RU1615919C

RU1615919C - Вакцина против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, способ ее изготовления и способ профилактики этих заболеваний

Info

Publication number: RU1615919C
Application number: SU4695244/13A
Authority: RU
Inventors: А.К. Кириллов; А.В. Селиванов; Л.В. Кириллов; А.А. Сулимов; И.А. Домский; Н.Д. Степаненко; ков Е.А. Пол; Е.А. Поляков
Original assignee: Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов
Priority date: 1989-05-24
Filing date: 1989-05-24
Publication date: 1995-11-20

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения повышение иммуногенной активности ассоциированной вакцины, а также защитного эффекта. Ассоциированная вакцина против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных содержит в качестве антигенов суспензию инактивированного штамма вируса энтерита норок "Родники-1631", анатоксин штамма Clostridium botulinum типа С 59 и вирусную культуральную суспензию аттенуированного штамма вируса чумы плотоядных "ЭПМ" с активностью вируса 10^3,0-10^4,0

в культуре клеток эмбрионов японских перепелов, а в качестве вспомогательных веществ гидроокись алюминия, желатозу, сорбит, метабисульфит натрия и дополнительно раствор Хенкса. Способ изготовления вакцины против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных предусматривает приготовление жидкого компонента, состоящего из суспензии инактивированного штамма вируса энтерита плотоядных и ботулического анатоксина, добавление к нему метабисульфита натрия для нейтрализации формалина и последующее использование жидкого компонента для разведения сухого компонента, включающего лиофилизированный со стабилизатором из сорбита и желатозы вирус чумы плотоядных. Способ профилактики вирусного энтерита ботулизма и чумы плотоядных включает однократное подкожное или внутримышечное введение клинически здоровым пушным зверям в возрасте 45 60 дней эффективных доз ассоциированной вакцины в объеме 1,0 - 3,0 см³ 5 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается ассоциированной вакцины, применяемой для специфической профилактики вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных.

Цель изобретения повышение иммуногенной активности ассоциированной вакцины, а также защитного эффекта.

Ассоциированная вакцина против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных содержит в качестве антигена возбудителя вирусного энтерита плотоядных вирусную культуральную суспензию инактивированного штамма Virus enteritis lutreo larum "Родники-1631" с биологической активность 10^4,0 10^4,5 ИД_50/см ³, анатоксин из штамма Clostridium botulinum 59 с содержанием в 1 мл токсина до инактивации 200-400 тысяч летальных доз (LD) для белых мышей, в качестве антигена возбудителя чумы плотоядных культуральную суспензию аттеньюированного штамма вируса "Distemper canine ЭПМ с активностью вируса 10^3,0-10^4,0 ТЦД/_50/0,5 _см ³ в культуре клеток эмбрионов японских перепелов, вспомогательные вещества: 3% -ный раствор гидрата окиси алюминия (ГОА) в качестве сорбента, раствор желатозы и сорбита в качестве стабилизаторов, 19% -ный раствор метабильсульфита натрия в качестве нейтрализующего агента и дополнительно раствор Хенкса при следующем соотношении компонентов, (вес/объем):
Культуральная суспензия
инактивированного штам-
ма Virus enteritis lutreo larum
"Родники-1631" 25-30
Ботулинический анатоксин
штамма Cl.botulinum 59 30-35
Вирусная культуральная
суспензия штамма вируса
Distemper canine ЭПМ 10-12
Гидрат окиси алюминия 10-12
Желатоза 4-6
Сорбит 4-6
Формалин Следы
Метабисульфит натрия 2-3
Раствор Хенкса Остальное
П р и м е р 1. Получение ассоциированной вакцины против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных осуществляют путем раздельного приготовления жидкого компонента, содержащего инактивированный вирус энтерита норок и ботулинический анатоксин, и сухого компонента, состоящего из лиофилизированного вируса чумы плотоядных, с последующим смешиванием жидкой и сухой фаз.

Для получения вируса энтерита норок используют первично-трипсинизированную культуру клеток почки котенка 2-6-месячного возраста. В качестве ростовой среды применяют среду, состоящую из 40-50% 0,5%-ного гидролизата лактальбумина (ГЛА) на растворе Хенкса, 15-20% среды 199, 15-20% среды Игла и 8-10% сыворотки крови крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков (пенициллин 100 Ед, стрептомицин 100 мг на 1 мл среды). Монослой клеток заражают нативным вирусом энтерита норок штамм "Родники-1631" с инфекционной активностью 10⁶ ИД_50/см ³ для норок, добавляют поддерживающую среду, включающую 70-75% 0,5%-ного ГЛА на растворе Хенкса и 25-30% среды 199. Вирус выращивают при 37±0,5^оС.

Полученный вируссодержащий материал замораживают при температуре минус 20^оС, выдерживают в течение 5-10 ч, а затем оставляют для оттаивания при 18-20^оС. Инфекционная активность вируса в культуре клеток 10^4,0-10^4,5 ИД_50/см ³, гемагглютинирующая активность в РГА 1:128 1:512.

Для инактивации вируса к объему вирусной суспензии добавляют 0,1% формалина с содержанием активного формальдегида 37-38% смесь выдерживают при 2-4^оС в течение 10-12 сут при постоянном перемешивании.

Для выращивания культуры Cl.botulinum типа С штамма 59 и получения ботулинического токсина используют ростовую среду Хоттингера с добавлением жидкого пептона Мартена и печеночного экстракта с содержанием аминного азота 180-220 мг% пептона 2,0-2,5% триптофана 40-60 мг. рН 7,2-7,4.

В ростовую среду непосредственно перед засевом вносят 0,5-0,6% глюкозы, а затем засевают отобранную матровую культуру в количестве 2-4% от объема среды.

После 5-10-дневного выращивания при 32-33^оС полученную культуральную жидкость фильтруют, определяют активность токсина и вносят формалин для инактивации. Формалин добавляют дробно: 0,4% непосредственно после окончания культивирования и еще 0,15% спустя 6 сут после первого внесения. Для полноты инактивации смесь выдерживают при 35-37^оС в течение 30-35 сут.

После проверки на стерильность и безвредность к формалинизированной культуре Cl.botulinum при постоянном перемешивании добавляют 10-12% от объема среды 3%-ного раствора гидрата окиси алюминия. Смесь постепенно охлаждают до 18-20^оС и выдерживают до полного просветления надосадочной жидкости. Затем 68-75% супернатанта сливают, промывают физиологическим раствором, выдерживая при комнатной температуре в течение 48-72 ч.

К смеси, содержащей 300 см³ полученного таким образом ботулинического анатоксина с активностью токсина до инактивации 200 тыс. LD для белых мышей и 100 см³ 3%-ного раствора ГОА, добавляют 250 см³ отдельно приготовленной вирусной культуральной суспензии инактивированного штамма вируса энтерита норок "Родинки-1631" с активностью 10⁴⁰ ИД_50/см ³, 20см³ свежеприготовленного 19% -ного раствора метабисульфита натрия, антибиотики Гентамицин и Нистатин по 50 мкг на 1 см³ смеси и раствор Хенкса. рН смеси 7,0.

Для изготовления сухого компонента аттеньюрованный штамм ЭПМ вируса чумы плотоядных выращивают в первично-трипсинизированной культуре клеток эмбрионов японских перепелов в ростовой среде из 0,5%-ного ГОА на растворе Хенкса, 25-30% среды 199 и 8-10% сыворотки крови крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков. Вирус вносят в суспензию клеток и выращивают роллерным способом при 37±0,5^оС и вращении со скоростью 10-15 об/ч.

Через 4-6 сут ростовую среду сливают (1-ый слив), а культивирование продолжают в поддерживающей среде, включающей 60-70% среды 199 и 30-40% 0,5%-ного ГЛА на растворе Эрла с добавлением антибиотиков. После полного развития ЦПД (7-14 сут) вируссодержащую культуральную жидкость (2-ой слив) замораживают при температуре минус 10-20^оС, оттаивают при комнатной температуре и объединяют 1-ый и 2-ой сливы.

Активность полученного вируса чумы плотоядных 10^3,0-10^4,0 ТЦД_50/0,5 _см ³ для культуры клеток эмбрионов японских перепелов.

В объединенную смесь сборов суспензии вируса чумы плотоядных добавляют стабилизаторы для лиофилизации; на 7±0,5 л вирусной суспензии 2±0,5 л 25%-ного раствора желатозы и 1±0,2 л 50%-ного раствора сорбита при тщательном перемешивании на шуттель-аппарате, и антибиотики Гентамицин, Мономицин или Канамицин из расчета 20 мкг на 1 см³. Смесь охлаждают до 5-10^оС а течение 5-7 ч, расфасовывают в стерильные стеклянные флаконы и лиофилизируют.

Ассоциированную вакцину против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных готовят путем разведения до гомогенной взвеси сухого компонента вирусного материала штамма вируса чумы плотоядных ЭПМ с титром вируса 10^3,0 ТЦД_50/0,5 _см ³ в культуре клеток эмбрионов японских перепелов, содержащей желатозу и сорбит, в жидком компоненте, включающем приготовленную соответственно суспензию инактивированного вируса энтерита плотоядных и ботулинический анатоксин. Разведение осуществляют при тщательном перемешивании.

Полученный препарат содержит ингредиенты, приведенные в табл.1.

П р и м е р 2. Ассоциированную вакцину против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных получают следующим образом. Приготовленные по примеру 1 сухой компонент лиофилизированную вирусную культуральную суспензию штамма вируса чумы плотоядных ЭПМ с титром вируса 10^4,0 ТЦД _50/0,5 _cм ³ в культуре клеток эмбрионов японских перепелов, содержащей желатозу и сорбит, разводят в жидком компоненте, который включает 200 см³ суспензии инактивированного штамма вируса энтерита норок "Родники-1631" с биологической активностью 10^4,5 ИД_50/см ³, 350 см³ ботулинического анатоксина с активностью токсина до инактивации 400 тыс. LD для белых мышей, 120 см³ 3%-ного раствора ГОА, 30 см³ 19% -ного раствора метабисульфита натрия и раствор Хенкса, рН 7,2.

Полученный препарат имеет состав ингредиентов, приведенный в табл.2.

П р и м е р 3. Способ профилактики вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных включает подкожное или внутримышечное введение ассоциированной вакцины клиническим здоровым животным в объеме 1,0-3,0 см³. При этом мелким зверям (норки, хорьки, соболи) препарат вводят в объеме 1,0-1,5 см³; крупным плотоядным (песцы, лисицы, собаки) 2,5-3,0 см³. Вакцинируют животных в возрасте 45-60 дней. Влияние возраста вакцинируемых щенков норок и хорьков на их устойчивость к контрольному заражению излучают в опыте на группах животных разных возрастов (см. табл.3) по 4 животных в группе. Ассоциированную вакцину против виpусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, содержащую,
Суспензия инактивированного
штамма вируса энтерита норок
"Родники-1631" с титром
вируса 10^4,2 ИД_50/см ³ 28,0
Ботулинический анатоксин
Cl.botulinum штамм 59 32,0
Суспензия штамма вируса чумы
плотоядных ЭПМ с титром
вируса 10^3,5 ТЦД_50/0,5 _см ³ 11,0
ГОА 10,0
Желатоза 5,0
Сорбит 5,0
Метабисульфит натрия 2,5
Раствор Хенкса до 100 вводят щенкам в объеме 0,9-1,1 см³ подкожно. Через 21 день после вакцинации разные группы животных заражают вирулентным штаммом соответствующего возбудителя.

Моновакцины против каждого возбудителя заболеваний вводят по такой же схеме. Исследования проводят на норках и хорьках.

Испытания показывают, что оптимальным для иммунизации норок является возраст 50-55 дней. Для вакцинации других животных оптимальным является возраст 55-60 дней.

П р и м е р 4. Изучение безвредности вакцины против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных проводят на лабораторных животных (белые мыши, морские свинки, кролики). При введении внутрибрюшинно многократных доз ассоциированной вакцины все животные в течение 10-дневного периода наблюдения не пpоявили признаков угнетения и остались живыми (см. табл.4).

П р и м е р 5. Изучение иммуногенной активности предлагаемой и известной ассоциированных вакцин против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, а также эффективности предлагаемого способа профилактики этих заболеваний проводят на норках. Иммуногенную активность биопрепаратов оценивают по устойчивости вакционированных животных к контрольному заражению. Предлагаемую ассоциированную вакцину, имеющую соотношение компонентов по примеру 1 и ассоциированную вакцину Distox в объеме 1 см³ вводят норкам 50-дневного возраста. Через 21 день после вакцинации проводят контрольное заражение иммунизированных зверей (см. табл.5).

Для заражения используют:
ботулинический глицеpинизированный токсин типа С в дозах 10 LD для норки внутримышечно (наблюдение в течение 5 сут);
нативный вирус энтерита норок, штамм "Родники-1631", в дозе 10^-6 ИД_50/см ³ внутримышечно, (наблюдение в течение 14 сут);
вирулентный штамм вируса чумы плотоядных Sneider Hill в дозе 1000 ИД_50/см ³ внутримышечно (наблюдение в течение 30 дн.).

Проведенные испытания показывают, что однократное введение норкам 50-дневного возраста предлагаемой ассоциированной вакцины против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных надежно защищает их от заболевания и падежа, вызываемых возбудителями указанных инфекций. Иммунитет наступает через 14-21 день после вакцинации и сохраняется в течение 12-15 месяцев, причем напряженность иммунитета выше, чем при применении ассоциированной вакцины Distox зарубежного производства.

Кроме того, предлагаемая ассоциированная вакцина в отличие от зарубежного аналога обладает широким спектром действия, может применяться для иммунизации разных видов плотоядных (норки, хорьки, соболи, песцы, лисицы, собаки и т.д.).

Благодаря высоким характеристикам ассоциированной вакцины предлагаемый способ профилактики является более эффективным по сравнению с известным.

Claims

1. Вакцина против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, включающая антигены возбудителей соответствующих заболеваний и вспомогательные вещества, отличающаяся тем, что, с целью повышения иммуногенной активности, вакцина содержит в качестве антигена возбудителя вирусного энтерита плотоядных вирусную суспензию инактивированного штамма Virus enteritis lutreo larum "Родники-1631" с биологической активностью

в качестве антигена ботулинического токсина типа C анатоксин штамма Clostridium botulinum 59, в качестве антигена возбудителя чумы плотоядных вирусную суспензию штамма вируса Distemper canine ЭПМ с биологической активностью

в качестве вспомогательных веществ растворы гидрата окиси алюминия, сорбита, желатозы, метабисульфита натрия и раствор Хенкса при следующем соотношении компонентов,
Культуральная суспензия инактивированного штамма Virus enteritis lutreo larum "Родники-1631" с биологической активностью вируса

25 30
Ботулинический анатоксин штамма Clostridium botulinum59 30 35
Вирусная культуральная суспензия штамма вируса Distemper canine ЭПМ с биологической активностью вируса

10 12
Гидрат окиси алюминия 10 12
Сорбит 4 6
Желатоза 4 6
Метабисульфит натрия 2 3
Раствор Хенкса Остальное
2. Способ изготовления вакцины против вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, включающий раздельное приготовление жидкого компонента, состоящего из суспензии инактивированного вируса энтерита плотоядных и ботулинического анатоксина, и сухого компонента, содержащего лиофилизированный вирус чумы плотоядных, с последующим их смешиванием, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенной активности препарата, для приготовления жидгоко компонента используют штамм вируса энтерита норок "Родники-1631" с биологической активностью вируса

выращенный в первично-трипсинизированной культуре клеток почки котенка и инактивированный формалином, и штамм Clostridium botulinum 59 с активностью токсина 200 400 тыс. летательных доз для белых мышей, инактивированный формалином и сорбированный на гидроокиси алюминия, при этом полученные суспензии штаммов объединяют, к смеси добавляют метабисульфит натрия для нейтрализации формалина, после чего применяют для разведения сухого компонента вакцины, приготовленного на основе штамма вируса чумы плотоядных "ЭПМ" с биологической активностью

выращенного в культуре клеток японских перепелов и лиофилизированного со стабилизатором из сорбита и желатозы.

3. Способ профилактики вирусного энтерита, ботулизма и чумы плотоядных, включающий иммунизацию животных с использованием ассоциированной вакцины, отличающийся тем, что, с целью повышения защитного эффекта, для иммунизации животных применяют ассоциированную вакцину на основе штаммов вируса энтерита плотоядных "Родники-1631", Clostridium botulinum типа C 59 и вируса чумы плотоядных ЭПМ, препарат вводят подкожно или внутримышечно клинически здоровым животным в возрасте 45 60 дней в объеме 1,0 3,0 см³.