RU2021135125A

RU2021135125A - Панель и способ получения пространственной информации о нуклеиновых кислотах

Info

Publication number: RU2021135125A
Application number: RU2021135125A
Authority: RU
Inventors: Ао ЧЭНЬ; Сюнь СЮЙ; Цзинь ЯН; Лунци ЛЮ; Оу ВАН; Юйсян ЛИ; Ша ЛЯО; Гуосинь ТАН; Юань ЦЗЯН; Чунцзюнь СЮЙ; Мин НИ; Вэньвэй ЧЖАН; Радое ДРМАНАЦ; Снезана ДРМАНАЦ
Original assignee: БиДжиАй ШЭНЬЧЖЭНЬ; ЭмДжиАй ТЕК КО., ЛТД.
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2023-06-15

Claims

1. Панель нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающая в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, при этом каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3' позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность, причем

позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;

первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации.

2. Панель нуклеиновых кислот по п. 1, дополнительно содержащая молекулу первой нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности, и где молекула первой нуклеиновой кислоты гибридизуется с первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;

предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты.

3. Панель нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, дополнительно содержащая молекулу второй нуклеиновой кислоты, лигированную с молекулой первой нуклеиновой кислоты, и молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность;

где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;

предпочтительно, каждая молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты.

4. Панель нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5'-конце, и вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности;

вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации.

5. Панель нуклеиновых кислот по п. 4, дополнительно содержащая молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность;

где комплемент второй иммобилизующей последовательности гибридизуется со второй иммобилизующей последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;

захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;

предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит гибридизованную с ней молекулу второй нуклеиновой кислоты.

6. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-5, где множественные копии последовательности-носителя представляют собой продукт амплификации, образованный посредством амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю, и амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации;

предпочтительно, множественные копии последовательности-носителя представляют собой DNB (наношарик ДНК), образованный конкатемером последовательности-носителя; предпочтительно множественные копии последовательности-носителя представляют собой DNB, образованный посредством амплификации по типу катящегося кольца с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;

предпочтительно, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя;

например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством мостиковой ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;

например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством эмульсионной ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;

например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством амплификации с множественным вытеснением цепи с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.

7. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-6, где молекула первой нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI), и последовательность UMI расположена на 5'-конце комплемента первой иммобилизующей последовательности;

последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т;

предпочтительно, последовательности UMI, содержащиеся в каждой из молекул первой нуклеиновой кислоты, отличаются от друг друга.

8. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-6, где молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;

предпочтительно, последовательности UMI, содержащиеся в каждой из молекул второй нуклеиновой кислоты, отличаются от друг друга.

9. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-8, где твердая подложка представляет собой чип;

предпочтительно, твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования;

предпочтительно, твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.

10. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-9, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;

предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т;

предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.

11. Панель нуклеиновых кислот по п. 1, где последовательность-носитель дополнительно содержит матрицу захватывающей последовательности, расположенную в направлении против хода транскрипции от позиционной последовательности, матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени;

и первая иммобилизующая последовательность последовательности-носителя также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER (урацил-специфический реагент для вырезания), фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами);

и панель нуклеиновых кислот дополнительно содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': связывающую область, область расщепления и область, комплементарную последовательности-носителю,

связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки;

область расщепления содержит сайт расщепления;

область, комплементарная последовательности-носителю, содержит последовательность, которая может быть комплементарна последовательности-носителю, и содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле первой нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;

и область молекулы первой нуклеиновой кислоты, комплементарная последовательности-носителю, гибридизуется с последовательностью-носителем с образованием двойной цепи;

12. Панель нуклеиновых кислот по п. 11, где последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI, расположенный в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, комплемент последовательности UMI комплементарен последовательности UMI, последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100) нуклеотида N, и каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т;

и область молекулы первой нуклеиновой кислоты, комплементарная последовательности-носителю, дополнительно содержит последовательность UMI, расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и в направлении по ходу транскрипции от комплемента первой иммобилизующей последовательности;

предпочтительно, комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности или между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью;

предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя (т.е. последовательностей-носителей, содержащих одинаковую позиционную последовательность) содержит комплемент последовательности UMI, отличающийся от других.

13. Панель нуклеиновых кислот по п. 11 или 12, где линкер молекулы первой нуклеиновой кислоты представляет собой линкерную группу, способную соединяться с активирующей группой (например, NH₂), и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой (например, NH₂);

предпочтительно, линкер содержит -SH, -DBCO (дибензоциклооктин) или -NHS;

предпочтительно, линкер представляет собой

(DBCO), а

(сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS) присоединен к поверхности твердой подложки.

14. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 11-13, где сайт расщепления, содержащийся в области расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом;

предпочтительно, сайт расщепления, содержащийся в области расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты, представляет собой сайт расщепления ферментом;

предпочтительно, область расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.

15. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 11-14, где твердая подложка представляет собой чип;

16. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 11-15, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;

17. Набор, содержащий: (1) панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-10, которая не содержит молекулу второй нуклеиновой кислоты; и (2) молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность;

где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.

18. Набор по п. 17, содержащий панель нуклеиновых кислот по п. 2, и иммобилизующая область молекулы второй нуклеиновой кислоты содержит двуцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (например, двуцепочечную последовательность ДНК).

19. Набор по п. 17, который содержит панель нуклеиновых кислот по п. 4, и где иммобилизующая область молекулы второй нуклеиновой кислоты содержит комплемент второй иммобилизующей последовательности.

20. Набор по любому из пп. 17-19, где, когда молекула первой нуклеиновой кислоты, содержащаяся в панели нуклеиновых кислот, не содержит последовательность UMI, тогда молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и указанная последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;

последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3. по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.

21. Способ изготовления панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в биологическом образце, включающий следующие стадии:

(1) предоставление многочисленных видов последовательностей-носителей, где каждый вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3' позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,

позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида

последовательности-носителя на панели;

первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;

(2) связывание многочисленных видов последовательностей-носителей с поверхностью твердой подложки (например чипа);

(3) предоставление первого праймера и осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве матрицы последовательности-носителя, так что область первой иммобилизующей последовательности и позиционная последовательность последовательности-носителя образуют двойную цепь, где цепь, которая гибридизуется последовательностью-носителем, представляет собой молекулу первой нуклеиновой кислоты, молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' первую иммобилизующую последовательность и последовательность, комплементарную позиционной последовательности; где первый праймер содержит область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, на своем З'-конце; область, комплементарная первой иммобилизующей последовательности, содержит последовательность, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, или ее фрагмент и имеет свободный З'-конец.

22. Способ по п. 21, где на стадии (1) многочисленные виды последовательностей-носителей предоставлены посредством следующих стадий:

(1) предоставление множества видов матриц последовательностей-носителей, где матрица последовательности-носителя содержит последовательность, комплементарную последовательности-носителю;

(2) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с применением в качестве матрицы каждого вида матрицы последовательности-носителя с получением продукта амплификации каждого вида матрицы последовательности-носителя, где продукт амплификации содержит множество копий последовательности-носителя;

предпочтительно, амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации;

предпочтительно, амплификацию по типу катящегося кольца выполняют с получением DNB, образованного конкатемером последовательности-носителя;

предпочтительно, мостиковую ПЦР-амплификацию, эмульсионную ПЦР-амплификацию или амплификацию с множественным вытеснением цепи выполняют с получением кластера ДНК, образованного популяцией клонов последовательности-носителя.

23. Способ по п. 21 или 22, дополнительно включающий следующие стадии: (4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, содержащей

захватывающую последовательность;

где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации,

(5) лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты (например, используя лигазу для лигирования молекулы второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты).

24. Способ по п. 23, где молекула второй нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность, и иммобилизующая область содержит двуцепочечную последовательность ДНК.

25. Способ по п. 23, где каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5'-конце, и вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности; где способ дополнительно включает следующие стадии:

(4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, содержащей в направлении от 5' к 3' комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность;

где комплемент второй иммобилизующей последовательности обеспечивает гибридизацию со своей комплементарной нуклеотидной последовательностью;

(5) гибридизация комплемента второй иммобилизующей последовательности со второй иммобилизующей последовательностью в условиях, обеспечивающих отжиг, и тем самым лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с последовательностью-носителем;

(6) возможно, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с последовательностью-носителем, соответственно (например, с использованием лигазы для лигирования молекулы второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты).

26. Способ по любому из пп. 23-25, где на стадии (3) первый праймер дополнительно содержит уникальный молекулярный идентификатор (UMI) на 5'-конце своей области, комплементарной первой иммобилизующей последовательности, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность UMI на 5'-конце своего комплемента первой иммобилизующей последовательности; или на стадии (4) молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, расположенную на 5'-конце захватывающей последовательности;

последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.

27. Способ по п. 22, в котором:

на стадии (1) последовательность-носитель дополнительно содержит матрицу захватывающей последовательности, расположенную в направлении против хода транскрипции от позиционной последовательности, матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и первая иммобилизующая последовательность последовательности-носителя также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER, фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR;

на стадии (3) область первой иммобилизующей последовательности, позиционная последовательность и матрица захватывающей последовательности последовательности-носителя образуют двойную цепь, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность; причем

первый праймер содержит в направлении от 5' к 3' связывающую область, область расщепления и область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки, и область расщепления содержит сайт расщепления;

и способ дополнительно включает следующие стадии:

(4) связывание первого праймера с поверхностью твердой подложки; причем стадии (3) и (4) выполняют в любом порядке;

(5) возможно, осуществление расщепления в сайте расщепления, содержащемся в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя для разрезания последовательности-носителя, так что продукт элонгации на стадии (3) отделяется от матрицы, на которой образовался такой продукт элонгации (т.е. последовательности-носителя) и, таким образом, молекула первой нуклеиновой кислоты связывается с поверхностью твердой подложки (например чипа);

предпочтительно, каждый вид последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный конкатемером множества копий последовательности-носителя.

28. Способ по п. 27, где на стадии (1) сайт расщепления, содержащийся в первой иммобилизующей последовательности, представляет собой сайт расщепления для фермента никазы;

предпочтительно, фермент никаза выбран из USER, BamHI и BmtI.

29. Способ по п. 27 или 28, где на стадии (1) последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI, расположенный в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, где комплемент последовательности UMI комплементарен последовательности UMI, и последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т;

и на стадии (3) область первой иммобилизующей последовательности, позиционная последовательность, матрица захватывающей последовательности и комплемент последовательности UMI последовательности-носителя образуют двойную цепь, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, а также последовательность UMI, расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и по ходу транскрипции от комплемента первой иммобилизующей последовательности;

при этом, предпочтительно, комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности или между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью.

30. Способ по любому из пп. 27-29, где линкер первого праймера представляет собой линкерную группу, способную присоединяться к активирующей группе (например NH₂), и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой (например NH₂);

предпочтительно, линкер содержит -SH, -DBCO или -NHS;

(DBCO), а

31. Способ по любому из пп. 27-30, где сайт расщепления, содержащийся в области расщепления первого праймера, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом;

предпочтительно, сайт расщепления, содержащийся в области расщепления первого праймера, представляет собой сайт расщепления ферментом;

предпочтительно, область расщепления первого праймера отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.

32. Способ по любому из пп. 21-31, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;

33. Способ по любому из пп. 21-32, где твердая подложка представляет собой чип;

34. Способ по любому из пп. 21-33, где на стадии (3) при осуществлении реакции элонгации последовательность-носитель секвенируют с получением информации о последовательности позиционной последовательности, содержащейся в последовательности-носителе.

35. Способ по любому из пп. 21-34, в котором перед стадией (3) включена стадия секвенирования последовательности-носителя;

предпочтительно, после выполнения секвенирования выполняют промывание для удаления дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов), добавленных к синтетической цепи в ходе секвенирования.

36. Панель нуклеиновых кислот, полученная способом по любому из пп. 23-26; где, предпочтительно, панель нуклеиновых кислот является такой, как определено в любом из пп. 3 и 5-10.

37. Панель нуклеиновых кислот, полученная способом по любому из пп. 27-31; где, предпочтительно, панель нуклеиновых кислот является такой, как определено в любом из пп. 11-16.

38. Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:

(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по п. 3 или 5 или получение панели нуклеиновых кислот способом по любому из пп. 23-26; где

панель нуклеиновых содержит многочисленные виды последовательностей-носителей, присоединенных к поверхности твердой подложки (например чипа), каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя;

каждая последовательность-носитель содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты, и молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты, или каждая последовательность-носитель содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу второй нуклеиновой кислоты, которые с ней гибридизованы;

молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующий положению данного вида последовательности-носителя на панели;

молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;

(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы второй нуклеиновой кислоты, и таким образом, положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением последовательности-носителя на панели нуклеиновых кислот;

(3) (i) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты не лигированы друг с другом, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с каждой последовательностью-носителем (например, используя лигазу);

осуществление реакции элонгации праймера, с использованием лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера и с использованием захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с захваченной молекулой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты; и/или

осуществление реакции элонгации праймера с использованием захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная захваченная нуклеиновая кислота в качестве метки пространственной информации имеет позиционную последовательность;

альтернативно, (ii) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты не лигированы друг с другом, осуществление реакции элонгации праймера с использованием молекулы второй нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы второй нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты содержит последовательность, комплементарную захваченной нуклеиновой кислоте; лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и удлиненной молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с каждой последовательностью-носителем (например, с использованием лигазы), причем удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты, лигированная с молекулой первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты;

альтернативно, (iii) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты лигированы друг с другом, осуществление реакции элонгации праймера с использованием в качестве праймера лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с молекулой захваченной нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты; и/или

осуществление реакции элонгации праймера с использованием в качестве праймера молекулы захваченной нуклеиновой кислоты и с использованием соединенных вместе лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула захваченной нуклеиновой кислоты в качестве метки пространственной информации имеет позиционную последовательность;

(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем эта часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и молекулу захваченной нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и

(5) анализ последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4);

где, предпочтительно, пространственная информация о нуклеиновой кислоте включает расположение, распределение и/или экспрессию нуклеиновой кислоты;

предпочтительно, образец представляет собой образец ткани, такой как срез ткани;

предпочтительно, срез ткани готовят из фиксированной ткани, например, фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPE) ткани или ткани, подвергнутой глубокой заморозке.

39. Способ по п. 38, применяемый для определения транскриптома в образце, где:

(а) на стадии (3)(i) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя лигированные молекулы первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, где молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК; или на стадии (3)(ii) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя молекулу второй нуклеиновой кислоты в качестве праймера для обратной транскрипции, лигируют молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу кДНК, гибридизованную с каждой последовательностью-носителем (например, используя лигазу) с получением молекулы кДНК, которая в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК; или на стадии (3)(iii) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя лигированные молекулы первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, где молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК;

и

(б) на стадии (4) высвобождают с поверхности панели по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой первую и/или вторую цепь молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь;

предпочтительно, на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.

40. Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:

(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по любому из пп. 11-16 или получение панели нуклеиновых кислот способом по любому из пп. 27-31; где панель нуклеиновых кислот содержит твердую подложку (например чип) с многочисленнымии видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя;

каждая последовательность-носитель содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты, и молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующий положению данного вида последовательности-носителя на панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;

(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы первой нуклеиновой кислоты, и таким образом, положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением молекулы первой нуклеиновой кислоты на панели нуклеиновых кислот;

(3) осуществление реакции элонгации праймера с использованием молекулы первой нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с молекулой захваченной нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты;

(5) прямой или косвенный анализ последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4);

41. Способ по п. 40, применяемый для определения транскриптома в образце, в котором:

на стадии (3) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, с использованием молекулы первой нуклеиновой кислоты в качестве праймера для обратной транскрипции, причем молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК;

на стадии (4) высвобождают с поверхности панели по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой первую и/или вторую цепь молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь;

42. Способ по любому из пп. 38-41, где многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой DNB, образованный конкатемером последовательности-носителя, или многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя.

43. Способ по любому из пп. 38-42, где на стадии (5) анализ последовательности включает секвенирование или специфичную к последовательности реакцию ПЦР.

44. Способ по любому из пп. 38-43, дополнительно включающий стадию (6): сопоставление информации, полученной путем анализа последовательности на стадии (5), с изображением образца, где изображение образца получают до или после стадии (3);

предпочтительно, изображение образца получают с применением световой, светлопольной, темнопольной, фазовоконтрастной, флуоресцентной, отражательной, интерференционной, конфокальной микроскопии или их комбинации.

45. Способ по любому из пп. 38-43, в котором до или после высвобождения с поверхности панели молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы ДНК), несущей метку пространственной информации, или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации, синтезируют комплементарную цепь или вторую цепь кДНК;

предпочтительно, в синтезе комплементарной цепи или второй цепи используют случайный праймер и полимеразу, обеспечивающую вытеснение цепи.

46. Способ по любому из пп. 38-45, который, перед анализом последовательности, дополнительно включает стадию амплификации молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы ДНК) или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации;

где, предпочтительно, стадию амплификации осуществляют после высвобождения с панели молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы ДНК) или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации, или стадию амплификации выполняют на панели in situ;

предпочтительно, стадия амплификации включает ПЦР.

47. Способ по любому из пп. 38-46, который, перед анализом последовательности, дополнительно включает стадию очистки высвобожденной молекулы нуклеиновой кислоты.

48. Способ по любому из пп. 38-47, который, перед стадией (4), дополнительно включает стадию промывания панели для удаления остатков образца (например, ткани).

49. Способ по любому из пп. 38-48, в котором на стадии (4) молекула нуклеиновой кислоты высвобождается с поверхности панели следующим способом: (1) расщеплением нуклеиновой кислоты; (2) денатурацией и/или (3) физическим способом.