Claims (11)
1. Способ определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда, где указанный способ включает одновременную детекцию мутаций в ДНК микобактерий туберкулеза биологического образца, приводящих к устойчивости микроорганизмов к противотуберкулезным препаратам второго ряда в участках генов gyrA, gyrB, rrs и промоторной области eis посредством мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации и зондов детекции, которые комплементарны указанным участкам генов gyrA, gyrB, rrs и промоторной области eis, где противотуберкулезные препараты второго ряда представляют собой фторхинолоны, аминогликозиды и капреомицин, где указанные участки гена gyrA выбраны из группы, включающей кодоны 89, 90, 91, 94 или их комбинации, указанные участки гена gyB выбраны из группы, включающей кодоны 538, 539, 540 или их комбинацию, указанные участки гена rrs выбраны из группы, включающей позиции 1401, 514, 517 или их комбинации, и указанные участки промоторной области eis выбраны из группы, включающей позиции -10, -12, -37 или их комбинации. 1. A method for determining the resistance of Mycobacterium tuberculosis to second-line anti-TB drugs, where the method includes the simultaneous detection of mutations in the DNA of Mycobacterium tuberculosis of a biological sample, leading to the resistance of microorganisms to anti-TB drugs of the second row in the regions of the gyrA, gyrB, rrs genes and the eis promoter region by multiplex real-time polymerase chain reaction using amplification primers and detection probes that are complementary to the indicated regions of the gyrA, gyrB, rrs genes and the eis promoter region, where the second-line anti-TB drugs are fluoroquinolones, aminoglycosides and capreomycin, where these sections of the gyrA gene are selected from the group comprising codons 89, 90, 91, 94 or combinations thereof, these sections the gyB gene is selected from the group comprising codons 538, 539, 540 or a combination thereof, the indicated regions of the rrs gene are selected from the group comprising the positions 1401, 514, 517 or combinations thereof, and these regions of the eis promoter region are selected from the group comprising the positions -10 , -12, -37 or their comb initiation.
2. Способ по п. 1, где аминогликозиды представляют собой канамицин и амикацин, фторхинолоны представляют собой офлоксацин, моксифлоксацин, левофлоксацин. 2. The method of claim 1, wherein the aminoglycosides are kanamycin and amikacin, the fluoroquinolones are ofloxacin, moxifloxacin, levofloxacin.
3. Способ по п. 1, где все реакции детекции мутаций устойчивости к противотуберкулезным препаратам второго ряда осуществляются в одном температурном режиме амплификации. 3. The method according to p. 1, where all the reactions of detection of mutations of resistance to second-line anti-TB drugs are carried out in the same temperature amplification mode.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный биологический образец представляет собой непосредственно материал клинического образца или предварительно выращенную культуру микроорганизмов. 4. The method according to claim 1, characterized in that said biological sample is directly a material of a clinical sample or a pre-grown culture of microorganisms.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ проводят для более чем одного биологического образца. 5. The method according to claim 1, characterized in that the method is carried out for more than one biological sample.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанные зонды детекции представляют собой олигонуклеотидные последовательности длиной 19-24 нуклеотида, применяемые для детекции мутаций в кодонах 89, 90, 91 и 94 гена gyrA и в кодонах 538, 539 и 540 гена gyrB для выявления мутаций устойчивости к фторхинолонам, олигонуклеотидные последовательности длиной 19-22 нуклеотида, применяемые для детекции мутаций в позициях -10, -12 и -37 промоторной области гена eis для выявления мутаций устойчивости к канамицину, амикацину и/или капреомицину, и олигонуклеотидные последовательности длиной 20-22 нуклеотида, применяемые для детекции мутаций в позиции 1401, 514 и 517 гена rrs для выявления мутаций устойчивости к канамицину, амикацину и /или капреомицину. 6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, where these detection probes are oligonucleotide sequences of 19-24 nucleotides in length used to detect mutations in codons 89, 90, 91 and 94 of the gyrA gene and in codons 538, 539 and 540 of the gyrB gene to detect mutations of resistance to fluoroquinolones, oligonucleotide sequences 19-22 nucleotides long used to detect mutations at positions -10, -12 and -37 of the promoter region of the eis gene to detect mutations of resistance to kanamycin, amikacin and / or capreomycin, and oligonucleotide sequences 20-22 nucleotides long, approx nyaemye for detecting mutations in positions 1401, 514 and 517 rrs gene to identify mutations of resistance to kanamycin, amikacin and / or capreomycin.
8. Способ по п. 6, где указанные зонды включают нуклеотидные последовательности, выбранные из представленных в SEQ ID NO:7-14, 17-19, 26- 31 или их комбинации. 8. The method of claim 6, wherein said probes include nucleotide sequences selected from those set forth in SEQ ID NOs: 7-14, 17-19, 26-31, or a combination thereof.
9. Способ по любому из пп. 1-5, где указанные праймеры для амплификации включают нуклеотидные последовательности, выбранные из представленных в SEQ ID NO: 1-6, 15, 16, 20-25 или их комбинации. 9. The method according to any one of paragraphs. 1-5, where these primers for amplification include nucleotide sequences selected from those presented in SEQ ID NO: 1-6, 15, 16, 20-25, or combinations thereof.
10. Набор зондов детекции для осуществления способа по любому из пп. 1-9, в котором указанные зонды включают нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 7-14, 17-19, 26- 31 или их комбинации. 10. A set of detection probes for implementing the method according to any one of paragraphs. 1-9, in which these probes include nucleotide sequences selected from the group consisting of those presented in SEQ ID NO: 7-14, 17-19, 26-31, or a combination thereof.
11. Набор праймеров амплификации для осуществления способа по любому из пп. 1-9, в котором указанные праймеры включают нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 1-6, 15, 16, 20-25 или их комбинации. 11. A set of amplification primers for implementing the method according to any one of paragraphs. 1-9, in which these primers include nucleotide sequences selected from the group consisting of those presented in SEQ ID NO: 1-6, 15, 16, 20-25, or a combination thereof.
12. Применение способа по любому из пп. 1-9 для подтверждения клинического диагноза туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.12. The application of the method according to any one of paragraphs. 1-9 to confirm the clinical diagnosis of extensively drug-resistant tuberculosis.