JP2021509013A - マイクロウェルにおけるdnaナノ技術による単一分子の検出または定量化 - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝情報の変換の定量分析、いわゆる遺伝子発現プロファイリング(GEP)は、異なる標的mRNA分子の数の検出および同定を必要とする(Stadler, Z. K. et al. Critical Reviews in Oncology Hematology 69, 1-11 (2009))。mRNAは、英語のメッセンジャーRNA(ドイツ語では「Boten−RNA」)という用語についての定着した略語であり、これは、ドイツにおいても使用される。mRNA配列は、対応する遺伝子の発現プロセスにおいて特異的に生成するので、分析される物質の遺伝子発現は、その方法で定量化することができる。
未解決の問題に応じて、異なる利点および欠点を有する、複数のGEPの手法がある。
マイクロアレイ。マイクロアレイを使用するGEP分析は、チップ上で特定の物理的に離れた標的配列への蛍光DNA分子の表面ハイブリダイゼーションに基づく(Trevino, V. et al. Mol Med 13, 527-541 (2007))。これらの分子は、RNA分子の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅による先立つステップにおいて生じる。これにより、マイクロアレイは、最大で数千までの配列の並列検出を可能にする。しかしながら、逆転写およびPCR増幅などの酵素反応は、系統誤差を伴うので、正確な定量化は不可能である。また、マイクロアレイに基づく方法は、約1日の比較的長いプロセスの時間を必要とし、したがって、多くの数の臨床応用に適してない。
このように、これらの従来の方法は、GEPのための上記で言及した好ましい要件のすべてを満たしておらず、例えば、必要な感度についての部分的な定量可能性を犠牲にする。
利用可能な方法の利用に基づく単一細胞に対する定量的GEPは、限られた方法でのみ可能であるが、科学的研究および工業的な研究開発の両方にとって、ならびに臨床応用にとって非常に有利であろう。
− mRNA、特に、例えば逆転写による、DNAへの翻訳なしのmRNAの直接検出
− 正確ではない増幅が定量化を損なうので、標的分子の増幅なし
− それにより:個々の標的分子の検出
− 可能な限り早い分析(分オーダー)
− 可能な限り簡単な分析、特に、少ない作業ステップ
− 分析結果と試料の元の成分との相関の可能性
この課題は、独立請求項に記載の本発明によって解決される。
本発明は、先行技術と比較して、有利な複数の態様に起因する、前述の課題の解決を可能にする。
本発明のさらなる態様によれば、分析される構造の個々の分析にもかかわらず、分析される複数の構造を並行して分析することが可能である。
冒頭で述べた既知の方法と比較して、本方法は、少ない数のステップを含み、このため、分析プロセス自体による不自然な結果の形成の危険性が低減される。
分析される構造を単離するための方法のステップは、有利には、簡単さを保ち、これは、例えば、単一の液滴への分離などの他の単離手法と比較して、本方法の遂行を大いに簡素化する。
本発明の特に有利な態様は、分析される個々の構造を分子的に分析できるだけでなく、それらの表現型、例えばそれらの形態に関して、分析することも可能であるという事実に見ることができる。これらの2つの分析結果は、互いに帰属されてもよく、その結果、分子の性質は、さらなる評価、例えば、相関分析などを可能にする、分析される構造の他の表現型の特徴に帰属されてもよい。
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入;
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)(i)標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、標的構造に特異的に結合し、3D DNAナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、少なくとも1つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第1の表面、好ましくは、少なくとも1つのマイクロウェルの底部に結合する、方法を対象とする。
したがって、本発明は、標的構造が、宿主体の内部に存在し、方法が、
e)宿主体から標的構造を放出させるための、好ましくは破壊緩衝液との液体交換による、宿主体の破壊
をさらに含む、方法の変形も対象とする。
マイクロウェルアレイは、好ましくは、蛍光顕微鏡に適している。マイクロウェルアレイは、好ましくは10〜500μメートルの直径を有する、アレイのウェル、すなわち、凹部であり、それぞれのウェルは、底部および周囲壁を含む。マイクロウェルの底部は、好ましくは、蛍光顕微鏡に適している。マイクロウェルのそれぞれは、好ましくは、開いた上面を含む。
第2の層の材料は、好ましくは、分析がマイクロウェルアレイの自己蛍光によって妨害されないように、分析に関係する波長で可能な限り低い自己蛍光を有するような方法で選択される。分析方法による蛍光測定において、第2の層の自己蛍光に起因する蛍光シグナルは、好ましくは、5つの蛍光分子、好ましくは4つの蛍光分子、より好ましくは3以下の蛍光分子を有する、3D DNAナノ構造に起因する蛍光シグナルよりも高くない。
現象上の自己蛍光δは、好ましくは0〜0.1、より好ましくは0〜10-2、さらにより好ましくは0〜10-4、特に好ましくは0〜10-6である。
マイクロウェルアレイの第2の層のために考慮される材料を分析するために、本発明の方法に関係する自己蛍光に関して、吸収および蛍光に関する以下の考慮が有用である。
I=I0×exp(−A)
(式中、吸光度Aは、
A=b×d=εabs×c×d=N×σabs
(式中、dは、照射された材料の厚さであり、bは、吸収係数であり、εabsは、濃度に関連する吸収係数(通常、吸収係数と称され、bおよびεabsの間の差は当業者には本文脈から明らかである)であり、cは、吸収するタイプの粒子の濃度である)として表すことができる)。
A=N×σabs/F=N×σabs×d/V
(式中、Nは、照射された粒子の数を指し、Fは、照射された試料の表面を指し、dは、照射された材料の厚さを指し、Vは、照射された試料の容積を指す)
である。
σabs=εabs/NA
(式中、NAは、6.022×1023モル-1のアボガドロ定数である)
を可能にする。
Iex=(h×νex)×Nexphot/(t×F)
すなわち、表面Fを横断する時間tを通して、Nexphotの光子の流れ、そのエネルギーは、h×νexであり、
吸収断面σabsの上記定義によれば、σabs.fluoと指定される蛍光粒子に関連する場合において、その結果、
Nabsphot=Nexphot×σabs.fluo/F
であり、光子は、前記時間を通して吸収される。放射された光子の数Nemphotは、吸収された光子の数および蛍光粒子の蛍光量子効率ηfluoの積であり(例えば、P. Atkins: Physikalische Chemie, 5th edition, 2013, Wiley-VCH, Weinheimを参照されたい):
Nemphot=ηfluo×Nabsphotである。
Nemphot/t=ηfluo×σabs,fluo×Iex/(h×νex)=ηfluo×(εabs,fluo/NA)×Iex/(h×νex)
が適用され、εabs,fluo(蛍光粒子についてεabs)およびηfluoは、蛍光マーカーについてのパラメーターであり、両方とも製造者によって示される。これらはまた、当業者が精通している方法を使用して、蛍光および吸収分光法によって、独立して決定されてもよい。この目的で、市販されている当業者に公知の装置、例えば以下の装置を使用してもよい:Horiba ScientificによるFluoroMax−4およびQuanta−Phi(Horiba Jobin Yvon GmbH、Bensheim、ドイツにより販売)。FluoroMax−4は、εabs,fluoの測定のために必要であり、両方の装置の組み合わせは、ηfluoの測定のために必要である。
I=Iex×e-b_mat×d
エネルギーの保存に起因して、以下の強度が吸収される。
Iabs mat=Iex×(1−e-b_mat×d)
次いで、時間tを通して、領域Fbに吸収される光子の数Nabsphot matは、
Nabsphot mat/t=Iabs/(h×νex)×Fb=Iex×(1−e-b_mat×d)/(h×νex)×Fb
である。
放射された光子の数Nemphot matは、材料の蛍光量子収量ηmatまで低減した吸収された光子の数に基づいて計算される。
Nemphot mat/t=ηmat×Nabsphot/t=ηmat×Iex×(1−e-b_mat×d)/(h×νex)×Fb
材料の単位の放射された光子の流れNemphot mat/tは、顕微鏡で得られ、顕微鏡画像によって表される蛍光シグナルに比例する。
γ=ηmat×NAvogadro×Fb×(1−e-b_mat×d)/(εabs,fluo×ηfluo)
Fb=πrairy 2=π×(0.61×λ/NA)2
(式中、πは、数学定数パイ(3.1415・・・)であり、λは、放射波長および/または放射波長範囲の中央波長であり、NAは、使用される顕微鏡の開口数である)
以下において、λは、フルオロフォアに関する自己蛍光と称され、蛍光チャネルの少なくとも1つについて、好ましくは5より低く、より好ましくは2より低く、特に好ましくは0.5より低く、最も特に好ましくは0.01より低い。
好ましい実施形態において、第2の層は、弾性材料、好ましくはPDMSからなり、マイクロウェルの上部で閉じられ、第1および第2の層は、互いに、好ましくは圧力によって、可逆的に接続される。
あるいは、または加えて、マイクロウェルはまた、特に層がガラスからなる場合、層にエッチングされてもよい。結果として、第1の連続的な底部の層、およびマイクロウェルとしてエッチングされた凹部を有する第2の上層が存在し、ここで、第2の層は、第1の層と堅く結合され、マイクロウェルの周囲壁を形成する。
好ましくは、第3の層のキャビティは、第3の層を通って伸びた入口および出口を介して、周囲の環境とさらに接続される。入口および出口は、好ましくは、特に、本発明の方法のステップにおいて、作業キャビティを液体で効率的に充填すること、および/または過剰な液体を効率的に排出することが意図される。この目的で、入口および/または出口は、標準コネクター、例えば、ルアーコネクターを備えることができる。
あるいは、または加えて、宿主体の液体のマイクロウェルへの導入は、チューブおよび/または異なる液体チャネルを用いて行うことができる。
本発明の方法の好ましい実施形態において、マイクロウェルの周囲壁、好ましくは第2の層の周囲壁が除去される、ステップe)の後に、方法のステップh)を行うことが可能である。
この実施形態は、続く方法のステップにおける液体および成分の交換を、より自由に行うことができ、第2の層のバリアによって妨げられないという利点を有する。したがって、それぞれの方法のステップは、迅速かつより経済的な方法で行うことができる。
本発明の好ましい実施形態において、方法は、
f)マイクロウェルの上面を、第2の層上に好ましくはフッ素化された油層を適用することによって閉じるステップ
をさらに含む。
そのため、方法の好ましい実施形態は、
g)マイクロウェルアレイ上に水溶液を注ぐことによって油を除去するステップ
をさらに含む。
それにより、もはや必要ではない油が、脂質二重層を残して、マイクロウェルアレイから除去される。マイクロウェルは脂質二重層によって閉じられたままである。
したがって、方法の好ましい実施形態において、ステップg)は、
g)マイクロウェルアレイ上に膜チャネルを含む水溶液を注ぐことによって油を除去するステップ
に含む。
既に記載したように、マイクロウェルチャンバーは、洗浄およびすすぎ落とされた液体の流れの方向が特に制御されるという利点を有し、特に有利である。これは、特に、水溶液および油による交互のすすぎに適用される。油によるマイクロウェルアレイの表面からの過剰の水溶液のすすぎは、特に、マイクロウェルチャンバー内の配列によって促進される、第2の層の表面に平行に動く流れの剪断効果によって容易になる。同じことは、脂質二重層の維持とともに、水溶液を用いる油のすすぎ落としにも適用される。
好ましくは、本発明の3D DNAナノ構造は、キャビティ、および少なくとも1つの内向きに配置された蛍光色素分子を有する3D DNAナノ構造であり、少なくとも1つの内向きに配置された蛍光色素分子と3D DNAナノ構造の周縁部との距離は、少なくとも2nm、好ましくは少なくとも3nm、特に好ましくは少なくとも5nmである。
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる標的構造(例えば、異なる遺伝子に由来する、すなわち異なる核酸配列を含む、2つのmRNA)の、好ましくは複数の異なる標的構造の、検出および/または定量化のための方法も対象とする。異なる標的構造は、対で区別可能である。
a)(i)それぞれの標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、それぞれの標的構造に特異的に結合し、少なくとも2つの3D DNAナノ構造が、対で異なるそれぞれの標的構造の領域と結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、少なくとも2つの異なる標的構造のそれぞれについての、同定構造の形成;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる少なくとも2つの標的構造の検出
を含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造の1つの中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、個々の異なる標的構造に対して形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択される、方法である。
好ましくは、異なる標的構造のそれぞれは、数回検出され、すなわち、特定の標的構造に帰属された同定構造のそれぞれが数回形成される。
特に、方法のステップp1)およびp2)の組み合わせが好ましい。
好ましくは、本発明のDNAナノ構造は、少なくとも1つの蛍光色素分子が付着した3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造の形状が、第2の類似または同一の3D DNAナノ構造に接近するとともに、少なくとも1つの蛍光色素分子が付着し、2つの3D DNAナノ構造の蛍光色素分子が著しく相互作用することを防止する。したがって、立体的な効果によって、DNAナノ構造の形状は、異なるDNAナノ構造の蛍光色素分子を互いに近づきすぎるのを防止する。
2つの蛍光色素分子の相互作用は、特に、蛍光消光および/またはFRETを含んでいてもよい。
したがって、「ナノレポーター」という用語は、付着したマーカー分子を有する構造を定義するために本明細書において使用され、これは、ナノメーターの範囲の寸法で測定可能および同定される特性を有する。特に、本発明のDNAナノ構造は、ナノレポーターであり得る。例えばRothemundによる他のDNAオリガミも、蛍光タンパク質のカスケードと同様に、ナノレポーターであり得る。
「マーカー分子」は、測定可能なシグナルを発する粒子を指す。特に、蛍光色素分子はマーカー分子である。蛍光色素分子のシグナルは、強度だけでなく、寿命、偏光、明滅の速度論、または同様の量であってもよい。金粒子は、この意味内でマーカー分子でもある。
本発明の3D DNAナノ構造は、好ましくは、キャビティを含み、キャビティは、少なくとも0.1ゼプトリットル(1e−22リットル)、好ましくは少なくとも10ゼプトリットル、特に好ましくは少なくとも100ゼプトリットルの容積を有する。
本発明の3D DNAナノ構造は、中空円柱状のDNAナノ構造、すなわち中空円柱体として、実質的に形成されてもよく、少なくとも1つの蛍光色素分子は、中空円柱状のDNAナノ構造の内側に付着する。中空円柱体のキャビティは、好ましくは上記に示された容積を有する。
好ましくは、本発明の3D DNAナノ構造において、少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも15、特に好ましくは少なくとも30、特に好ましくは少なくとも60の蛍光色素分子が付着する。好ましくは、3D DNAナノ構造上の蛍光色素分子は、均一である、すなわち同じタイプである。
好ましい実施形態において、3D DNAナノ構造は、実質的に楕円の円柱体として、好ましくは実質的に環状の円柱体として、形成される。
好ましい実施形態において、3D DNAナノ構造の中空円柱体は、環状の円柱体であり、少なくとも5nm、少なくとも10nm、好ましくは少なくとも20nm、好ましくは少なくとも20nmの外半径、好ましくは30nm〜80nm、好ましくは50nm〜70nmの外半径、特に好ましくは60nmの外半径を有する。外半径は、構造の外筒の外半径を指す。
好ましい実施形態において、好ましくは環状の外筒である3D DNAナノ構造の中空円柱体は、最大で200nmの高さ、好ましくは60nm〜30nmの高さ、特に好ましくは30nmの高さを有する。構造の高さは、外筒の高さを指す。
好ましい実施形態は、互いからの、好ましくは3D DNAナノ構造の内側の色素分子の十分な距離で十分な数の色素分子を付着させるために、十分なサイズの3D DNAナノ構造を確実にする。
好ましくは、本発明の3D DNAナノ構造は、DNA二重らせんの直径に少なくとも相当する壁厚を含む。好ましくは、壁厚は、2〜4本、特に好ましくは3本のDNA二本鎖のための空間を有し、DNA鎖は、好ましくは、それらの長さにおける壁厚に垂直で配列され、加えて、ハニカム空間格子の隣接する空間格子の部位に配列される。
中空円柱体の内径は、中空円柱体の外径および壁厚の差として定義される。したがって、好ましい内径は、本明細書に示される外径および壁厚における詳細からもたらされる。
記載されている最小の壁厚は、周囲から色素を遮断する3D DNAナノ構造の形状と組み合わせて、3D DNAナノ構造の色素と、キャリアおよび/または別の3D DNAナノ構造に付着し得る別の色素の表面との相互作用が、立体障害によって防止されるという事実にも寄与する。したがって、特に、別の色素、および/もしくはキャリア、特に基材の表面との非特異的な結合による消光ならびに/またはFRFTが防止される。
バスケットの開いた側は、好ましくは、少なくとも5nmの外径、好ましくは30nm〜60nmの内半径、特に好ましくは60nmの内半径を含む。開いた上面および閉じた上面を有する中空円柱体は、バスケットの特定の場合である。
本発明の3D DNAナノ構造は、中空球の形態を含んでいてもよく、好ましくは内向きに配置されたマーカー分子を備えていてもよい。
本発明の3D DNAナノ構造は、四面体、八面体、立方体、六面体、ピラミッドなどのワイヤーフレーム形状でもある。
フルオロフォアアダプターのためのステープル鎖についての同じモデルによれば、1つのステープル鎖がそれぞれの3D DNAナノ構造についての標的アダプターのために設計され、ステープル鎖の位置についての選択基準は、異なる、例えば、標的構造との良好な結合効率のための露出であってもよい。
この文脈において、これは、好ましくはk>2、好ましくはk>3、より好ましくはk>4、さらにより好ましくはk>5、特に好ましくはk>6;および/またはm>2、好ましくはm>3、より好ましくはm>4、さらにより好ましくはm>5、特に好ましくはm>6が好ましく適用される。
a)(i)標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、3D DNAナノ構造のそれぞれが、標的構造に(特異的に)結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、同定構造の形成;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
好ましくは、少なくとも2つの3D DNAナノ構造は、対で異なる標的分子の領域/セグメントに結合する。したがって、標的構造の検出のためのより高い特異性が達成される。
特に、方法のステップp1)およびp2)を有する前記方法の組み合わせが好ましい。
それ故に、方法の好ましい実施形態において、標的構造は、ポリヌクレオチド、好ましくは部分的に一本鎖のポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAを有し得るか、またはこれらであり得る。
a)(i)mRNA、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、3D DNAナノ構造のそれぞれが、対で異なるmRNAの配列セグメントに(特異的に)結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、同定構造の形成;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、mRNAを有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入;
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)(i)mRNA、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、3D DNAナノ構造のそれぞれが、対で異なるmRNAの配列セグメントに(特異的に)結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、同定構造を形成するステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによるmRNAの検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
本発明の方法に関して、「3D DNAナノ構造」は、本発明の3D DNAナノ構造に関連して上記に定義されたものと同じものを指す。言い換えれば、3D DNAナノ構造は、DNAオリガミと称してもよい。
同定構造の部分である少なくとも2つの3D DNAナノ構造の、好ましくは少なくとも1つ、好ましくはすべてが、本明細書に記載の本発明の3D DNAナノ構造である。
しかしながら、色および/または強度の代わりに他の変数も利用することができ、これらは、例えば色分子の退色率または蛍光の寿命などの異なる同定構造の蛍光シグナルを区別するために適している。
定量化は、内部標準または経験的データに基づいて行うこともできる。好ましくは、内部標準は、既知の濃度との比較値を定義する。
好ましい実施形態において、方法のステップaa)において、好ましくは、方法のステップp1)の後、キャリアマトリックスは、マイクロウェルアレイにおいて生成され、キャリアアダプターは、好ましくは、方法のステップbb)においてキャリアマトリックスに固定される。
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、mRNAを有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入;
aa)少なくとも1つのマイクロウェル中でキャリアマトリックスを生成するステップ、
bb)キャリアアダプターをキャリアマトリックスに付着させるステップ、
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)(i)mRNA、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、3D DNAナノ構造のそれぞれが、対で異なるmRNAの配列セグメントに(特異的に)結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、同定構造を形成するステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによるmRNAの検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
mRNA以外の他の標的構造について、変更すべきところは変更して前記方法を使用することも可能である。
好ましくは、結合部位、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、キャリアアダプターまたは中間キャリアアダプターは、以下の距離/パターン/密度で、キャリアおよび/またはキャリア表面上に配列される。
好ましくは、すべてまたは実質的にすべての結合部位は、少なくとも250nm、好ましくは少なくとも500nm、特に好ましくは少なくとも1μmの距離を有する。好ましくは、結合部位は、上記で言及されたエッジの長さを有する六角形の空間格子で配列される。結合部位はまた、好ましくは、1e−5/μm2〜1e3/μm2、好ましくは1e−3/μm2〜4/μm2、特に好ましくは0.1/μm2〜1/μm2の表面密度で、任意の方法においてキャリアおよび/またはその表面上で配列され得る。前記表面密度は、結合部位の十分な距離を確実にする。
上記で言及されたように、本方法における標的構造は、タンパク質でもあり得るか、またはタンパク質も含み得る。この場合において、キャリアアダプターは、標的構造に(特異的に)結合する、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むか、またはこれらであることが特に好ましい。
洗浄ステップは、好ましくは、緩衝溶液を用いて行われる。他の洗浄ステップに関連して上記で既に定義された、緩衝液の成分が好ましい。
同定構造において、3D DNAナノ構造は、直接的に、または標的構造への標的アダプターを介してのいずれかで結合することができる。
標的結合アダプターは、好ましくは、1つ(および/または少なくとも1つ)の標的結合セグメントを含む。標的結合セグメントは、好ましくは、それが、それぞれの同定構造が結合する、標的構造および/または標的構造のそれぞれの領域への特異的結合を媒介するように設計される。
標的構造は、タンパク質であるか、またはタンパク質を含む場合、標的アダプターの標的結合セグメントは、ペプチド/タンパク質、またはタンパク質に特異的に結合する抗体(および/または抗体の抗原結合フラグメント)を含み得るか、またはこれらであり得る。
好ましくは、標的構造の検出のための本発明の方法は、第1の標的構造と異なる(ここで、異なる標的構造は対で異なる)さらなる標的構造の検出のためにも設定される。それ故に、この方法は、少なくとも2つの異なる標的構造の検出のための方法とも称することができ、少なくとも2つの異なる標的構造は、互いに対で区別可能である。
ここで、異なる標的構造が、対で異なり、
標的構造のそれぞれについて、ステップp1)における宿主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも1つの宿主体を含み;
方法が、
c)互いに異なる1つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれ割り当てられた同定構造を形成するステップであって、さらなる同定構造のそれぞれが、
(i)それぞれの割り当てられたさらなる標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、少なくとも2つの3D DNAナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域と結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、ステップ
をさらに含み;
ステップa)が、
d)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる、1つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の1つの中で結合しない場合に、a)およびc)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが、複数回存在していてもよく、方法が、1つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、方法を対象とする。
標的構造の検出について上記で言及したことは、変更すべきところは変更して、異なる標的構造のさらなるおよび/またはそれぞれのさらなる標的構造の検出に適用される。特に、標的構造、同定構造、同定構造のキャリアへの結合または結合状態、キャリアアダプター、3D−DNAナノ構造、標的アダプターおよびさらに任意の方法のステップに関する上記のすべては、変更すべきところは変更して、少なくとも1つ、好ましくはすべてのさらなる同定構造に適用可能である。
a)(i)それぞれの標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、3D DNAナノ構造のそれぞれが、標的構造に(特異的に)結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、少なくとも2つの異なる標的構造のそれぞれについての、同定構造の形成;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる少なくとも2つの標的構造の検出
を含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造の1つの中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、かつ個々の異なる標的構造に対して形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択される、方法も対象とする。
方法が、2つ以上の標的構造の検出のためである場合、特に好ましくは、さらなる標的構造の1つ、好ましくはすべてのさらなる同定構造を含む、少なくとも1つのさらなる同定構造は、キャリアに結合する/結合している。特に好ましくは、すべての同定構造は、同じキャリアに結合する。同定構造に関連して言及された上記の「結合している」および「結合する」は、より多く/さらなる同定構造の場合における「結合する」および「結合している」に対して、変更すべきところは変更して、適用される。
同定構造の形成は、成分の混合物がそこに結合するインキュベーション期間を含むことができる。好ましくは、インキュベーション期間は、5分〜20時間、好ましくは1時間〜20時間(例えば、1時間、2時間、4時間、8時間)、特に好ましくは10時間〜20時間であり得る。
本発明の方法において、1つまたはいくつかの同定構造はまた、連続的(好ましくは上記で言及された緩衝溶液中)の代わりに1ステップで形成され得、キャリアに結合し得る。
q)蛍光顕微鏡、好ましくは落射蛍光顕微鏡、TIRE顕微鏡、光シート顕微鏡および/または共焦点顕微鏡による、試料の部分/区分から放射された蛍光シグナルに関するデータを含有するデータセットを作成するステップ
を含む。言い換えれば、少なくとも1つの蛍光シグナルの測定は、例えば、二次元または三次元の試料の部分によって放射される強度が、ピクセルまたはボクセルで測定および保存するという点で、いくつかの蛍光シグナルまたは複数の蛍光シグナルの測定を含むことができる。この文脈において、測定は、いくつかの励起波長および/もしくはいくつかの検出波長(バンド)による同時または連続的な測定を含むこともできる。
w)同定構造の1つの蛍光シグナルを表す、データセット中に含有される1つまたは複数のデータムの同定
を含む。
この同定は、例えば、特定の励起波長および/もしくは検出波長によるピクセルまたはボクセルの測定された強度と、そのような所定の組み合わせのセットとの比較を含むことができ、この結果、比較は、組み合わせが割り当てられている同定構造を示す。
w1)(好ましくは)データムおよび/または画像要素の色および/または強度情報の読み出し、ならびに
w2)(好ましくは)データムおよび/または画像要素の色および/または強度情報を、同定構造について代表する色および/または強度情報と比較するステップ
を含むことができる。
DNAナノ構造における蛍光色素の選択に応じて、標的構造は、それらの色によって、および/またはそれらの強度によって、区別可能である。好ましくは、試料の部分は、すべての色で個々に記録され、別々の画像で保存される。しかしながら、試料の部分はまた、いくつかの色で同時に記録され得、異なる色の記録は、共通の画像において、または別々の画像において、保存される。
これらのステップは、手動、手動であるがソフトウェアによる支援、または分析ソフトウェアにより自動的に、行うことができる。
手動分析は、例えばFijiなどの画像分析ソフトウェアによるソフトウェアの支援によって、行うことができる。完全に自動化された分析へのスムーズな移行が存在する。一般に、手動またはソフトウェアによる任意の個々のステップを行うことが可能である。
本発明の1つの態様は、ソフトウェアによる分析であって、分析が、ノイズ法による密度に基づく適用の空間クラスタリング(要するにDBSCAN)に基づく、分析に関する。説明は、分析される画像がいくつかの蛍光要素を有する場合についての適用に基づく。分析は、当然ながら、1つのみの蛍光要素が画像に存在するか、蛍光要素が画像に存在しない場合、同じ方法で作業される。
この文脈において、以下が好ましく適用される:k>2、好ましくはk>3、より好ましくはk>4、さらにより好ましくはk>5、特に好ましくはk>6。さらにまた、以下が好ましく適用される:m>2、好ましくはm>3、より好ましくはm>4、さらにより好ましくはm>5、特に好ましくはm>6。
特に、それぞれ直交測定可能なタイプのナノレポーターおよび/または3D DNAナノ構造の強度勾配は、例えば、数、距離または方向の変動によって、異なって選択することができる。勾配は、光子のポアソン統計または不完全なマーカー分子の付着などの因子に起因して拡張される強度分布が重複しないように、非常に大きくあり得る。したがって、分析は簡単で、測定値はナノレポーターによって直接同定することができる。一方、勾配はまた、隣接する強度勾配の強度分布が0.1〜10%まで、さらに5〜80%まで重複するように、より小さくあり得る。したがって、測定の後、直交測定の結果の分布からのベクトルを、予測されるベクトルと比較することができ、標的分子の相対頻度を、最小二乗または最大尤度に基づく方法によって決定することができる。同じことは、予測される分布を含めるか、または含めることなく、クラスターに基づく機械学習の方法で達成することができる。
また、この文脈において、以下が好ましく適用される;k>2、好ましくはk>3、より好ましくはk>4、さらにより好ましくはk>5、特に好ましくはk>6:および/またはm>2、好ましくはm>3、より好ましくはm>4、さらにより好ましくはm>5、特に好ましくはm>6。
マイクロウェルアレイ、好ましくは既に記載した実施形態のいずれか1つのマイクロウェルアレイ;
少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含むキットであって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、少なくとも1つの内向きに配置された蛍光色素分子を含む、キットを対象とする。
3D DNAナノ構造は、好ましくは、上記または本明細書の以下で記載される3D DNAナノ構造である。
本発明の1つの態様は、複数の異なる標的構造の検出および/または定量化のために提供されるキットに関する。好ましくは、本発明のキットは、したがって、複数の3D DNAナノ構造のセットを含み、セットは、N個の異なる3D DNAナノ構造を含み、セットのN個の異なる3D DNAナノ構造は、蛍光色素分子中で互いに対で異なる。
a.それぞれのタイプの標的構造に対して、1つまたは複数の直交測定可能なナノレポーター(例えば、本発明の3D DNAナノ構造)の一義的な組み合わせを、それぞれのタイプの標的構造が一義的な方法で区別可能および同定可能であるような方法で、割り当てる、
b.それぞれのタイプの標的構造のために、ナノレポーターとして少なくとも多くの結合領域を同定し、特異的および一義的に結合領域に結合することが可能なアダプターを選択する、
c.1つのタイプの標的構造に割り当てられたナノレポーターおよびアダプターを、一時的に対合およびカップリングさせる、
d.任意に、ナノレポーターに割り当てられなかったアダプターを、基材、キャリアまたはマトリックスとカップリングさせる、
e.ナノレポーターおよびアダプターからなる複合体を、溶液中の標的構造とともにインキュベートする、
f.標的分子、アダプターおよびナノレポーターからなる得られた複合体を、存在するマーカーについて、許容可能な低い確率でのみ、2つ以上の複合体が測定事象の原因となるような方法で、測定装置により測定する、
g.直交シグナルの最小数を有さない測定事象を取り除く、
h.他の測定事象は、
i.個々のシグナルによって直接割り当てられたナノレポーターの組み合わせを、または
ii.測定シグナルの測定された分布およびそれぞれのナノレポーターについて予測される分布の比較による、ナノレポーターの組み合わせに由来する、統計学的に割り当てられた確率、または
iii.クラスターに基づくアルゴリズムによる、ナノレポーターの組み合わせに由来する、割り当てられた確率
のいずれかである、
i.標的構造の相対数を、ナノレポーターの計算された組み合わせの総数、またはその確率によって決定する、および
j.任意に、少なくとも1つの標的構造の既知の絶対濃度により、または既知の測定容積により、標的構造の絶対数を決定する、ならびに
k.任意に、すべての他のナノレポーターに関して直交測定することができるナノレポーターは、その測定シグナルが、1つの測定事象に基づく標的構造の数に対する情報を提供するように、すべての標的構造について設計することができる。
特に、本発明の方法および/または3D DNAナノ構造は、遺伝子発現分析、好ましくは単一細胞レベルでの遺伝子発現分析のために使用されることが想定される。
1)マイクロウェルに宿主体を提供する。
2)ポリマーマトリックス(すなわちキャリア)により宿主体を包む;ポリマーマトリックスが、非常に迅速な方法で生成され、その結果、宿主体の破壊の前に宿主体がその標的構造の組成を変化させることができないこと、またはポリマーマトリックスが、宿主体の標的構造の組成がこれによって影響されないように生成されることを確実にしなければならない。後者は、例えば、低融点のアガロースを使用することによって確実にすることができる。
3)宿主体を破壊する、例えば、宿主体が細胞である場合において、溶解(例えば、超音波、浸透もしくは凍結により機械的に;または例えば、pH値の改変、EDTA、例えば、リゾチームなどの酵素、トルオール、Triton−XもしくはTrizolの導入によって化学的に、これは細胞壁もしくは膜をすべて不安定化するか、または自己分解を誘導する)によって宿主体を破壊し、その結果、mRNAは、宿主体から、例えば細胞に放出される。
(a)マイクロウェル中で、ポリマーマトリックスにより部分的または完全に細胞を包むこと;
(b)相補的オリゴヌクレオチドなどの標的分子へ結合することを可能にする要素でポリマーマトリックスを装飾すること;
(c)標的構造が拡散し、装飾要素と結合するように、宿主体を破壊すること;
(d)3D DNAナノ構造または他の要素を添加すること、および適切なインキュベーション期間後にこれらを洗い流すこと;
(e)試料を、例えば、落射蛍光顕微鏡、光シート顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化すること、および上記に記載のようにしてそれを分析すること
が好ましくあり得る。
本明細書において、「細胞」という用語は、すべての生物有機体、特に、ヒト細胞、組織試料からの細胞、動物細胞、細菌、真菌、藻類を含む。特に、細胞について記載されるすべての特徴は、変更すべきところは変更して、他の宿主体に適用される。
・拡散に起因するマイクロウェルからの標的構造の損失を最小化するために、標的分子の拡散を制限すること、および/または
・マイクロウェルあたりより多くの標的構造を分析することができるように、標的構造のためのより多くの固定点を提供すること
である。
1.マイクロウェルアレイ中での分析される宿主体の蓄積。
2.ポリマーマトリックスによる宿主体の包囲。
3.標的構造が放出され得るように宿主体の破壊。
4.キャリア(ポリマーマトリックスおよび/またはマイクロウェルの第1および第2層の表面)における同定構造の形成。
5.対応する機器による同定構造の検出。
6.検出された同定構造、および対応する標的構造の分析およびそれらの元の宿主体への割り当て。
1.標的構造の検出(好ましくは定量化)のための方法であって:
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入;
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)(i)標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、3D DNAナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、少なくとも1つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第1の表面、好ましくは少なくとも1つのマイクロウェルの底部に結合する、方法。
2.標的構造が、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAである、態様1に記載の方法。
3.同定構造が、キャリア、好ましくはキャリアの第1の表面に結合し、および/または方法が、形成された同定構造をキャリア、好ましくはキャリアの第1の表面に結合させるステップをさらに含む、態様1または2に記載の方法。
5.キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様3または4に記載の方法。
6.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に対する同定構造の結合および/または結合状態が、標的構造によって媒介され、および/または媒介されている、態様3〜5に記載の方法。
7.標的構造がキャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に結合し、および/または結合しており、結合および/または結合状態が、標的構造に特異的に結合する、および/または結合しているキャリアアダプターによって媒介される、態様6に記載の方法。
8.キャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第1の表面に直接結合する、および/または直接結合している、態様7に記載の方法。
9.キャリアアダプターが、共有結合または非共有結合によってキャリアまたはキャリアの第1の表面に結合する、および/または結合している、態様7または8に記載の方法。
12.標的構造が、ポリ(A)テールを有するmRNAであり、キャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドであり、その核酸配列がmRNAのポリ(A)テールに特異的に結合するように設計される、態様7〜10のいずれか1つに記載の方法。
13.方法が、a)の後でb)の前に、キャリアおよび/または第1のキャリア表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様3〜12のいずれか1つに記載の方法。
14.3D DNAナノ構造の1つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべてが、標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計され、および/または標的分子に直接結合している、態様1から13のいずれか1つに記載の方法。
16.3D DNAナノ構造が、ナノ構造の外部にまたは外部の上に整列し、およびそれがそれぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される少なくとも1つの一本鎖DNAセグメントを含む、態様15に記載の方法。
17.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの3D DNAナノ構造に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれ設計される一本鎖DNAセグメントを含む、態様15または16に記載の方法。
18.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれ設計される標的結合セグメントを含む、態様15〜17のいずれか1つに記載の方法。
19.標的構造が態様2に定義した標的構造であり、それぞれの標的結合セグメントが、標的構造の1つの一本鎖セグメントに特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、態様18に記載の方法。
20.標的構造がタンパク質を含むかまたはタンパク質であり、それぞれの標的結合セグメントが、標的構造のタンパク質に特異的に結合するペプチド、好ましくは抗体を含む、態様18に記載の方法。
c)互いに異なる1つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれに割り当てられた同定構造の形成であって、さらなる同定構造のそれぞれが、
(i)割り当てられたさらなる標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、および少なくとも2つの3D DNAナノ構造が対で異なるそれぞれの標的構造の領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、それぞれに割り当てられた同定構造の形成
をさらに含み、
ステップb)が
d)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる1つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の1つの中で結合しない場合、a)およびc)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての形成された同定構造の測定された蛍光が、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが複数回存在していてもよく、方法が、1つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、
態様1から22のいずれか1つに記載の方法。
24.さらなる標的構造のそれぞれが、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAである、態様23に記載の方法。
27.キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様25または26に記載の方法。
28.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に結合する/結合している少なくとも1つ、好ましくはすべての同定構造の結合および/または結合状態が、それぞれの標的構造によって媒介される、および/または媒介されている、態様25〜27のいずれかに記載の方法。
29.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に対するそれぞれの標的構造の結合および/または結合状態が、それぞれの標的構造に特異的に結合するそれぞれに割り当てられたキャリアアダプターによって媒介される、態様28に記載の方法。
30.それぞれのキャリアアダプターがキャリアまたはキャリアの第1の表面に直接結合する、および/または結合している、態様29に記載の方法。
31.それぞれのキャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第1の表面に、共有結合または非共有結合によって結合する、および/または結合している、態様29または30に記載の方法。
34.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に結合した標的構造が、ポリ(A)テールを有するmRNAであり、前記結合した標的構造のそれぞれのキャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドであり、その核酸配列が、それがmRNAのポリ(A)テールに特異的に結合するように設計される、態様29〜33のいずれか1つに記載の方法。
35.a)およびc)が1ステップで、好ましくは同時に実施される、態様23〜34のいずれか1つに記載の方法。
36.a)およびc)の後でb)の前に、キャリアまたはキャリアの第1の表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様25〜35のいずれか1つに記載の方法。
37.1つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべての3D DNAナノ構造が、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計され、および/または標的分子に直接結合している、態様23〜36のいずれか1つに記載の方法。
39.少なくとも1つ、好ましくはすべての3D DNAナノ構造が、ナノ構造の外部または外部の上に整列し、それぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される、少なくとも1つの一本鎖DNAセグメントを含む、態様38に記載の方法。
40.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの3D DNAナノ構造に対する特異的結合を媒介するように設計される一本鎖DNAセグメントを含む、態様38または39に記載の方法。
41.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するように設計される標的結合セグメントを含む、態様38〜40に記載の方法。
42.すべての標的構造が同じ試料に存在し、好ましくは試料溶液中に提供される、態様23〜41のいずれか1つに記載の方法。
45.同定構造または少なくとも1つおよび/もしくはすべての同定構造が、複数回形成される、態様1〜44のいずれか1つに記載の方法。
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入であって、標的構造のそれぞれについて、縮主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも1つの宿主体を含む、導入;
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)少なくとも2つの異なる標的構造のそれぞれについて、それぞれの同定構造を形成するステップであって、
(i)それぞれの標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、少なくとも2つの3D DNAナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、ステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる、1つまたは複数の異なる標的構造の検出
を含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の1つの中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、個々の標的構造について形成された異なる同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが複数回存在してもよく、方法が、1つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、方法。
47.少なくとも2つの標的構造が、同じ試料に存在する、態様46に記載の方法。
48.標的構造の少なくとも1つ、好ましくはそれぞれが、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAである、態様1に記載の方法。
50.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面が、ガラス表面および/もしくはポリマー表面を含む、および/またはガラス表面および/もしくはポリマー表面からなり、ならびに/またはポリマー表面が任意に不動態化されている、態様49に記載の方法。
51.キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様49または50に記載の方法。
52.キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に結合する、および/または結合している少なくとも1つ、好ましくはすべての同定構造の結合および/または結合状態が、それぞれの標的構造によって媒介される、または媒介されている、態様49〜51のいずれかに記載の方法。
54.それぞれのキャリアアダプターが、キャリアおよび/またはキャリアの第1の表面に直接結合する、および/または結合している、態様53に記載の方法。
55.それぞれのキャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第1の表面に、共有結合または非共有結合によって結合する、および/または結合している、態様53または54に記載の方法。
58.キャリアまたはキャリアの第1の表面に結合した標的構造が、ポリ(A)テールを有するmRNAであり、前記結合した標的構造のそれぞれのキャリアアダプターがオリゴヌクレオチドであり、その核酸配列がmRNAのポリ(A)テールに特異的に結合するように設計される、態様53〜57のいずれか1つに記載の方法。
59.a)の後でb)の前に、キャリアおよび/または第1のキャリア表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様49〜58のいずれか1つに記載の方法。
60.1つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべての3D DNAナノ構造が、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計されており、および標的分子に直接結合する、態様46〜59のいずれか1つに記載の方法。
62.少なくとも1つ、好ましくはすべての3D DNAナノ構造が、外向きに配置され、それぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される少なくとも1つの一本鎖DNAセグメントを含む、態様61に記載の方法。
63.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの3D DNAナノ構造に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれが設計される一本鎖DNAセグメントを含む、態様61または62に記載の方法。
64.1つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれが設計される標的結合セグメントを含む、態様61〜63のいずれか1つに記載の方法。
65.少なくとも2つの標的構造の第1が、態様48に定義した標的構造であり、第1の標的構造に結合する標的結合アダプターの標的結合セグメントが、第1の標的構造の1つの一本鎖セグメントに特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、態様64に記載の方法。
66.態様63の特色がまた、すべてのさらなる標的構造およびそれぞれの標的結合アダプターのそれぞれの標的結合セグメントにも当てはまる、態様65に記載の方法。
67.少なくとも2つの標的構造の第1がタンパク質を含むかまたはタンパク質であり、第1の標的構造に結合する標的結合アダプターの標的結合セグメントが、第1の標的構造に特異的に結合するペプチド、好ましくは抗体を含む、態様64に記載の方法。
68.態様63の特色がまた、すべてのさらなる標的構造およびそれぞれの標的結合アダプターのそれぞれの標的結合セグメントにも当てはまる、態様67に記載の方法。
70.少なくとも2つの標的構造を含有する試料溶液を、少なくとも2つの3D DNAナノ構造、ならびに任意にキャリアアダプターおよび/または標的アダプターと混合するステップをさらに含む、態様46〜69のいずれか1つに記載の方法。
q)蛍光顕微鏡、好ましくは落射蛍光顕微鏡、TIRF、光シート顕微鏡、および/または共焦点顕微鏡を使用することによって、試料の区分から放射された蛍光シグナルのデータを含有するデータセットを作成するステップ
を含み、
標的構造および/または1つもしくは複数のさらなる標的構造の検出が、
w)同定構造の1つの蛍光シグナルを表す、データセットに含有される1つまたは複数のデータを同定するステップ
を含む、態様1から70のいずれか1つに記載の方法。
72.ステップq)が、
試料区分の蛍光データを含有する少なくとも1つの画像ファイルを記録するステップ
を含む、態様71に記載の方法。
73.ステップw)における同定するステップが、以下のステップ:
w1)データおよび/または画像要素の色および/または強度情報の読み出し、ならびに
w2)データおよび/または画像要素の色および/または強度情報を、同定構造を表す色および/または強度情報と比較するステップ
を含む、態様71または72に記載の方法。
w1)データおよび/または画像要素の色および強度情報の読み出し、ならびに
w2)データおよび/または画像要素の色および強度情報を、同定構造を表す色および強度情報と比較するステップ
を含む、態様73に記載の方法。
75.個々の異なる標的構造について形成された同定構造の蛍光シグナルが、それらが同定構造の1つの中で結合しない場合、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルとは異なり、および個々の異なる標的構造について形成された同定構造の蛍光シグナルが、対応する蛍光シグナルが、色および/または強度情報の区別可能に異なる組み合わせを含むという点において対で異なる、態様73または74に記載の方法。
77.k>2であり、好ましくはk>3であり、より好ましくはk>4であり、さらにより好ましくはk>5であり、特に好ましくはk>6である、態様76に記載の方法。
78.m>2であり、好ましくはm>3であり、より好ましくはm>4であり、さらにより好ましくはm>5であり、特に好ましくはm>6である、態様76または77に記載の方法。
81.相互作用が消光および/またはFRETを含む、態様80に記載の3D DNAナノ構造。
82.少なくとも2つの蛍光色素分子が3D DNAナノ構造に結合し、少なくとも2つの蛍光色素分子の間の距離が、それらが有意に相互作用する距離より対で大きい、態様80または81に記載の3D DNAナノ構造。
83.3D DNAナノ構造が本質的に中空円柱体として形成され、少なくとも1つの蛍光色素分子または少なくとも2つの蛍光色素分子が円柱状のDNAナノ構造の内側に付着する、態様80〜82のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
85.3D DNAナノ構造が少なくとも2つの内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの内向きに配置された蛍光色素分子の距離が、少なくとも2nm、好ましくは少なくとも5nm、特に好ましくは少なくとも9nmである、態様84に記載の3D DNAナノ構造。
86.3D DNAナノ構造が、本質的に楕円の中空円柱体として、好ましくは環状の中空円柱体として形成される、態様80〜85のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
87.中空円柱体が環状の円柱体であり、少なくとも5nmの内径、好ましくは30nm〜60nmの内径、特に好ましくは60nmの内径、および/または最大で200nmの高さ、好ましくは30nm〜60nmの高さ、特に好ましくは30nmの高さを含む、態様86に記載の3D DNAナノ構造。
89.3D DNAナノ構造が、少なくとも3000塩基,好ましくは5000〜50000塩基、特に好ましくは10000〜11000塩基の一本鎖DNAスキャフォールド鎖を含み、DNAスキャフォールド鎖が、好ましくは環状である、態様80〜88のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
90.複数のステープル鎖をさらに含み、好ましくはそれぞれが好ましくは30〜100塩基を有する100〜500個のステープル鎖を含む、態様89に記載の3D DNAナノ構造。
91.内向きに配置された蛍光色素分子の1つがステープル鎖の内向きに配置されたセグメントに結合し、好ましくは内向きに配置された蛍光色素分子のそれぞれがステープル鎖のそれぞれの内向きに配置されたセグメントに結合する、態様90に記載の3D DNAナノ構造。
93.ステープル鎖の内向きに配置された一本鎖配列セグメントが、内向きに配置され、3D DNAナノ構造のアセンブリにとって必要ではないオーバーハングである、態様92に記載の3D DNAナノ構造。
94.標的構造、好ましくはポリヌクレオチド標的構造、特に好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド標的構造に特異的に結合し得る一本鎖DNAセグメントを含む、態様80〜93のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
95.3D DNAナノ構造が、少なくとも1つの標的アダプターをさらに含み、標的アダプターが標的構造に対する特異的結合を媒介し得る、態様80〜94のいずれかに記載の3D DNAナノ構造。
97.標的アダプターが、標的構造に特異的に結合し得る標的結合セグメントをさらに含む、態様95または96に記載の3D DNAナノ構造。
98.標的結合セグメントが第2の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むか、または第2の一本鎖ポリヌクレオチド配列であり、標的構造が、一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくはmRNAを含む、態様97に記載の3D DNAナノ構造。
99.標的結合セグメントが、標的構造に特異的に結合するタンパク質、好ましくは抗体または抗体の抗体結合性断片を含む、態様97に記載の3D DNAナノ構造。
100.標的アダプター、好ましくは少なくとも標的結合セグメントが外向きである、態様95〜99のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
101.外向きに位置する蛍光色素分子を含まない、態様80〜100のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造。
102.態様1〜79のいずれか1つに記載の方法のための態様80〜101のいずれか1つに記載の3D DNAナノ構造の使用。
103.セットが、互いに異なるN個の3D DNAナノ構造を含み、セットのN個の異なる3D DNAナノ構造が、蛍光色素分子により互いに対で異なる、態様80〜101のいずれか1つに記載の複数の3D DNAナノ構造を含むセット。
105.互いに異なるN個の3D DNAナノ構造の少なくとも一部がセットに複数回含有され、それによってk個の強度レベルのそれぞれが強度分布によって形成され、k個の強度分布が互いに、好ましくは統計学的に区別可能である、態様104に記載のセット。
107.隣接する分布の重複が、30%より小さい、好ましくは10%より小さい、より好ましくは5%より小さい、さらにより好ましくは2%より小さい、特に好ましくは1%より小さい、態様105または106に記載のセット。
108.k>2、好ましくはk>3、より好ましくはk>4、さらにより好ましくはk>5、特に好ましくはk>6である、態様104〜107のいずれか1つに記載のセット。
109.m>2、好ましくはm>3、より好ましくはm>4、さらにより好ましくはm>5、特に好ましくはm>6である、態様104〜108のいずれか1つに記載のセット。
110.態様1〜79のいずれか1つに記載の方法のための態様103〜109のいずれか1つに記載のセットの使用。
以下に、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照してより詳細に説明する。図面は、以下を示している:
図1の底部では、3つの3D DNAナノ構造1eが、例示的に標的構造1gに結合し、蛍光条件で測定した3つの3D DNAナノ構造1eの強度は、互いに異なり、これは「明るい」、「弱い」、および「中間」として示され、3D DNAナノ構造に存在する蛍光分子の異なる数によって引き起こされる。
以下の非制限的な実施例は本発明を説明するためである。
本発明の3Dナノ構造の調製
1.調製した3D DNAナノ構造の説明
それぞれが60個の内向きに配置された色素分子を有する中空円柱体の形態を有し、同じ3D DNAナノ構造内で隣接する色素分子に対して少なくとも9nmの対の距離を示す3D DNAナノ構造を、3つの異なる色素バリアント、すなわち3D_1、3D_2、および3D_3で調製した:
・3D DNAナノ構造バリアント3D_1:赤色蛍光:
3D_1 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する60個の内向きに配置されたDNAステープル鎖(配列S1と呼ぶ)、およびそれぞれがAtto647N色素分子と共に提供される60個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー、配列番号1259)を含む。フルオロフォアアダプターの結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から2nmより大きい距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、およびそれらが互いに5nmより大きい距離を有する(設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる)という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。その上、3D_1ナノ構造は、T1標的アダプター(オリゴマー配列番号1263)と共に提供された。3D_1ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール3D_S1に要約する。鎖p7308(配列番号1258)をスキャフォールド鎖として使用した。
3D_2 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する60個の内向きに配置されたDNAステープル鎖(配列S2と呼ぶ)、およびそれぞれがAtto565色素分子と共に提供される60個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1260)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から2nm以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに5nmより大きい距離を有する(設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる)という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。3D_2ナノ構造は、T2標的アダプター(オリゴマー配列番号1264)と共に提供された。3D_2ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール3D_S2に要約する。鎖p7308(配列番号1258)をスキャフォールド鎖として使用した。
3D_3 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する60個の内向きに配置されたDNAステープル鎖(配列S3と呼ぶ)、およびそれぞれがAtto488色素と共に提供される60個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1261)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から2nm以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに5nmより大きい距離を有する(設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる)という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。3D_3ナノ構造は、T3標的アダプター(オリゴマー配列番号1265)と共に提供された。3D_3ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール3D_S3に要約する。鎖p7308(配列番号1258)をスキャフォールド鎖として使用した。
すべてのDNAオリゴマー(蛍光色素と共に提供されるDNAオリゴマーも同様に)を、Eurofins Genomics GmbHから得た。
本実施例では、3D DNAナノ構造3D_1〜3を、以下に記載される調製プロトコールに従って調製した:
3D DNAナノ構造3D_1、3D_2、および3D_3の調製のために、第1に以下の成分を混合して最終体積200μlを得た:
・10nM p7308スキャフォールド鎖(配列番号1258)
・100nMのそれぞれのステープル鎖(DNAナノ構造3D_1についてオリゴプール3D_S1からの配列番号、DNAナノ構造3D_2についてオリゴプール3D_S2の配列番号、およびDNAナノ構造3D_3についてオリゴプール3D_S3からの配列番号)
・120nM蛍光色素改変DNAオリゴ(DNAナノ構造3D_1について配列番号1259、DNAナノ構造3D_2について配列番号1260、およびDNAナノ構造3D_3について配列番号1261)
・400nM標的結合DNAオリゴ(DNAナノ構造3D_1について配列番号1263、DNAナノ構造3D_2について配列番号1264、およびDNAナノ構造3D_3について配列番号1265)
・1×緩衝液FB02(緩衝液の組成については以下を参照されたい)
・65℃で15分間維持し、1分以内に50℃に冷却する
・50℃から40℃に一定の速度で66時間減少させる
・66時間の終了時(任意に、40℃でさらに数時間インキュベートすることが可能である)、1分以内に4℃に冷却し、2〜8℃で保存する。
・サーマルサイクラー由来の液体を同じ体積のPEGX01(緩衝液の組成については以下を参照されたい)と混合する
・13000〜16000rfc、室温(20〜25℃)で35分間遠心分離する
・ピペットによって上清を除去する
・FB02(緩衝液の組成については以下を参照されたい)200μlおよびPEGX01(緩衝液の組成については以下を参照されたい)200μlに再浮遊させる
・13000〜16000rfc、室温(20〜25℃)で35分間遠心分離する
・FB01(緩衝液の組成については以下を参照されたい)100μlに再浮遊させる
・ペレットを完全に溶解するために、シェーカーにおいて、室温の暗所で8〜16時間、好ましくは10時間(この場合、一晩)、600rpmでインキュベートする
・さらなる使用のために4℃で保存する(可能であれば最長12ヶ月、しかし本発明の場合では保存はわずか数日であった)。
・1.5質量/体積%アガロースゲルを調製する
・5×オレンジGローディング緩衝液を試料に添加する
・氷中で冷却しながら4.5V/cmの電圧で1.5時間電気泳動する
・DNAオリガミバンドを有するゲルの小片を切り出す。オリガミバンドは、約2mmの幅を有し、任意に、隣接するレーンにスキャフォールド鎖をローディングし、それをFreeze ‘N Squeeze(商標)DNAゲル抽出スピンカラム(BioRad Laboratories GmbH)に入れ、室温、1050rcfで4.5分間遠心分離することによって、より容易に同定することが可能である。
PEGX01:
・15% PEG 8000
・1×TAE(トリス酢酸EDTA緩衝液:40mMトリス、20mM酢酸、1mM EDTA)
・12.5mM MgCl2
・500mM NaCl
FB01:
・10mMトリス、pH8.0
・1mM EDTA
・12.5mM MgCl2
FB02:
・10mMトリス、pH8.0
・1mM EDTA
・10mM MgCl2
それぞれの3D DNAナノ構造を調製するために、オリゴマーを、以下のプールにおいてその配列番号(角括弧内の数字はそれぞれの配列番号を示す)に基づいて組み合わせた:
オリゴプール_3D−S1:[1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、277、286、287、288、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、469、478、479、480、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、265、274、275、276、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、301、310、311、312、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、253、262、263、264、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、289、298、299、300、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、241、250、251、252、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252]
比較のための2D DNAナノ構造の調製
1.調製した2D DNAナノ構造の説明
それぞれが、同じ2D DNAナノ構造内のそれぞれの最も近い色素分子に対して対の距離が5nmである48個の色素分子を有する長方形の2D DNAナノ構造(そのような2D DNAナノ構造は、例えば国際公開第002016140727号の図1Aに示される)を、3つのバリアント、すなわちバリアント2D_1、2D_2、および2D_3で調製した:
・2D DNAナノ構造バリアント2D_1:赤色蛍光:
2D_1 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する48個のDNAステープル鎖(配列S1と呼ぶ)、ならびにそれぞれがAtto647N色素と共に提供される48個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー、配列番号1259)を含む。フルオロフォアアダプターの結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。2D_1 DNAナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するT1標的アダプター(オリゴマー配列番号1266)と共に提供された。2D_1 DNAナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール2D_S1に要約する。鎖p7249(配列番号1257)をスキャフォールド鎖として使用した。
2D_2 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する48個のDNAステープル鎖(配列S2と呼ぶ)、ならびにそれぞれがAtto565色素と共に提供される48個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1260)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。2D_2 DNAナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するT2標的アダプター(オリゴマー配列番号1267)と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール2D_S2に要約する。鎖p7249(配列番号1257)をスキャフォールド鎖として使用した。
2D_3 DNAナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する48個のDNAステープル鎖(配列S3と呼ぶ)、ならびにそれぞれがAtto488色素と共に提供される48個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1261)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。2D_3 DNAナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するT3標的アダプター(オリゴマー配列番号1268)と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール2D_S3に要約する。鎖p7249(配列番号1257)をスキャフォールド鎖として使用した。
2.調製プロトコール:
本実施例では、2D DNAナノ構造2D_1〜3を以下に記載の調製プロトコールに従って調製した。
・10nM p7249スキャフォールド鎖(配列番号1257)
・100nMのそれぞれのステープル鎖(DNAナノ構造2D_1についてオリゴプール2D_S1からの配列番号、DNAナノ構造2D_2についてオリゴプール2D_S2からの配列番号、DNAナノ構造2D_3についてオリゴプール2D_S3からの配列番号)
・120nM蛍光色素改変DNAオリゴ(DNAナノ構造2D_1について配列番号1259、DNAナノ構造2D_2について配列番号1260、およびDNAナノ構造2D_3について配列番号1261)
・400nM標的結合DNAオリゴ(DNAナノ構造2D_1について配列番号1266、DNAナノ構造2D_2について配列番号1267、およびDNAナノ構造2D_3について配列番号1268)
・1×緩衝液FB02(緩衝液の組成については実施例1を参照されたい)
・65℃で15分間維持し、1分以内に60℃に冷却する
・60℃から20℃に一定の速度で1時間減少させる
・1分以内に4℃に冷却し、4℃で保存する。
・サーマルサイクラー由来の液体を同じ体積のPEGX01(緩衝液の組成については以下を参照されたい)と混合する
・13000〜16000rfc、室温(20〜25℃)で35分間遠心分離する
・FB01 200μlおよびFB02(緩衝液の組成については実施例1を参照されたい)200μlに再浮遊させる
・13000〜16000rfc、室温(20〜25℃)で35分間遠心分離する
・FB01 100μlに再浮遊させる
・シェーカーにおいて、室温(20〜25℃)の暗所で一晩、600rpmでインキュベートする
・さらなる使用のために−20℃(例えば、最長3年)または4℃(例えば、最長12ヶ月)で保存する(本発明の場合では保存はわずか数日であった)。
同様に、この場合、PEGに基づく精製の代替として、実施例1で言及したアガロースゲル電気泳動に基づく精製を、原則として使用することが可能である:
それぞれの2D DNAナノ構造の調製のために、オリゴマーを、以下のプールにおいてその配列番号に基づいて組み合わせた(角括弧内の数字はそれぞれの配列番号を示す)
オリゴプール_2D−S1:[529、538、539、540、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、563、572、573、574、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、623、632、633、634、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、657、666、667、668、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、693、702、703、704、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、714、715、716、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、787、796、797、798、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、808、809、810、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、575、584、585、586、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、596、597、598、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、669、678、679、680、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、690、691、692、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、541、548、549、550、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、560、561、562、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、635、642、643、644、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、654、655、656、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656]
実施例1の3Dナノ構造および実施例2の2D DNAナノ構造による標的構造の検出の比較
1.概要
本明細書に記載の例における、標的構造を有する同定構造およびそれぞれの結合したDNAナノ構造が、キャリア(本発明の場合、カバースリップの表面)の表面に結合する、および/または結合しているその実施形態において、標的構造をどのように良好に、本発明の方法による本発明の2D DNAナノ構造または3D DNAナノ構造によって検出することができるかを比較するために、同じ標的DNAオリゴマーを標的構造として使用し、一方で実施例2に記載したバリアント2D_1、2D_2、および2D_3(2D試料)の赤色、緑色、および青色2D DNAナノ構造の結合に基づいて、および他方で実施例1に記載のバリアント3D_1、3D_2、および3D_3の赤色、緑色、および青色3D DNAナノ構造の結合に基づいて検出した。加えて、両方の実験について対照実験を実施し、標的構造が存在しない場合に、偽陽性の検出がカバースリップの表面上で起こるか否か、およびどの程度起こるかをチェックする。比較は、色素分子の最適化されて良好に認識された位置により、3D DNAナノ構造が顕微鏡カバースリップの表面に対してはるかにより少ない程度に接着することを示している。
標的構造(本発明の場合、標的DNAオリゴマー、要するに標的オリゴマー)を検出するために、これらを最初に、適した緩衝液中でそれぞれのDNAナノ構造(すなわち、2D_1、2D_2、および2D_3、または3D_1、3D_2、および3D_3)および捕捉鎖と共にハイブリダイゼーション反応において、これらのすべての成分が、互いに結合して同定構造を形成することができるようにインキュベートした(図1、1kを参照されたい)。これを、2Dおよび3D DNAナノ構造について個別に実施した。
・実施例1に記載のDNAナノ粒子あたり200pMのDNAナノ粒子3D_1〜3の4μl混合物
・2×緩衝液RX07(組成については以下を参照されたい)10μl
・ビオチンアダプターを有する20nMキャリアアダプター(本明細書において、捕捉鎖とも呼ぶ)(配列番号1262)1μl、この場合ビオチンアダプターを有する捕捉鎖(5’末端でビオチンによって改変されている)はEurofins社によって提供される
・750pM一本鎖標的DNAオリゴマー(配列番号1269)1μl。このオリゴマーは、T1、T2、およびT3について相補的な領域を有し、それによって3D DNAナノ構造3D_1、3D_2、および3D_3が、それぞれのT1、2、および3領域によって標的DNAオリゴマーの対応する相補的領域に、ならびに捕捉鎖の場合は相補的領域に結合することができる。標的構造およびそれぞれの結合領域は、3つすべての3D DNAオリゴマーならびに捕捉鎖が、標的DNAオリゴマーに同時に結合することができるように設計された。対照実験では、この体積をH2Oと交換した。
・H2O 4μl。
これを30℃で16時間インキュベートし、捕捉鎖、標的オリゴマー、および3D DNAナノ構造を互いに結合させた。
・μスライドVI0.1(ibidi GmbH、Martinsried)を、緩衝液A(組成については、以下を参照されたい)によってすすいだ。
・1mg/mlビオチン化BSA(Sigma−Aldrich GmbH)40μlをμスライドの対応するチャネルの第1のチャネル末端にピペッティングし、2分間インキュベートし、μスライドの対応するチャネルの他の第2のチャネル末端を通して流体をピペッティングによって除去し、緩衝液A 100μlを上記の第1のチャネル末端にピペッティングし、流体をピペッティングによって上記の第2のチャネルを通して除去する。
・0.5mg/mlストレプトアビジン(Thermo Scientific)40μlを上記の第1のチャネル末端にピペッティングし、2分間インキュベートし、ピペッティングによって上記の第2のチャネル末端を通して除去し、緩衝液A 100μlを上記の第1のチャネルにピペッティングし、ピペッティングによって上記の第2のチャネル末端を通して流体を除去する。
・緩衝液B(組成については以下を参照されたい)100μlを上記の第1のチャネルにピペッティングし、ピペッティングによって上記の第2のチャネル末端を通して流体を除去する、
・上記のステップからのハイブリダイズした溶液(2D試料プローブについて2Dナノ構造を有する溶液、または3D試料について3D DNAナノ構造を有する溶液、または標的DNAオリゴマーを有しない対応する対照実験)40μlを、上記の第1のチャネル末端にピペッティングする。15分間インキュベートする。この間に、捕捉鎖のビオチンは、表面に結合したストレプトアビジンに結合する。加えて、DNAナノ構造の一部は表面に非特異的に接着する、これは、意図的ではなく、2D DNAナノ構造では、3D DNAナノ構造より有意に頻繁に起こる。上記の第2のチャネル末端を通してピペッティングによって除去する。
・緩衝液RX07(組成については以下を参照されたい)200μlを上記の第1のチャネルにピペッティングすることによって、非結合DNAナノ構造を洗浄し、ピペッティングによって上記の第2のチャネル末端を通して除去する。
・緩衝液RX07(組成については以下を参照されたい)50μlを上記の第1のチャネル末端にピペッティングする。
2D試料および3D試料の両方について、ならびに標的DNAを有しない2つの対照について色毎に10個の画像を得た。色を連続的に撮像した。これらの画像のそれぞれは、他の画像の区分と重複せず、チャネル幅に沿って平均値の半分に位置する試料の特定の区分で撮影した。
記載の方法に関するDNAナノ構造の適切性を評価するために、標的DNAオリゴマーを有する対応する試料との比較において、どれほど多くのDNAナノ構造がそれぞれの対照(標的DNAオリゴマーを有しない)に見出されるかを測定した(図3の上部)。これによって、標的構造の存在下の試料中で測定されたDNAナノ構造の割合が表面に結合した非特異的ナノ構造によるものであったという結論に達した。3D DNAナノ構造は、顕微鏡試料キャリアの顕微鏡表面に対して有意により低い程度(2Dの4.0%と比較して3Dでは1.2%)の非特異的接着を示すことが見出された。3D DNAナノ構造のエラーバー(標準偏差)は、ゼロの線と交差し、このように、3D DNAナノ構造では、非特異的結合率が一連の測定の解像限界より下であることを示している。
本発明の方法は、特異性を増加させるためにDNAナノ構造の複数の結合を使用し、すなわちこれは偽陽性同定率を低減させる。1つのみのDNAナノ構造結合による測定法では、この比率は、図3(上部)に示すように高く、すなわち4.0%(2D)および1.2%(3D)であるが、本発明の方法では0.7%(2D)および0%(3D)である。
RX07緩衝液
・4×SSC(150mM塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸三ナトリウムの水溶液からなり、HClによってpH7.0に調節したクエン酸ナトリウム緩衝食塩水)
・5%硫酸デキストラン
・0.1%Tween20
・5×Denhardts
緩衝液A
・10mMトリス−HCl、pH7.5
・100mM NaCl
・0.05% Tween20
緩衝液B
・10mMトリス−HCl、pH8.0
・10mM MgCl2
・1mM EDTA
・0.05% Tween 20
組織試料に基づく遺伝子発現解析
本明細書において、例えば乳房腫瘍の組織試料を、複数のマーカー遺伝子、例えばHer2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、TFRC、GAPDH等などの100個の遺伝子の発現について解析する。
組織試料を最初に、例えば酵素的におよび/または剪断力によって単細胞浮遊液に溶解することができる。
次に細胞を、例えば機械によって、溶解緩衝液によって、酵素的および/もしくは化学的に、または光によって破壊してもよい。
溶解物を、さらに処理し、例えばRNAを抽出し、成分を濾過し、核酸を例えばエタノール沈殿によって単離することができる。あるいは、溶解物をさらなる使用に直接供することができる。
次に、複合体を、一部の応用において表面上または溶液中で検出する
検出および同定された個々のmRNA配列を計数することによって、相対的遺伝子発現を決定することが可能であり、例えばmRNA1が200回検出され、mRNA2が300回検出される場合、遺伝子2の遺伝子発現は、遺伝子1の発現より3/2倍高い。
加えて、インキュベーションステップにおける参照として、既知濃度の既定のナノレポーター(mRNA配列と完全に同等である)に結合する核酸を添加することが可能である。これによって、検出された他のmRNA配列の正規化および絶対的な定量化が可能となる。この基準値が、例えば100pMの初回濃度で100回同定される場合、mRNA1の濃度は、200pMであると決定することができる。
タンパク質の検出
タンパク質標的分子の検出および同定は、核酸標的分子の検出および同定と類似の方法で実施することができる。
前提条件は、タンパク質標的分子が、対応する結合体(抗体、アプタマー、ナノボディ、アディロン)が結合することができる少なくとも2つの区別可能なエピトープを保有することである。
タンパク質標的分子およびアダプターをDNAナノ構造において十分な反応時間で混合することによって、標的タンパク質およびそれぞれがDNAナノ構造にカップリングされた少なくとも2つのアダプターからなる検出可能な複合体が形成される。
複合体は、少なくとも2つのDNAナノ構造の同時検出によって同定することができる。
抗体Aおよび抗体Bにそれぞれ結合する、エピトープAおよびエピトープBを有するタンパク質標的1。
抗体Cおよび抗体Dにそれぞれ結合する、エピトープCおよびエピトープDを有するタンパク質標的2。
抗体Aは、赤色蛍光色素によって標識されたDNAナノ構造にカップリングされる。
抗体Bは、緑色蛍光色素によって標識されたDNAナノ構造にカップリングされる。
抗体Cは、黄色蛍光色素によって標識されたDNAナノ構造にカップリングされる。
抗体Dは、青色蛍光色素によって標識されたDNAナノ構造にカップリングされる。
タンパク質標的およびカップリングした抗体/DNAナノ構造を混合し、反応を十分な期間、例えば12時間行う。
同じ方法によって、タンパク質のクラスターを同定することが可能であり、この場合、異なる抗体は、標的クラスターにおける異なるタンパク質(異なるエピトープの代わりに)を同定する。
3つの遺伝子の遺伝子発現解析
方法の特に好ましい実施形態を証明するために、HeLa細胞の遺伝子GAPDH、TFRC、およびACTBの遺伝子発現解析をより詳細に記載する。このように、遺伝子GAPDH、TFRC、およびACTBのmRNAは、標的構造であり、HeLa細胞は宿主体である。
次に、緩衝液A 0.5mlによるすすぎステップおよび緩衝液RX07(処方は以下を参照されたい)0.5mlによるさらなるすすぎステップが続く。その後、RX07中の1nMビオチン−アダプターオリゴ(配列番号1262)をその中に流し、10分間インキュベートする。インキュベーション期間の間に、ビオチン−アダプターオリゴの少なくとも一部が、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって、表面に結合したストレプトアビジンに結合し、このようにして、それ自身が表面に結合する。
次に、緩衝液RX07 0.5mlによるすすぎステップの後、1ミリリットルあたり細胞100万個の密度を有する細胞浮遊液をその中に流す。細胞浮遊液の緩衝液は、PBS(リン酸緩衝食塩水、組成については以下を参照されたい)である。細胞を、10分間マイクロウェルに沈める。
RX07 0.5mlによるすすぎステップの後、標的構造は底部との結合によりマイクロウェルに残っており、RX07中のそれぞれ50nMの3D_1_1、3D_1_2、3D_2_1、3D_2_2、3D_3_1、および3D_3_2の溶液を注入し、60分間インキュベートする。インキュベーションの間、3D DNAナノ構造の多くが対応する標的構造に結合する。
RX07のそれぞれ0.5mlによる3回のすすぎステップが後に続く。
次に、それぞれの色スポットを、解析のために選択した各マイクロウェルにおいて検索する評価、すなわち標的構造の検出および/または定量化を実施する。赤色−緑色スポットはGAPDH mRNAを表し、赤色−青色スポットはTFRC mRNAを表し、および緑色−青色スポットはACTB mRNAを表す。
緩衝液A:実施例3の緩衝液Aを参照されたい
RX07緩衝液:実施例3のRX07緩衝液を参照されたい
溶解緩衝液
・20mMトリス pH7.5
・150mM NaCl
・1mM EDTA
・1mM EGTA
・1%プロテアーゼ阻害剤カクテル、哺乳動物細胞用のP−8340、Sigma−Aldrich
PBS緩衝液(リン酸緩衝食塩水)
・137mM NaCl
・2.7mM KCl
・10mM Na2HPO4
・1.8mM KH2PO4
配列番号1270 T4_gapdh
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTTTTTCCATTGATGACAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTT
配列番号1271 T4_tfrc
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTTCGAGTTTTGAGCGCTGTCTTTGACCTGAATCTTAAC
配列番号1272 T4_actb
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTTAATGATCTTGATCTTCATTGTGCTGGGTGCCAG
配列番号1273 キャリアアダプター_gapdh
GCCATGGGTGGAATCATATTGGAACATGTAAACCTTCGGTTGTACTGTGACCGATTC
配列番号1274 キャリアアダプターtfrc
CACGCCAGACTTTGCTGAGTTTAAATTCACGTTCGGTTGTACTGTGACCGATTC
配列番号1275 キャリアアダプターactb
ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACATTCGGTTGTACTGTGACCGATTC
配列番号1276 T5_gapdh
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTctgggtggcagtgatggcatggactgtggtcatgagtcct
配列番号1277 T5_TFRC
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTTacccatcttttaagaccatatctgagaacatctgggc
配列番号1278 T5_ACTB
TTGTGTCGTGACGAGAAACACCAAATTTCAACTTTTTcagtgtacaggtaagccctggctgcctccaccc
1)マイクロウェルに宿主体を提供する。
2)ポリマーマトリックス(すなわちキャリア)により宿主体を包む;ポリマーマトリックスが、非常に迅速な方法で生成され、その結果、宿主体の破壊の前に宿主体がその標的構造の組成を変化させることができないこと、またはポリマーマトリックスが、宿主体の標的構造の組成がこれによって影響されないように生成されることを確実にしなければならない。後者は、例えば、低融点のアガロースを使用することによって確実にすることができる。
3)宿主体を破壊する、例えば、宿主体が細胞である場合において、溶解(例えば、超音波、浸透もしくは凍結により機械的に;または例えば、pH値の改変、EDTA、例えば、リゾチームなどの酵素、トルオール、Triton−XもしくはTrizolの導入によって化学的に、これは細胞壁もしくは膜をすべて不安定化するか、または自己分解を誘導する)によって宿主体を破壊し、その結果、mRNAは、宿主体から、例えば細胞に放出される。
3D_2 DNAナノ構造は、緑色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する60個の内向きに配置されたDNAステープル鎖(配列S2と呼ぶ)、およびそれぞれがAtto565色素分子と共に提供される60個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1260)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から2nm以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに5nmより大きい距離を有する(設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる)という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。3D_2ナノ構造は、T2標的アダプター(オリゴマー配列番号1264)と共に提供された。3D_2ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール3D_S2に要約する。鎖p7308(配列番号1258)をスキャフォールド鎖として使用した。
3D_3 DNAナノ構造は、青色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する60個の内向きに配置されたDNAステープル鎖(配列S3と呼ぶ)、およびそれぞれがAtto488色素と共に提供される60個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1261)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から2nm以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに5nmより大きい距離を有する(設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる)という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。3D_3ナノ構造は、T3標的アダプター(オリゴマー配列番号1265)と共に提供された。3D_3ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール3D_S3に要約する。鎖p7308(配列番号1258)をスキャフォールド鎖として使用した。
すべてのDNAオリゴマー(蛍光色素と共に提供されるDNAオリゴマーも同様に)を、Eurofins Genomics GmbHから得た。
2D_2 DNAナノ構造は、緑色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する48個のDNAステープル鎖(配列S2と呼ぶ)、ならびにそれぞれがAtto565色素と共に提供される48個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1260)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。2D_2 DNAナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するT2標的アダプター(オリゴマー配列番号1267)と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール2D_S2に要約する。鎖p7249(配列番号1257)をスキャフォールド鎖として使用した。
2D_3 DNAナノ構造は、青色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する48個のDNAステープル鎖(配列S3と呼ぶ)、ならびにそれぞれがAtto488色素と共に提供される48個の関連するフルオロフォアアダプター(オリゴマー配列番号1261)を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムCaDNAnoにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、3’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。2D_3 DNAナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するT3標的アダプター(オリゴマー配列番号1268)と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール2D_S3に要約する。鎖p7249(配列番号1257)をスキャフォールド鎖として使用した。
2.調製プロトコール:
本実施例では、2D DNAナノ構造2D_1〜3を以下に記載の調製プロトコールに従って調製した。
Claims (15)
- 標的構造の検出のための方法であって、
p1)正確に1つの宿主体が少なくとも1つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入;
p2)少なくとも2つの3D DNAナノ構造の少なくとも1つのマイクロウェルへの導入であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入;
a)(i)標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、3D DNAナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、3D DNAナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、少なくとも1つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ;
b)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造中で結合しない場合に、a)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも2つの単離された3D DNAナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第1の表面、好ましくは少なくとも1つのマイクロウェルの底部に結合する、方法。 - 宿主体が、細胞、ウイルス、エキソソーム、小胞および/または液滴である、請求項1に記載の方法。
- 標的構造が宿主体中に存在し、方法が、
c)宿主体から標的構造を放出させるための、好ましくは破壊緩衝液との液体交換による、宿主体の破壊
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 標的構造が、ポリヌクレオチド、好ましくは部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAを含むか、またはポリヌクレオチド、好ましくは部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはmRNAである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡のためのマイクロウェルアレイであって、複数のマイクロウェルを含み、それぞれのマイクロウェルが底部および周囲壁を含み、底部が、蛍光顕微鏡に適しており、マイクロウェルのそれぞれが、好ましくは開いた上面を有し、
マイクロウェルアレイが、
蛍光顕微鏡に適しており、好ましくはカバースリップである、マイクロウェルの底部を形成する第1の層;
マイクロウェルの壁を形成する、第1の層に適用される第2の層
をさらに含む、マイクロウェルアレイ。 - 1つまたは複数のキャリアアダプターが、少なくとも1つのマイクロウェルの底部に結合する、請求項5に記載のマイクロウェルアレイ。
- 第2の層が、SU−8、好ましくはPEG−DA、特に好ましくはPDMS、より好ましくはCYTOP、特に好ましくは液体ガラスを含み、および/またはこれらからなる、請求項5または6のいずれか1項に記載のマイクロウェルアレイ。
- マイクロウェルアレイが、請求項5〜7のいずれか1項に記載のマイクロウェルアレイであり、第1の表面が、少なくとも1つのマイクロウェルの底部であり、好ましくは、標的構造が、標的構造に特異的に結合するキャリアアダプターの媒介によって、マイクロウェルの底部に結合する、および/または結合している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- f)マイクロウェルアレイの上面を、第2の層に油層を適用することによって閉じるステップであって、油が脂質を含んでいてもよい、ステップ
をさらに含み、
g)マイクロウェルアレイ上に水溶液を注ぐことによって油を排出するステップであって、水溶液が、膜チャネルを含んでいてもよい、ステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項8に記載の方法。 - 互いに異なる1つまたは複数のさらなる標的構造の検出にさらに追加で適しており、異なる標的構造が、対で異なり、
標的構造のそれぞれについて、ステップp1)における宿主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも1つの宿主体を含み;
方法が、
c)互いに異なる1つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれ割り当てられた同定構造を形成するステップであって、さらなる同定構造のそれぞれが、
(i)それぞれの割り当てられたさらなる標的構造、および
(ii)少なくとも2つの3D DNAナノ構造であって、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、1つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、少なくとも2つの3D DNAナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含む、ステップ
をさらに含み、
ステップa)が、
d)少なくとも1つの蛍光シグナルを測定することによる、1つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての3D DNAナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の1つの中で結合しない場合に、a)およびc)において形成された同定構造の少なくとも1つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された3D DNAナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが、複数回存在していてもよく、方法が、1つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、請求項1〜4または8〜9のいずれか1項に記載の方法。 - ステップp1)において、宿主体が、マイクロウェルアレイの上面に宿主体を含有する液体の容積を適用し、重力の効果を介して、宿主体がマイクロウェルの底部に沈む時間を与えることによって単離される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- aa)少なくとも1つのマイクロウェル中でキャリアマトリックスを調製するステップ
をさらに含み、
bb)キャリアアダプターをキャリアマトリックスに付着させるステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項1〜4または8〜11のいずれか1項に記載の方法。 - h)マイクロウェルの、好ましくは第2の層の周囲壁を、ステップp1)およびa)の間、またはa)およびb)の間に、底部から除去するステップ
を含む、請求項1〜4または9〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 好ましくは請求項5〜7のいずれか1項に記載のマイクロウェルアレイ;
少なくとも2つの3D DNAナノ構造
を含むキットであって、3D DNAナノ構造のそれぞれが、少なくとも1つの内向きに配置された蛍光色素分子を含む、キット。 - 少なくとも2つの3D DNAナノ構造のそれぞれについて、少なくとも1つの内向きに配置された蛍光色素分子と3D DNAナノ構造の周縁部との距離が、少なくとも2nm、好ましくは少なくとも3nm、特に好ましくは少なくとも5nmであり、少なくとも1つの3D DNAナノ構造が、少なくとも2つの内向きに配置された蛍光色素分子を含んでいてもよく、少なくとも2つの内向きに配置された蛍光色素分子の対の距離が、少なくとも2nm、好ましくは少なくとも5nm、特に好ましくは少なくとも9nmである、請求項14に記載のキット。
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