RU2006114685A

RU2006114685A - Способ продуцирования экзогенного белка в молоке трансгенных млекопитающих и способ очистки белков из молока

Info

Publication number: RU2006114685A
Application number: RU2006114685/13A
Authority: RU
Inventors: Карлос Альберто МЕЛО (AR); Карлос Альберто МЕЛО; Лино БАРАНАО (AR); Лино БАРАНАО; Цезар КАРБОННЕТТО (AR); Цезар КАРБОННЕТТО
Original assignee: Стерренбелд Байотекнолоджи Норт Америка, Инк. (Us); Стерренбелд Байотекнолоджи Норт Америка, Инк.
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2007-11-10
Also published as: RU2006114793A; RU2390562C2; RU2360002C2

Claims

1. Способ продуцирования белка, включающий в себя

а) получение отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое в своем молоке продуцирует представляющий интерес белок;

b) получение указанного молока от указанного трансгенного млекопитающего, отличного от человека; и

с) выделение указанного представляющего интерес белка из указанного молока.

2. Способ по п.1, где указанное отличное от человека трансгенное млекопитающее получено способом, включающим в себя

a) получение гена, который кодирует представляющий интерес белок;

b) клонирование указанного гена в плазмиду, посредством чего указанный ген оперативно связывается с промотором, который будет направлять экспрессию указанного гена в клетках молочной железы, приводя к экспрессии плазмиды;

c) трансфекцию соматических клеток указанной экспрессирующей плазмидой так, чтобы указанная плазмида включалась в геном указанных соматических клеток, что приводит к получению трансгенных соматических клеток;

d) энуклеацию зрелых ооцитов, что приводит к получению энуклеированных ооцитов;

e) слияние одной из указанных трансгенных соматических клеток с указанным энуклеированным ооцитом, что приводит к получению моноклеточного эмбриона;

f) имплантацию указанного эмбриона в матку реципиентного млекопитающего;

g) мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

3. Способ по п.2, где указанный промотор является промотором бета-казеина и где указанный представляющий интерес белок является гормоном роста человека.

4. Способ по п.3, где экспрессирующей плазмидой является плазмида pRβhGH.

5. Способ по п.4, где указанная экспрессирующая плазмида дополнительно включает в себя ген резистентности к неомицину.

6. Способ по п.5, где указанной экспрессирующей плазмидой является плазмида pRNeo.

7. Способ по п.2, где указанное млекопитающее относится к роду быков и продуцирует в своем молоке рекомбинантный гормон роста, геном которого содержит интегрированную плазмиду, где указанная плазмида содержит ген гормона роста человека и промотор бета-казеина, который направляет экспрессию указанного гена в клетки молочной железы указанного млекопитающего.

8. Способ по п.7, где указанной плазмидой является плазмида pRβhGH.

9. Способ по п.8, где указанная плазмида дополнительно содержит ген резистентности к неомицину.

10. Способ по п.9, где указанной плазмидой является плазмида pRNeo.

11. Способ по п.2, где указанные соматические клетки являются фибробластами.

12. Способ по п.2, где указанные трансгенные соматические клетки получены путем выделения из женской особи, трансгенной по продуцированию в своем молоке указанного представляющего интерес белка.

13. Способ по п.12, где указанные трансгенные соматические клетки являются фибробластами.

14. Способ по п.1, где указанное отличное от человека трансгенное млекопитающее получено способом, включающим в себя

a) суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, которое является трансгенным по продуцированию в своем молоке указанного представляющего интерес белка;

b) искусственное оплодотворение указанного млекопитающего спермой, полученной от мужской особи нетрансгенного млекопитающего, отличного от человека, с получением эмбрионов;

c) сбор указанных эмбрионов;

d) имплантацию указанных эмбрионов в матку млекопитающего-реципиента;

e) мониторинг беременности вплоть до рождения трансгенного млекопитающего.

15. Способ по п.1, где указанное трансгенное млекопитающее, отличное от человека, получено способом, включающим в себя

a) суперовуляцию женской особи млекопитающего, отличного от человека, которая является трансгенной по продуцированию в своем молоке указанного представляющего интерес белка;

b) искусственное оплодотворение указанного млекопитающего спермой, полученной от мужской особи млекопитающего, отличного от человека, являющегося трансгенным по продуцированию указанного представляющего интерес белка, с получением эмбрионов;

c) сбор указанных эмбрионов;

16. Способ по п.1, где указанное трансгенное млекопитающее, отличное от человека, получено способом, включающим в себя

a) суперовуляцию женской особи нетрансгенного млекопитающего, отличного от человека;

c) сбор указанных эмбрионов;

17. Способ по любому из пп.2, 12, 14, 15 или 16, где указанное млекопитающее представляет собой млекопитающее из рода быков, рода свиней, рода овец, рода коз или рода грызунов.

18. Способ по п.17, где указанное млекопитающее относится к роду быков.

19. Способ по любому из пп.2, 12, 14, 15 или 16, где указанный представляющий интерес белок является гормоном роста млекопитающих.

20. Способ по п.19, где указанный гормон роста млекопитающих является гормоном роста человека, бычьим гормоном роста, свиным гормоном роста, овечьим гормоном роста, козьим гормоном роста или гормоном роста грызуна.

21. Способ по п.20, где указанный гормон роста млекопитающих является гормоном роста человека.

22. Способ по п.21, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 1,0 г hGH/л молока.

23. Способ по п.22, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 2,0 г hGH/л молока.

24. Способ по п.23, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 3,0 г hGH/л молока.

25. Способ по п.24, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 4,0 г hGH/л молока.

26. Способ по п.25, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 5,0 г hGH/л молока.

27. Способ по п.26, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 6,0 г hGH/л молока.

28. Способ по п.19, где продуцирование указанного гормона роста млекопитающих указанным млекопитающим стимулирует указанное млекопитающее продуцировать больше молока, содержащего указанный гормон роста млекопитающего.

29. Способ по любому из пунктов 2, 12, 14, 15 или 16, где ген, кодирующий указанный представляющий интерес белок (связанный с промотором, который направляет экспрессию указанного гена в клетки молочной железы), находится в соматических клетках и клетках эмбрионов указанного млекопитающего.

30. Способ очистки рекомбинантного гормона роста из молока отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, включающий в себя a) осветление молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, что дает осветленное молоко; b) хроматографирование указанного осветленного молока, что дает очищенный рекомбинантный гормон роста.

31. Способ по п.30, где указанная хроматография представляет собой ионообменную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой, молекулярную заместительную хроматографию или аффинную хроматографию.

32. Способ по п.31, где проводят многократные стадии хроматографирования.

33. Способ по п.31, где указанная ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию.

34. Способ по п.31, где аффинная хроматография представляет собой иммунохроматографию.

35. Способ по п.31, дополнительно включающий в себя стадию концентрирования.

36. Способ очистки рекомбинантного гормона роста из молока отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, включающий в себя

a) осветление молока трансгенного млекопитающего, отличного от человека, что дает осветленное молоко;

b) анионообменную хроматографию указанного осветленного молока в расширенном слое, с получением результирующего материала после анионообменной хроматографии;

c) хроматографию с обращенной фазой указанного материала после анионообменной хроматографии, с получением результирующего материала после хроматографии с обращенной фазой;

d) анионообменную хроматографию указанного материала после хроматографии с обращенной фазой, с получением результирующего материала после анионообменной хроматографии;

e) молекулярную вытеснительную хроматографию указанного материала после анионообменной хроматографии, с получением результирующего материала после молекулярной вытеснительной хроматографии;

f) концентрирование указанного материала после молекулярной вытеснительной хроматографии, с получением концентрированного материала;

g) молекулярную вытеснительную хроматографию указанного концентрированного материала, что дает чистый рекомбинантный гормон роста.

37. Способ очистки рекомбинантного гормона роста из молока отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое продуцирует рекомбинантный гормон роста, включающий в себя

a) осветление молока, полученного от трансгенного млекопитающего, что дает осветленное молоко;

b) иммуноаффинную хроматографию указанного осветленного молока, с получением результирующего материала после иммуноаффинной хроматографии;

c) хроматографию с обращенной фазой указанного материала после иммуноаффинной хроматографии с получением результирующего материала после хроматографии о обращенной фазой;

d) анионообменную хроматографию указанного материала после хроматографии с обращенной фазой с получением результирующего материала после анионообменной хроматографии;

e) молекулярную вытеснительную хроматографию указанного материала после анионообменной хроматографии с получением результирующего материала после молекулярной вытеснительной хроматографии;

f) концентрирование указанного материала после молекулярной вытеснительной хроматографии с получением концентрирующего материала;

g) молекулярную вытеснительную хроматографию указанного концентрированного материала с получением чистого рекомбинантного гормона роста.

38. Способ по п.36 или 37, где указанный гормон роста представляет собой гормон роста млекопитающего.

39. Способ по п.38, где указанный гормон роста млекопитающего представляет собой гормон роста человека, бычий гормон роста, свиной гормон роста, овечий гормон роста, козий гормон роста или гормон роста грызуна.

40. Способ по п.39, где указанный гормон роста млекопитающего представляет собой гормон роста человека.

41. Способ по п.40, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 1,0 г hGH/л молока.

42. Способ по п.41, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 2,0 г hGH/л молока.

43. Способ по п.42, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 3,0 г hGH/л молока.

44. Способ по п.43, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 4,0 г hGH/л молока.

45. Способ по п.44, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 5,0 г hGH/л молока.

46. Способ по п.45, где указанное млекопитающее продуцирует гормон роста человека приблизительно в количестве, составляющем более чем 6,0 г hGH/л молока.

47. Способ по п.36 или 37, где указанное отличное от человека трансгенное млекопитающее относится к роду быков.

48. Способ по п.36 или 37, где указанное отличное от человека трансгенное млекопитающее представляет собой свинью, овцу, козу или грызуна.