RU2020123137A

RU2020123137A - Одномолекулярное определение и количественный анализ с помощью днк-нанотехнологии в микролунках

Info

Publication number: RU2020123137A
Application number: RU2020123137A
Authority: RU
Inventors: Хайнрих ГРАБМАЙР; Йоханнес Бенедикт ВЕРШТАЙН
Original assignee: Людвиг-Максимилианс-Универзитет Мюнхен
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2022-01-14
Also published as: KR20200098624A; US20200354777A1; CN111479930A; CA3087850A1; EP3498865A1; IL275101A; DK3498865T3; EP3498865B1; WO2019115801A1; AU2018382598A1; EP3805405A1; JP2021509013A

Claims

1. Способ определения целевой структуры, включающий:

р1) введение группы образцов хозяина, в том числе образца хозяина с целевой структурой, в микролуночный планшет таким образом, что по меньшей мере в одной микролунке имеется ровно один образец хозяина;

р2) введение по меньшей мере двух 3D-ДНК-наноструктур по меньшей мере в одну микролунку, где каждая из 3D-ДНК-наноструктур содержит одну или многие размещенные внутри молекулы флуоресцентных красителей;

а) формирование идентификационной структуры по меньшей мере в одной микролунке, которая содержит:

(i) целевую структуру, и

(ii) по меньшей мере две 3D-ДНК-наноструктуры, где каждая из 3D-ДНК-наноструктур специфично связана с целевой структурой, и где 3D-ДНК-наноструктуры соединены с попарно различными участками целевой структуры;

b) определение целевой структуры измерением по меньшей мере одного флуоресцентного сигнала,

где 3D-ДНК-наноструктуры и параметры измерения флуоресценции выбираются так, что по меньшей мере один измеренный флуоресцентный сигнал от образованной в а) идентификационной структуры может быть отличимым от флуоресцентного сигнала каждой из по меньшей мере двух изолированных 3D-ДНК-наноструктур, когда они не связаны с идентификационной структурой, где идентификационная структура связана с первой поверхностью, предпочтительно дном по меньшей мере одной микролунки.

2. Способ по п. 1, где образец хозяина представляет собой клетку, вирус, экзосому, везикулу и/или капельку.

3. Способ по п. 1 или 2, где целевая структура находится в образце хозяина, где способ дополнительно включает:

е) перевод образца хозяина в растворимую форму, предпочтительно путем жидкостного обмена с лизис-буфером, чтобы высвободить целевую структуру из образца хозяина.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где целевая структура включает или представляет собой полинуклеотид, предпочтительно по меньшей мере частично одноцепочечный полинуклеотид, предпочтительно одноцепочечный полинуклеотид, и особенно предпочтительно мРНК.

5. Микролуночный планшет для флуоресцентной микроскопии, который содержит многочисленные микролунки, где каждая микролунка содержит дно и окружную стенку, где донышки пригодны для флуоресцентной микроскопии, и где каждая из микролунок предпочтительно имеет открытую верхнюю сторону,

где микролуночный планшет дополнительно содержит:

1-ый слой, который образует дно микролунки, где 1-ый слой пригоден для флуоресцентной микроскопии и предпочтительно представляет собой покровное стекло;

2-ой слой, который нанесен на 1-ый слой, где 2-ой слой образует стенки микролунки.

6. Микролуночный планшет по п. 5, где с дном по меньшей мере одной из микролунок связаны один или более адаптеров носителя.

7. Микролуночный планшет по любому из пп. 5, 6, где 2-ой слой содержит фоторезист SU-8, предпочтительно PEG-DA, особенно предпочтительно PDMS, еще более предпочтительно Cytop, и особенно предпочтительно Liquid Glass, и/или состоит из них.

8. Способ по любому из пп. 1-4, где микролуночный планшет представляет собой микролуночный планшет по одному из пп. 5-7, и где 1-ая поверхность представляет собой дно по меньшей мере одной микролунки, где целевая структура предпочтительно связана или, соответственно, связывается с дном микролунки посредством адаптера носителя, который специфично связан с целевой структурой.

9. Способ по п. 8, дополнительно включающий:

f) закупоривание верхней стороны микролунок нанесением слоя масла на 2-ой слой;

где необязательно масло смешано с липидами, и способ необязательно дополнительно включает:

g) смывание масла путем заливания микролуночного планшета водным раствором, где необязательно водный раствор снабжен мембранными каналами.

10. Способ по любому из пп. 1-4 или 8, 9, где способ кроме дополнительно пригоден для определения одной или более дополнительных, различающихся между собой целевых структур, где различные целевые структуры попарно различаются,

где для каждой из целевых структур группа образцов хозяина в стадии р1) содержит по меньшей мере один образец хозяина с данной целевой структурой;

и где способ дополнительно включает:

с) для каждой из одной или более дополнительных, отличающихся друг от друга целевых структур: формирование в каждом случае соответственной ей идентификационной структуры, где каждая из дополнительных идентификационных структур содержит:

(i) соответственную ей дополнительную целевую структуру, и

(ii) по меньшей мере две 3D-ДНК-наноструктуры, где каждая из по меньшей мере двух 3D-ДНК-наноструктур содержит одну или более размещенных внутри молекул флуоресцентных красителей, и где каждая из по меньшей мере двух 3D-ДНК-наноструктур специфично связана с данной дополнительной целевой структурой, и где по меньшей мере две 3D-ДНК-наноструктуры связаны с попарно различными участками данной целевой структуры;

и где стадия а)дополнительно включает:

d) определение одной или многих дополнительных целевых структур измерением по меньшей мере одного флуоресцентного сигнала,

где все 3D-ДНК-наноструктуры и параметры измерения флуоресценции выбираются таким образом, что по меньшей мере один измеренный флуоресцентный сигнал от образованных в а) и с) идентификационных структур может быть отличимым от флуоресцентного сигнала всех изолированных 3D-ДНК-наноструктур, когда они не связаны с идентификационными структурами, и что измеренные флуоресцентные сигналы всех образованных идентификационных структур попарно отличаются друг от друга, где каждая из различных целевых структур может присутствовать многократно, и способ может включать многократное определение одной или многих различных целевых структур.

11. Способ по одному из пп. 8-10, где в стадии р1) образцы хозяина локализуются, для чего объем жидкости, которая содержит образец хозяина, наносят на открытую сторону микролуночного планшета и оставляют образцам хозяина время, чтобы они под действием силы тяжести опустились на дно микролунок.

12. Способ по одному из пп. 1-4 или 8-11, где способ дополнительно включает:

аа) получение матрицы носителя по меньшей мере в одной микролунке; и, необязательно:

bb) закрепление адаптера носителя на матрице носителя.

13. Способ по любому из пп. 1-4 или 9-12

h) удаление окружных стенок микролунок, предпочтительно 2-ого слоя, от донышек между стадиями р1) и а) или а) и b).

14. Набор, который содержит:

микролуночный планшет, предпочтительно по одному из пп. 5-7;

по меньшей мере две 3D-ДНК-наноструктуры, где каждая из 3D-ДНК-наноструктур содержит по меньшей мере одну размещенную внутри молекулу флуоресцентного красителя.

15. Набор по п. 14, где для каждой из по меньшей мере двух 3D-ДНК-наноструктур расстояние по меньшей мере одной размещенной внутри молекулы флуоресцентного красителя до края 3D-ДНК-наноструктуры составляет по меньшей мере 2 нм, предпочтительно по меньшей мере 3 нм, и особенно предпочтительно по меньшей мере 5 нм, где необязательно по меньшей мере одна из 3D-ДНК-наноструктур содержит по меньшей мере 2 размещенных внутри молекулы флуоресцентного красителя, и где расстояние между двумя находящимися внутри молекулами флуоресцентного красителя попарно составляет по меньшей мере 2 нм, предпочтительно по меньшей мере 5 нм, и особенно предпочтительно по меньшей мере 9 нм.