RU2026685C1 - Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином - Google Patents
Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином Download PDFInfo
- Publication number
- RU2026685C1 RU2026685C1 SU5064945A RU2026685C1 RU 2026685 C1 RU2026685 C1 RU 2026685C1 SU 5064945 A SU5064945 A SU 5064945A RU 2026685 C1 RU2026685 C1 RU 2026685C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trypsin
- immobilized
- preparing
- enzyme
- polyurethane foam
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и хирургии. Известен способ иммобилизации трипсина на полиуретановой матрице, заключающийся во взаимодействии трипсина с толуилендиизоцианатом и последующей сополимеризацией форпродукта с полиэфирным компонентом. Однако иммобилизация трипсина на низкопористой полиуретановой матрице ограничивает область его практического применения. Цель изобретения - получение биосовместимого, биодеградируемого, высокопористого, ферментсодержащего полимера, повышающего стабильность фермента, время его действия и доступность субстратам. Для достижения указанной цели трипсин предварительно связывается с предполимером, содержащим толуилендиизоцианат 80/20 и полиизоцианат в соотношении (1,8-2,2): (1,3-1,0) с последующим удлинением цепи полимера с помощью компонента, содержащего активатор триэтилендиамин.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и хирургии, и может быть использовано для создания высокостабильных иммобилизованных ферментных препаратов, а также при разработке лекарственных форм пролонгированного действия для лечения гнойных осложнений.
Известны методы иммобилизации протеолитических ферментов (протеиназ), основанные на использовании в качестве полимерной матрицы полиакриламида (Мартинек К. и др. Докл.АН СССР, 1982. - т.263. - N 2. - с.494-497; Можаев В. В. Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине. Тез.докл. - Л., 1980. - с.79) и белковых носителей - водонерастворимый сывороточный альбумин, коллагеновые пленки (Веремеенко К. Н. и Карпенко Г.Ф. Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине. Тез.докл. - Л., 1980. - с.114).
К недостаткам полимерных матриц, полученных с помощью этих методов, относятся их высокая токсичность, бионесовместимость, присутствие белков, которые могут изменять сродство к исследуемым субстратам, повышать их антигенные, иммуногенные и аллергенные свойства.
Преимуществом полиуретановых композиций, как исходного материала для иммобилизации ферментов, является их биодеградируемость и биосовместимость. Однако при иммобилизации протеиназ на полиуретанах использовались большей частью монолитные низкопористые (пленочные) материалы (Вирник А.Д. и др. Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине. Тез.докл., Л., 1980. - с.117).
Недостатком иммобилизованных ферментов на низкопористых полиуретанах является ограниченность области их практического использования в биохимических средах и при разработке и применении лекарственных форм на их основе из-за затрудненности массопереноса субстрата к иммобилизованной протеиназе, длительности перемешивания до начала вспенивания (15-20 мин), токсичности активатора (N-этилдиэтаноламин), относительно высокой летучести полиэфирного предполимера (средняя мол.м.2000), длительности и достаточной сложности предварительных операций.
В качестве прототипа изобретения принят способ иммобилизации трипсина на полиуретановой матрице, заключающийся во взаимодействии трипсина с толуилендиизоцианатом и последующей сополимеризацией форпродукта с полиэфирным компонентом.
Цель изобретения - получение биосовместимого, биодеградируемого, высокопористого, ферментсодержащего полимера, повышающего стабильность фермента, время его действия и доступность субстратам. Для достижения указанной цели трипсин предварительно связывается с предполимером, содержащим толуилендиизоцианат 80/20 и полиизоцианат в соотношении (1,8-2,2):(1,3-1,0) с последующим удлинением цепи полимера с помощью компонента, содержащего активатор триэтилендиамин.
Способ осуществляется следующим образом.
Приготовление полиэфирного (А) и изоцианатного (Б) форпродуктов. Компонент А содержит 94,5 мас.% лапрола 5003, 2,8% лапрола 402 и 2,7% активатора; активатор - 10% триэтилендиамин в воде (средняя мол.м.5000). Компонент Б (суризон АММ) - предполимер на основе триэтиленгликоля, толуилендиизоцианата 80/20 и полиизоцианата, соотношение по массе (1,8-2,2):(1,3-1,0). Готовый компонент: раствор продукта конденсации ≈ 32-36% в толуилендиизоцианате 80/20 ≈ 64-68%. Содержание NCO-групп ≈ 27,5%.
Иммобилизация трипсина.
К 0,09-1,1 мл компонента B добавляют 1-10 мг сухого трипсина (Spofa) и тщательно вручную перемешивают в течение 20-40 с. К полученной системе добавляют 0,3-3,0 мл компонента А и вновь тщательно вручную перемешивают в течение 10-15 с. Через 2-7 мин пена перестает расти, через 8-15 мин - затвердевает. Соотношение компонента A:B:фермент составляет 900:300:1. Полученные образцы перистогубчатого полимера обладали высокой эластичностью и гигроскопичностью.
Свойства иммобилизованного трипсина.
При исследовании свойств трипсина использовали аликвоты матрицы по 50-100 мг, содержащие по 50-100 мкг иммобилизованного фермента. В качестве контроля использовали раствор фермента в той же концентрации, а также полиуретан без иммобилизованного фермента. Активность трипсина оценивали по расщеплению низкомолекулярного хромогенного субстрата - α-N-бензоил-D,Z-аргининпаранитроанилида (БАПНА) (Keilova M., Keil B., - FEBS Letters. - 1969. - 4. - p.295) и по расщеплению естественного высокомолекулярного субстрата - бычьего сывороточного альбумина (Алексеенко Л.П. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1968, с.115). В первом случае прирост продуктов гидролиза регистрировали по светопоглощению р-нитроанилина при 410 нм, во втором случае - по приросту светопоглощения при 280 нм и с помощью реакции Лоурин (Lowry O. , Rosenbrough N., Farr A. et al. - J.Biol.Chem. - 1957. - 193. - p.265). Результаты обработаны статистически (Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйшая школа, 1973).
Стабильность иммобилизованного трипсина при хранении.
Исследовали стабильность иммобилизованного трипсина при его хранении при комнатной температуре в 0,9% растворе NaCl в сравнении с раствором трипсина той же концентрации. Иммобилизованный фермент полностью сохранял активность в течение 3 сут. Через 5 суток его активность снижалась на 20±4%, а через 7 сут - на 48±8%, сохраняясь на таком уровне в течение 14 сут. Раствор фермента уже через 3-е суток терял 50±6% своей активности, а к 7 суткам полностью инактивировался.
Оптимум рН действия иммобилизованного трипсина.
Для изучения оптимума рН использовали 0,1 М цитратный буфер (рН 4,0), 0,1 М фосфатный буфер (рН 6,0) и 0,1 М трис-буфер (рН 8,0 и рН 10,0). Наиболее оптимальным значением среды для действия иммобилизованного трипсина было рН 8,0 и рН 10,0. При значении среды рН 6,0 он терял 52±7% своей активности, а при рН 4,0 - 85±4%. Фермент в растворе был наиболее активен при рН 8,0, при рН 4,6 и 10 он сохранял 7±3%, 18±6% и 74±9% своей активности соответственно.
Термостабильность иммобилизованного трипсина.
Иммобилизованный фермент практически полностью сохранял свою активность при прогревании до 60оС в течение 20 мин; прогревание при 70оС приводило к потере им 42±9% активности. Раствор фермента при прогревании при 50оС терял до 95% исходной активности.
Таким образом, предлагаемый способ иммобилизации трипсина увеличивает его стабильность при хранении в водной фазе, расширяет рН-диапазон его действия, увеличивает термостабильность.
Преимуществами предлагаемого способа являются:
впервые получена высокопористая пенополиуретановая композиция с высокостабильным иммобилизованным трипсином;
впервые в качестве предполимера использован толуилендиизоцианат 80/20 и полиизоцианат в соотношении (1,8-2,2):(1,3-1,0);
впервые в качестве активатора при иммобилизации трипсина использован триэтилендиамин, имеющий невысокую токсичность и сравнительно малую летучесть;
существенно уменьшается время перемешивания компонентов полиуретановой композиции до начала вспенивания (10-12 с), что позволяет применять метод в экспресс-исследованиях;
за счет высокой пористости матрицы иммобилизованный трипсин более доступен для действия низко- и высокомолекулярных субстратов, при этом значительно увеличивается время сохранения его активности и устойчивости к нагреванию и изменению рН среды.
впервые получена высокопористая пенополиуретановая композиция с высокостабильным иммобилизованным трипсином;
впервые в качестве предполимера использован толуилендиизоцианат 80/20 и полиизоцианат в соотношении (1,8-2,2):(1,3-1,0);
впервые в качестве активатора при иммобилизации трипсина использован триэтилендиамин, имеющий невысокую токсичность и сравнительно малую летучесть;
существенно уменьшается время перемешивания компонентов полиуретановой композиции до начала вспенивания (10-12 с), что позволяет применять метод в экспресс-исследованиях;
за счет высокой пористости матрицы иммобилизованный трипсин более доступен для действия низко- и высокомолекулярных субстратов, при этом значительно увеличивается время сохранения его активности и устойчивости к нагреванию и изменению рН среды.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПОРИСТОЙ ПЕНОПОЛИУРЕТАНОВОЙ КОМПОЗИЦИИ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ ТРИПСИНОМ путем взаимодействия трипсина с толуолилендиизоцианатом и последующей сополимеризации форпродукта с полиэфирным компонентом, отличающийся тем, что трипсин предварительно связывают с предполимером на основе триэтиленгликоля, толуоилендиизоцианата в соотношении 80:20 и полиизоцианата в соотношении по массе 1,8-2,2:1,3-1,0 с последующим удлинением цепи полимера с помощью полиэфирного компонента, содержащего активатор триэтилендиамин.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5064945 RU2026685C1 (ru) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5064945 RU2026685C1 (ru) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2026685C1 true RU2026685C1 (ru) | 1995-01-20 |
Family
ID=21614572
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5064945 RU2026685C1 (ru) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2026685C1 (ru) |
-
1992
- 1992-10-13 RU SU5064945 patent/RU2026685C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Липатова Т.Э. и др. Украинский биохимический журнал 1979, N 4, с. 319-323. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4004979A (en) | Preparation of active proteins cross-linked to inactive proteins | |
US4412947A (en) | Collagen sponge | |
US4515637A (en) | Collagen-thrombin compositions | |
US5733563A (en) | Albumin based hydrogel | |
US5603956A (en) | Cross-linked enzymatically controlled drug release | |
EP0830381A1 (en) | Chitin hydrogels, methods of their production and use | |
Shockman et al. | Autolytic Enzyme System of Streptococcus faecalis III. Localization of the Autolysin at the Sites of Cell Wall Synthesis | |
Brown et al. | The cornea-destroying enzyme of Pseudomonas aeruginosa | |
EP1017429A2 (en) | Fibrin sponge | |
DE1915970A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen | |
JPS61502588A (ja) | 移植組織 | |
WO1993025189A1 (en) | Burn foam and delivery system | |
WO1994028937A1 (en) | Conjugated biodhesives | |
IE43057L (en) | Immobilisation of enzymes | |
NO149550B (no) | Vannuopploeselig enzympreparat og fremgangsmaate for fremstilling derav. | |
DE19903655A1 (de) | Proteinhaltige Hydrogele | |
EP0651634B1 (en) | Cross-linked polyhydroxylic material for enzymatically controlled drug release | |
US5817309A (en) | Antidote for hirudin and synthetic thrombin inhibitors and method of use | |
GB1518746A (en) | Process for producing an immobilized biological material | |
RU2026685C1 (ru) | Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином | |
US4530905A (en) | Crosslinked gelatin foams | |
EP0837882A1 (en) | Collagen peptide fraction and its uses | |
JPH07508429A (ja) | 創傷用包帯,創傷用被覆物もしくはキャリアマトリックス | |
LEVINE et al. | Debridement of experimental skin burns of pigs with bromelain, a pineapple-stem enzyme | |
JPH0233356B2 (ru) |