаммов.Cellular debris is understood as the structural components of Vero cells (cellular debris, apoptotic structures, etc.) formed in the culture medium during the reproduction of viral strains.

Известно, что трудности, связанные с разработкой вакцинных препаратов против вирусов ПУУМАЛА и ДОБРАВА, обусловлены особенностями репродукции штаммов этих вирусов в чувствительных клеточных системах. Для них характерен довольно длительный цикл размножения, низкий уровень продукции и отсутствие цитопатогенного действия.It is known that the difficulties associated with the development of vaccine preparations against the PUUMALA and DOBRAVA viruses are due to the peculiarities of the reproduction of strains of these viruses in sensitive cell systems. They are characterized by a rather long reproduction cycle, a low level of production, and the absence of a cytopathogenic effect.

Процесс получения вакцины включает репродуцирование вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего субстрата, концентрирование, хроматографическую очистку, инактивирование, а также, при необходимости, сорбцию очищенного вируса на гидроокиси алюминия. Различные технические средства, используемые для концентрирования, хроматографической очистки, инактивирования или сорбции антиген-содержащего материала известны специалистам в области получения вакцин и могут отличаться от средств, раскрытых в указанных ниже примерах, приведенных в качестве демонстрации возможности осуществления изобретения.The process of obtaining a vaccine includes reproduction of the virus in cell culture, collection of the virus-containing substrate, concentration, chromatographic purification, inactivation, and, if necessary, sorption of the purified virus on aluminum hydroxide. The various techniques used to concentrate, chromatographically purify, inactivate or adsorb antigen-containing material are known to those skilled in the art of vaccine production and may differ from those disclosed in the following examples, given as a demonstration of the possibility of carrying out the invention.

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Для получения вируссодержащего субстрата используют линию перевиваемых клеток почек зеленой мартышки Vero, аттестованную в качестве субстрата для производства инактивированных вакцин (Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. Edited by A. Doyle, J.Brayan Griffiths. 1999; Cell substrates for the production of viral vaccines. F. Aubrit, F. Perugi, A. Leon, F.Guehenneux, P. Champion-Arnaud, M. Lahmar, K. Schwamborn. Vaccine. 2015; 33(44):5905-12). Накопление культурыпродуцента достигают путем серийных пассажей культуры клеток, восстановленной из банка посевных клеток. Культуру клеток для заражения вирусами выращивают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. Для заражения клеток используются штаммы ПУУ-ТКД/VERO, ДОБ-СОЧИ/VERO и XTH-P-88/VERO вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН, депонированные в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) под номерами №1026, №1283 и №1282, соответственно. Заражение проводят на 3-4 сутки после рассева клеток, сформировавших монослой, без признаков дегенерации и контаминации посторонней микрофлорой. Перед заражением клетки дважды отмывают рабочим раствором Хенкса, после чего в бутыли вносят пул вируса, предварительно разведённого средой Игла 2МЕМ до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 фокусобразующихThe following examples of the implementation of the method are given in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. To obtain a virus-containing substrate, a line of continuous green monkey kidney cells Vero, certified as a substrate for the production of inactivated vaccines, is used (Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. Edited by A. Doyle, J. Brayan Griffiths. 1999; Cell substrates for the production of viral vaccines F. Aubrit, F. Perugi, A. Leon, F. Guehenneux, P. Champion-Arnaud, M. Lahmar, K. Schwamborn Vaccine 2015; 33(44):5905-12). Accumulation of the producer culture is achieved by serial passages of the cell culture recovered from the seed cell bank. Cell culture for virus infection is grown in 1 liter roller bottles in Eagle's MEM medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% fetal bovine serum. The PUU-TKD/VERO, DOB-SOCHI/VERO and XTH-P-88/VERO strains of the PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN viruses deposited in the State Collection of Viruses (D.I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Russian Academy of Medical Sciences) are used to infect cells. No. 1026, No. 1283 and No. 1282, respectively. Infection is carried out 3-4 days after seeding of cells that have formed a monolayer, without signs of degeneration and contamination by foreign microflora. Before infection, the cells are washed twice with Hank's working solution, after which a pool of virus is added to the bottles, previously diluted with Eagle's 2MEM medium to a concentration that provides a multiplicity of infection of 0.1-0.5 focus-forming

- 3 040093 единиц (ФОЕ)/кл при объёме инокулята 15 мл на 1-литровую роллерную бутыль. Для адсорбции вируса на клетки, зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 ч при температуре (37±1) °С. По истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей рост клеток среды Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов (без добавления сыворотки крови плодов коров) и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±1) °С. Сбор вируссодержащего материала проводят на 5,6,7,8, 9 сутки после заражения и с одного монослоя клеток получают до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Сведению подлежат сборы только вируссодержащих культуральных жидкостей, в которых инфекционный титр вируса составляет не менее 5,2 Ig ФОЕ/мл.- 3,040,093 units (FFU)/cell with an inoculum volume of 15 ml per 1 liter roller bottle. For adsorption of the virus on the cells, the infected bottles are placed in a roller installation and incubated for 1 hour at a temperature of (37 ± 1) °C. After the specified time has elapsed, 100 ml of MEM Needle cell growth-supporting medium with a double content of amino acids and vitamins (without the addition of fetal bovine blood serum) is added to each bottle and placed again in a roller installation in a thermostatic room with a temperature of (37 ± 1) °C. The collection of virus-containing material is carried out on days 5,6,7,8, 9 after infection, and up to 5 collections of virus-containing liquid are obtained from one monolayer of cells. Only collections of virus-containing culture liquids in which the infectious titer of the virus is at least 5.2 Ig FFU / ml are subject to information.

Объединённый сбор (вируссодержащая культуральная жидкость) подвергают осветляющей фильтрации используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размером пор 0.6 мкм.The pooled harvest (virus-containing culture fluid) was subjected to clarifying filtration using a Poly Pro XL (CUNO) filter with a pore size of 0.6 µm.

Далее проводят концентрирование вируссодержащей жидкости путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке, используя систему концентрирования с пределом отсечения 100 кДа. Возможно использование других способов ультрафильтрации. Процесс ультрафильтрации ведут до уменьшения первоначального объёма вируссодержащей культуральной жидкости в 100-200 раз.Next, the virus-containing liquid is concentrated by ultrafiltration in a tangential flow using a concentration system with a cut-off of 100 kDa. It is possible to use other methods of ultrafiltration. The ultrafiltration process is carried out until the initial volume of the virus-containing culture liquid is reduced by 100-200 times.

На этапе очистки концентрата вируса, содержащего вирусные частицы и вирусные белки, балластные компоненты удаляют с помощью гель-фильтрации с использованием Sepharose 6 FF и хроматографа АКТА purifier (GE Healthcare). Под балластными компонентами понимают балластные клеточные компоненты (фрагменты клеточных белков, фрагменты мембран, белки, РНК и ДНК клеток и др), а также компоненты питательной среды, в которой растут клетки.During the purification step of the virus concentrate containing viral particles and viral proteins, the bulk components are removed by gel filtration using Sepharose 6 FF and an AKTA purifier chromatograph (GE Healthcare). Ballast components are ballast cellular components (fragments of cellular proteins, fragments of membranes, proteins, RNA and DNA of cells, etc.), as well as components of the nutrient medium in which cells grow.

Для оптимизации процессов, осуществляемых на каждом из этих этапов, предварительно определяют параметры взаимодействия вируса с разными пористыми сорбентами. Выбирают гельфильтрационную схему очистки вируса, приводящую к получению высокоактивных препаратов, удовлетворяющих требованиям к чистоте конечного продукта.To optimize the processes carried out at each of these stages, the parameters of the interaction of the virus with different porous sorbents are preliminarily determined. A gel filtration scheme for virus purification is chosen, resulting in highly active preparations that meet the requirements for the purity of the final product.

Очищенный вирус в виде вируссодержащей жидкости (пул фракций после хроматографической очистки, каждый ортохантавирус в отдельности) подвергают инактивированию бетапропиолактоном (βПЛ). Бетапропиолактон перед внесением в бутыль с вируссодержащей жидкостью разводят 1:10 в дистиллированной воде, перемешивая на магнитной мешалке или вручную. Раствор β-ПЛ в концентрации 1:10 вносят в бутыль с очищенным вирусом до конечной концентрации 1:4000; смесь перемешивается на магнитной мешалке. Процесс инактивации длится 2 ч при температуре (6±2) °С. Вируссодержащую жидкость после добавления бетапропиолактона, подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану Millipore с диаметром пор 0,22 мкм. В некоторых вариантах полуфабрикаты моновалентных вакцин против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН разводят 10-кратным раствором среды 199 в соответствии с их антигенной активностью, добавляют в качестве стабилизатора 1,0 мг/мл альбумина человека (донорский для внутривенного капельного введения). Среда 199 с солями Хенкса, с глутамином представляет собой растворённую в очищенной воде смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы и фенолового красного, простерилизованную через фильтры с размером пор 0,1 мкм (ПанЭко). В готовый вариант вакцины могут быть добавлены один или несколько компонентов, выбранных из следующего списка: фосфатный буфер (соли буферной системы: натрия хлорид (Eur.Ph.) - 4 мг; калия хлорид (Eur.Ph.) - 0,1 мг), натрия фосфат (Eur.Ph.) - 0,71 мг; калия фосфат (Eur.Ph.) - 0,12 мг.), альбумин человека, сорбитол, желатоза, аминокислоты (L-цистеин, L-тирозин, L-глутамин). Фосфатный буфер используют в качестве растворителя, альбумин человека - в качестве стабилизатора, среда 199 - в качестве стабилизатора, аминокислоты - в качестве стабилизатора, сорбитол и желатоза - в качестве стабилизатора.The purified virus in the form of a virus-containing liquid (a pool of fractions after chromatographic purification, each orthohantavirus separately) is subjected to inactivation with betapropiolactone (βPL). Betapropiolactone is diluted 1:10 in distilled water before being introduced into a bottle with a virus-containing liquid, stirring on a magnetic stirrer or manually. A solution of β-PL at a concentration of 1:10 is added to a bottle with purified virus to a final concentration of 1:4000; the mixture is stirred on a magnetic stirrer. The inactivation process lasts 2 hours at a temperature of (6 ± 2) °C. The virus-containing liquid after addition of betapropiolactone is subjected to sterilizing filtration through a Millipore membrane with a pore diameter of 0.22 μm. In some embodiments, semi-finished products of monovalent vaccines against PUUMALA, DOBRAVA and HANTAAN viruses are diluted with a 10-fold solution of medium 199 in accordance with their antigenic activity, 1.0 mg/ml of human albumin (donor for intravenous drip) is added as a stabilizer. Medium 199 with Hank's salts, with glutamine is a mixture of inorganic salts, amino acids, vitamins, glucose and phenol red dissolved in purified water, sterilized through filters with a pore size of 0.1 μm (PanEco). One or more components selected from the following list can be added to the finished version of the vaccine: phosphate buffer (salts of the buffer system: sodium chloride (Eur.Ph.) - 4 mg; potassium chloride (Eur.Ph.) - 0.1 mg) , sodium phosphate (Eur.Ph.) - 0.71 mg; potassium phosphate (Eur.Ph.) - 0.12 mg.), human albumin, sorbitol, gelatose, amino acids (L-cysteine, L-tyrosine, L-glutamine). Phosphate buffer is used as a solvent, human albumin as a stabilizer, medium 199 as a stabilizer, amino acids as a stabilizer, sorbitol and gelatose as a stabilizer.

Для приготовления трехвалентной вакцины против этих вирусов определяют антигенную активность моновалентных вакцинных полуфабрикатов и рассчитывают их рабочие дозы (РД). В соответствии с предварительно установленным соотношением зависимости между количеством содержащегося в вакцине специфического антигена и её иммуногенной активностью минимальная иммунизирующая доза (МИД), то есть максимальное разведение исходного препарата, обеспечивающее продукцию вируснейтрализующих антител у 50% мышей BALB/c, соответствует 8 антигенным единицам (АЕ). Разведение исходного препарата, содержащего 4 МИД или 32 АЕ, принимают за 1 рабочую дозу (РД) моновалентной вакцины. После сведения равных объёмов моновалентных препаратов в разведениях, содержащих по 1 РД для каждой из моновакцин, и добавления адсорбента-гидроокиси алюминия (конечная концентрация 1,5±0,5 мг/мл) получают готовую комбинированную (трехвалентную) вакцину против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН.To prepare a trivalent vaccine against these viruses, the antigenic activity of monovalent vaccine semi-finished products is determined and their working doses (RD) are calculated. In accordance with the previously established relationship between the amount of specific antigen contained in the vaccine and its immunogenic activity, the minimum immunizing dose (MID), that is, the maximum dilution of the parent drug that ensures the production of virus-neutralizing antibodies in 50% of BALB/c mice, corresponds to 8 antigenic units (AU ). The dilution of the original preparation containing 4 MID or 32 AU is taken as 1 working dose (RD) of a monovalent vaccine. After mixing equal volumes of monovalent preparations in dilutions containing 1 RD for each of the monovaccines, and adding an aluminum hydroxide adsorbent (final concentration 1.5 ± 0.5 mg / ml), a ready-made combined (trivalent) vaccine against PUUMALA, DOBRAVA viruses is obtained and HANTAAN.

Иммуногенную активность трехвалентной вакцины против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН определяют в опытах на мышах линии BALB/c по образованию вируснейтрализующих антител в ответ на введение вакцины внутримышечно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом. Следует отметить, что вируснейтрализующие антитела к хантавирусам образуются в ответ на взаимодействие организма с поверхностными белками вирусной частицы, представляющими собой комплекс гликопротеинов G1 и G2. Выявление у вакцинированных животных способности продуцировать вируснейтралиThe immunogenic activity of the trivalent vaccine against PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN viruses is determined in experiments on BALB/c mice by the formation of virus-neutralizing antibodies in response to intramuscular injection of the vaccine 3 times with a 2-week interval. It should be noted that virus-neutralizing antibodies to hantaviruses are formed in response to the interaction of the organism with the surface proteins of the viral particle, which are a complex of glycoproteins G1 and G2. Identification of the ability to produce virus neutrals in vaccinated animals

- 4 040093 зующие антитела указывает, во-первых, на сохранение полноценных структурных вирусных белков класса G1-G2 в процессе приготовления вакцины и, во-вторых, на протективную эффективность вакцины - способность защищать от заражения вирусами-возбудителями геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).- 4 040093 stinging antibodies indicates, firstly, the preservation of full-fledged structural viral proteins of the G1-G2 class during the preparation of the vaccine and, secondly, the protective efficacy of the vaccine - the ability to protect against infection with viruses that cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS ).

Для определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных мышей используют следующий метод. Сыворотки в 2-х кратных разведениях смешивают с 50-100 ФОЕ вируса ПУУМАЛА, вируса ДОБРАВА и вируса ХАНТААН (в параллельных опытах) и инкубируют при (6±2) °С в течение 18-20 ч. На монослой клеток Vero-E6, выращенных в 24 луночных панелях (Costar), вносят по 0,2 мл вирус-сывороточной смеси и инкубируют при (37±1)°С в течение 1 ч. Затем добавляют метилцеллюлозное покрытие и через 6-7 дней инкубации при (37±1)°С монослой фиксируют абсолютным спиртом. Образовавшиеся в культуре клеток фокусы выявляют с помощью твердофазного иммуноферментного метода, используя специфические анти-хантавирусные сыворотки и меченный пероксидазой белок А. В качестве индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl₂ и 0,01% Н₂О₂, после чего через 15-20 мин проводят учёт опыта. Титр вируснейтрализующих антител определяют по 50% подавлению числа фокусобразующих единиц (ФОЕ).The following method is used to determine virus-neutralizing antibodies in the blood sera of immunized mice. Sera in 2-fold dilutions are mixed with 50-100 FFU of the PUUMALA virus, the DOBRAVA virus and the HANTAAN virus (in parallel experiments) and incubated at (6 ± 2) ° C for 18-20 hours. On a monolayer of Vero-E6 cells, grown in 24 well panels (Costar), add 0.2 ml of the virus-serum mixture and incubate at (37 ± 1) ° C for 1 hour. Then add methylcellulose coating and after 6-7 days of incubation at (37 ± 1 )°С, the monolayer is fixed with absolute alcohol. Foci formed in cell culture are detected using enzyme-linked immunosorbent assay using specific anti-hantavirus sera and protein A labeled with peroxidase. 0.05% diaminobenzidine tetrachloride with the addition of 0.02% NiCl ₂ and 0.01% H ₂ is used as an indicator system. About ₂ , after which, after 15-20 minutes, the experience is recorded. The titer of virus-neutralizing antibodies is determined by 50% suppression of the number of focus-forming units (FFU).

Для выявления в исследуемых образцах вакцины антигенов вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН поверхностного протективного (ПВА) и капсидного (КВА), который обеспечивает протективный Т-клеточный иммунитет, применяют вариант непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител, приготовленных к эпитопам гликопротеинового комплекса хантавируса (моноклон G10 - субтип мышиных иммуноглобулинов IgG2a) и эпитопам капсидного белка (моноклоны А4 и F1 субтип мышиных иммуноглобулинов IgGia), перекрестно реагирующими со всеми тремя вирусами. Методика постановки ИФА заключается в следующем: в лунки панели Costar вносят по 100 мкл моноклона G10 (или F1) в концентрации 4 мкг/мл. В качестве контроля используют мышиные иммуноглобулины класса G, не содержащие специфических антител к хантавирусам (по 100 мкл в контрольные лунки). Панели выдерживают 18 ч при 6±2 °С, после чего в лунки добавляют по 100 мкл 2% БСА и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки промывают 5 раз по 2 мин раствором 0,01 М PBS + 0,05% Tween-20 с помощью отмывочного аппарата Washer Bio-Rad и вносят по 50 мкл образцов исследуемых антигенов, разведённых (начиная с 1:2) в ИФА-буфере (PBS + 0,1% BSA + 0,01% Твин-20). После инкубирования панелей в течение 1 ч при температуре 37±1°С лунки промывают 5 раз по 5 мин и вносят в них по 50 мкл пероксидазного конъюгата в рабочем разведении, приготовленном на ИФА-буфере. После инкубирования при 37±1 °С в течение 1 ч лунки 5-ти кратно промывают по 5 мин. Стандартный субстрат (5мг OPD на 12 мл цитратно-фосфатного буфера с pH 5.0 + перекись водорода до 0,05%) вносят по 100 мкл в каждую лунку и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин. Реакцию останавливают 2М серной кислотой в объеме 50 мкл. Фотометрию проводят на приборе Multiskan при длине волны 492 нм. Положительными (содержащими специфические хантавирусные антигены) считают те образцы, для которых отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышает показатель оптической плотности с нормальным иммуноглобулином в 2.1 (индекс P/N). Следует отметить, что протективный вирусный антиген ассоциирован с белками G1-G2, индуцирующими у экспериментальных животных образование вирус-нейтрализующих антител обладающих протективными свойствами.To detect antigens of the PUUMALA, DOBRAVA and HANTAAN viruses of the surface protective (PVA) and capsid (CVA) viruses, which provides protective T-cell immunity, in the studied samples of the vaccine, a variant of indirect enzyme immunoassay (ELISA) is used using monoclonal antibodies prepared for epitopes of the glycoprotein complex hantavirus (monoclone G10 - subtype of mouse IgG2a immunoglobulins) and capsid protein epitopes (monoclones A4 and F1 subtype of mouse immunoglobulins IgGia), cross-reacting with all three viruses. The ELISA procedure is as follows: 100 µl of monoclone G10 (or F1) at a concentration of 4 µg/ml is added to the wells of the Costar panel. As a control, class G mouse immunoglobulins that do not contain specific antibodies to hantaviruses are used (100 μl in control wells). The panels are incubated for 18 hours at 6±2°C, after which 100 µl of 2% BSA are added to the wells and left for 1 hour at room temperature. Then the wells are washed 5 times for 2 min with a solution of 0.01 M PBS + 0.05% Tween-20 using a Washer Bio-Rad washer and 50 μl of samples of the studied antigens diluted (starting from 1:2) in ELISA- buffer (PBS + 0.1% BSA + 0.01% Tween-20). After incubation of the panels for 1 hour at a temperature of 37±1°C, the wells are washed 5 times for 5 minutes and 50 μl of the peroxidase conjugate in a working dilution prepared in ELISA buffer is added to them. After incubation at 37 ± 1 °C for 1 hour, the wells are washed 5 times for 5 minutes. The standard substrate (5 mg OPD per 12 ml citrate-phosphate buffer pH 5.0 + hydrogen peroxide up to 0.05%) is added 100 µl to each well and incubated in the dark at room temperature for 20 minutes. The reaction is stopped with 2M sulfuric acid in a volume of 50 μl. Photometry is carried out on a Multiskan instrument at a wavelength of 492 nm. Positive (containing specific hantavirus antigens) are those samples for which the ratio of optical density in the well with specific immunoglobulin exceeds the optical density with normal immunoglobulin by 2.1 (P/N index). It should be noted that the protective viral antigen is associated with G1-G2 proteins, which induce the formation of virus-neutralizing antibodies with protective properties in experimental animals.

При серологическом исследовании сывороток крови мышей после 3-х кратной иммунизации образцами трехвалентной вакцины против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН выявляются достаточно высокие показатели вируснейтрализующих антител к этим вирусам (табл. 1, 2, 3), свидетельствующие об иммуногенной и протективной эффективности вакцины.A serological study of mouse blood sera after 3-fold immunization with samples of a trivalent vaccine against the PUUMALA, DOBRAVA, and KHANTAAN viruses revealed sufficiently high rates of virus-neutralizing antibodies to these viruses (Tables 1, 2, 3), indicating the immunogenic and protective efficacy of the vaccine.

Таблица 1. Иммуногенная и протективная активность трехвалентной вакцины по отношению __к вирусу ПУУМАЛА_____________________Table 1. Immunogenic and protective activity of the trivalent vaccine against __ PUUMALA virus _____________________

Вакцина Vaccine РН RN Разведение Breeding ПВА титр* PVA titer* Белок Protein наличие антител у мышей (полож/обслед) the presence of antibodies in mice (positive / examination) % мышей с антителами % mice with antibodies титр** titer** н/р n/r 512 512 100pg/ml 100pg/ml 8/8 8/8 100 100 145 145 1:2 1:2 256 256 50 pg/ml 50pg/ml 7/7 7/7 100 100 60 60 1:4 1:4 128 128 25 цд/т1 25 cd/t1 8/8 8/8 100 100 18,75 18.75 1:8 1:8 64 64 12 pg/ml 12pg/ml 7/8 7/8 87,5 87.5 18,75 18.75 1:16 1:16 32 32 6 pg/ml 6 pg/ml 4/8 4/8 50 50 11,25 11.25 1:32 1:32 16 16 3 цд/ml 3 cd/ml 2/8 2/8 25 25 7,5 7.5 1:64 1:64 8 8 1,5цд/т! 1.5cd/t! 1 /8 18 12,5 12.5 2,5 2.5 1:128 1:128 4 4 0,5рд/т1 0.5rd/t1 0/8 0/8 0 0 0 0 1:256 1:256 2 2 0,2рд/т1 0.2rd/t1 0/8 0/8 0 0 0 0

* обратные значения титров антигена в ИФА;* reverse values of antigen titers in ELISA;

** среднеарифметический титр вируснейтрализующих антител.** Arithmetic mean titer of virus-neutralizing antibodies.

- 5 040093- 5 040093

Таблица 2. Иммуногенная и протективная активность трехвалентной вакцины по отношению ______________________к вирусу ДОБРАВА______________________Table 2. Immunogenic and protective activity of the trivalent vaccine in relation to ______________________ against the DOBRAVA virus ______________________

Вакцина Vaccine РН RN Разведение Breeding ПВА титр* PVA titer* Белок Protein наличие антител у мышей (полож/обслед) the presence of antibodies in mice (positive / examination) % мышей с антителами % mice with antibodies титр** titer** н/р n/r 512 512 88 pg/ml 88pg/ml 8/8 8/8 100 100 150 150 1:2 1:2 256 256 44 pg/ml 44pg/ml 7/7 7/7 100 100 70 70 1:4 1:4 128 128 22 pg/ml 22pg/ml 8/8 8/8 100 100 18,5 18.5 1:8 1:8 64 64 11 pg/ml 11pg/ml 7/8 7/8 87,5 87.5 16,7 16.7 1:16 1:16 32 32 5,5 pg/ml 5.5pg/ml 5/8 5/8 62,5 62.5 12,2 12.2 1:32 1:32 16 16 2,2 pg/ml 2.2 pg/ml 4/8 4/8 50 50 6,5 6.5 1:64 1:64 8 8 1,1 pg/ml 1.1pg/ml 1/8 1/8 12,5 12.5 2,5 2.5 1:128 1:128 4 4 0,5рд/т1 0.5rd/t1 0/8 0/8 0 0 0 0 1:256 1:256 2 2 0,2рд/т! 0.2rd/t! 0/8 0/8 0 0 0 0

Таблица 3. Иммуногенная и протективная активность трехвалентной вакцины по отношению к вирусу ХАНТААНTable 3. Immunogenic and protective activity of the trivalent vaccine against the HANTAAN virus

Вакцина Vaccine PH PH Разведение Breeding ПВА титр* PVA titer* Белок Protein наличие антител у мышей (полож/обслед) the presence of antibodies in mice (positive / examination) % мышей с антителами % mice with antibodies титр** titer** н/р n/r 512 512 97 pg/ml 97pg/ml 8/8 8/8 100 100 135 135 1:2 1:2 256 256 51 pg/ml 51pg/ml 7/7 7/7 100 100 67 67 1:4 1:4 128 128 24 pg/ml 24pg/ml 8/8 8/8 100 100 21,8 21.8 1:8 1:8 64 64 17 pg/ml 17pg/ml 7/8 7/8 87,5 87.5 17,6 17.6 1:16 1:16 32 32 6 pg/ml 6 pg/ml 5/8 5/8 62,5 62.5 11,2 11.2 1:32 1:32 16 16 2,5 pg/ml 2.5pg/ml 4/8 4/8 50 50 6,8 6.8 1:64 1:64 8 8 1,3 pg/ml 1.3pg/ml 1/8 1/8 12,5 12.5 1,75 1.75 1:128 1:128 4 4 0,7pg/ml 0.7pg/ml 0/8 0/8 0 0 0 0 1:256 1:256 2 2 0,3pg/ml 0.3pg/ml 0/8 0/8 0 0 0 0

* * среднеарифметический титр вируснейтрализующих антител.* * Arithmetic mean titer of virus-neutralizing antibodies.

Согласно требованиям ВОЗ в вакцинах, изготовленных на основе перевиваемых клеточных культур, жестко лимитируется содержание остаточной ДНК: оно не должно превышать 10 пг на 1 дозу вакцины для исключения потенциальной возможности её онкогенного и трансформирующего действия. Существуют ограничения по содержанию в конечном продукте таких гетерологичных белков, как белки сыворотки крови крупного рогатого скота.According to the WHO requirements, the content of residual DNA in vaccines made on the basis of transplanted cell cultures is strictly limited: it should not exceed 10 pg per 1 dose of the vaccine to exclude the potential possibility of its oncogenic and transforming effect. There are restrictions on the content of heterologous proteins such as bovine serum proteins in the final product.

Соответствие национальным и международным требованиям к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям, достигается тем, что заявленный способ предусматривает заражение вирусами-возбудителями ГЛПС культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его концентрированием, очисткой, инактивированием и сорбцией на гидроокиси алюминия (гидроокись алюминия - ALUM - применяют в качестве адъюванта). На стадии репродукции вируса используется культуральная среда без добавления сыворотки крупного рогатого скота. Специфическая безопасность (отсутствие живого вируса), бактериологическая стерильность вакцины достигаются использованием режима инактивации вируса β-ПЛ и фильтрацией через пакет фильтров с конечным размером пор 0,22 мкм. Отсутствие туморогенности обеспечено за счет резкого снижения на стадии гельфильтрации содержания клеточной ДНК (менее чем 10 пг в одной вакцинной дозе). Практически на всех этапах изготовления вакцины, начиная от штаммов вируса и заканчивая готовой формой вакцины, предусмотрен ряд известных и новых физико-химических и молекулярно-биологических тестов, а также контролей на животных и в культуре клеток. Эта система надёжно обеспечивает безопасность применения новой вакцины, высокий уровень и стабильность её иммунологической активности.Compliance with national and international requirements for medical immunobiological preparations administered to humans is achieved by the fact that the claimed method involves infection of cell cultures with HFRS pathogens, followed by reproduction and release of the virus into the culture medium, its concentration, purification, inactivation and sorption on aluminum hydroxide (hydroxide aluminum - ALUM - is used as an adjuvant). At the stage of virus reproduction, a culture medium is used without the addition of bovine serum. Specific safety (lack of live virus), bacteriological sterility of the vaccine is achieved using the β-PL virus inactivation mode and filtration through a filter package with a final pore size of 0.22 μm. The absence of tumorigenicity is ensured by a sharp decrease in the content of cellular DNA at the stage of gel filtration (less than 10 pg in one vaccine dose). Practically at all stages of vaccine manufacture, from virus strains to the finished form of the vaccine, a number of well-known and new physicochemical and molecular biological tests, as well as controls on animals and in cell culture, are provided. This system reliably ensures the safety of the new vaccine, the high level and stability of its immunological activity.

Ниже изложены примеры получения вакцины по настоящему изобретению.The following are examples of obtaining a vaccine according to the present invention.

Пример 1.Example 1

Вируссодержащую культуральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ПУУТКД/VERO вируса ПУУМАЛА в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 Ig ФОЕ/мл осветляют, используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размером пор 0.6 мкм. Далее проводят концентрирование вируссодержащей жидкости с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Да и концентрируют в 100-200 раз. КонцентратThe virus-containing culture fluid is obtained by reproducing the PUUTKD/VERO strain of the PUUMALA virus in a monolayer continuous culture of green monkey kidney (VERO) cells. The cell monolayer is obtained in 1 liter roller bottles in Eagle's MEM medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% fetal bovine serum. After infection of monolayer cultures, a medium containing no serum components is used to support viral propagation. The collection of virus-containing fluid begins on the 6th day. From one monolayer of cells, from 3 to 5 collections of virus-containing liquid are obtained. The obtained virus-containing liquid with an average titer of 5.5 Ig FFU/ml is clarified using a Poly Pro XL (CUNO) filter with a pore size of 0.6 μm. Next, the virus-containing liquid is concentrated using ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of permeable particles of 100,000 Da and concentrated by 100-200 times. Concentrate

- 6 040093 очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Инактивируют бетапропиолактоном в концентрации 1:4000 при температуре (6±2)°С в течение 2 ч. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 100±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.- 6 040093 is purified on a 2.6/70 Sepharose 6 Fast Flow column at a rate of 7 ml/min. Inactivate betapropiolactone at a concentration of 1:4000 at a temperature of (6 ± 2) ° C for 2 hours. The concentration of total protein in the purified concentrate is 100 ± 50 μg / ml. The purified inactivated concentrate is filtered through a 0.22 µm sterilizing filter and used to prepare a monovalent vaccine adsorbed on aluminum hydroxide.

При серологическом исследовании сывороток крови мышей после 3-х кратной иммунизации образцами моновалентной вакцины против вируса Пуумала выявляются достаточно высокие показатели вируснейтрализующих антител к этому вирусу, свидетельствующие о протективной эффективности вакцины.In a serological study of blood sera of mice after 3-fold immunization with samples of a monovalent vaccine against the Puumala virus, sufficiently high levels of virus-neutralizing antibodies to this virus are detected, indicating the protective efficacy of the vaccine.

Пример 2.Example 2

Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ДОБEAT/VERO вируса ДОБРАВА в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 Ig ФОЕ/мл осветляют используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размером пор 0.6 мкм. Далее проводят концентрирование вируссодержащей жидкости с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Да и концентрируют в 100-200 раз. Концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Инактивируют бетапропиолактоном в концентрации 1:4000 при температуре 6±2°С в течение 2 ч. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 100±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.The virus-containing culture fluid is obtained by reproducing the DOBEAT/VERO strain of the DOBRAVA virus in a monolayer continuous culture of green monkey kidney cells (Vero). The cell monolayer is obtained in 1 liter roller bottles in Eagle's MEM medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% fetal bovine serum. After infection of monolayer cultures, a medium containing no serum components is used to support viral propagation. The collection of vaccinated fluid begins on the 6th day. From one monolayer of cells, from 3 to 5 collections of virus-containing liquid are obtained. The obtained virus-containing liquid with an average titer of 5.5 Ig FFU/ml was clarified using a Poly Pro XL (CUNO) filter with a pore size of 0.6 μm. Next, the virus-containing liquid is concentrated using ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of permeable particles of 100,000 Da and concentrated by 100-200 times. The concentrate was purified on a 2.6/70 Sepharose 6 Fast Flow column at 7 ml/min. Inactivate with betapropiolactone at a concentration of 1:4000 at a temperature of 6±2°C for 2 hours. The concentration of total protein in the purified concentrate is 100±50 μg/ml. The purified inactivated concentrate is filtered through a 0.22 µm filter and used to prepare a monovalent vaccine adsorbed on aluminum hydroxide.

При серологическом исследовании сывороток крови мышей после 3-х кратной иммунизации образцами моновалентной вакцины против вируса Добрава выявляются достаточно высокие показатели вируснейтрализующих антител к этому вирусу, свидетельствующие о протективной эффективности вакцины.A serological study of blood sera of mice after 3-fold immunization with samples of a monovalent vaccine against the Dobrava virus revealed sufficiently high levels of virus-neutralizing antibodies to this virus, indicating the protective efficacy of the vaccine.

Пример 3.Example 3

Вируссодержащую культуральную жидкость получают путем репродуцирования штамма XTH-P88/VERO вируса ХАНТААН в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 Ig ФОЕ/мл осветляют, используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размером пор 0.6 мкм. Далее проводят концентрирование вируссодержащей жидкости с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Да и концентрируют в 100-200 раз. Концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Инактивируют бетапропиолактоном в концентрации 1:4000 при температуре 6±2 °С в течение 2 ч. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 100±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.The virus-containing culture fluid is obtained by reproducing the XTH-P88/VERO strain of the HANTAAN virus in a monolayer continuous green monkey kidney (VERO) cell culture. The cell monolayer is obtained in 1 liter roller bottles in Eagle's MEM medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% fetal bovine serum. After infection of monolayer cultures, a medium containing no serum components is used to support viral propagation. The collection of vaccinated fluid begins on the 6th day. From one monolayer of cells, from 3 to 5 collections of virus-containing liquid are obtained. The resulting vaccinated liquid with an average titer of 5.5 Ig FFU/ml was clarified using a Poly Pro XL (CUNO) filter with a pore size of 0.6 μm. Next, the virus-containing liquid is concentrated using ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of permeable particles of 100,000 Da and concentrated by 100-200 times. The concentrate was purified on a 2.6/70 Sepharose 6 Fast Flow column at 7 ml/min. Inactivate with betapropiolactone at a concentration of 1:4000 at a temperature of 6 ± 2 ° C for 2 hours. The concentration of total protein in the purified concentrate is 100 ± 50 μg / ml. The purified inactivated concentrate is filtered through a 0.22 µm filter and used to prepare a monovalent vaccine adsorbed on aluminum hydroxide.

При серологическом исследовании сывороток крови мышей после 3-х кратной иммунизации образцами моновалентной вакцины против вируса Хантаан выявляются достаточно высокие показатели вируснейтрализующих антител к этому вирусу, свидетельствующие о протективной эффективности вакцины.Serological examination of blood sera of mice after 3-fold immunization with samples of a monovalent vaccine against the Hantaan virus revealed sufficiently high levels of virus-neutralizing antibodies to this virus, indicating the protective efficacy of the vaccine.

Пример 4.Example 4

После сведения (до адсорбции на гидроокиси алюминия) равных объёмов моновалентных препаратов в разведениях, содержащих по 1 РД для каждой из моновакцин, и добавления адсорбента-гидроокиси алюминия (конечная концентрация 1,5±0,5 мг/мл) получают готовую комбинированную (трехвалентную) вакцину против вирусов ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН. Специфическую активность (иммуногенность) трехвалентной вакцины проверяют на мышах. Адсобрированный на поверхности гидроокиси алюминия концентрат вводят мышам линии BALB/c 10-12 недельного возраста, весом 18-20 г в объёме 0,5 мл внутримышечно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом. В качестве контроля используют мышей BALB/c, которым в те же сроки вводят гидроокись алюминия без вирусного антигена. Через 2 недели после последней иммунизации у животных берут из орбитальной вены кровь и готовят из неё сыворотку. В полученных сыворотках крови определяют титры вирусспецифических антител. На 28 день после первой иммунизации мышей BALB/c выявляются вируснейтрализующие антитела к вирусамAfter mixing (before adsorption on aluminum hydroxide) equal volumes of monovalent preparations in dilutions containing 1 RD for each of the monovaccines, and adding an adsorbent-aluminum hydroxide (final concentration 1.5 ± 0.5 mg / ml), a ready-made combined (trivalent ) vaccine against PUUMALA, DOBRAVA and HANTAAN viruses. The specific activity (immunogenicity) of the trivalent vaccine is tested in mice. The concentrate adsorbed on the surface of aluminum hydroxide is administered to BALB/c mice 10-12 weeks old, weighing 18-20 g in a volume of 0.5 ml intramuscularly 3 times with a 2-week interval. As a control, BALB/c mice are used, which are injected with aluminum hydroxide without viral antigen at the same time. Two weeks after the last immunization, blood is taken from the orbital vein of the animals and serum is prepared from it. In the obtained blood sera, the titers of virus-specific antibodies are determined. On the 28th day after the first immunization of BALB/c mice, virus-neutralizing antibodies to viruses are detected.

- 7 040093- 7 040093

ПУУМАЛА, ДОБРАВА и ХАНТААН (табл. 1, 2, 3), свидетельствующие о высокой иммуногенной и протективной эффективности трехвалентной вакцины.PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN (Tables 1, 2, 3), indicating a high immunogenic and protective efficacy of the trivalent vaccine.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.While the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific instances described in detail are for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be clear that various modifications are possible without departing from the essence of the present invention.

Claims

CLAIM

1. A method for producing a vaccine for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome, comprising at least the following steps:

a) strains of orthohantaviruses PUUMALA, DOBRAVA and HANTAAN, causing hemorrhagic fever with renal syndrome, are reproduced in a continuous culture of Vero cells, while these strains are adapted for reproduction in a continuous culture of Vero cells;

b) the virus-containing culture liquid is taken and its clarifying filtration is performed to remove cellular detritus;

c) concentrate the virus-containing material obtained after filtration;

d) the concentrate containing virions and viral proteins is purified from ballast cellular components and components of the nutrient medium;

e) produce inactivation of the reproduced viral particles.

2. The method according to claim 1, characterized in that either PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN virus strains deposited in the State Virus Collection under numbers No. 1026, No. 1283 and No. 1282, respectively, or derivatives of these strains are used.

3. The method according to claim 2, characterized in that the viruses are reproduced in a continuous cell culture of the Vero line without the addition of bovine serum.

4. The method according to claim 3, characterized in that in step b) the virus-containing culture liquid is taken five times from one monolayer of Vero cells and the collected liquids are combined before clarifying filtration.

5. The method according to claim 3, characterized in that in step c) the concentration is carried out by means of ultrafiltration in a tangential flow, using a concentration system with a cut-off of 100 kDa.

6. The method according to claim 3, characterized in that at stage d) the purification of the concentrate is carried out using gel filtration and ion exchange chromatography.

7. The method according to claim 3, characterized in that at stage e) the inactivation of viral particles is carried out with a solution of betapropiolactone at a concentration of 1:4000 at a temperature of (6 ± 2) ° C for 2 hours.

8. The method according to claim 3, characterized in that after the inactivation of viral particles, they are additionally sorbed onto aluminum hydroxide.

9. Combined trivalent, concentrated, inactivated and purified vaccine containing antigens of strains of orthohantaviruses PUUMALA, DOBRAVA and KHANTAAN, for the prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome, obtained according to any one of claims 1-8.

10. The vaccine according to claim 10, characterized in that it additionally contains one or more components selected from the following list: phosphate buffer, human albumin, sorbitol, gelatose, L-cysteine, L-tyrosine, L-glutamine.