Claims (25)
1. Способ идентификации маркеров генетически модифицированных растений, включающий обеспечение образца исследуемой ДНК, прямых и обратных праймеров, специфичных к ДНК одного или более маркеров ГМИ, и биочипа, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК и специфичных праймеров с зондами, специфичными к указанному одному или более маркерам, обработку продуктов ПЦР реакции ферментом, инкубацию ПЦР-продукта с биочипом в условиях гибридизации, определение наличия ГМИ детекцией образованных гибридизационных комплексов на биочипе, отличающийся тем, что биочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:23-33, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-22, в качестве ПЦР используют мультипраймерную симметричную ПЦР, продукты которой обрабатывают экзонуклеазой фага лямбда в концентрации от 5 до 20 единиц активности в течение от 30 до 90 мин, где в паре прямого и обратного праймеров, один праймер содержит метку, которую после гибридизации ДНК детектируют, регистрируют и используют для идентификации маркеров ГМИ, причем в качестве отрицательного контроля используют дифференцирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:36, частично комплементарный олигонуклеотиду SEQ ID NO:8, а в качестве положительного контроля используют дифференцирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:34, которому комплементарен специфический олигонуклеотид SEQ ID NO:35.1. A method for identifying markers of genetically modified plants, including providing a sample of the studied DNA, direct and reverse primers specific for the DNA of one or more GMI markers, and a biochip, performing PCR in the presence of a DNA sample and specific primers with probes specific to the specified one or more markers, processing the PCR reaction products with an enzyme, incubating the PCR product with a biochip under hybridization conditions, determining the presence of GMI by detecting the formed hybridization complexes on a biochip, the fact that the biochip contains differentiating oligonucleotides, with the sequences shown in SEQ ID NO: 23-33, as specific primers, primers are used, the sequence of which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-22, symmetric multi-primer is used as PCR PCR, the products of which are treated with an exonuclease of phage lambda in a concentration of 5 to 20 units of activity for 30 to 90 minutes, where in a pair of forward and reverse primers, one primer contains a label that is detected after DNA hybridization, register they are used and used to identify GMI markers; moreover, the differentiating oligonucleotide SEQ ID NO: 36, partially complementary to the oligonucleotide SEQ ID NO: 8, is used as a negative control, and the differentiating oligonucleotide SEQ ID NO: 34, to which the specific oligonucleotide SEQ is complementary, is used ID NO: 35.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят детекцию образцов на наличие в них, по крайней мере, одной ДНК, принадлежащей гену, входящему в перечень маркеров ГМИ, приведенных в таблице 1.2. The method according to claim 1, characterized in that the detection of samples for the presence in them of at least one DNA belonging to a gene included in the list of GMI markers shown in table 1.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец исследуемой ДНК выделяют, по крайней мере, из одного образца, содержащего ГМИ, входящего в группу, состоящую из плодов или сока растений, зерна, муки, или пищевых продуктов, в состав которых входят генетически модифицированные растения.3. The method according to claim 1, characterized in that the sample of the studied DNA is isolated from at least one sample containing GMI, included in the group consisting of fruits or juice of plants, grain, flour, or food products, which genetically modified plants are included.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул, причем каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин, лигандную молекулу выбирают из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол, а флуоресцентную молекулу выбирают из группы, включающей FAM, TAMRA, Су3, Су5, Су7, R6G, R110, ROX или JOE.4. The method according to claim 1, characterized in that the defined label is selected from the group consisting of catalytic, ligand, fluorescent or radioactive molecules, the catalytic molecule being selected from the group comprising hemin, cyanocobalamin or flavin, the ligand molecule is selected from the group including biotin, dioxigenin or dinitrobenzene, and the fluorescent molecule is selected from the group consisting of FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, Cy7, R6G, R110, ROX or JOE.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию ГМИ осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.5. The method according to claim 1, characterized in that the detection and / or identification of GMI is carried out by comparative analysis of the signal level of the test sample, positive and negative controls.
6. Специфический олигонуклеотид в качестве праймера ПЦР для идентификации маркера ГМИ в способе идентификации ГМИ по пп.1-5 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:22.6. A specific oligonucleotide as a PCR primer for identifying a GMI marker in a GMI identification method according to claims 1-5 with the sequences shown from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 22.
7. Дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для идентификации маркера ГМИ в способе идентификации ГМИ по пп.1-5 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO:23 по SEQ ID NO:33.7. Differentiating oligonucleotide as a probe for identifying a GMI marker in a method for identifying GMI according to claims 1-5 with the sequences presented from SEQ ID NO: 23 according to SEQ ID NO: 33.
8. Биочип для идентификации ГМИ, представляющий собой несущий элемент, характеризующийся тем, что на его поверхности иммобилизированы от 1 до 11 кластеров с дифференцирующими олигонуклеотидами, выбранными из SEQ ID NO:23-33, один или более кластеров, включающих олигонуклеотид положительного контроля, представленный в SEQ ID NO:34, и один или более кластеров, включающих олигонуклеотид отрицательного контроля, представленный в SEQ ID NO:36.8. A biochip for identification of GMI, which is a supporting element, characterized in that from its surface 1 to 11 clusters with differentiating oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 23-33, one or more clusters comprising a positive control oligonucleotide, are represented in SEQ ID NO: 34, and one or more clusters comprising the negative control oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 36.
9. Биочип по п.8, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов, входящих в группу, состоящую из: полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций.9. The biochip according to claim 8, characterized in that the supporting element of the chip is made of materials included in the group consisting of: polymers, glass, metals, ceramics, or combinations thereof.
10. Биочип по п.9, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из: полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.10. The biochip according to claim 9, characterized in that the polymers are selected from the group consisting of: polymethyl methacrylate, polybutyl methacrylate, polyvinyl chloride, polycarbonate, copolymers of methyl methacrylate and / or copolymers of butyl methacrylate with other monomers such as styrene, acrylonitrile.
11. Биочип по п.8, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок с толщиной от 0,05 до 5,0 мм.11. The biochip according to claim 8, characterized in that the supporting element of the chip is made in the form of flat platforms, films with a thickness of 0.05 to 5.0 mm.
12. Биочип по п.8, отличающийся тем, что дополнительно содержит идентификатор выполненный в виде штрих-кода или элемента с магнитной записью.12. The biochip according to claim 8, characterized in that it further comprises an identifier made in the form of a bar code or element with magnetic recording.
13. Биочип по п.12, отличающийся тем, что идентификатор биочипа включает код номера партии и/или даты изготовления и информацию о перечне размещенных дифференцирующих олигонуклеотидов.13. The biochip according to claim 12, wherein the biochip identifier includes a batch number code and / or production date and information about the list of placed differentiating oligonucleotides.
14. Набор для идентификации ГМИ, включающий:14. A kit for the identification of GMI, including:
а) по меньшей мере, один биочип для проведения разовой диагностики, содержащий один или более дифференцирующих олигонуклеотидов, специфичных к идентифицируемым маркерам трансгенных растений, и представленных в SEQ ID NO:23-33, один или более дифференцирующих олигонуклеотидов в качестве положительного контроля, представленных в SEQ ID NO:34, и один или более дифференцирующих олигонуклеотидов в качестве отрицательного контроля, и представленных в SEQ ID NO:36,a) at least one biochip for a one-time diagnosis, containing one or more differentiating oligonucleotides specific for identifiable markers of transgenic plants, and presented in SEQ ID NO: 23-33, one or more differentiating oligonucleotides as a positive control, presented in SEQ ID NO: 34, and one or more differentiating oligonucleotides as a negative control, and presented in SEQ ID NO: 36,
б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации и фермента экзонуклеазы.b) reagents that are selected from reagents for sample preparation, reagents for PCR, reagents for hybridization and their combination and exonuclease enzyme.
в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для выявления маркеров ГМИ с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:22.c) specific oligonucleotides as PCR primers to identify GMI markers with sequences that are selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 22.
15. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера 35S преимущественно для идентификации 35S промотора из вируса мозаики цветной капусты, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:23, и SEQ ID NO:1, и SEQ ID NO:2.15. The combination of oligonucleotides for the identification of the 35S marker, mainly for the identification of the 35S promoter from cauliflower mosaic virus, characterized in that it includes oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 2.
16. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера NOS преимущественно для идентификации 3' нетранслируемой области гена нопалинсинтазы, отличающаяся тем, включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:24, и SEQ ID NO:3, и SEQ ID NO:4.16. The combination of oligonucleotides for detecting the NOS marker, mainly for identifying the 3 'untranslated region of the nopalin synthase gene, characterized in that it includes oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4.
17. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера OCS преимущественно для идентификации 3' нетранслируемой области гена октопинсинтазы, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:25, и SEQ ID NO:5, и SEQ ID NO:6.17. The combination of oligonucleotides for detecting the OCS marker is predominantly for identifying the 3 'untranslated region of the octopin synthase gene, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
18. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера NPTII преимущественно для идентификации гена кодирующего неомицин-фосфотрансферазу II, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:26, и SEQ ID NO:7, и SEQ ID NO:8.18. The combination of oligonucleotides to identify the NPTII marker, mainly for identification of a gene encoding neomycin phosphotransferase II, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 26, and SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8.
19. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера GUS преимущественно для идентификации гена кодирущего бета-глюкуронидазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:27, и SEQ ID NO:9, и SEQ ID NO:10.19. The combination of oligonucleotides for detecting the GUS marker, mainly for identification of a gene encoding beta-glucuronidase, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10.
20. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Lectin преимущественно для идентификации гена семейства Lel из Glycine max, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 28 в качестве зонда и два специфических SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12.20. The combination of oligonucleotides for detecting the Lectin marker is predominantly for identifying a gene of the Lel family from Glycine max, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 28 as a probe and two specific SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
21. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Zein преимущественно для идентификации гена семейства Zein из Zea Mays, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:29, и SEQ ID NO:13, и SEQ ID NO:14.21. The combination of oligonucleotides to identify the Zein marker, mainly for identification of a gene of the Zein family from Zea Mays, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14.
22. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера bar преимущественно для идентификации гена из Streptomyces hygroscopicus, кодирущего фосфотрицин-ацетилтрансферазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:30, и SEQ ID NO:15, и SEQ ID NO:16.22. The combination of oligonucleotides for detecting the bar marker is predominantly for identifying a gene from Streptomyces hygroscopicus encoding a phosphotricin acetyltransferase, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
23. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера cry1Ab преимущественно для идентификации гена из Bacillus thuringiensis, кодирующего Bt-токсин, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:31, и SEQ ID NO:17, и SEQ ID NO:18.23. The combination of oligonucleotides to identify the cry1Ab marker, mainly for identifying a gene from Bacillus thuringiensis encoding a Bt toxin, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
24. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера EPSPS преимущественно для идентификации гена из Agrobacterium tumefaciens, кодирующего 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:32, и SEQ ID NO:19, и SEQ ID NO:20.24. The combination of oligonucleotides for detecting the EPSPS marker primarily for identifying a gene from Agrobacterium tumefaciens encoding 5-enolpyruvyl chimate-3-phosphate synthase, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 19, and :twenty.
25. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Patatin преимущественно для идентификации гена pat1 из Solanum tuberosum, кодирующего предшественник пататина, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:33, и SEQ ID NO:21, и SEQ ID NO:22.
25. The combination of oligonucleotides for identifying the Patatin marker, primarily for identifying the pat1 gene from Solanum tuberosum encoding a patatin precursor, characterized in that it comprises oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.