RU2021118538A - Композиции и способы получения библиотек нуклеотидных последовательностей с использованием crispr/cas9, иммобилизованного на твердой подложке - Google Patents
Композиции и способы получения библиотек нуклеотидных последовательностей с использованием crispr/cas9, иммобилизованного на твердой подложке Download PDFInfo
- Publication number
- RU2021118538A RU2021118538A RU2021118538A RU2021118538A RU2021118538A RU 2021118538 A RU2021118538 A RU 2021118538A RU 2021118538 A RU2021118538 A RU 2021118538A RU 2021118538 A RU2021118538 A RU 2021118538A RU 2021118538 A RU2021118538 A RU 2021118538A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- crispr
- nucleic acid
- solid support
- double
- cas9
- Prior art date
Links
- 229920000033 CRISPR Polymers 0.000 title claims 53
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims 47
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims 39
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 title claims 2
- 108010082319 CRISPR-Associated Protein 9 Proteins 0.000 claims 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 23
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Trimethylglycine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 8
- 108091022036 biotin-binding proteins Proteins 0.000 claims 8
- 102000028710 biotin-binding proteins Human genes 0.000 claims 8
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 claims 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 7
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims 6
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 claims 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims 6
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims 4
- 102100001434 BTD Human genes 0.000 claims 4
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 claims 4
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N DMA Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229920002391 Guide RNA Polymers 0.000 claims 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims 4
- 230000001745 anti-biotin Effects 0.000 claims 4
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims 4
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims 4
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 4
- 108010053098 biotin receptor Proteins 0.000 claims 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 4
- 108010025649 holocarboxylase synthetases Proteins 0.000 claims 4
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 claims 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 claims 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims 1
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims 1
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 claims 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 claims 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 claims 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
Claims (81)
1. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на нем ферментами CRISPR/Cas9; и
(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом ферментами CRISPR/Cas9, а CRISPR/Cas9 связывается по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.
3. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
5. Способ по п. 4, в котором первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
7. Способ по п. 6, в котором огРНК содержит (GC)n или (AT)n, при этом n составляет 5-20.
8. Способ по п. 7, в котором n составляет 10.
9. Способ по п. 6, в котором огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.
10. Способ по п. 9, в котором огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.
11. Способ по любому из пп. 4-10, в котором первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков.
12. Способ по п. 11, в котором биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
13. Способ по п. 12, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.
14. Способ по любому из пп. 1-13, включающий промывку твердой подложки с иммобилизованными на ней двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты для удаления любых несвязанных нуклеиновых кислот.
15. Способ по любому из пп. 4-14, включающий амплификацию двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой поверхности.
16. Способ по п. 15, в котором амплификация включает предоставление полимеразы и праймера для амплификации, соответствующего части первого полинуклеотида.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
18. Способ по п. 18, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 103, 104, 105 или 106 ферментов на мм2.
20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором длины двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в иммобилизованной библиотеке пропорциональны плотности ферментов CRISPR/Cas9 на твердой подложке.
21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
22. Способ по п. 21, в котором микрочастицы представляют собой гранулы.
23. Способ по любому из пп. 1-22, включающий: (в) нанесение интеркалирующего красителя по меньшей мере на часть иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты для получения набора окрашенных иммобилизованных фрагментов; и получение изображения окрашенных иммобилизованных фрагментов.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает добавление биологического образца на твердую подложку.
25. Способ по п. 24, в котором биологический образец содержит клеточный лизат.
26. Способ по п. 24, в котором биологический образец содержит цельные клетки.
27. Способ по п. 24, в котором биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиального аспирата, фекалий и мацерированной ткани.
28. Способ по любому из пп. 1-27, включающий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
29. Способ по п. 28, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.
30. Способ по п. 29, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.
31. Способ по п. 29 или п. 30, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.
32. Способ по любому из пп. 1-31, включающий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.
33. Способ по п. 32, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.
34. Способ по п. 32, в котором высвобождение включает выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификации с замещением цепей (SDA), опосредованной транскрипцией амплификации (ТМА) и амплификации на основе нуклеотидной последовательности (NASBA) или другого процесса амплификации.
35. Способ по п. 34, в котором ПЦР содержит ПЦР супрессии.
36. Способ по п. 32, в котором высвобождение содержит применение света или тепла.
37. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке; и
(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом комплексами CRISPR/Cas9, а комплексы CRISPR/Cas9 связываются по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
38. Способ по п. 37, в котором биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
39. Способ по п. 38, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
40. Способ по п. 38 или 39, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
41. Способ по п. 40, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
42. Способ по любому одному из пп. 37-41, содержащий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
43. Способ по п. 42, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.
44. Способ по п. 43, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.
45. Способ по п. 43 или 44, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.
46. Способ по любому из пп. 37-45, дополнительно содержащий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.
47. Способ по п. 46, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.
48. Способ по п. 47, в котором высвобождение включает выполнение ПЦР или другого процесса амплификации.
49. Способ по п. 48, в котором ПЦР включает ПЦР супрессии.
50. Способ по п. 48, в котором высвобождение включает применение света или тепла.
51. Твердая подложка, имеющая библиотеку иммобилизованных на ней двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, полученная в соответствии со способом по любому из пп. 1-45.
52. Твердая подложка с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат ферменты CRISPR/Cas9, которые случайным образом фрагментируют целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту.
53. Твердая подложка по п. 52, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.
54. Твердая подложка по п. 53, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.
55. Твердая подложка по любому из пп. 51-54, в которой ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
56. Твердая подложка по п. 55, в которой первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
57. Твердая подложка по п. 55 или 56, в которой первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
58. Твердая подложка по п. 57, в которой огРНК содержит (GC)n или (AT)n, при этом n составляет 5-20.
59. Способ по п. 58, в котором n составляет 10.
60. Способ по п. 57, в котором огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.
61. Способ по п. 60, в котором огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.
62. Твердая подложка по любому из пп. 55-51, в которой первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит биотинсвязывающие белки.
63. Твердая подложка по п. 62, в которой биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
64. Твердая подложка по п. 63, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
65. Твердая подложка по любому из пп. 52-64, в которой ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 103, 104, 105 или 106 ферментов на мм2.
66. Твердая подложка по любому из пп. 52-65, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
67. Твердая подложка по п. 66, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.
68. Композиция, содержащая твердую подложку по любому из пп. 52-67 и один или более реагентов, уменьшающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
69. Композиция по п. 68, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
70. Твердая подложка с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке.
71. Твердая подложка по п. 70, в которой биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
72. Твердая подложка по п. 71, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
73. Твердая подложка по любому из пп. 70-72, в которой комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 103, 104, 105, 106 комплексов на мм2.
74. Твердая подложка по любому из пп. 70-73, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
75. Твердая подложка по п. 74, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.
76. Композиция, содержащая твердую подложку по любому из пп. 70-75 и один или более реагентов, снижающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
77. Композиция по п. 76, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/873,609 | 2019-07-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021118538A true RU2021118538A (ru) | 2023-01-27 |
| RU2810091C2 RU2810091C2 (ru) | 2023-12-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102628035B1 (ko) | 메틸화 서열결정을 위한 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 | |
| US9255291B2 (en) | Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing | |
| EP3760733A1 (en) | Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same | |
| EP3350732A1 (en) | Methods for preparing a next generation sequencing (ngs) library from a ribonucleic acid (rna) sample and compositions for practicing the same | |
| JP2007524399A (ja) | 機能性ｄｎａエレメントおよび細胞性タンパク質のゲノムマッピング | |
| US20080145898A1 (en) | Sequencing methods | |
| JP2015528305A (ja) | 標的ｒｎａ枯渇化組成物を調製するための方法およびキット | |
| WO2017084023A1 (zh) | 一种高通量的单细胞转录组建库方法 | |
| JP2008510471A (ja) | 非対称ｐｃｒ増幅法、その特別なプライマーおよび用途 | |
| JP2021531778A (ja) | 核酸検出方法 | |
| US11401543B2 (en) | Methods and compositions for improving removal of ribosomal RNA from biological samples | |
| Civit et al. | Evaluation of techniques for generation of single-stranded DNA for quantitative detection | |
| AU2016102398A4 (en) | Method for enriching target nucleic acid sequence from nucleic acid sample | |
| WO2021194699A1 (en) | Single cell genetic analysis | |
| Ludgate et al. | A streamlined method for analysing genome-wide DNA methylation patterns from low amounts of FFPE DNA | |
| JP2015516814A (ja) | 標的化されたｄｎａの濃縮および配列決定 | |
| JP2023533418A (ja) | シークエンシングライブラリーの収率を増加させるための方法 | |
| WO2019236726A1 (en) | Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same | |
| RU2021118538A (ru) | Композиции и способы получения библиотек нуклеотидных последовательностей с использованием crispr/cas9, иммобилизованного на твердой подложке | |
| US20220380839A1 (en) | Methods and kits for depleting undesired nucleic acids | |
| US20210268508A1 (en) | Parallelized sample processing and library prep | |
| KR20230112647A (ko) | 콘카티머를 사용한 분석물 검출 방법 | |
| JPWO2021008805A5 (ru) | ||
| US20220154173A1 (en) | Compositions and Methods for Preparing Nucleic Acid Sequencing Libraries Using CRISPR/CAS9 Immobilized on a Solid Support | |
| US20220017953A1 (en) | Parallelized sample processing and library prep |