RU2057761C1

RU2057761C1 - Method for production of water-soluble oligomers

Info

Publication number: RU2057761C1
Application number: RU93021006/04A
Authority: RU
Inventors: В.И. Максимов; Ю.В. Смирнова; Д.В. Зашихина; С.Н. Савченков; В.А. Мосин
Original assignee: Акционерное общество "Биотехнология"
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1993-04-23
Publication date: 1996-04-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: chitin is used as reagent 1, sulfuric acid being used as reagent 2. Reaction is carried out within 20-120 min at 40-50 C by treatment with water, volume ratio of water and sulfuric acid being 20-25: 1. Then neutralization by calcium-containing compounds takes place. Water-soluble oligosaccharides represent desired product. EFFECT: improves efficiency of method. 2 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к получению низкомолекулярных олигосахаридов из хитина, которые могут быть использованы самостоятельно или в качестве промежуточных продуктов, отдельно или в смеси с неорганическими или органическими соединениями разного строения. Хитиновые олигосахариды находят применение в качестве биологически активных веществ в медицине, косметике, пищевой промышленности, животноводстве и растениеводстве. The invention relates to the production of low molecular weight oligosaccharides from chitin, which can be used alone or as intermediates, alone or in a mixture with inorganic or organic compounds of different structures. Chitin oligosaccharides are used as biologically active substances in medicine, cosmetics, food industry, animal husbandry and crop production.

Известны способы получения низкомолекулярных олигосахаридов из хитина действием концентрированных кислот, преимущественно относящихся к галогеноводородным кислотам, например, соляной кислоты. Под концентрированными кислотами понимают растворы кислот в воде, концентрации которых зависят от типа кислот и лежат в пределах от 20 до 100%
Прототипом предлагаемого способа является способ получения водорастворимых олигосахаридов по авторскому свидетельству СССР N 1571047, 1990. Согласно прототипу в качестве концентрированной кислоты использовали 65%-ный раствор серной кислоты в количестве 2,7-10 мл на 1 г хитина, обработку проводили при 40-50^оС в течение 20-120 мин, после чего к реакционной смеси добавляли ацетон в количестве 5-7 об. на 1 об. кислоты, осадок отделяли, растворяли в воде, центрифугировали, раствор нейтрализовали анионитом и высушивали.Known methods for producing low molecular weight oligosaccharides from chitin by the action of concentrated acids, mainly related to hydrohalic acids, for example, hydrochloric acid. Concentrated acids mean solutions of acids in water, the concentrations of which depend on the type of acids and range from 20 to 100%
The prototype of the proposed method is a method for producing water-soluble oligosaccharides according to the USSR copyright certificate N 1571047, 1990. According to the prototype, a 65% solution of sulfuric acid in an amount of 2.7-10 ml per 1 g of chitin was used as a concentrated acid, processing was carried out at 40-50 ^about C for 20-120 minutes, after which acetone was added to the reaction mixture in an amount of 5-7 vol. on 1 about. acids, the precipitate was separated, dissolved in water, centrifuged, the solution was neutralized with anion exchange resin and dried.

Недостатком этого способа является многостадийность, расход органического растворителя и использование взрывоопасного оборудования. The disadvantage of this method is the multi-stage flow rate of the organic solvent and the use of explosive equipment.

Цель упрощение процесса. The goal is a simplification of the process.

Для осуществления заявляемого способа хитин обрабатывали серной кислотой, взятой в количестве 2,7-10 мл на 1 г хитина. Количество кислоты зависит от ее концентрации, которая изменяется от 55 до 75% Температура и время реакции лежат в пределах 40-50^оС и 20-120 мин соответственно. Более высокой температуре соответствует меньшее время и наоборот. После реакции добавляют охлажденную (со льдом) воду в количестве 20-25 мл на 1 г хитина. Полученный раствор продуктов деполимеризации хитина в разбавленной серной кислоте нейтрализуют добавлением соединений кальция, например, негашеной (СаО), гашеной [Ca(OH)₂] извести или карбоната кальция, можно использовать смеси названных веществ. Количество добавляемых соединений кальция должно быть достаточным для нейтрализации раствора. Получают кашицеобразную массу, которая представляет собой смесь водного раствора олигосахаридов хитина с нерастворимым сульфатом кальция.To implement the proposed method, chitin was treated with sulfuric acid, taken in an amount of 2.7-10 ml per 1 g of chitin. The amount of acid depends on its concentration, which varies from 55 to 75% of the reaction temperature and time are in the range 40-50 ^{° C} and 20-120 minutes, respectively. Higher temperatures mean less time and vice versa. After the reaction, chilled (with ice) water is added in an amount of 20-25 ml per 1 g of chitin. The resulting solution of chitin depolymerization products in dilute sulfuric acid is neutralized by the addition of calcium compounds, for example quicklime (CaO), quicklime [Ca (OH) ₂ ] lime or calcium carbonate; mixtures of these substances can be used. The amount of added calcium compounds should be sufficient to neutralize the solution. A pulp mass is obtained, which is a mixture of an aqueous solution of chitin oligosaccharides with insoluble calcium sulfate.

Ее фильтруют, прозрачный фильтрат лиофилизируют и получают смесь водорастворимых олигосахаридов хитина в виде белого порошка, растворимого в воде. It is filtered, the clear filtrate is lyophilized and a mixture of water-soluble chitin oligosaccharides is obtained in the form of a white powder, soluble in water.

Однако в качестве биологически активного вещества можно использовать и кашицеобразную массу, полученную сразу после нейтрализации, или ее сухую форму, которая представляет собой белый (или почти белый) порошок, состоящий на 90-91% из минерального компонента, преимущественно СаSO₄ и органического компонента хитиновой природы (9-10%).However, as a biologically active substance, you can use the pulp mass obtained immediately after neutralization, or its dry form, which is a white (or almost white) powder, consisting of 90-91% of the mineral component, mainly CaSO ₄ and the organic component of chitin nature (9-10%).

Присутствие сульфата кальция в препарате не отражается на его биологической активности, о чем свидетельствуют опыты по бифидостимулирующему действию на микрофлору кишечника животных. The presence of calcium sulfate in the preparation does not affect its biological activity, as evidenced by experiments on the bifidostimulating effect on the intestinal microflora of animals.

Предельные значения параметров способа обоснованы следующим образом. Превышение указанных параметров приводит к снижению степени полимеризации и ухудшению качества продукта, а понижение к снижению выхода водорастворимых олигосахаридов. Пределы объемов воды соответствуют необходимому минимуму (20 мл на 1 г хитина) для осуществления нейтрализации серной кислоты и максимуму для экономии энергии, затрачиваемой на высушивание материала. The limit values of the parameters of the method are justified as follows. Exceeding these parameters leads to a decrease in the degree of polymerization and deterioration of the quality of the product, and a decrease to a decrease in the yield of water-soluble oligosaccharides. The limits of water volumes correspond to the required minimum (20 ml per 1 g of chitin) to neutralize sulfuric acid and the maximum to save energy spent on drying the material.

П р и м е р. К 30 г хитина панцирей креветок прибавляют 90 мл 65%-ной серной кислоты, перемешивают 1 ч при 40^оС, после чего добавляют около 650 мл воды со льдом и затем мел до нейтральной реакции. Кашицеобразную массу сушат на воздухе, получают 300 г белого порошка.PRI me R. To 30 g of shrimp shells chitin was added 90 ml of 65% sulfuric acid, stirred for 1 h ^at 40 ° C after which was added about 650 ml of ice water and then the chalk until neutral. The gruel is dried in air, and 300 g of a white powder is obtained.

30 г полученного порошка перемешивают с 300 мл воды, фильтруют, прозрачный фильтрат лиофилизируют, получают 2,4 г целевого продукта, который при повторном растворении в воде дает прозрачные растворы при концентрации 1,5-2,5% опалесцирующие при концентрации 3% Содержание мономера в препарате 5,4%
Сходство препаратов, получаемых по заявленному способу и способу-прототипу следует из сравнения показателей, приведенных в таблице.30 g of the obtained powder is mixed with 300 ml of water, filtered, the clear filtrate is lyophilized, 2.4 g of the expected product are obtained, which upon repeated dissolution in water gives clear solutions at a concentration of 1.5-2.5% opalescent at a concentration of 3% Monomer content 5.4% in the preparation
The similarity of the preparations obtained by the claimed method and the prototype method follows from a comparison of the indicators given in the table.

Содержание свободного мономера определяли прямым колориметрическим измерением по Моргану-Элсону. The content of free monomer was determined by direct colorimetric measurement according to Morgan-Elson.

Содержание олигосахаридов со степенью полимеризации больше 4 определяли с использованием фракционирования обоих препаратов колоночной хроматографией на акрилексе Р-2. The content of oligosaccharides with a degree of polymerization of more than 4 was determined using fractionation of both preparations by column chromatography on acrylic P-2.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что оба продукта представляют смесь полимергомологов одного и того же мономера, что объясняется общим сырьем (хитин) и одинаковой его обработкой. Ограниченная растворимость в 2% свидетельствует об избытке более высокомолекулярных фракций со степенью полимеризации 6-8. Содержание свободного мономера в смеси (менее 3%) свидетельствует так же об ограниченной степени деполимеризации хитина в обоих препаратах. Содержание олигосахаридов со степенью полимеризации больше 4, превышающая в этих случаях 70% свидетельствует о том, что основная целевая задача технологии получение преимущественно более высокомолекулярных олигосахаридов одинаково достигнута как в предлагаемом способе, так и в прототипе. The data in the table indicate that both products are a mixture of polymer homologs of the same monomer, which is explained by common raw materials (chitin) and its identical processing. Limited solubility of 2% indicates an excess of higher molecular fractions with a degree of polymerization of 6-8. The content of free monomer in the mixture (less than 3%) also indicates a limited degree of chitin depolymerization in both preparations. The content of oligosaccharides with a degree of polymerization of more than 4, exceeding 70% in these cases, indicates that the main target of the technology for producing predominantly higher molecular weight oligosaccharides is equally achieved both in the proposed method and in the prototype.

Дополнительно для характеристики препаратов испытывали их гидролизуемость кислотой и ферментом при одновременном контроле за реакцией по приросту восстанавливающих сахаров и по специфической реакции на образующийся при гидролизе мономер. Additionally, to characterize the preparations, they were tested for their hydrolyzability with an acid and an enzyme, while the reaction was monitored by the growth of reducing sugars and by a specific reaction to the monomer formed during hydrolysis.

Гидролиз кислотой: раствор препарата (200 мкг/мл) в 0,1 М и 0,2 М соляной кислоте нагревали до 100^оС в течение 2 ч, измеряли прирост восстанавливающих сахаров по Шомоди-Нельсону и N-ацетил-D-глюкоамизина по методу Райсинг и др.Hydrolysis of the acid: drug solution (200 ug / ml) in 0.1 M and 0.2 M hydrochloric acid was heated ^to 100 ° C for 2 hours, reducing sugars were measured increase in Nelson and Somogyi-N-acetyl-D-glyukoamizina by Rising et al.

На фиг. 1 приведены кривые солянокислого гидролиза водорастворимых олигосахаридов хитина. Концентрация олигосахаридов 200 мкг/мл. In FIG. Figure 1 shows the hydrochloric acid hydrolysis curves of water-soluble chitin oligosaccharides. The concentration of oligosaccharides is 200 μg / ml.

Концентрация соляной кислоты в реакционной массе -1-0,2 M; 2-0,1 M. Измерения проведены по методу Шомоди-Нельсона. The concentration of hydrochloric acid in the reaction mass is -1-0.2 M; 2-0.1 M. The measurements were carried out according to the Shomody-Nelson method.

Гидролиз ферментом: раствор препарата (1,55 мг/мл) в 15 мМ ацетатном буфере, рН 5,25, инкубировали с ферментным препаратом пектофоетидином ГЗХ, измеряли прирост восстанавливающих сахаров и N-ацетил-D-глюкоамина. Enzyme hydrolysis: a solution of the drug (1.55 mg / ml) in 15 mM acetate buffer, pH 5.25, was incubated with the enzyme preparation pectofoetidine GZH, and the increment of reducing sugars and N-acetyl-D-glucoamine was measured.

На фиг. 2 кривая гидролиза растворимой части солихита под действием пектофоетидина ГЗХ. Концентрация субстрата 1,55 мг/мл. Концентрация фермента 38,5 мкг/мл. рН ферментативной реакции рН 5,25, 15 мМ ацетатный буфер. Температура 40^оС. Измерения проведены по методу Райсинг и др.In FIG. 2 curve of hydrolysis of the soluble part of solichite under the action of pectofoetidine GLC. The concentration of the substrate is 1.55 mg / ml. The concentration of the enzyme is 38.5 μg / ml. pH of the enzymatic reaction; pH 5.25; 15 mM acetate buffer. Temperature 40 ^о С. Measurements were carried out by the method of Rising et al.

Из сравнения кривых, полученных для обоих препаратов, следует, что они гидролизуются ферментом с образованием ацетилглюкозамина практически одинаково, что свидетельствует о сходстве их химической природы. Так, если начальную скорость гидролиза препарата, полученного по способу-прототипу, выразить условно за 1, то соответствующий показатель для препарата по предлагаемому способу будет отличаться не более, чем на 20% Для сравнения отметим, что скорость гидролиза более высокомолекулярных продуктов деполимеризации хитина, называемых коллоидным хитином, бывают снижены в десятки раз. From a comparison of the curves obtained for both drugs, it follows that they are hydrolyzed by the enzyme with the formation of acetylglucosamine almost the same, which indicates the similarity of their chemical nature. So, if the initial rate of hydrolysis of the drug obtained by the prototype method is arbitrarily expressed as 1, then the corresponding indicator for the drug by the proposed method will differ by no more than 20%. For comparison, we note that the hydrolysis rate of higher molecular weight products of chitin depolymerization, called colloidal chitin, are reduced tenfold.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить водорастворимые олигосахариды хитина, причем по сравнению со способом-прототипом он имеет следующие преимущества:
не требуется применения органического растворителя и пожаробезопасносного оборудования;
при использовании целевого продукта в виде первоначально получающейся смеси его с минеральным компонентом (СаSO₄) производство является безотходным и следовательно экологически чистым.Thus, the claimed method allows to obtain water-soluble chitin oligosaccharides, and in comparison with the prototype method, it has the following advantages:
the use of an organic solvent and fireproof equipment is not required;
when using the target product in the form of an initially obtained mixture of it with a mineral component (CaSO ₄ ), the production is waste-free and therefore environmentally friendly.

Claims

METHOD FOR PRODUCING WATER-SOLUBLE OLIGOMERS, including treating chitin with a solution of sulfuric acid at a ratio of 2.7 10.0 ml of an acid solution per 1 g of chitin at 40 50 ^o C for 20 120 minutes, diluting with water, neutralizing, filtering and drying, characterized in that a solution with a concentration of 55 75% of neutralization is used as a solution of sulfuric acid; the reaction mixture is diluted with water in a ratio of 20 25 ml of water per 1 g of chitin by treatment with inorganic calcium salts, the target product is isolated by filtration and drying oh.