RU2022107379A

RU2022107379A - Варианты амилазы

Info

Publication number: RU2022107379A
Application number: RU2022107379A
Authority: RU
Inventors: Штефан ЕНЕВАЙН; Захари Давид МАЙЛЗ; Прия АНАНД
Original assignee: Басф Се
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2023-09-22

Claims

1. Выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид, имеющий альфа-амилазную активность, содержащий А и В домен и С домен, где аминокислотная последовательность А и В домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и аминокислотная последовательность С домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44.

2. Полипептид по п. 1, имеющий альфа-амилазную активность, состоящий из А и В домена и С домена, где аминокислотная последовательность А и В домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и аминокислотная последовательность С домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44.

3. Полипептид по п. 1, где А и В домен на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичен последовательности А и В домена, имеющего аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 42.

4. Полипептид по п. 1, где С домен на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичен последовательности С домена, имеющего аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 44.

5. Полипептид по п. 1, содержащий замещение, делецию, и/или вставку при одном или нескольких положениях.

6. Полипептид по п. 1, содержащий последовательность TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX, где X может представлять собой любую аминокислоту.

7. Полипептид по п. 1, где полипептид имеет один или несколько аминокислотных остатка, выбранных из группы, состоящей из 402R,H, 419S,G,D, 420V,I, 422,A,V, 423N,D,G,K, 428T,A, 435G,R,E, 437S,A, 441N,E,D, 444K,E, 450V,I, 452Y,H,R, 466K,R, 469W,S, 473H,Q,R, 475S,N, 476G,E, 479V,A, 483V,I, и 485R,Q,K согласно нумерации SEQ ID NO: 39.

8. Полипептид по п. 1, содержащий замещение при одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из 430 и 454, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из I430M и M454I, согласно нумерации SEQ ID NO: 39.

9. Полипептид по п. 1, содержащий аминокислотный остаток при одном или нескольких аминокислотных положениях, выбранных из группы, состоящей из 401, 403, 405, 411, 413, 415, 424, 426, 428, 432, 455, 477, 479 и 481 (согласно нумерации SEQ ID NO: 39), как представлено в SEQ ID NO: 39.

10. Полипептид по п. 1, содержащий аминокислотный остаток при одном или нескольких аминокислотных положениях, выбранных из группы, состоящей из 309, 313, 347, 348, 350, 351, 354, 355, 358, 359, 388, 389, 392 и 396 (согласно нумерации SEQ ID NO: 39), как представлено в SEQ ID NO: 40.

11. Полипептид по п. 1, содержащий делецию одной или нескольких аминокислот, соответствующих положениям 181, 182, 183 и 184 согласно нумерации SEQ ID NO: 39, предпочтительно делецию двух или более аминокислот, соответствующих положениям 181, 182, 183 и 184, предпочтительно делецию аминокислот, соответствующих положениям 181 и 182, 182 и 183, или 183 и 184 (согласно нумерации SEQ ID NO: 39).

12. Полипептид по п. 1, содержащий замещение при одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из 9, 130, 195, 206, 244, 202, 179, 181, 186, и 190 согласно нумерации SEQ ID NO: 39, предпочтительно одно или несколько замещений, выбранные из группы, состоящей из M9L, E130V, N195F, I206L, S244Q, M202L, K179L, R181E, G186E/N/Q/S и Е190Р согласно нумерации SEQ ID NO: 39.

13. Полипептид по п. 1, содержащий:

(b) аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37,

(b) аминокислотную последовательность, кодируемую полипептидом, имеющим последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38,

(c) аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях с высокой степенью строгости с комлементом

(i) кодирующей последовательности SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37, или

(ii) полинуклеотида, показанного в SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38,

или

(d) фрагмент (a), (b) или (с), имеющий амилазную активность.

14. Полипептид по любому из пп. 1-13, где амилаза имеет увеличение экспрессии, активности, термостабильности, стабильности, эффективности при стирке, специфической активности, специфичности к субстрату, рН-зависимой активности, рН-зависимой стабильности, стабильности к окислению, Са2+ зависимости или любой их комбинации по сравнению с амилазой, показанной в SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40, предпочтительно, амилаза имеет увеличение термостабильности по сравнению с амилазой, показанной в SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40.

15. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий амилазную активность,

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, на по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичный последовательности SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37, где полипептид имеет амилазную активность, или кодирующую полипептид по любому из предшествующих пунктов,

(c) полинуклеотид, который гибридизуется в условиях с высокой степенью строгости с комлементом

(d) фрагмент (a), (b) или (с), где фрагмент кодирует полипептид, имеющий амилазную активность, или

(e) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарную любому из (а)-(d).

16. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид по п. 15.

17. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 15 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 16.

18. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 15, конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 16 или экспрессионный вектор по п. 17.

19. Композиция, содержащая выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид, имеющий альфа-амилазную активность, по любому из пп. 1-14.

20. Композиция по п. 19, дополнительно содержащая по меньшей мере один второй фермент, выбранный из группы, состоящей из: второй амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы, лакказы, маннаназы, пектиназы, ксиланазы и нуклеазы.

21. Способ получения выделенного, синтетического или рекомбинантного полипептида, имеющего альфа-амилазную активность, по любому из пп. 1-14, включающий: предоставление последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, трансформацию последовательности нуклеиновой кислоты в хозяина экспрессии, культивирование хозяина экспрессии с получением полипептида и необязательно очистку полипептида.

22. Способ получения теста или хлебобулочного изделия, полученного из теста, причем способ включает добавление выделенного, синтетического или рекомбинантного полипептида, имеющего альфа-амилазную активность, по любому из пп. 1-14 в тесто и выпекание.

23. Способ применения выделенного, синтетического или рекомбинантного полипептида, имеющего альфа-амилазную активность, по любому из пп. 1-14, для чистки или мытья текстиля, твердых поверхностей или посуды, для производства этанола, для переработки целлюлозы или бумаги или для кормления животных, предпочтительно для чистки или мытья текстиля, твердых поверхностей или посуды.

24. Способ получения выделенного, синтетического или рекомбинантного полипептида, имеющего альфа-амилазную активность, включающий стадию получения гибрида по меньшей мере двух разных амилаз, где гибрид содержит А и В домен и С домен, и где аминокислотная последовательность А и В домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и аминокислотная последовательность С домена на по меньшей мере 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44.

25. Способ применения С домена первой амилазы, причем указанный С домен имеет аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 44, для улучшения одного или более свойств, выбранных из группы, состоящей из стабильности, рН-профиля, экспрессии, активности, термостабильности, специфической активности, специфичности к субстрату, рН-зависимой активности, рН-зависимой стабильности, стабильности к окислению, Са2+ зависимости, эффективности при стирке, обработки крахмала, очистки текстиля, очистки твердых поверхностей, очистки посуды, производства этанола, обработки пульпы или бумаги, и кормления животных, второй альфа-амилазы, имеющей А и В домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 42, причем указанное применение включает замещение С домена второй альфа-амилазы на С домен первой альфа-амилазы.