RU2023127142A - Методы амплификации для характеризации нуклеиновых кислот - Google Patents

Claims (59)

1. Композиция нуклеиновых кислот, содержащая:

первый олигонуклеотид, содержащий последовательность первого 5'-праймера, последовательность первого 3'-праймера и первую промежуточную область, расположенную между последовательностью первого 5'-праймера и последовательностью первого 3'-праймера;

второй олигонуклеотид, содержащий последовательность второго 5'-праймера, последовательность второго 3'-праймера и вторую промежуточную область, расположенную между последовательностью второго 5'-праймера и последовательностью второго 3'-праймера; и

целевую нуклеиновую кислоту, причем последовательность первого 5'-праймера и последовательность первого 3'-праймера комплементарны первым областям, фланкирующим первую целевую последовательность целевой нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность второго 5'-праймера и последовательность второго 3'-праймера комплементарны вторым областям, фланкирующим вторую целевую последовательность целевой нуклеиновой кислоты таким образом, что первый олигонуклеотид при связывании с целевой нуклеиновой кислотой образует первую петлевую структуру вокруг первой целевой последовательности, а второй олигонуклеотид при связывании с целевой нуклеиновой кислотой образует вторую петлевую структуру вокруг второй целевой последовательности.

2. Композиция по п. 1, в которой первая целевая последовательность и вторая целевая последовательность имеют длину в 50-350 оснований.

3. Композиция по п. 1, в которой целевая нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечную РНК.

4. Композиция по п. 1, содержащая полимеразу, которая способна удлинять первую петлевую структуру между последовательностью первого 5'-праймера и последовательностью первого 3'-праймера и удлинять вторую петлевую структуру между последовательностью второго 5'-праймера и последовательность второго 3'-праймера.

5. Композиция по п. 4, в которой полимераза представляет собой RT-полимеразу.

6. Композиция по п. 4, содержащая лигазу, которая способна замыкать первую петлевую структуру путем лигирования удлиненного первого 3'-конца с последовательностью первого 5'-праймера и вторую петлевую структуру путем лигирования удлиненного второго 3'-конца с последовательностью второго 5'-праймера.

7. Композиция по п. 1, содержащая праймер для амплификации по типу катящегося кольца, специфичный для общей последовательности в первой промежуточной области и второй промежуточной области.

8. Композиция по п. 1, содержащая первую одноцепочечную конкатенированную нуклеиновую кислоту, содержащую повторяющиеся блоки, причем повторяющиеся блоки содержат первую целевую последовательность и комплементы к последовательности первого 5'-праймера, последовательности первого 3'-праймера и к первой промежуточной области.

9. Композиция по п. 8, содержащая вторую конкатенированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту, содержащую повторяющиеся блоки, причем повторяющиеся блоки содержат вторую целевую последовательность и комплементы к последовательности второго 5'-праймера, последовательности второго 3'-праймера и ко второй промежуточной области.

10. Композиция по п. 1, в которой первая промежуточная область и вторая промежуточная область имеют одинаковую последовательность.

11. Композиция по п. 1, в которой первая промежуточная область и вторая промежуточная область содержат индексную последовательность.

12. Композиция по п. 1, в которой последовательность первого 5'-праймера связывает целевую нуклеиновую кислоту на 5'-конце первой целевой последовательности, и при этом последовательность первого 3'-праймера связывает 3'-конец первой целевой последовательности.

13. Композиция по п. 1, в которой последовательность второго 5'-праймера связывает целевую нуклеиновую кислоту на 5'-конце второй целевой последовательности, и при этом последовательность второго 3'-праймера связывает 3'-конец второй целевой последовательности.

14. Композиция по п. 1, в которой первая целевая последовательность и вторая целевая последовательность разнесены друг от друга на целевой нуклеиновой кислоте.

15. Способ амплификации целевой последовательности, включающий:

приведение целевой нуклеиновой кислоты в контакт с олигонуклеотидом таким образом, что олигонуклеотид связывается с разнесенными друг от друга мишень-связывающими последовательностями на нуклеиновой кислоте с образованием петлевой структуры вокруг целевой последовательности целевой нуклеиновой кислоты;

удлинение 3'-конца олигонуклеотида по направлению к 5'-концу и по целевой последовательности;

лигирование удлиненного 3'-конца с 5'-концом олигонуклеотида с образованием замкнутой петли; и

использование замкнутой петли в качестве матрицы для амплификации по типу катящегося кольца для генерирования конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

16. Способ по п. 15, включающий обнаружение конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты для обнаружения целевой последовательности.

17. Способ по п. 15, включающий секвенирование конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты для обнаружения целевой последовательности.

18. Способ по п. 15, включающий объединение конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты с другими конкатенированными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, причем конкатенированная одноцепочечная нуклеиновая кислота содержит уникальную индексную последовательность, которая отсутствует в других конкатенированных одноцепочечных нуклеиновых кислотах.

19. Способ по п. 18, включающий амплификацию объединенной с другими конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты для введения одной или нескольких дополнительных индексных последовательностей.

20. Способ обнаружения целевой нуклеиновой кислоты, включающий:

обеспечение системой, имеющей первую гидовую РНК с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и первый CRISPR-ассоциированный (Cas) белок, и вторую гидовую РНК CRISPR и второй белок Cas, причем первая гидовая РНК содержит мишень-специфичную нуклеотидную область, комплементарную первой области целевой нуклеиновой кислоты, а вторая гидовая РНК содержит мишень мишень-специфичную нуклеотидную область, комплементарную второй области целевой нуклеиновой кислоты, разнесенной от первой области;

приведение целевой нуклеиновой кислоты в контакт с системой с образованием комплекса для расщепления внутри первой области и второй области с высвобождением олигонуклеотида, содержащего промежуточные нуклеотиды между первой областью и второй областью;

отжиг олигонуклеотида с матрицей; и

амплификацию матрицы с использованием отожженного олигонуклеотида в качестве праймера.

21. Способ по п. 20, включающий обнаружение амплифицированной матрицы для обнаружения олигонуклеотида.

22. Способ по п. 20, включающий секвенирование амплифицированной матрицы для обнаружения олигонуклеотида.

23. Способ по п. 20, в котором матрица закольцована, и при этом амплификация включает генерацию конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты путем амплификации матрицы посредством амплификации по типу катящегося кольца с использованием олигонуклеотида в качестве праймера.

24. Способ по п. 20, в котором амплификация включает обеспечение наличия другого праймера из пары прямого и обратного праймеров, причем пара прямого и обратного праймеров содержит данный праймер.

25. Способ обнаружения целевой нуклеиновой кислоты, включающий:

обеспечение системой, имеющей гидовую РНК с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и CRISPR-ассоциированный (Cas) белок, причем гидовая РНК содержит мишень-специфичную нуклеотидную область, комплементарную области целевой нуклеиновой кислоты;

обеспечение наличия множества закольцованных олигонуклеотидов;

приведение целевой нуклеиновой кислоты в контакт с системой с образованием комплекса;

линеаризацию множества закольцованных олигонуклеотидов для генерирования праймеров с использованием в комплексе белка Cas;

отжиг одного или нескольких праймеров с матрицей; и

амплификацию матрицы с использованием одного или нескольких праймеров, отожженных с матрицей.

26. Способ по п. 25, включающий обнаружение области целевой нуклеиновой кислоты на основе амплифицированной матрицы.

27. Способ по п. 25, включающий обнаружение области целевой нуклеиновой кислоты на основе секвенирования амплифицированной матрицы.

28. Способ по п. 25, в котором один или более праймеров содержат пару прямого и обратного праймеров.

29. Способ по п. 25, в котором амплификация включает обеспечение наличия другого праймера из пары прямого и обратного праймеров, причем пара прямого и обратного праймеров содержит данный праймер.

30. Способ по п. 25, в котором множество закольцованных олигонуклеотидов содержат гантелеобразную структуру, имеющую первую кольцевую область, связанную со второй кольцевой областью, и при этом линеаризация множества закольцованных олигонуклеотидов для генерации праймеров включает линеаризацию только первой кольцевой области, а не второй закольцованной части, и при этом матрица содержит вторую кольцевую область.

31. Способ по п. 25, в котором амплификация матрицы включает амплификацию второй кольцевой области с образованием конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты с использованием одного или более праймеров в качестве праймера для амплификации по типу катящегося кольца.

32. Способ амплификации целевой нуклеиновой кислоты мРНК, включающий:

обеспечение наличия праймера для реакции с обратной транскриптазой, причем праймер содержит праймер-связывающую последовательность для амплификации по типу катящегося кольца и фосфорилированный 5'-конец;

отжиг праймера с мРНК;

удлинение праймера с использованием обратной транскриптазы для генерирования кДНК, содержащей праймер;

лигирование фосфорилированного 5'-конца праймера в кДНК с 3'-концом для циркуляризации кДНК;

отжиг праймера для амплификации по типу катящегося кольца с последовательностью связывания праймера закольцованной кДНК; и

амплификацию закольцованной кДНК с использованием праймера для амплификации по типу катящегося кольца, отожженного с закольцованной кДНК, с генерированием конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

33. Способ по п. 32, включающий отжиг праймеров второй цепи с повторяющимися блоками конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты и удлинение отожженных праймеров второй цепи для синтеза второй цепи конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

34. Способ по п. 32, включающий секвенирование конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты для генерации информации о последовательности мРНК.

35. Способ по п. 34, в котором секвенирование включает фрагментацию конкатенированной одноцепочечной нуклеиновой кислоты для генерации фрагментов библиотеки секвенирования и секвенирование фрагментов.

36. Способ по п. 35, в котором фрагментация включает реакцию тагментации.