Claims (3)
1. Способ для определения гаплогрупп Y-хромосомы и этнической принадлежности человека, включающий проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием тест-системы, и анализ образующихся продуктов на ДНК-анализаторе, отличающийся тем, что способ осуществляют за два этапа с использованием тест-системы, содержащей два набора: при этом на первом этапе производят генотипирование путем мультиплексной ПЦР реакции с использованием мультиплексов 20-ти специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по основным гаплогруппам N, J, I, Q, С, Е, D, G, О Y-хромосомного древа из первого набора тест-системы, очищают ПЦР-амплификат на колонках, затем путем мультиплексного анализа осуществляют SNaPshot реакцию с использованием мультиплексов 10-ти специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по основным гаплогруппам из второго набора тест-системы и очищают образующиеся продукты ферментом TSAP, затем на втором этапе по результатам анализа, если на первом этапе мутация выявлена, проводят мультиплексную ПЦР реакцию с использованием мультиплексов 62-х специфичных олигонуклеотидных праймеров для типирования по субгаплогруппам из первого набора тест-системы и после очистки амплификата помощью колонок проводят SNaPshot реакцию путем мультиплексного анализа с использованием мультиплексов 28-ми специфичных олигонуклеотидных праймеров для типирования по субгаплогруппам из второго набора тест-системы, а если на первом этапе мутация не выявлена, проводят мультиплексную ПЦР реакцию с использованием мультиплексов 16-ти специфичных олигонуклеотидных праймеров для типирования по редким гаплогруппам из первого набора тест-системы, после очистки амплификата помощью колонок проводят SNaPshot реакцию путем мультиплексного анализа с использованием мультиплексов 8-ми специфичных олигонуклеотидных праймеров для типирования по редким гаплогруппам из второго набора тест-системы, очищают образующиеся продукты ферментом TSAP, после чего осуществляют анализ.1. A method for determining haplogroups of the Y-chromosome and ethnicity of a person, comprising conducting a multiplex polymerase chain reaction using a test system, and analyzing the resulting products on a DNA analyzer, characterized in that the method is carried out in two stages using a test system, containing two sets: at the first stage, genotyping is performed by multiplex PCR reaction using multiplexes of 20 specific oligonucleotide primers for genotyping according to the main to the aplogroups N, J, I, Q, C, E, D, G, O of the Y chromosome tree from the first set of the test system, the PCR amplification on the columns is purified, then a SNaPshot reaction is performed using multiplexes of 10 specific multiplexes oligonucleotide primers for genotyping according to the main haplogroups from the second set of test systems and purify the resulting products with TSAP enzyme, then at the second stage, according to the analysis results, if a mutation is detected at the first stage, a multiplex PCR reaction is performed using 62 multiplex special specific oligonucleotide primers for typing by subhaplogroups from the first set of the test system and after purification of the amplification using columns, the SNaPshot reaction is carried out by multiplex analysis using multiplexes of 28 specific oligonucleotide primers for typing by subhaplogroups from the second set of test system, and if at the first stage no mutation was detected; a multiplex PCR reaction was performed using multiplexes of 16 specific oligonucleotide primers for typing according to rare haplogroups m from the first set of the test system, after purification of the amplification using columns, a SNaPshot reaction is carried out by multiplex analysis using multiplexes of 8 specific oligonucleotide primers for typing on rare haplogroups from the second set of the test system, the resulting products are purified by TSAP enzyme, and then the analysis is performed .
2. Тест-система для определения гаплогрупп Y-хромосомы и этнической принадлежности человека, содержащая набор реагентов для проведения ПЦР и мультиплексный набор праймеров, отличающаяся тем, что в состав тест-системы дополнительно входит второй набор для проведения SNaPshot реакции, при этом, первый набор для проведения ПЦР включает смесь для ПЦР реакции - 1,5 мл и три мультиплексных набора специфичных олигонуклеотидных праймеров каждый по 1,5 мл: мультиплексы 20 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по основным гаплогруппам Y хромосомы, мультиплексы 62 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по субгаплогруппам и мультиплексы 16 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования редких гаплогрупп, а второй набор для проведения SNaPshot реакции включает три мультиплексных набора специфичных олигонуклеотидных праймеров каждый по 1,5 мл: мультиплексы 10 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по основным гаплогруппам Y хромосомы, мультиплексы 28 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования по субгаплогруппам, мультиплексы 8 специфичных олигонуклеотидных праймеров для генотипирования редких гаплогрупп.2. A test system for determining haplogroups of the Y chromosome and ethnicity of a person, containing a set of reagents for PCR and a multiplex set of primers, characterized in that the test system additionally includes a second set for conducting SNaPshot reactions, while the first set for PCR, it includes a mixture for the PCR reaction - 1.5 ml and three multiplex sets of specific oligonucleotide primers each of 1.5 ml: multiplexes of 20 specific oligonucleotide primers for genotyping according to the main haplogroups Y chromosomes, multiplexes of 62 specific oligonucleotide primers for genotyping by subhaplogroups and multiplexes of 16 specific oligonucleotide primers for genotyping of rare haplogroups, and the second set for SNaPshot reaction includes three multiplex sets of specific oligonucleotide primers of 1.5 ml each: for genotyping according to the main haplogroups of the Y chromosome, multiplexes of 28 specific oligonucleotide primers for genotyping according to ubgaplogruppam, multiplexes 8 specific oligonucleotide primers for genotyping rare Haplogroups.
3. Специфичные олигонуклеотидные праймеры для определения гаплогрупп Y-хромосомы и этнической принадлежности человека, характеризующиеся тем, что в первом наборе тест-системы последовательностям, приведенным в Таблицах 3, 4 и 5, соответствует область отжига праймеров вне зон мутаций в пределах видовой специфичности с температурой плавления в диапазоне 55-64°С, GC-состав 40-60%; в последовательностях праймеров отсутствуют стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры, а во втором наборе тест-системы последовательностям, приведенным в Таблицах 6, 7 и 8, соответствует область отжига олигонуклеотидных праймеров непосредственно примыкающая к зоне мутации в пределах видовой специфичности; в последовательностях праймеров отсутствуют стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры; расчетная температура плавления для всех праймеров составляет 50°С±2°С, к 5′ концам праймеров присоединены GACT-хвосты в соответствии с заданной длиной олигонуклеотида.
3. Specific oligonucleotide primers for determining haplogroups of the Y chromosome and ethnicity of a person, characterized in that in the first set of the test system, the sequences shown in Tables 3, 4 and 5 correspond to the annealing region of the primers outside the mutation zones within species specificity with temperature melting in the range 55-64 ° C; GC composition 40-60%; in the primer sequences there are no stable secondary structures - hairpins and dimers, and in the second set of the test system, the sequences shown in Tables 6, 7 and 8 correspond to the annealing region of oligonucleotide primers directly adjacent to the mutation zone within species specificity; in the primer sequences there are no stable secondary structures — studs and dimers; the calculated melting temperature for all primers is 50 ° C ± 2 ° C, GACT tails are attached to the 5 ′ ends of the primers in accordance with a given oligonucleotide length.