RS66033B1 - Konjugat citotoksičnog leka i oblik proleka pomenutog konjugata - Google Patents

Konjugat citotoksičnog leka i oblik proleka pomenutog konjugata

Info

Publication number
RS66033B1
RS66033B1 RS20241109A RSP20241109A RS66033B1 RS 66033 B1 RS66033 B1 RS 66033B1 RS 20241109 A RS20241109 A RS 20241109A RS P20241109 A RSP20241109 A RS P20241109A RS 66033 B1 RS66033 B1 RS 66033B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
conjugate
mmol
prodrug
cytotoxic drug
procedure
Prior art date
Application number
RS20241109A
Other languages
English (en)
Inventor
Oleksandr Koniev
Sergii Kolodych
Jean-Yves Bonnefoy
Original Assignee
Syndivia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syndivia filed Critical Syndivia
Publication of RS66033B1 publication Critical patent/RS66033B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na specifični konjugat citotoksičnih lekova i oblike proleka pomenutog konjugata za upotrebu u lečenju kancera i inflamatornih bolesti.
TEHNIČKA OSNOVA PRONALASKA
[0002] Kancer i inflamatorne bolesti danas spadaju u najčešće bolesti. Naročito kancer predstavlja jedan od najznačajnijih uzroka smrti u razvijenim zemljama, i broj ljudi kojima je dijagnostikovan kancer nastavlja da raste.
[0003] Do danas je razvijeno nekoliko režima lečenja, međutim, hemoterapija je i dalje jedino lečenje koje može da se koristi za tumore krvi, kao što su limfomi i leukemije, i metastaze.
[0004] Kod hemoterapije, jedna strategija obuhvata inhibiciju polimerizacije tubulina čime se sprečava ćelijska deoba (antimitotici). Ovo se može postići korišćenjem jedinjenja iz familije dolastatina, naročito prirodnog dolastatina 10, koji može da se izoluje iz vrste Dolabella auricularia koja živi u Indijskom okeanu i sastoji se od četiri aminokiseline, od čega su tri specifične za nju. Takođe postoje sintetički derivati dolastatina 10, kao što je auristatin PE, auristatin E i monometil auristatin E (MMAE), i pokazalo se da su delotvorni inhibitori. Najveća mana takvih jedinjenja jeste nepostojeća selektivnost za ćelije kancera, što dovodi do uništavanja zdravih tkiva, te stoga i snažnih neželjenih dejstava, kao što je gubitak kose ili mučnina. Razvoj konjugata protein-lek za takve aktivne agense javio se kao zgodna i delotvorna strategija za rešavanje problema nepostojeće selektivnosti.
[0005] Konjugati protein-lek su daleko najbrže rastuća klasa visoko potentnih aktivnih farmaceutskih sastojaka. Konstrukti konjugata protein-lek generalno obuhvataju protein, kao što je antitelo, kovalentno vezan sa jednim krajem vezujuće grupe, na čijem drugom kraju se nalazi citotoksin, tj. veoma potentan toksin koji ubija ćelije. Proteinska komponenta biomolekula obezbeđuje specifičnost za cilj. Kada konjugat uđe u ćeliju dolazi do oslobađanja toksina, na primer, usled delovanja ćelijskih enzima. Većina konjugata proteinlek je namenjena za lečenje kancera. Osim tržišno dostupnog trastuzumab emtanzina (naziva se T-DM1 ili Kadcyla<®>) i brentuksimab vedotina (Adcetris<®>), više konjugata protein-lek se trenutno u kliničkim ispitivanjima procenjuje za različite indikacije kancera.
[0006] Jedan od glavnih preduslova za aktivnost tih konjugata je delotvorno oslobađanje citotoksičnog leka nakon internalizacije od strane ćelija kancera, pri čemu linker između proteina i leka treba da bude stabilan u krvotoku pre nego što konjugat stigne do svog biološkog cilja.
[0007] U pogledu prethodnog, značajan napredak je postignut uvođenjem linkera raskidivih enzimom u konstrukt konjugata.
[0008] WO 2015/118497 tako opisuje albumin vezujući konjugat formule (I) koji daje odgovor na β-glukuronidazu,
pri čemu A obično predstavlja MMAE. Njegov periferni funkcionalni ostatak maleimida treba da obezbedi selektivno spajanje sa albuminom u krvotoku nakon intravenske primene.
Funkcionalni ostatak glukuronida, koji je osetljiv na glukuronidazu, takođe je prisutan u molekulu i vezan je za samoreaktivni krak. Pošto se albumin taloži u tumorima, a βglukuronidaza je prisutna u okruženju tumora, jedinjenje stiže na lokaciju tumora gde enzim katalizuje raskidanje glikozidne veze, a zatim dovodi do oslobađanja leka (MMAE).
Konjugat postoji u vidu 1:1 smeše dva izomera, čiji varirajući stereogeni centar se nalazi na samoreaktivnom kraku (obeleženo zvezdicom u formuli (I)). Legigan et al. (J. Med. Chem 2012, 55, 9, 4516-4520) takođe opisuju racemat određenog konjugata formule (I) kao što je iznad prikazano, kao i njegovu upotrebu za lečenje kancera.
SAŽETAK PRONALASKA
[0009] Pronalazači su pokazali da dva izomera prethodnog konjugata, koji nije mogao da se razdvoji korišćenjem uobičajenih tehnika, mogu da se dobiju putem enantiomernog HPLC razdvajanja ranog intermedijera. Pokazalo se da su dva izolovana izomera stabilna, naročito u ljudskoj plazmi, ali je izomer čiji varirajući stereogeni centar ima R konfiguraciju pokazao veće kinetičke vrednosti za enzimsko raskidanje nego drugi izomer. Ove veće kinetičke vrednosti koje su uočene kod jednog izomera su vrlo neočekivane jer stereogeni centar nije deo farmakofora koji enzim prepoznaje. Ova neočekivana karakteristika može biti naročito korisna za pacijente koji imaju nižu ekspresiju enzima.
[0010] Pronalazači su takođe pokazali da insercija samorazgradivog funkcionalnog ostatka u strukturu, konkretnije između citotoksičnog leka i ostatka konjugata, može povećati stabilnost konjugata, uz očuvanje njegove sposobnosti raskidanja (tj. oslobađanja citotoksičnog leka).
[0011] Pomenuti izomer na koji se odnosi predmetni pronalazak je konjugat predstavljen formulom (I):
pri čemu
A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka,
G je samorazgradivi funkcionalni ostatak, i
m je 0 ili 1,
i farmaceutski prihvatljive soli prethodnog.
[0012] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za pripremu prethodno definisanog konjugata, koji obuhvata sledeće korake:
a) priprema rac-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola od 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida; b) razdvajanje i izolovanje (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola, poželjno pomoću hiralne tečne hromatografije visokih performansi;
c) dovođenje u reakciju (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola sa derivatom glukuronske kiseline, kao što je metil acetobrom-α-D-glukuronat, u baznim uslovima; d) dovođenje u reakciju jedinjenja dobijenog u koraku (c) sa 4-nitrofenil hloroformatom; e) spajanje jedinjenja dobijenog u koraku (d) sa citotoksičnim lekom ili sa funkcionalnim ostatkom A-G-H, gde A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka i G predstavlja samorazgradivi funkcionalni ostatak;
f) deprotekcija funkcionalnog ostatka glukuronida jedinjenja dobijenog u koraku (e), poželjno u baznim uslovima; i
g) spajanje jedinjenja dobijenog u koraku (f) sa azidom formule N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-(CO)-(CH2)5-X, pri čemu X predstavlja maleimidnu grupu.
[0013] Pronalazak se takođe odnosi na prolek koji obuhvata najmanje jedan molekul prethodno definisanog konjugata, pri čemu je pomenuti molekul konjugata preko kovalentne veze vezan za molekul proteina, poželjno albumin, ili njegov fragment,
pri čemu se „prolek“ odnosi na najmanje jedan konjugat kovalentno vezan za makromolekul.
[0014] Dalje je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata barem delotvornu količinu najmanje jednog konjugata, kao što je prethodno definisan, ili najmanje jednog proleka, kao što je prethodno definisan, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0015] Ovaj pronalazak se dalje nezavisno odnosi na konjugat, kao što je prethodno definisan, prolek, kao što je prethodno definisan, ili farmaceutsku kompoziciju, kao što je prethodno definisana, za upotrebu u lečenju kancera i/ili inflamatorne bolesti.
KRATAK OPIS SLIKA
[0016]
Slika 1 prikazuje molekulsku strukturu jedinjenja R1a na osnovu rendgenske kristalografije. Elipsoidi pomeranja su nacrtani sa nivoom verovatnoće od 50%.
Slika 2 prikazuje kinetičke parametre oslobađanja MMAE indukovanog β-glukuronidazom rastvorima jedinjenja R5 i S5 u plazmi.
Slika 3 prikazuje kinetičke parametre oslobađanja MMAF indukovanog β-glukuronidazom rastvorima jedinjenja R6 i S6 u plazmi.
Slika 4 prikazuje kinetičke parametre oslobađanja SN-38 indukovanog β-glukuronidazom u rastvorima jedinjenja R7 i S7 u plazmi.
Slika 5 prikazuje kinetičke parametre oslobađanja doksorubicina indukovanog βglukuronidazom u rastvorima jedinjenja R8 i S8 u plazmi.
Slika 6 prikazuje stabilnost jedinjenja R5 i S5 u PBS-u na pH 7,4.
Slika 7 prikazuje kinetičke parametre vezivanja jedinjenja R5 i S5 u plazmi.
Slika 8 prikazuje stabilnost R5 i S5 vezanih za albumin u plazmi.
Slika 9 prikazuje HPLC profil 1: 1 smeše R5 i S5.
Slika 10 prikazuje HPLC profil 1: 1 smeše R4 i S4.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Predmetni pronalazak je dat u priloženom skupu zahteva.
Konjugati
[0018] Pronalazak se odnosi na konjugat koji ima sledeću formulu (I):
pri čemu
A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka,
G je samorazgradivi funkcionalni ostatak, i
m je 0 ili 1,
i farmaceutski prihvatljive soli prethodnog.
[0019] U kontekstu ovog pronalaska, „farmaceutski prihvatljiva so“ označava so konjugata ili proleka ili leka prema pronalasku, i alkalnog metala, zemnoalkalnog metala ili amonijaka, uključujući soli koje su dobijene sa organskim amonijačnim bazama, ili soli konjugata ili proleka ili leka prema pronalasku i organske i neorganske kiseline.
[0020] Soli koje su konkretnije pogodne za pronalazak mogu biti soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, kvaternerne amonijumove soli kao što je tetrametil amonijum ili tetraetil amonijum, i dodatne soli sa amonijakom i farmaceutski prihvatljivim organskim aminima, kao što su metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, trietilamin, etanolamin ili tris(2-hidroksietil)amin.
[0021] Soli konjugata ili proleka ili leka prema pronalasku i neorganske kiseline koje su pogodne za pronalazak mogu da se dobiju sa hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, azotnom kiselinom ili fosfornom kiselinom.
[0022] Soli konjugata ili proleka ili leka prema pronalasku i organske kiseline koje su pogodne za pronalazak mogu da se dobiju sa karboksilnim kiselinama i sulfonskim kiselinama, kao što je mravlja kiselina, sirćetna kiselina, oksalna kiselina, limunska kiselina, mlečna kiselina, jabučna kiselina, sukcinska kiselina, malonska kiselina, benzojeva kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, metansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina ili p-toluensulfonska kiselina.
[0023] Prema ovom pronalasku, „samorazgradivi funkcionalni ostatak“ označava dvovalentnu hemijsku grupu koja povezuje radikal izveden iz citotoksičnog leka sa ostatkom konjugata, i koji postaje raskidiv prilikom aktivacije (npr. enzimsko raskidanje ostatka glukuronida), što dovodi do oslobađanja slobodnih funkcionalnih ostataka, naročito citotoksičnog leka. Samorazgradivi funkcionalni ostaci su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast (Polym. Chem. 2011, 2, 773-790).
[0024] U jednom otelotvorenju, m je 0.
[0025] U još jednom otelotvorenju, m je 1, i G je predstavljeno formulom izabranom od:
[0026] U jednom poželjnom otelotvorenju, G je predstavljeno sledećom formulom:
[0027] Prema ovom pronalasku, „radikal izveden iz citotoksičnog leka“ označava ostatak koji se sastoji od citotoksičnog leka kome je oduzet jedan ili više atoma jedne od funkcionalnih grupa (na primer, H atom) koji je reagovao sa ostatkom konjugata.
[0028] Lek prema pronalasku je citotoksični lek. Kao što se ovde koristi, „citotoksični lek“ označava molekul koji prilikom dolaska u dodir sa ćelijom, opciono prilikom internalizacije u ćeliju, menja ćelijsku funkciju (npr. ćelijski rast i/ili proliferaciju i/ili diferencijaciju i/ili metabolizam kao što je sinteza proteina i/ili DNK) na štetan način ili dovodi do ćelijske smrti. Kao što se ovde koristi, termin „citotoksični lek“ obuhvata toksine, naročito citotoksine. U principu, citotoksični lek se definiše kao molekul LO1 ATC („Anatomsko-terapijsko-hemijski sistem klasifikacije“ gde LO1 predstavlja podgrupu koja definiše antineoplastične i imunomodulatorne agense prema Centru za saradnju za metodologiju statistike lekova (Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology) SZO).
[0029] Citotoksični lek prema pronalasku može biti izabran od dolastatina kao što je dolastatin 10, dolastatin 15, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monometil auristatin F (MMAF), monometilauristatin-D (MMAD), monometil auristatin E (MMAE), 5-benzoilpentanska kiselina-AE estar (AEVB) ili njihovih derivata.
[0030] Poželjni dolastatini su MMAF, MMAD, MMAE ili njihovi derivati.
[0031] Poželjniji dolastatini su MMAE, MMAF ili njihovi derivati.
[0032] U jednom konkretnom otelotvorenju, citotoksični lek prema pronalasku je antraciklin kao što je doksorubicin, idarubicin, epirubicin, daunorubicin ili valrubicin, poželjno doksorubicin.
[0033] U još jednom konkretnom otelotvorenju, citotoksični lek prema pronalasku je lek iz porodice kamptotecina (takođe se naziva „analog kamptotecina“), kao što je kamptotecin, SN-38, topotekan, irinotekan, eksatekan, silatekan, kositekan, lurtotekan, gimatekan, belotekan ili rubitekan, poželjno SN-38, eksatekan, belotekan, a poželjnije SN-38.
[0034] U jednom poželjnom otelotvorenju, citotoksični lek je izabran od doksorubicina, SN-38, MMAE, MMAF, MMAD, i njihovih derivata.
[0035] Dolastatini su porodica jedinjenja koja imaju strukturu od najmanje 4 aminokiseline, poželjno 4 aminokiseline, od čega su najmanje 3 specifične za njih, pošto se razlikuju od 20 aminokiselina koje se uobičajeno mogu naći u prirodi. Prema pronalasku, derivat dolastatina ima hemijsku strukturu koja je veoma bliska najmanje jednom jedinjenju iz porodice dolastatina i prikazuje slična antimitotična svojstva. Strukturne razlike između pomenutog derivata i jedinjenja iz porodice dolastatina mogu biti posledica supstitucije na najmanje jednom bočnom lancu najmanje jedne aminokiseline bilo kojim pogodnim uobičajenim supstituentom. Na primer, pomenuti supstituent može biti:
● alkil grupa, tj. linearni ili razgranati zasićeni lanac ugljovodonika, kao što je metil, etil, propil, izopropil, butil, sek-butil, terc-butil, pentil, heksil, heptil, oktil, nonil ili decil grupa;
● heteroalkil grupa, tj. linearni ili razgranati lanac ugljovodonika prekinut sa jednim ili više heteroatoma, prvenstveno O, N i S, kao što je metoksi ili etoksi grupa;
● aril grupa, tj. aromatična karbociklična grupa, kao što je fenil ili naftil grupa, koja može biti opciono supstituisana sa najviše četiri grupe uključujući, bez ograničenja: -COOH, - SO3H, -OCH3, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -NO2, -CN;
● heteroaril grupa, tj. aromatična grupa koja sadrži jedan ili više heteroatoma, kao što je piridil, oksazolil, furanil ili tiazolil grupa; ili
● atom halogena, kao što je -F, -Cl, -Br, -I.
[0036] Strukturne modifikacije takođe mogu da obuhvataju modifikaciju dolastatina kao što je dolastatin 10, dolastatin 15, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monometil auristatin F (MMAF), monometilauristatin-D (MMAD), monometil auristatin E (MMAE), ili 5-benzoilpentanska kiselina-AE estar (AEVB), na primer na nivou tercijarnog amina na N-terminalnoj poziciji, kako bi se ta funkcija učinila kompatibilnom sa nastankom kovalentne veze sa krakom linkera koji se razmatra.
[0037] Stručnjak će umeti da odabere odgovarajuće modifikacije, naročito odgovarajuće supstituente, za tu svrhu.
[0038] Prema još jednom otelotvorenju, lek može biti izabran od mitanzina kao što su DM1 i DM4, antraciklina kao što su doksorubicin, nemorubicin i PNU-159682, kaliheamicina, duokarimicina kao što su CC-1065 i duokarmicin A, pirolobenzodiazepina, dimera pirolobenzodiazepina, indolino-benzodiazepina, dimera indolino-benzodiazepina, αamanitina, eribulina, akalabrutiniba, bleomicina, beritiniba, kladribina, klofarabina, kobimetiniba, kopanlisiba, krizotiniba, citarabina, dabrafeniba, daktinomicina, daunorubicina, decitabina, epirubicina, ibrutiniba, idarubicina, lapatiniba, lenalidomida, mitomicina C, mitoksantrona, nelarabina, nirapariba, paklitaksela, panobinostata, pomalidomida, prednizona, ribocikliba, palbocikilba, rolapitanta, rukapariba, sonidegiba, tamoksifena, temsirolimusa, topotekana, trabektedina, valrubicina, vinblastina, vinkristina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
[0039] U jednom konkretnom otelotvorenju, citotoksični lek je SN-38, m je 1 i G je
[0040] U još jednom konkretnom otelotvorenju, citotoksični lek je dolastatin ili antraciklin, i m je 0.
Proces
[0041] Termin „rastvarač“ označava organski rastvarač, neorganski rastvarač kao što je voda, ili njihovu smešu. Primeri za organske rastvarače uključuju, bez ograničenja, alifatične ugljovodonike kao što je pentan ili heksan, aliciklične ugljovodonike kao što je cikloheksan, aromatične ugljovodonike kao što je benzen, stiren, toluen, orto-ksilen, meta-ksilen ili paraksilene, halogenovane ugljovodonike kao što je dihlormetan, hloroform ili hlorbenzen, rastvarače na bazi azota kao što je piridin, acetonitril ili trietilamin, rastvarače na bazi kiseonika, naročito ketone kao što je aceton, etre kao što je dietil etar, terc-butil metil etar (TBME), ciklopentil metil etar (CPME), tetrahidrofuran (THF) ili metil tetrahidrofuran (Me-THF) i alkohole kao što je metanol ili etanol, estre kao što je n-butil acetat, ili amide kao što je dimetilformamid (DMF), i njihove smeše.
1
[0042] „Kiseli uslovi“ označavaju uslove kada se koristi jedna ili više kiselina. Primeri za kiseline uključuju, bez ograničenja, hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, jodovodoničnu kiselinu, fluorovodoničnu kiselinu, azotnu kiselinu, sumpornu kiselinu, heksafluorfosfornu kiselinu, tetrafluorbornu kiselinu, trifluorsirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, sulfonsku kiselinu kao što je metansulfonska kiselina, mono- ili polikarboksilnu kiselinu, ili njihove smeše, poželjno hlorovodoničnu kiselinu.
[0043] „Bazni uslovi“ označavaju uslove kada se koristi jedna ili više baza. Primeri za baze uključuju, bez ograničenja, litijum hidroksid ili natrijum hidroksid, karbonate kao što je kalijum karbonat, natrijum karbonat ili natrijum hidrogen karbonat, alkokside kao što je natrijum metoksid, amine kao što je trietilamin, i ciklične baze na bazi azota, kao što je imidazol, N-metilimidazol, piridin ili dimetil-amino-piridin (DMAP), poželjno litijum hidroksid.
[0044] Konjugat prema pronalasku može da se pripremi od komercijalnog 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida, putem sinteze u više koraka, uključujući korak razdvajanja enantiomera intermedijera rac-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola putem hiralne tečne hromatografije visokih performansi (HPLC).
[0045] Stručnjak može da prilagodi uslove (temperatura, koncentracija, rastvarači, reaktanti, ekvivalenti reaktanata) koji su u nastavku opisani za svaki korak koristeći svoje opšte poznavanje organske sinteze. Svaki intermedijer ili proizvod koji se dobije na kraju koraka može da se izoluje i opciono prečisti, ili alternativno, nekoliko koraka može da se obavi u jednoj posudi bez izolovanja pomenutog intermedijera ili proizvoda. Redosled koraka procesa koji je u nastavku opisan može da se izmeni.
Korak (a)
[0046] U jednom otelotvorenju, rac-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenol može da se pripremi u jednom koraku od 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida. Reakcija se sastoji od uvođenja propargil grupe njenom adicijom na aldehidnu funkcionalnu grupu 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida. Pomenuta reakcija obično može da se obavi dovođenjem u reakciju 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida sa nukleofilnom propargil grupom, tj. bilo kojim anjonskim ili organometalnim oblikom propargil grupe, koja može da doda elektrofilno mesto. Pomenuta reakcija može biti potpomognuta katalizatorom, kao što je HgCh. Pomenuta nukleofilna propargil grupa može da se formira in situ ili da se prethodno pripremi u zasebnoj posudi, od izvora propargila kao što je propargil bromid. U jednom poželjnom otelotvorenju, reakcija se vrši sa 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehidom i propargil bromidom u prisustvu metalnog aluminijuma i HgCl2.
Korak (b)
[0047] Dva enantiomera rac-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola zatim mogu da se razdvoje pomoću tehnike kao što je hiralna HPLC, nastanak i razdvajanje dijastereoizomernih soli, kristalizacija, katalitičko razdvajanje ili enzimsko razdvajanje, ili njihove kombinacije. Poželjno, dva enantiomera su razdvojena pomoću hiralne HPLC. Hiralna HPLC je tehnika hromatografije čija stacionarna faza je hiralna. Hiralna stacionarna faza može biti na faza na bazi amiloze, na bazi ciklodekstrina ili na bazi celuloze. Poželjno, hiralna stacionarna faza je faza na bazi amiloze.
[0048] Ovaj korak razdvajanja enantiomera omogućava izolovanje (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenola. Enantiomerna čistoća (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola nakon koraka razdvajanja je pogodno veća od 90%, poželjno veća od 95%. Enantiomerna čistoća može da se meri putem analitičke hiralne HPLC.
Korak (c)
[0049] U svrhu uvođenja funkcionalnog ostatka glukuronida, (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenol može da se dovede u reakciju sa derivatom glukuronske kiseline, u uslovima koji omogućavaju selektivnu O-glukuronidaciju fenol grupe. Poželjno, pomenuti derivat glukuronske kiseline je potpuno zaštićena glukuronska kiselina, obično acetilovani glukuronat, i funkcionalizovan je tako da može da reaguje sa fenol grupom. Pomenuti derivat glukuronske kiseline je poželjno alkil acetobrom-α-D-glukuronat, poželjnije metil acetobromα-D-glukuronat. U jednom poželjnom otelotvorenju, O-glukuronidacija fenol grupe se vrši u baznim uslovima. Na primer, reakcija može da se obavi u prisustvu Ag2CO3i HMTTA (1,1,4,7,10,10-heksametil trietilen tetramin).
Korak (d)
[0050] Proizvod O-glukuronidacije dobijen u koraku (c) može da se konvertuje za potrebe koraka spajanja (e). U tu svrhu, sekundarna alkoholna funkcionalna grupa pomenutog proizvoda može da se dovede u reakciju sa hloroformatom, poželjno 4-nitrofenil hloroformatom, što dovodi do nastanka karbonata. Reakcija može da se katalizuje pomoću nukleofila, koji takođe može imati funkciju baze, kao što je piridin.
Koraci (e), (f) i (g)
[0051] U koraku (e), jedinjenje dobijeno u koraku (d) je zatim vezano sa citotoksičnim lekom kao što je prethodno definisan (kao što je MMAE) ili sa funkcionalnim ostatkom A-G-H, gde A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka, a G predstavlja samorazgradivi funkcionalni ostatak. U prvom otelotvorenju, kada je citotoksični lek direktno vezan sa jedinjenjem dobijenim u koraku (d), amino grupa (ili hidroksi grupa) pomenutog citotoksičnog leka reaguje sa karbonatom jedinjenja dobijenog u koraku (d), što daje amidnu grupu. Može da se koristi aktivirajući agens, kao što je HOAt, HOBt, HOCt. Pomenuti aktivirajući agens je poželjno HOBt.
[0052] Implementacija koraka (f) i (g), kao što je opisano u nastavku, koja sledi nakon tog prvog otelotvorenja, dovodi do konjugata formule (I), kao što je prethodno definisano, pri čemu, m je 0.
[0053] U drugom otelotvorenju, kada je citotoksični lek vezan sa jedinjenjem dobijenim u koraku (d) preko samorazgradivog funkcionalnog ostatka, jedinjenje dobijeno u koraku (d) se dovodi u reakciju sa funkcionalnim ostatkom A-G-H, gde A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka, a G predstavlja samorazgradivi funkcionalni ostatak.
[0054] A-G-H se povezuje sa jedinjenjem dobijenim u koraku (d) preko funkcionalne grupe, koja je pogodno -NH2ili -NH-.
[0055] Primeri za funkcionalne ostatke A-G-H uključuju, bez ograničenja:
1
[0056] Pomenuti funkcionalni ostatak A-G-H obično može da se pripremi dovođenjem u reakciju citotoksičnog leka sa jedinjenjem formule X-G-H, gde X predstavlja odlazeću grupu, kao što je sulfonat (npr. metansulfonat, trifluormetan sulfonat, toluensulfonat, nitrobenzen sulfonat), ili halogen (npr. hlor, brom, jod). Poželjno, X je brom. Citotoksični lek obično reaguje sa X-G-H preko njegove amino ili hidroksi grupe (ili jedne od njegovih pomenutih grupa), što daje A-G-H, kao što je prethodno definisano. U jednom konkretnom otelotvorenju, X-G-H je u zaštićenom obliku kada reaguje sa citotoksičnim lekom. „Zaštićeni oblik“ se odnosi na oblik u kome jedna ili više reaktivnih funkcionalnih grupa jedinjenja postoji u nereaktivnom obliku, kao što je NH2grupa zaštićena u obliku N3grupe. Nakon reakcije X-G-H sa citotoksičnim lekom, dobija se A-G-H i takođe može biti u „zaštićenom obliku“. Pomenuti A-G-H može biti „deprotektovan“ kako bi se oslobodila jedna ili više reaktivnih funkcionalnih grupa (na primer, konverzija N3grupe u NH2grupu).
[0057] Implementacija koraka (f) i (g), kao što je opisano u nastavku, koja sledi nakon tog drugog otelotvorenja, dovodi do konjugata formule (I), kao što je prethodno definisano, pri čemu, m je 1.
[0058] U jednom otelotvorenju, deprotekcija acetil i estarskih funkcionalnih grupa na funkcionalnom ostatku glukuronida u funkcionalne grupe hidroksi, odnosno karboksilne kiseline, zatim se vrši u koraku (f). Pomenuti korak (f) deprotekcije funkcionalnog ostatka glukuronida jedinjenja dobijenog u koraku (e) se poželjno obavlja u baznim uslovima, a poželjnije u baznim uslovima na niskoj temperaturi. Alternativno, pomenuti korak (f) može da se obavi u kiselim uslovima, i u bilo kom organskom rastvaraču, kao što je acetonitril. Funkcionalna grupa alkil jedinjenja dobijenog u koraku (f) je zatim spojena sa azidom formule N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-CO-(CH2)5-X, gde X predstavlja maleimidnu grupu, u dobro poznatim uslovima klik hemije, što omogućava selektivnu formaciju 1,4-disupstituisanog regioizomera triazola, te tako i nastanak konjugata iz pronalaska.
[0059] Azid formule N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-CO-(CH2)5-X, gde X predstavlja maleimidnu grupu, tipično se može dobiti reakcijom N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH2sa 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoatom.
[0060] U još jednom otelotvorenju, korak (f) se sastoji od spajanja jedinjenja dobijenog u koraku (e) sa azidom formule N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH2u uslovima klik hemije, što omogućava selektivno nastajanje 1,4-disupstituisanog regioizomera triazola. U koraku (g), -NH2grupa je konvertovana u alkilamid supstituisan maleimidnom grupom na kraju alkil lanca, tipično putem reakcije jedinjenja dobijenog u koraku (f) sa 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoatom. Zatim se vrši konačna deprotekcija funkcionalnog ostatka glukuronida jedinjenja dobijenog u koraku (g). Ta deprotekcija se poželjno obavlja u baznim uslovima, a poželjnije u baznim uslovima na niskoj temperaturi.
[0061] Proces prema pronalasku daje pristup konjugatu koji postoji kao pojedinačni izomer, čija čistoća je pogodno veća od 90%, poželjno veća od 95%.
Prolek
[0062] Konjugat prema pronalasku obuhvata maleimidnu grupu, koja je veoma reaktivna za nukleofilne grupe, a konkretnije za tiolnu grupu (-SH). Takve grupe obično dodaju funkcionalni ostatak maleimida putem Majklove adicije. Maleimidna grupa je stoga poželjna reaktivna grupa za spajanje konjugata iz pronalaska sa makromolekulom. U kontekstu ovog pronalaska, makromolekul je poželjno endogeni molekul.
[0063] Prema ovom pronalasku, prolek označava najmanje jedan konjugat kovalentno vezan sa makromolekulom, konkretnije proteinom. Pomenuti prolek može da transportuje, u inaktiviranom obliku, citotoksični lek u organizam, i oslobodi pomenuti lek u organu, tkivu ili ćelijama koje su specifično ciljane, usled dejstva β-glukuronidaze. Prolek može da se formira in vivo ili in vitro putem reakcije sa makromolekulom, konkretnije proteinom.
[0064] Konkretno, protein je izabran od proteina koji specifično vezuju molekul prisutan na membrani ćelije kancera, poželjno molekul izabran iz grupe koja se sastoji od proteina, glikoproteina, glikolipida, ugljovodonika ili njihove kombinacije, a još poželjnije, protein specifično vezuje protein prisutan na membrani ćelije kancera. Membranski molekul za koji protein može da se vezuje je molekul koji je prevashodno ili isključivo prisutan na membrani ćelije kancera. U jednom konkretnom otelotvorenju, membranski molekul koji protein prepoznaje je protein koji je prekomerno eksprimiran na membrani ćelije kancera. U jednom poželjnom otelotvorenju, protein može biti izabran iz grupe koja se sastoji od antitela i albumina.
1
[0065] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ označava molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji obuhvataju antigen vezujuće mesto koje imunospecifično vezuje antigen. Tako, termin antitelo obuhvata ne samo cele molekule antitela, već i antigen vezujuće fragmente antitela kao i varijante antitela i fragmente antitela. Konkretno, antitelo prema pronalasku može da odgovara monoklonskom antitelu (npr. himerno, humanizovano ili humano antitelo) ili fragmentu monoklonskog antitela. Termin antitelo označava klasična antitela kao i antitela teškog lanca i njihove fragmente kao što su fragmenti (VHH)2 i jednodomenska antitela.
[0066] Fragmenti antitela koji prepoznaju određene epitope mogu da se dobiju poznatim tehnikama. Fragmenti antitela su antigen vezujući delovi antitela, kao što su F(ab')2, Fab, Fv, scFv i slično. Drugi fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja: fragmente F(ab')2 koji mogu da se proizvedu pepsinskom digestijom molekula antitela, i fragmente Fab', koji mogu da se dobiju redukovanjem disulfidnih mostova fragmenata F(ab')2. Alternativno, mogu da se konstruišu ekspresione biblioteke Fab' (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281), što omogućava brzu i jednostavnu identifikaciju fragmenata monoklonskih Fab' sa željenom specifičnošću.
[0067] Antitela prema pronalasku mogu da se proizvedu bilo kojom tehnikom koja je poznata u struci, kao što je, bez ograničenja, bilo koja hemijska, biološka, genetska ili enzimska tehnika, samostalno ili u kombinaciji. Antitela iz pronalaska mogu da se dobiju proizvodnjom i uzgajanjem hibridoma. Vidite i WO 2015/063331 za proizvodnju sintetičkih jednodomenskih antitela.
[0068] Antitelo prema pronalasku može biti monomerno antitelo ili multimerno antitelo i može da obuhvata najmanje varijabilni domen, naročito kada je antitelo multimerno.
Poželjno, antitelo prema pronalasku je IgG, poželjno podtipa IgG1 ili IgG4, na primer, trastuzumab ili rituksimab.
[0069] U najpoželjnijem otelotvorenju ovog pronalaska, protein je molekul albumina, koji ima slobodne funkcionalne grupe tiola. Može biti predviđen endogeni ili egzogeni albumin, a naročito humani serumski albumin, rekombinantni albumin ili fragment albumina.
1
[0070] Poznato je da se endogeni albumin akumulira putem efekta „EPR“ („povećana propustljivost i retencija“) u mikrookruženju čvrstih tumora, te stoga in situ spajanje konjugata prema pronalasku sa molekulom endogenog albumina omogućava ciljanje tako nastalog kuplovanog entiteta, koji se naziva i prolek, u mikrookruženje tumora, čime se otklanja nedostatak selektivnosti slobodnih oblika nekih derivata citotoksičnih lekova, kao što su dolastatini. Treba napomenuti da se takav efekat „EPR“ primenjuje i na mikrookruženje upaljenih tkiva.
[0071] Prolek tako može da se dobije putem selektivnog formiranja, in vivo, kovalentne veze između konjugata, preko njegove reaktivne maleimidne grupe, i slobodne i komplementarne reaktivne funkcionalne grupe, obično tiolne funkcionalne grupe, nekog proteina, poželjno molekula endogenog albumina, poželjnije ljudskog serumskog albumina. Pomenuti prolek može da obuhvata najmanje jedan molekul konjugata prema pronalasku, kovalentno vezan sa molekulom proteina ili fragmentom molekula.
[0072] U slučaju albumina, pomenuta kovalentna veza može da se formira sa tiolnom funkcionalnom grupom cisteina na poziciji 34 albumina.
[0073] U jednom konkretnom otelotvorenju, prolek iz pronalaska može da se pripremi pre njegove primene. Prolek iz pronalaska može da se formira in vitro putem nastanka kovalentne veze između najmanje jednog konjugata iz pronalaska i slobodne i komplementarne funkcionalne grupe, obično tiolne funkcionalne grupe, proteina kao što je molekul albumina, molekul rekombinantnog albumina ili njegov fragment. Pomenuta kovalentna veza može da se formira sa tiolnom funkcionalnom grupom cisteina na poziciji 34 albumina.
[0074] U kontekstu ovog pronalaska, „fragment molekula albumina“ označava fragment molekula albumina koji je dovoljno veliki da za tako dobijeni prolek garantuje zadovoljavajuću bioraspoloživost, propustljivost u pogledu tumorskih tkiva i nepropustljivost u pogledu endotelne barijere zdravih tkiva. U jednom konkretnom otelotvorenju, fragment molekula albumina obuhvata cistein koji odgovara cisteinu 34 u sekvenci endogenog albumina.
[0075] Prolek prema pronalasku može biti predstavljen formulom (II):
1
pri čemu su A, G i m kao što je prethodno definisano,
Prt predstavlja radikal dobijen od proteina,
n se nalazi u rasponu od 0,1 do 16, poželjno od 0,1 do 8,
i farmaceutski prihvatljive soli prethodnog.
[0076] U jednom konkretnom otelotvorenju, Prt predstavlja radikal dobijen od antitela, i n je prosečan broj konjugata vezanih za pomenuto antitelo i nalazi se u rasponu od 0,1 do 16, poželjno od 0,1 do 8.
[0077] U još jednom konkretnom otelotvorenju, Prt predstavlja radikal dobijen od albumina, i n je 1. n može da se izmeri masenom spektrometrijom (MS) i hromatografijom hidrofobnih interakcija (HIC).
[0078] Prema ovom pronalasku, „radikal izveden iz proteina“ označava funkcionalni ostatak koji se sastoji od proteina kome je oduzet jedan ili više atoma jedne od njegovih funkcionalnih grupa koji je reagovao sa ostatkom konjugata. Konkretnije, „radikal izveden iz proteina“ označava protein koji obuhvata najmanje jedan funkcionalni ostatak cisteina kome je oduzet atom vodonika u njegovoj -SH grupi.
Farmaceutske kompozicije
[0079] Konjugati ili prolekovi iz ovog pronalaska mogu da se isporuče u farmaceutskoj kompoziciji koja obuhvata barem delotvornu količinu najmanje jednog konjugata iz pronalaska ili najmanje jednog proleka iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Farmaceutska kompozicija može biti u čvrstom ili tečnom stanju i može biti u bilo kom farmaceutskom obliku koji se uobičajeno koristi u lečenju ljudi i/ili životinja, na primer, u
1
obliku običnih tableta ili tableta sa šećernom oblogom, pilula, lozengi, želatinskih kapsula, kapi, granula, injektabilnih preparata, melema, krema ili gelova. Farmaceutska kompozicija može da se pripremi prema uobičajenim postupcima.
[0080] Kao što se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava bilo koji sastojak osim aktivnog sastojka (prvenstveno ekscipijensi) koji je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji. Pored toga, on može biti namenjen da se ostvari određena konzistentnost ili druge fizičke ili organoleptičke osobine finalnog proizvoda. Ekscipijens ili farmaceutski prihvatljiv nosač ne sme na bilo koji način da interaguje, a naročito ne hemijski, sa aktivnim sastojcima. Uobičajeni ekscipijensi mogu da se koriste u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima za ovu oblast. Kao što se ovde koristi, termin „delotvorna količina“ označava količinu aktivnog sastojka koja dovodi do sprečavanja, otklanjanja ili smanjenja štetnih dejstava bolesti.
Upotrebe
[0081] Konjugati iz pronalaska ili prolekovi iz pronalaska mogu da se koriste za lečenje kancera i/ili inflamatorne bolesti.
[0082] Kao što se ovde koristi, termin „tretman“, „lečenje“ ili „lečiti“ označava bilo koji postupak u cilju poboljšanja zdravstvenog stanja pacijenata, kao što je terapija, prevencija, profilaksa i usporavanje bolesti. U određenim otelotvorenjima, takav termin označava poboljšanje ili otklanjanje bolesti ili simptoma povezanih sa bolešću. U drugim otelotvorenjima, termin označava smanjenje širenja ili pogoršanja bolesti usled primene jednog ili više terapeutskih agensa na ispitaniku koji ima takvu bolest.
[0083] Kao što se ovde koriste, termini „ispitanik“, „pojedinac“ ili „pacijent“ koriste se naizmenično i označavaju životinju, poželjno sisara, još poželjnije ljudsko biće. Međutim, termin „ispitanik“ takođe može da označava nehumane životinje, naročito sisare. Ispitanik prema pronalasku je životinja, poželjno sisar, još poželjnije ljudsko biće. Ispitanik može biti nehumana životinja, naročito izabrana od sisara kao što su, između ostalog, psi, mačke, konji, krave, svinje, ovce i nehumani primati. Poželjno, ispitanik je ljudsko biće, poželjno odrasla osoba, još poželjnije odrasla osoba stara barem 40 godina, još poželjnije odrasla osoba stara najmanje 50 godina, a još poželjnije odrasla osoba stara najmanje 60 godina.
1
[0084] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu konjugata prema pronalasku, proleka prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku za pripremu leka. Poželjno se odnosi na konjugat prema pronalasku, prolek prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za pripremu leka za lečenje kancera i/ili inflamatorne bolesti kod ispitanika.
[0085] Dalje se odnosi na postupak za lečenje kancera i/ili inflamatorne bolesti kod ispitanika, gde se terapeutski delotvorna količina konjugata prema pronalasku, terapeutski delotvorna količina proleka prema pronalasku ili terapeutski delotvorna količina farmaceutske kompozicije prema pronalasku primenjuje na pomenutom ispitaniku koji boluje od kancera i/ili inflamatorne bolesti.
[0086] Takođe se odnosi na postupak za lečenje kancera i/ili inflamatorne bolesti kod ispitanika, gde se terapeutski delotvorna količina konjugata prema pronalasku, terapeutski delotvorna količina proleka prema pronalasku ili terapeutski delotvorna količina farmaceutske kompozicije prema pronalasku primenjuje na pomenutom ispitaniku koji boluje od kancera i/ili inflamatorne bolesti, u kombinaciji sa drugim lečenjem izabranim iz grupe koja se sastoji od hemoterapije, terapije zračenjem, lečenja najmanje jednim antiinflamatornim agensom i njihovih kombinacija.
[0087] Konjugat prema pronalasku, prolek prema pronalasku ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku mogu na bilo koji pogodan način da se primenjuju na ispitaniku kome je to potrebno. Na primer, mogu da se primenjuju sistemskim putem, naročito putem supkutane, intramuskularne, intravenske ili intradermalne, poželjno putem intravenske injekcije.
Konjugat prema pronalasku, prolek prema pronalasku ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku mogu da se primenjuju kao jedna doza ili u više doza. Konjugat prema pronalasku, prolek prema pronalasku ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku mogu da se primenjuju od svakog dana do svakog meseca, poželjno svake nedelje ili na svake dve nedelje, još poželjnije svake nedelje. Trajanje lečenja konjugatom prema pronalasku, prolekom prema pronalasku ili farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku poželjno traje od 1 nedelje do 20 nedelja, poželjno od 1 nedelje do 10 nedelja. Alternativno, lečenje može trajati sve dok postoje simptomi bolesti. Količina konjugata prema pronalasku, proleka prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku koja će se primeniti mora da se utvrdi standardnim postupkom koji je poznat osobama sa uobičajenim znanjem i
2
veštinama u ovoj oblasti. Prilikom određivanja odgovarajuće doze treba uzeti u razmatranje pacijentove fiziološke podatke (npr. starost, visina i težina) i način primene, kako bi se na pacijentu primenila terapeutski delotvorna količina.
Kancer
[0088] Termini „kancer“ ili „tumor“, kao što se ovde koriste, označavaju prisustvo ćelija koje imaju karakteristike koje su uobičajene za ćelije koje izazivaju kancer, kao što je nekontrolisana proliferacija i/ili besmrtnost i/ili metastatski potencijal i/ili ubrzan rast i/ili stopa proliferacije i/ili određene karakteristične morfološke osobine. Ovaj termin označava bilo koju vrstu maligniteta (primarni ili metastaze) kod ispitanika bilo koje vrste. Može da označava čvrsti tumor kao i hematopoetski tumor.
[0089] Poželjno, kancer prema pronalasku je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera prostate, kancera pluća, kancera dojke, kancera želuca, kancera bubrega, kancera jajnika, hepatocelularnog kancera, osteosarkoma, melanoma, kancera hipofarinksa, kancera jednjaka, kancera endometrijuma, kancera grlića materice, kancera pankreasa, kancera jetre, kancera debelog creva ili kolorektalnog kancera, neuroendokrinih tumora, malignih tumora mišića, kancera nadbubrežne žlezde, kancera štitne žlezde, kancera materice, kancera kože, kancera bešike, kancera glave i vrata, limfoma i leukemije.
[0090] Konjugati iz ovog pronalaska, prolekovi iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska naročito su usmereni na lečenje kancera dojke, debelog creva, jajnika, prostate, pankreasa i pluća.
[0091] Konjugati iz ovog pronalaska, prolekovi iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje metastaza.
Inflamatorne bolesti
[0092] Termin „inflamatorne bolesti“, kao što se ovde koristi, označava naročito hronična patološka stanja creva ili reumatska patološka stanja.
PRIMERI
[0093] Ovaj pronalazak će biti jasniji pomoću sledećih primera koji su dati samo u ilustrativne svrhe.
Postupak 1 - preparativna HPLC
[0094] Sistem za preparativnu HPLC se sastojao od dve pumpe Shimadzu LC-8A, detektora SPD-10A VP (Shimadzu), kontrolera SCL-10A VP (Shimadzu), automatskog uzorkivača SIL-10A, petlje za uzorke od 2 ml i kolone SunFire C18 (150 mm × 19 mm i.d., 5 µm, Waters). Uzorak je injektovan u petlju za uzorak i eluiran pri protoku od 17 ml/min (ciklus od 50 min, detekcija na 254 nm; pufer A: H2O miliQ 0,05% TFA; pufer B: acetonitril; gradijent: 40 min - od 5% do 95% B, 5 min - 95% B, 5 min - 5% B).
Postupak 2 - analitička HPLC
[0095] Analitička HPLC je obavljena na separacionim modulima Waters 2695 opremljenim UV detektorom Waters 2487 i kolonom Gemini-NX, 5 µm, C18, 150 × 4,6 mm. Protok je bio 1 ml/min. Rastvarač A: 0,05% TFA u vodi. Rastvarač B: 0,05% TFA u acetonitrilu. Ciklus gradijenta: 0-1 min - 30% B; 1-11 min - 30% do 80% B; 11-12 min - 80 do 95% B; 12-14,5 min - 95% B; 14,5-14,7 min - 95% do 30% B; 14,7-17 min - 30% B.
Postupak 3 - LCMS
[0096] LCMS je obavljena na separacionim modulima Waters 2695 opremljenim UV detektorom Waters 2487, detektorom mase Waters Acquity QDa i kolonom CORTECS, 2,7 µm, C18, 50 × 4,6 mm. Protok je bio 1 ml/min. Rastvarač A: 0,05% HCOOH u vodi.
Rastvarač B: 0,05% HCOOH u acetonitrilu. Ciklus gradijenta: 0-5 min - 5% do 95% B; 5-6 min - 95% B; 6-7,8 min - 5% B. Detektor mase je radio u režimu pozitivnog MS skeniranja sa temperaturom sonde 600 °C, kapilarnim naponom 1,5 kV i konusnim naponom 10 V.
Postupak 4 - hiralna HPLC
[0097] Hiralna HPLC je obavljena na sistemu Shimadzu SCL-10AVP opremljenom automatskim uzorkivačem Shimadzu SIL-10A, UV detektorom Shimadzu SCL-10AVP (podešenim na 254 nm), dve pumpe Shimadzu LC-8A, polupreparativnom kolonom CHIRALPAK<®>IG (5 µm, ID 20 mm × L 250 mm) i petljom za uzorke od 2 ml. Protok je bio 20 ml/min. Eluent je bio dihlormetan. Razdvajanje je vršeno tokom 5 minuta.
Postupak 5 - hiralna HPLC
[0098] Hiralna HPLC je obavljena na sistemu Shimadzu SCL-10AVP opremljenom automatskim uzorkivačem Shimadzu SIL-10A, UV detektorom Shimadzu SCL-10AVP (podešenim na 254 nm), dve pumpe Shimadzu LC-8A, polupreparativnom kolonom CHIRALPAK<®>IG (5 µm, ID 20 mm × L 250 mm) i petljom za uzorke od 2 ml. Protok je bio 20 ml/min. Eluent je bio smeša heptana i etanola (70:30). Razdvajanje je vršeno tokom 25 minuta.
Sinteza racemske smeše jedinjenja R1 i S1
[0099]
(R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenol(S)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenol
[0100] U balonu opremljenom rashladnim sredstvom i dodatnim levkom, aluminijum u prahu (6,17 ekv., 14156 mg, 524 mmol) i katalitička količina HgCl2(0,00248 ekv., 57,2 mg, 0,211 mmol) pokriveni su anhidrovanim THF-om (218 ml). Zatim je ukapavanjem dodat 80% rastvor propargil bromida (6,2 ekv., 78439 mg, 58,8 ml, 527 mmol) u toluenu (pažnja: egzotermna reakcija; pik egzoterma i njegov intenzitet zavise od disperznosti aluminijuma u prahu). Nakon što je dodavanje završeno, dobijena reakciona smeša je refluktovana tokom 6 sati. Rastvor je zatim ohlađen na 0 °C i ukapavanjem je dodat rastvor 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida (1 ekv., 14210 mg, 85 mmol) u THF-u (109 ml). Nakon 30 minuta mešanja, aldehid je u potpunosti nestao (kontrolisano pomoću TLC) i reakcija je ohlađena na 0 °C. Reakciona smeša je deaktivirana ukapavanjem 1 N HCl (10 ml), a zatim je ekstrahovana 3 puta pomoću EtOAc. Organski sloj je osušen iznad MgSO4, a zatim uparen, što je dalo smeđe ulje koje je prečišćeno fleš hromatografijom (cikloheksan/EtOAc - 70/30). Dobijeno žuto ulje je solubilizovano u DCM-u (655 ml) kako bi se uklonili tragovi nusproizvoda Vurcove reakcije, organski sloj je ekstrahovan 3 puta pomoću 1 N rastvora NaOH (svaki put po 1/3 zapremine DCM). U dobijeni kombinovani organski sloj zatim je dodat DCM (jednaka zapremina). Reakciona smeša je zakiseljena pomoću koncentrovane HCl do pH 1. Vodena faza je još 3 puta ekstrahovana pomoću DCM-a (svaki put po 1/3 zapremine vodenog rastvora). Kombinovani organski sloj je osušen iznad MgSO4i uparen, što je dalo racemsku smešu (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenola i (S)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenola (7927 mg, 38,3 mmol, 45%).
2
[0101]<1>H NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 10,63 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 7,73 (dd, J = 8,5, 1,5 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,97 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 2,67 - 2,97 (m, 3H), 2,20 (t, J = 2,5 Hz, 1H).
[0102]<13>C NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 154,6, 135,2, 135,0, 133,3, 122,3, 120,1, 79,6, 71,9, 70,8, 29,3.
[0103] MS (ESI, postupak 3) m/z: 230,1 [M+Na]<+>
Razdvajanje enantiomera R1 i S1
[0104] Enantiomeri R1 i S1 su razdvojeni pomoću hiralne hromatografije. Hiralna hromatografija je obavljena na sistemu Shimadzu SCL-10AVP opremljenom automatskim uzorkivačem Shimadzu SIL-10A, UV detektorom Shimadzu SCL-10AVP (podešenim na 254 nm), kolektorom frakcija Shimadzu FRC-10A, dve pumpe Shimadzu LC-8A, polupreparativnom kolonom CHIRALPAK<®>IG (5 µm, ID 20 mm × L 250 mm) i petljom za uzorke od 2 ml. Prečišćavanje je obavljeno pri protoku 20 ml/min koristeći smešu heptana i etanola (70:30) kao eluent. U 250 mg smeše R1 i S1 dodato je 0,15 ml etanola i 0,35 ml heptana. Dobijena smeša je injektovana u petlju za uzorke i prečišćavanje je vršeno tokom 25 minuta. Prva frakcija koja sadrži čist izomer R1 je sakupljena između 4 min i 8 min. Druga frakcija koja sadrži čist izomer S1 je sakupljena između 10 min i 22 min. Eluent je uparen i čisti enantiomeri R1 i S1 su korišćeni u sledećim koracima. Čistoća enantiomera R1 i S1 je potvrđena pomoću hiralne HPLC (postupak 5).
Jedinjenje R1 HPLC (postupak 5) RT: 6,53 min
Jedinjenje S1 HPLC (postupak 5) RT: 16,79 min
[0105]
Jedinjenje R2
[0106] Rastvor HMTTA (0,7 ekv., 2,11 g, 2,5 ml, 9,17 mmol; 1,1,4,7,10,10-heksametiltrietilentetramina, CAS 3083-10-1) i Ag2CO3(3,7 ekv., 13,4 g, 48,5 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (20 ml) mešan je tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Rastvor (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenola (1 ekv., 2,71 g, 13,1 mmol) i (2R,3R,4S,5S,6S)-2-brom-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetata (1,1 ekv., 5,7 g, 14,3 mmol) u acetonitrilu (11,9 ml) dodat je na 0 °C, i dobijena smeša je mešana tokom 4 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je deaktivirana vodom, nakon čega je dodat EtOAc (50 ml). Dobijena reakciona smeša je mešana tokom 3 minuta, a zatim je filtrirana kako bi se uklonile soli srebra. Obavljena je ekstrakcija sa još 4 porcije Et2O; objedinjene organske frakcije su osušene iznad MgSO4i uparene. Dobijena sirova supstanca je prečišćena fleš hromatografijom (gradijent cikloheksan/EtOAC 0-100% EtOAc za 20 minuta; 30 zapremina kolone), što je dalo metil R2 (3428 mg, 6,55 mmol, 50%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
[0107]<1>H NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 7.86 (dd, J = 6,1, 1,9 Hz, 1H), 7,49 - 7,65 (m, 1H), 7,36 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,25 - 5,39 (m, 3H), 5,17 - 5,25 (m, 1H), 4,90 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,53 - 2,70 (m, 2H), 1,98 - 2,20 (m, 10H).
[0108]<13>C NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 170,0, 169,3, 169,3, 166,7, 148,5, 141,2, 138,9, 131,2, 122,6, 120,0, 99,8, 90,3, 79,4, 72,6, 72,0, 71,2, 70,7, 70,2, 68,8, 53,0, 29,4, 20,6, 20,5.
[0109] MS (postupak 3) m/z: 546,2 [M+Na]<+>
Jedinjenje S2
[0110] Rastvor HMTTA (0,7 ekv., 3,4 g, 4 ml, 14,76 mmol; 1,1,4,7,10,10-heksametiltrietilentetramin, CAS 3083-10-1) i Ag2CO3(3,7 ekv., 21,5 g, 78 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (30 ml) mešan je tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Rastvor (S)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitrofenola (1 ekv., 4,37 g, 21,1 mmol) i metil (2R,3R,4S,5S,6S)-
2
2-brom-6-(metoksikarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetata (1,1 ekv., 10 g, 25,3 mmol) u acetonitrilu (20 ml) dodat je na 0 °C, i dobijena smeša je mešana tokom 4 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je deaktivirana vodom, nakon čega je usledio dodatak EtOAc (80 ml). Dobijena reakciona smeša je mešana tokom 3 minuta, a zatim je filtrirana kako bi se uklonile soli srebra. Obavljena je ekstrakcija sa još 4 porcije Et2O; objedinjene organske frakcije su osušene iznad MgSO4i uparene. Dobijena sirova supstanca je prečišćena fleš hromatografijom (gradijent cikloheksan/EtOAC 0-100% EtOAc za 20 minuta; 30 zapremina kolone), što je dalo S2 (6100 mg, 11,6 mmol, 55%) kao bledožutu čvrstu supstancu.<1>H NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 7.86 (dd, J = 6,1, 1,9 Hz, 1H), 7,49 - 7,65 (m, 1H), 7,36 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,25 - 5,39 (m, 3H), 5,17 - 5,25 (m, 1H), 4,90 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,53 - 2,70 (m, 2H), 1,98 - 2,20 (m, 10H).
[0111]<13>C NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 170,0, 169,3, 169,3, 166,7, 148,5, 141,2, 138,9, 131,2, 122,6, 120,0, 99,8, 90,3, 79,4, 72,6, 72,0, 71,2, 70,7, 70,2, 68,8, 53,0, 29,4, 20,6, 20,5.
[0112] MS (postupak 3) m/z: 546,3 [M+Na]<+>
Jedinjenje
[0113] U rastvor R2 (1 ekv., 1600 mg, 3,05 mmol) i 4-nitrofenil hloroformata (2 ekv., 1230 mg, 6,1 mmol) u suvom DCM-u (30 ml) dodat je piridin (2,5 ekv., 0,62 ml, 7,62 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim je deaktivirana zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3. Smeša je tri puta ekstrahovana pomoću DCM (odgovara zapremini reakcije) i kombinovani organski slojevi su osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanje fleš hromatografijom (gradijent cikloheksan/EtOAC 0-100% EtOAc za 20 minuta; 30 zapremina kolone) dalo je R3 (1469 mg, 2,13 mmol, 70%) kao beličastu čvrstu supstancu.
2
[0114]<1>H NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 8,17 - 8,34 (m, 2H), 7,94 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,65 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,33 - 7,40 (m, 2H), 5,81 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 5,21 - 5,43 (m, 4H), 4,25 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,78 - 3,02 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 2,09 - 2,12 (m, 1H), 2,02 - 2,09 (m, 6H).
[0115]<13>C NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 169,9, 169,2, 169,1, 166,7, 155,2, 151,5, 149,5, 145,6, 141,2, 133,4, 132,1, 125,3, 123,6, 121,7, 119,9, 99,5, 72,7, 72,5, 71,0, 70,2, 68,6, 53,0, 26,3, 20,6, 20,5, 20,5.
MS (postupak 3) m/z: 711,2 [M+Na]<+>
HPLC (postupak 4) RT: 2,77 min
Jedinjenje S3
[0116] U rastvor S2 (1 ekv., 2600 mg, 5,0 mmol) i 4-nitrofenil hloroformata (2 ekv., 2000 mg, 9,9 mmol) u suvom DCM-u (50 ml) dodat je piridin (2,5 ekv., 1 ml, 12,42 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, deaktivirana zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3. Smeša je tri puta ekstrahovana pomoću DCM (isto kao zapremina reakcije) i kombinovani organski sloj je osušen iznad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Prečišćavanje fleš hromatografijom u cikloheksanu/etil acetatu (gradijent cikloheksan/EtOAC 0-100% EtOAc za 20 minuta; 30 zapremina kolone) dalo je S3 (2300 mg, 2,13 mmol, 68%) kao beličastu čvrstu supstancu.
[0117]<1>H NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 8,17 - 8,34 (m, 2H), 7,94 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,65 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,33 - 7,40 (m, 2H), 5,81 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 5,21 - 5,43 (m, 4H), 4,25 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,78 - 3,02 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 2,09 - 2,12 (m, 1H), 2,02 - 2,09 (m, 6H).
2
[0118]<13>C NMR (HLOROFORM-d) Pomak: 170,0, 169,3, 169,2, 166,7, 155,2, 151,5, 149,5, 145,6, 141,1, 133,4, 132,1, 125,4, 123,7, 121,7, 119,9, 99,5, 72,6, 72,5, 71,0, 70,2, 68,6, 53,1, 26,2, 20,6, 20,6, 20,5.
MS (postupak 3) m/z: 711,2 [M+Na]<+>
HPLC (postupak 4) RT: 2,84 min
Jedinjenje R4
[0119] U rastvor R3 (1 ekv., 41,3 mg, 0,06 mmol) i MMAE (1 ekv., 43,1 mg, 0,06 mmol) u DMF-u (1,15 ml) dodat je rastvor HOBt (1 ekv., 8,11 mg, 0,06 mmol) u piridinu (0,287 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h, zatim razblažena sa MeOH (11,5 ml) i ohlađena na 0 °C. U dobijeni rastvor je dodat LiOH (10 ekv., 1 M u H2O, 0,6 ml, 0,6 mmol) i smeša je inkubirana na 4 °C tokom 16 h. Dobijeni rastvor je deaktiviran pomoću HCOOH (20 ekv., 1 M u H2O, 1,2 ml, 1,2 mmol) i koncentrovan do 3 ml pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R4 (41,9 mg, 0,0372 mmol, 62%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 7,81 min
MS (postupak 3) m/z: 1127,7 [M+H]<+>
Jedinjenje S4
2
[0120] U rastvor S3 (1 ekv., 37,9 mg, 0,055 mmol) i MMAE (1 ekv., 39,5 mg, 0,055 mmol) u DMF-u (1,05 ml) dodat je rastvor HOBt (1 ekv., 7,43 mg, 0,055 mmol) u piridinu (0,263 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h, zatim razblažena dodatkom MeOH (10,5 ml) i ohlađena na 0 °C. U dobijeni rastvor je dodat LiOH (10 ekv., 1 M u H2O, 0,55 ml, 0,55 mmol) i smeša je inkubirana na 4 °C tokom 16 h. Dobijeni rastvor je deaktiviran pomoću HCOOH (20 ekv., 1 M u H2O, 1,1 ml, 1,1 mmol) i koncentrovan do 3 ml pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S4 (36,6 mg, 0,0325 mmol, 59%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 7,66 min
MS (postupak 3) m/z: 1127,9 [M+H]<+>
Jedinjenje R5
[0121] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,2 ekv., 19 mg, 0,036 mmol) u suvom DMF-u (0,5 ml) dodat je 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (1,2 ekv., 11,1 mg, 0,036 mmol). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat R4 (1 ekv., 33,8 mg, 0,03 mmol). Kompleks TBTA-Cu(II) je pripremljen mešanjem tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (0,2 ekv., 0,2 M u DMF-u, 0,03 ml, 0,006 mmol) i bakar sulfat pentahidrata (0,2 ekv., 0,2 M u H2O, 0,03 ml, 0,006 mmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 2 minuta. Kompleks TBTA-Cu(II) (0,2 ekv., 0,1 M u DMF/H2O 50/50, 0,06 ml, 0,006 mmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (1 ekv., 1 M u H2O, 0,03 ml, 0,03 mmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 1 sata i prečišćena pomoću preparativne HPLC, što je dalo R5 (30,5 mg, 0,0165 mmol, 55%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 6,85 min
MS (postupak 3) m/z: 924,2 [M+2H]<2+>/2
2
Jedinjenje S5
[0122] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,2 ekv., 15,8 mg, 0,03 mmol) u suvom DMF-u (0,417 ml) dodat je 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoat (1,2 ekv., 9,25 mg, 0,03 mmol). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat S4 (1 ekv., 28,2 mg, 0,025 mmol). Kompleks TBTA-Cu(II) je pripremljen mešanjem tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (0,2 ekv., 0,2 M u DMF-u, 0,025 ml, 0,005 mmol) i bakar sulfat pentahidrata (0,2 ekv., 0,2 M u H2O, 0,025 ml, 0,005 mmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 2 minuta. Kompleks TBTA-Cu(II) (0,2 ekv., 0,1 M u DMF/H2O 50/50, 0,05 ml, 0,005 mmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (1 ekv., 1 M, 0,025 ml, 0,025 mmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 1 sata i prečišćena pomoću preparativne HPLC, što je dalo S5 (26,8 mg, 0,0145 mmol, 58%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 6,65 min
MS (postupak 3) m/z: 924,1 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje R6a
[0123] U rastvor R3 (1 ekv., 41,5 mg, 0,06 mmol) i MMAF (1 ekv., 47,5 mg, 0,06 mmol) u DMF-u (1,3 ml) dodat je rastvor HOBt (1 ekv., 8,14 mg, 0,06 mmol) u piridinu (0,291 ml).
Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 66 h, deaktivirana pomoću HCOOH (3 ekv., 6,8 µl, 0,18 mmol) i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R6a (57 mg, 0,043 mmol, prinos 71%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 6,0 min
MS (postupak 3) m/z: 669,5 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje S6a
[0124] U rastvor S3 (1 ekv., 41,5 mg, 0,06 mmol) i MMAF (1 ekv., 47,5 mg, 0,06 mmol) u DMF-u (1,3 ml) dodat je rastvor HOBt (1 ekv., 8,14 mg, 0,06 mmol) u piridinu (0,291 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 66 h, deaktivirana pomoću HCOOH (3 ekv., 6,8 µl, 0,18 mmol) i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je
dalo S6a (26,6 mg, 0,02 mmol, prinos 33%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 6,0 min
MS (postupak 3) m/z: 669,4 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje R6b
[0125] U rastvor R6a (1 ekv.26,5 mg, 0,02 mmol) u MeCN (233 µl) dodat je koncentrovani vodeni rastvor HCl (233 µl) i rastvor je mešan na 40 °C tokom 20 h. Smeša je zatim razblažena sa 0,5 ml MeCN i centrifugirana kako bi se talog razdvojio. Supernatant je
1
prečišćen pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R6b (6,7 mg, 5,9 µmol, prinos 30%) kao beličastu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 4,4 min
MS (postupak 3) m/z: 1141,6 [M+H]<+>
Jedinjenje S6b
[0126] U rastvor S6a (1 ekv.26,5 mg, 0,02 mmol) u MeCN (233 µl) dodat je koncentrovani vodeni rastvor HCl (233 µl) i rastvor je mešan na 40 °C tokom 20 h. Smeša je zatim razblažena sa 0,5 ml MeCN i centrifugirana kako bi se talog razdvojio. Supernatant je prečišćen pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S6b (10,4 mg, 9,1 µmol, prinos 46%) kao beličastu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 4,4 min
MS (postupak 3) m/z: 1141,6 [M+H]<+>
Jedinjenje R6
[0127] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,2 ekv., 3,53 mg, 6,7 µmol) u suvom DMF-u (0,15 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,2 ekv., 2,07 mg, 6,7 µmol) u suvom DMF-u (0,15 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat R6b (1 ekv., 6,4
2
mg, 5,6 µmol) u DMSO-u (0,15 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) pripremljen je mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (1,5 ekv., 0,1 M u DMF-u, 0,084 ml, 8,4 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (1,5 ekv., 0,1 M u H2O, 0,084 ml, 8,4 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (1,5 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 0,168 ml, 8,4 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (7,46 ekv., 0,5 M u H2O, 0,084 ml, 41,5 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R6 (3,7 mg, 1,99 µmol, 36%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 4,18 min
MS (postupak 3) m/z: 931,1 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje S6
[0128] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,2 ekv., 4,63 mg, 8,8 µmol) u suvom DMF-u (0,15 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,2 ekv., 2,71 mg, 8,8 µmol) u suvom DMF-u (0,15 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat S6b (1 ekv., 8,3 mg, 7,3 µmol) u DMSO-u (0,15 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) pripremljen je mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (1,5 ekv., 0,1 M u DMF-u, 0,109 ml, 10,9 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (1,5 ekv., 0,1 M u H2O, 0,109 ml, 10,9 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (1,5 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 0,218 ml, 10,9 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (7,46 ekv., 0,5 M u H2O, 0,109 ml, 54,4 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S6 (6,2 mg, 3,33 µmol, 46%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 4,14 min
MS (postupak 3) m/z: 931,1 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje 7a
[0129] U rastvor SN-38 (1 ekv., 72,2 mg, 0,18 mmol) i 1-azido-4-(brommetil)benzena (1 ekv., 39 mg, 0,18 mmol) u DMF-u (7,22 ml) dodat je K2CO3(3 ekv., 76,3 mg, 0,55 mmol). Dobijeni rastvor je pročišćen azotom i mešan tokom 1 h na sobnoj temperaturi, što je omogućilo nastanak 7a. Sirovi 7a (92 mg, 0,18 mmol, 96%) korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
[0130] MS (postupak 3) m/z: 524,2 [M+H]<+>
Jedinjenje 7b
[0131] U rastvor 7a (1 ekv., 96 mg, 0,18 mmol) u DMF-u (3 ml) dodat je tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP, 1,3 ekv., 68,33 mg, 0,24 mmol), nakon čega je dodat K2CO3(3 ekv., 76 mg, 0,55 mmol). Smeša je mešana tokom 1 sata, zatim je dodato 5x zapremina EtOAc, a zatim 1x zapremina vode. Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je ekstrahovan sa još 5x zapremina EtOAc. Kombinovani organski sloj je osušen iznad MgSO4i koncentrovan pod vakuumom, što je dalo 7b (90 mg, 0,18 mmol, 99%) kao bledožutu čvrstu supstancu. Sirovi 7b je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
[0132] MS (postupak 3) m/z: 498,2 [M+H]<+>
4
Jedinjenje R7c
[0133] Rastvor R3 (1 ekv., 82 mg, 0,12 mmol), 7b (1 ekv., 59 mg, 0,12 mmol) i HOBt (1 ekv., 16 mg, 0,12 mmol) u DMF-u (2,4 ml) mešan je na 25 °C tokom 16 sati. Dobijena smeša je prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R7c (45 mg, 0,043 mmol, 36%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
[0134] MS (postupak 3) m/z: 1047,3 [M+H]<+>
Jedinjenje S7c
[0135] Rastvor S3 (1 ekv., 82 mg, 0,12 mmol), 7b (1 ekv., 59 mg, 0,12 mmol) i HOBt (1 ekv., 16 mg, 0,12 mmol) u DMF-u (2,4 ml) mešan je na 25 °C tokom 16 sati. Dobijena smeša je prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S7c (63 mg, 0,06 mmol, 50%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
[0136] MS (postupak 3) m/z: 1047,3 [M+H]<+>
Jedinjenje R7d
[0137] U rastvor R7c (1 ekv., 23 mg, 22 µmol) u MeOH (20 ml) dodat je 1 M vodeni rastvor LiOH (200 ekv., 4,4 ml, 4,4 mmol). Dobijena reakciona smeša je mešana na 25 °C tokom 4 h i prečišćena pomoću preparativne HPLC, što je dalo R7d (16 mg, 0,018 mmol, 80%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
[0138] MS (postupak 3) m/z: 907,3 [M+H]<+>
Jedinjenje S7d
[0139] U rastvor S7c (1 ekv., 23 mg, 22 µmol) u MeOH (20 ml) dodat je 1 M vodeni rastvor LiOH (200 ekv., 4,4 ml, 4,4 mmol). Dobijena reakciona smeša je mešana na 25 °C tokom 4 h i prečišćena pomoću preparativne HPLC, što je dalo S7d (13,9 mg, 0,016 mmol, 69,6%) kao bledožutu čvrstu supstancu.
[0140] MS (postupak 3) m/z: 907,3 [M+H]<+>
Jedinjenje R7
[0141] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,5 ekv., 5,92 mg, 11,3 µmol) u suvom DMF-u (0,1 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,5 ekv., 3,47 mg, 11,3 µmol) u suvom DMF-u (0,1 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat R7d (1 ekv., 6,8 mg, 7,5 µmol) u DMSO-u (0,1 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) pripremljen je mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (0,5 ekv., 0,1 M u DMF-u, 37,5 µl, 3,75 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (0,5 ekv., 0,1 M u H2O, 37,5 µl, 3,75 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (0,5 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 75 µl, 3,75 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (2,5 ekv., 0,5 M u H2O, 37,5 µl, 18,75 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R7 (6,95 mg, 4,28 µmol, 57%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 3,92 min
MS (postupak 3) m/z: 813,9 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje S7
[0142] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,5 ekv., 5,92 mg, 11,3 µmol) u suvom DMF-u (0,1 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,5 ekv., 3,47 mg, 11,3 µmol) u suvom DMF-u (0,1 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat S7d (1 ekv., 6,8 mg, 7,5 µmol) u DMSO-u (0,1 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) pripremljen je mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (0,5 ekv., 0,1 M u DMF-u, 37,5 µl, 3,75 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (0,5 ekv., 0,1 M u H2O, 37,5 µl, 3,75 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (0,5 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 75 µl, 3,75 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (2,5 ekv., 0,5 M u H2O, 37,5 µl, 18,75 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S7 (7,44 mg, 4,58 µmol, 61%) kao belu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 3,95 min
MS (postupak 3) m/z: 813,9 [M+2H]<2+>/2
Jedinjenje R8a
[0143] U rastvor R3 (1 ekv., 317 mg, 0,46 mmol) u acetonitrilu (2 ml) dodat je koncentrovani HCl (52,2 ekv., 2 ml, 24 mmol) i smeša je mešana na 37 °C tokom 16 h. U dobijenu smešu je dodat EtOAc (8 ml), a zatim je dodata voda (8 ml). Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je tri puta ekstrahovan pomoću EtOAc. Kombinovani organski sloj je osušen iznad MgSO4i koncentrovan pod vakuumom, što je dalo sirovi R8a (250 mg, 0,46 mmol, 99%), koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
[0144] MS (postupak 3) m/z: 549,1 [M+H]<+>
Jedinjenje S8a
[0145] U rastvor S3 (1 ekv., 317 mg, 0,46 mmol) u acetonitrilu (2 ml) dodat je koncentrovani HCl (52,2 ekv., 2 ml, 24 mmol) i smeša je mešana na 37 °C tokom 16 h. U dobijenu smešu je dodat EtOAc (8 ml), a zatim je dodata voda (8 ml). Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je tri puta ekstrahovan pomoću EtOAc. Kombinovani organski sloj je osušen iznad MgSO4i koncentrovan pod vakuumom, što je dalo sirovi S8a (247 mg, 0,45 mmol, 98%), koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
[0146] MS (postupak 3) m/z: 549,1 [M+H]<+>
Jedinjenje R8b
[0147] U rastvor doksorubicin hidrohlorida (1 ekv., 10 mg, 0,017 mmol) u DMF-u (0,35 ml) dodat je rastvor TEA (2 ekv., 0,35 ml, 0,1 M u DMF-u, 0,035 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje R8a (1 ekv., 9,5 mg, 0,017 mmol). Dobijena smeša je mešana na 25 °C tokom 16 h i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R8b (12,2 mg, 0,013 mmol, 74%) kao crvenu čvrstu supstancu.
[0148] MS (postupak 3) m/z: 953,3 [M+H]<+>
Jedinjenje S8b
[0149] U rastvor doksorubicin hidrohlorida (1 ekv., 10 mg, 0,017 mmol) u DMF-u (0,35 ml) dodat je rastvor TEA (2 ekv., 0,35 ml, 0,1 M u DMF-u, 0,035 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje S8a (1 ekv., 9,5 mg, 0,017 mmol). Dobijena smeša je mešana na 25 °C tokom 16 h i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S8b (13,2 mg, 0,014 mmol, 80%) kao crvenu čvrstu supstancu.
[0150] MS (postupak 3) m/z: 953,3 [M+H]<+>
Jedinjenje R8
[0151] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,5 ekv., 11,82 mg, 22,45 µmol) u suvom DMF-u (0,2 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,5 ekv., 6,92 mg, 22,45 µmol) u suvom DMF-u (0,2 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat R8b (1
4
ekv., 12 mg, 14,97 µmol) u DMSO-u (0,2 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) je pripremljen mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (1 ekv., 0,1 M u DMF-u, 150 µl, 14,97 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (1 ekv., 0,1 M u H2O, 150 µl, 14,97 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (1 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 300 µl, 14,97 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (2 ekv., 0,5 M u H2O, 60 µl, 29,94 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo R8 (14,35 mg, 9,43 µmol, 63%) kao crvenu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 3,70 min
MS (postupak 3) m/z: 836,9 [M+2H]<2+>/2
[0152] U rastvor 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-dekaoksadotriakontan-1-amina (1,5 ekv., 11,82 mg, 22,45 µmol) u suvom DMF-u (0,2 ml) dodat je rastvor 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoata (1,5 ekv., 6,92 mg, 22,45 µmol) u suvom DMF-u (0,2 ml). Smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata, a zatim je dodat S8b (1 ekv., 12 mg, 14,97 µmol) u DMSO-u (0,2 ml). Kompleks THPTA-Cu(II) je pripremljen mešanjem tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina (1 ekv., 0,1 M u DMF-u, 150 µl, 14,97 µmol) i bakar sulfat pentahidrata (1 ekv., 0,1 M u H2O, 150 µl, 14,97 µmol) i inkubiranjem na 21 °C tokom 1 minuta. Kompleks THPTA-Cu(II) (1 ekv., 0,05 M u DMF/H2O 50/50, 300 µl, 14,97 µmol) dodat je u reakcionu smešu, nakon čega je sledio natrijum askorbat (2 ekv., 0,5 M u H2O, 60 µl, 29,94 µmol). Dobijena smeša je inkubirana na 21 °C tokom 15 min i prečišćena pomoću preparativne HPLC (postupak 1), što je dalo S8 (15,5 mg, 10,18 µmol, 68%) kao crvenu čvrstu supstancu.
HPLC (postupak 2) RT: 3,65 min
MS (postupak 3) m/z: 836,9 [M+2H]<2+>/2
Utvrđivanje apsolutne konfiguracije R1 do R1a pomoću rendgenske kristalografije 1) Priprema R1a
[0153]
[0154] Estar R1a je sintetisan, kristalisan i analiziran pomoću rendgenske kristalografije radi utvrđivanja apsolutne konfiguracije R1. U rastvor R1 (1 ekv., 111 mg, 0,536 mmol) i trietilamina (2 ekv., 108 mg, 0,149 ml, 1,07 mmol) u THF-u (3,61 ml) ohlađen na 0 °C ukapavanjem je dodat rastvor 4- nitrobenzoil hlorida (1,5 ekv., 149 mg, 0,804 mmol) u THF-u (3,61 ml). Dobijeni rastvor je zagrejan na sobnu temperaturu i ostavljen tokom 30 minuta. Dodat je etil acetat (22 ml), nakon čega je dodato 7 ml vode. Organski sloj je odvojen i ispran zasićenim rastvorom NaCl. Organski sloj je uparen i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (gradijent cikloheksan/EtOAC 0-100% EtOAc za 20 minuta; 30 zapremina kolone), što je dalo R1a (60,5 mg, 0,17 mmol, prinos 88%).
2) Utvrđivanje apsolutne konfiguracije R1a pomoću rendgenske kristalografije [0155] R1a (60 mg) rastvoren je u 3 ml dihlormetana i razblažen sa 3 ml heptana. Smeša je ostavljena da se polako upari tokom perioda od 2 nedelje, što je dovelo do nastanka kristala R1a. Kristali su ubačeni u ulje, i pojedinačni kristal u vidu bezbojne ploče dimenzija 0,50 × 0,40 × 0,18 mm je izabran, montiran na stakleno vlakno i stavljen pod mlaz N2na niskoj temperaturi. Prikupljanje podataka na osnovu rendgenske difrakcije je obavljeno na difraktometru Bruker APEX II DUO Kappa-CCD opremljenom uređajem Oxford Cryosystem sa tečnim N2, koristeći Cu-Kα zračenje (λ = 1,54178 Å). Razdaljina kristaldetektor je bila 40 mm. Ćelijski parametri su utvrđeni (softver APEX3) na osnovu refleksija snimljenih sa tri skupa od 20 frejmova, svaki sa ekspozicijom 10 s. Struktura je određena koristeći program SHELXT-2014. Utačnjavanje i sve dalje kalkulacije su obavljene koristeći SBELXL-2014. Atom vodonika jedne OH grupe je lociran pomoću Furijeove razlike. Ostali atomi H su uključeni na izračunatim pozicijama i tretirani su kao jašući atomi koristeći zadata podešavanja SHELXL. Atomi koji nisu H su anizotropno utačnjeni, koristeći ponderisanu kompletnu matricu najmanjih kvadrata na F<2>. Poluempirijska korekcija apsorpcije je primenjena koristeći SADABS u APEX3; transmisioni faktori: Tmin/Tmax= 0,6111/0,7528.
[0156] Rezultati rendgenske kristalografije su dati na slici 1.
Merenje kinetičkih parametara oslobađanja MMAE indukovanog β-glukuronidazom [0157]
● Rastvor uzorka R izomera je pripremljen dodavanjem 10 µl R5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
● Rastvor uzorka S izomera je pripremljen dodavanjem 10 µl S5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
● Rastvor za deaktivaciju (Q) pripremljen je dodavanjem 50 µl 1 M vodenog rastvora HCl u 1,5 ml acetonitrila.
● Rastvor β-glukuronidaze (Glu) pripremljen je dodavanjem 20 µl vodenog glicerolnog rastvora β-glukuronidaze od Escherichia coli (6,5 mg/ml) u 180 µl H2O.
● Referentni rastvor (Ref) pripremljen je dodavanjem 10 µl MMAE (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
[0158] U 1 ml svakog izomera i referentnog rastvora dodato je 40,9 ul Glu. Dobijene smeše su inkubirane na 37 °C. Alikvoti svakog rastvora od 45 µl su deaktivirani sa 155 µl Q u sledećim terminima: 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min i 7 min. Deaktivirani alikvoti su centrifugirani na 15.000 g tokom 5 min i supernatant je analiziran pomoću LCMS (postupak 3) sa snimanjem odabranog jona podešenim na 719 Da (odgovara [MMAE+H]<+>). Količina oslobođenog MMAE u svakom terminu je izračunata kao (površina pika uzorka)/(površina pika reference) × 100% (slika 2).
Opšti postupci za merenje kinetičkih parametara oslobađanja citotoksičnog leka indukovanog β-glukuronidazom
[0159]
4
● Rastvor uzorka R izomera je pripremljen dodavanjem 5 µl jedinjenja R6, R7 ili R8 (10 mM u DMSO-u) u 500 µl smeše ljudske plazme i kalijum fosfatnog pufera (0,1 M, pH 7,0) 50/50 i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
● Rastvor uzorka S izomera je pripremljen dodavanjem 5 µl jedinjenja S6, S7 ili S8 (10 mM u DMSO-u) u 500 µl smeše ljudske plazme i kalijum fosfatnog pufera (0,1 M, pH 7,0) 50/50 i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
● Rastvor za deaktivaciju (Q) pripremljen je dodavanjem 50 µl 1 M vodenog rastvora HCl u 1,5 ml acetonitrila.
● Rastvor β-glukuronidaze (Glu) pripremljen je dodavanjem 20 µl vodenog glicerolnog rastvora β-glukuronidaze od Escherichia coli (6,5 mg/ml) u 180 µl H2O.
● Referentni rastvor (Ref) pripremljen je dodavanjem 5 µl odgovarajućeg slobodnog citotoksičnog leka (10 mM u DMSO-u) u 500 µl smeše ljudske plazme i kalijum fosfatnog pufera (0,1 M, pH 7,0) 50/50 i inkubiranjem na 37°C tokom 20 min.
[0160] U svaki uzorak i referentni rastvor dodato je 10 ul Glu. Dobijene smeše su inkubirane na 25 °C. Alikvoti svakog rastvora od 45 µl su deaktivirani sa 155 µl Q u preciznim terminima koji su prikazani na grafikonima (slike 3-5). Deaktivirani alikvoti su centrifugirani na 15.000 g tokom 5 min i supernatant je analiziran pomoću LCMS (postupak 3) sa snimanjem odabranog jona podešenim na [M+H]<+>gde M odgovara molekulskoj masi slobodnog citotoksičnog agensa. Količina oslobođenog citotoksičnog agensa u svakom terminu je izračunata kao (površina pika uzorka)/(površina referentnog pika) × 100%.
[0161] Rezultati su prikazani na slikama 2 do 5:
Slika 2. Kinetički parametri oslobađanja MMAE indukovanog β-glukuronidazom u rastvorima R5 i S5 u plazmi pokazuju značajno brže raskidanje R5 vezanog za plazmu u poređenju sa S5 : nakon 7 minuta inkubacije, 24% MMAE je oslobođeno iz R5 vezanog za plazmu, a samo 12% iz S5 vezanog za plazmu.
Slika 3. Kinetički parametri oslobađanja MMAF indukovanog β-glukuronidazom u rastvorima R6 i S6 u plazmi pokazuju značajno brže raskidanje R6 vezanog za plazmu u poređenju sa S6 : nakon 40 minuta inkubacije, 86% MMAF je oslobođeno iz R6 vezanog za plazmu, a samo 57% iz S6 vezanog za plazmu.
Slika 4. Kinetički parametri oslobađanja SN-38 indukovanog β-glukuronidazom u rastvorima R7 i S7 u plazmi pokazuju brže raskidanje R7 vezanog za plazmu u poređenju sa S7 : nakon 40 minuta inkubacije, 24% SN-38 je oslobođeno iz R7 vezanog za plazmu, a samo 18% iz S7 vezanog za plazmu.
Slika 5. Kinetički parametri oslobađanja doksorubicina indukovanog β-glukuronidazom u rastvorima R8 i S8 u plazmi pokazuju brže raskidanje R8 vezanog za plazmu u poređenju sa S8 : nakon 40 minuta inkubacije, 99% doksorubicina je oslobođeno iz R8 vezanog za plazmu, a 80% iz S8 vezanog za plazmu.
Merenje stabilnosti R5 i S5 u vodenom puferu na pH 7,4
[0162]
● Rastvor uzorka R5-PBS je pripremljen dodavanjem 20 µl R5 (10 mM u DMSO-u) u 180 µl fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (pH 7,4).
● Rastvor uzorka S5-PBS je pripremljen dodavanjem 20 µl S5 (10 mM u DMSO-u) u 180 µl fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (pH 7,4).
● Uzorci su inkubirani na 25 °C i analizirani pomoću LCMS (postupak 3) sa snimanjem odabranog jona podešenim na 924 Da (odgovara [R5+2H]<2+>/2 i [S5+2H]<2+>/2) i na 933 Da (glavna nastala nečistoća koja odgovara hidrolizovanim proizvodima [R5+H2O+2H]<2+>/2 i [S5+H2O+2H]<2+>/2). Uzorci su injektovani u sledećim terminima: 0 min, 99 min, 195 min, 291 min, 387 min, 543 min, 699 min, 855 min, 980 min. Površine pika uzoraka injektovanih nakon 0 min su smatrane referentnim površinama pika.
● % površine pika je izračunat kao (površina pika 924 Da)/((površina pika 924 Da) (površina pika 933 Da)) × 100%.
[0163] Rezultati su prikazani na slici 6. Spora hidroliza jedinjenja (R5 ili S5) uočena je za oba jedinjenja na pH 7,4: 30-40% jedinjenja je hidrolizovano nakon 1000 min.
[0164] Isti eksperiment je obavljen u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom na pH 6,0. Nije uočena razgradnja R5 ili S5 u ovim uslovima ni u jednom terminu.
Kinetički parametri vezivanja R5 i S5 u plazmi
[0165]
● Rastvor za deaktivaciju (Q) pripremljen je dodavanjem 50 µl 1 M vodenog rastvora HCl u 1,5 ml acetonitrila.
4
● Rastvor uzorka R-Alb je pripremljen dodavanjem 10 µl R5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme i inkubiranjem na 37 °C.
● Rastvor uzorka S-Alb je pripremljen dodavanjem 10 µl S5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme i inkubiranjem na 37 °C.
● Alikvoti svakog uzorka od 45 µl su dodati u 155 µl rastvora za deaktivaciju u sledećim terminima: 0 min, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min.
● Deaktivirani alikvoti su centrifugirani na 15.000 g tokom 5 min i supernatant je analiziran pomoću LCMS (postupak 3) sa snimanjem odabranog jona podešenim na 924 Da (odgovara [R5+2H]<2+>/2 i [S5+2H]<2+>/2). Površine pika alikvota deaktiviranih nakon 0 min su smatrane referentnim površinama pika.
● % preostalog slobodnog leka u svakom terminu je izračunat kao (površina pika uzorka)/(površina referentnog pika) × 100%.
[0166] Oba jedinjenja R5 i S5 podležu reakciji brzog vezivanja sa serumskim albuminom, što dovodi do naglog smanjenja koncentracije njihovog slobodnog oblika, kao što je prikazano na slici 7. Nakon 2 minuta inkubacije, oko 90% S5 ili R5 je vezano za serumski albumin, a potpuna konverzija je ostvarena nakon 4 minuta.
Stabilnost R5 i S5 vezanih albuminom u plazmi
[0167]
● Rastvor uzorka R5-Alb je pripremljen dodavanjem 10 µl R5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme.
● Rastvor uzorka S5-Alb je pripremljen dodavanjem 10 µl S5 (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme.
● Rastvor za deaktivaciju (Q) pripremljen je dodavanjem 50 µl 1 M vodenog rastvora HCl u 1,5 ml acetonitrila.
● Referentni rastvor (Ref) pripremljen je dodavanjem 10 µl MMAE (10 mM u DMSO-u) u 990 µl ljudske plazme.
● Rastvori uzoraka i referentni rastvor su inkubirani na 37 °C.
● Alikvoti svakog uzorka od 45 µl su dodati u 155 µl rastvora za deaktivaciju u sledećim terminima: 0 h, 8 h, 24 h, 48 h, 102 h, 192 h.
4
● Deaktivirani alikvoti su centrifugirani na 15.000 g tokom 5 min i supernatant je analiziran pomoću LCMS (postupak 3) sa snimanjem odabranog jona podešenim na 719 Da (odgovara [MMAE+H]<+>).
● % oslobođenog MMAE u svakom terminu je izračunat kao (površina pika uzorka)/(površina pika reference) × 100%.
[0168] Kao što je prikazano na slici 8, R5 i S5 vezani albuminom ostaju stabilni u plazmi, pošto su samo neznatne količine citotoksičnog leka (MMAE) oslobođene nakon dugotrajne inkubacije (manje od 10% nakon 192 sata, tj.8 dana, inkubacije).
Testovi razdvajanja
[0169] Test sa ciljem razdvajanja jedinjenja R5 i S5 u smeši 1:1 obavljen je pomoću HPLC prema postupku 2, ali se pokazao neuspešnim: kao što je prikazano na slici 9, dobijena su veoma slična RT od 6,72 i 6,83 minuta.
[0170] Sličan test je obavljen sa smešom R4 i S41:1, ali je razdvajanje takođe bilo neuspešno, pošto su dobijena RT od 7,56 i 7,72 minuta (slika 10).
4

Claims (4)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat predstavljen formulom (I)
    pri čemu A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka, G je samorazgradivi funkcionalni ostatak, i m je 0 ili 1, i farmaceutski prihvatljive soli prethodnog.
  2. 2. Konjugat prema zahtevu 1, pri čemu je citotoksični lek izabran od antraciklina, kao što je doksorubicin, dolastatina kao što je dolastatin 10, dolastatin 15, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monometil auristatin F (MMAF), monometil auristatin D (MMAD), monometil auristatin E (MMAE), 5-benzoilpentanska kiselina-AE estar (AEVB), i analoga kamptotecina koji su izabrani od kamptotecina, SN-38, topotekana, irinotekana, eksatekana, silatekana, kositekana, lurtotekana, gimatekana, belotekana i rubitekana.
  3. 3. Konjugat prema zahtevu 2, pri čemu je citotoksični lek izabran iz grupe koja se sastoji od SN-38, doksorubicina, MMAF, MMAE i MMAD.
  4. 4. Konjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je G predstavljeno formulom izabranom od:
    4 5. Prolek koji obuhvata najmanje jedan molekul konjugata prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je pomenuti molekul konjugata preko kovalentne veze vezan za molekul proteina, poželjno albumina, ili njegov fragment, pri čemu se „prolek“ odnosi na najmanje jedan konjugat kovalentno vezan za makromolekul. 6. Prolek prema zahtevu 5, pri čemu je kovalentna veza uspostavljena sa tiolnom funkcionalnom grupom cisteina na poziciji 34 u albuminu. 7. Prolek prema zahtevu 5, predstavljen formulom (II),
    pri čemu A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka, Prt predstavlja radikal dobijen od proteina, n se nalazi u rasponu od 0,1 do 16, poželjno od 0,1 do 8, G je samorazgradivi funkcionalni ostatak, i m je 0 ili 1, i farmaceutski prihvatljive soli prethodnog. 8. Prolek prema zahtevu 7, pri čemu Prt predstavlja radikal dobijen od albumina, i n je 1. 9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata barem delotvornu količinu najmanje jednog konjugata definisanog prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili najmanje jednog proleka definisanog prema bilo kom od zahteva 5 do 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač. 4 10. Konjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju kancera i/ili inflamatorne bolesti. 11. Prolek prema bilo kom od zahteva 5 do 8 za upotrebu u lečenju kancera i/ili inflamatorne bolesti. 12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 za upotrebu u lečenju kancera i/ili inflamatorne bolesti. 13. Proces za pripremu konjugata definisanog prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji se sastoji od sledećih koraka: a) pripreme rac-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola od 4-hidroksi-3-nitrobenzaldehida; b) razdvajanje i izolovanje (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola, poželjno pomoću hiralne tečne hromatografije visokih performansi; c) dovođenje u reakciju (R)-4-(1-hidroksibut-3-in-1-il)-2-nitro-fenola sa derivatom glukuronske kiseline, kao što je metil acetobrom-α-D-glukuronat, u baznim uslovima; d) dovođenje u reakciju jedinjenja dobijenog u koraku (c) sa 4-nitrofenil hloroformatom; e) spajanje jedinjenja dobijenog u koraku (d) sa citotoksičnim lekom ili sa funkcionalnim ostatkom A-G-H, gde A predstavlja radikal dobijen od citotoksičnog leka i G predstavlja samorazgradivi funkcionalni ostatak; f) deprotekcija funkcionalnog ostatka glukuronida jedinjenja dobijenog u koraku (e), poželjno u baznim uslovima; i g) spajanje jedinjenja dobijenog u koraku (f) sa azidom formule N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-(CO)-(CH2)5-X, pri čemu X predstavlja maleimidnu grupu.
RS20241109A 2018-04-03 2019-04-02 Konjugat citotoksičnog leka i oblik proleka pomenutog konjugata RS66033B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18305390 2018-04-03
EP19713507.2A EP3773735B1 (en) 2018-04-03 2019-04-02 Conjugate of cytotoxic drug and prodrug form of said conjugate
PCT/EP2019/058226 WO2019192979A1 (en) 2018-04-03 2019-04-02 Conjugate of cytotoxic drug and prodrug form of said conjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66033B1 true RS66033B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=61965888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241109A RS66033B1 (sr) 2018-04-03 2019-04-02 Konjugat citotoksičnog leka i oblik proleka pomenutog konjugata

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20210023113A1 (sr)
EP (1) EP3773735B1 (sr)
JP (1) JP7397058B2 (sr)
KR (2) KR20250117704A (sr)
CN (2) CN120078904A (sr)
AU (1) AU2019248589B2 (sr)
CA (1) CA3095146A1 (sr)
DK (1) DK3773735T3 (sr)
EA (1) EA202092361A1 (sr)
ES (1) ES2989309T3 (sr)
FI (1) FI3773735T3 (sr)
HR (1) HRP20241363T1 (sr)
HU (1) HUE068574T2 (sr)
IL (1) IL277693B2 (sr)
LT (1) LT3773735T (sr)
MX (1) MX2020010201A (sr)
PL (1) PL3773735T3 (sr)
PT (1) PT3773735T (sr)
RS (1) RS66033B1 (sr)
SI (1) SI3773735T1 (sr)
SM (1) SMT202400404T1 (sr)
WO (1) WO2019192979A1 (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114437151B (zh) * 2020-11-03 2023-12-01 华东师范大学 白蛋白结合型喜树碱衍生物前药及其制备方法与应用
FR3126982B1 (fr) * 2021-09-14 2023-09-15 Centre Nat Rech Scient Vecteurs ciblant la beta-d-n-acetylglucosaminidase
CN114085256B (zh) * 2021-11-23 2024-03-19 江南大学 一种β-半乳糖苷酶响应的糖类衍生物及其应用
CN114957356B (zh) * 2022-06-17 2024-10-01 江南大学 一种β-葡萄糖醛酸酶响应的糖类衍生物及其制备方法与应用
CN120936385A (zh) 2023-03-13 2025-11-11 海德堡医药研究有限责任公司 用于在癌症治疗中使用的皮下施用的抗体-药物缀合物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2960153B1 (fr) * 2010-05-20 2012-08-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux bras autoreactifs et prodrogues les comprenant
EP3066120B1 (en) 2013-11-04 2018-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Synthetic single domain antibody
FR3017298B1 (fr) * 2014-02-07 2016-03-04 Centre Nat Rech Scient Conjugues et pro-drogues pour le traitement du cancer et de maladies inflammatoires

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021520409A (ja) 2021-08-19
ES2989309T3 (es) 2024-11-26
SMT202400404T1 (it) 2024-11-15
SI3773735T1 (sl) 2025-03-31
MX2020010201A (es) 2020-12-10
HRP20241363T1 (hr) 2024-12-20
PL3773735T3 (pl) 2025-01-20
DK3773735T3 (da) 2024-10-21
FI3773735T3 (fi) 2024-10-14
HUE068574T2 (hu) 2025-01-28
CN112004556A (zh) 2020-11-27
IL277693B1 (en) 2023-10-01
IL277693B2 (en) 2024-02-01
WO2019192979A1 (en) 2019-10-10
AU2019248589A1 (en) 2020-10-22
CN120078904A (zh) 2025-06-03
JP7397058B2 (ja) 2023-12-12
EP3773735A1 (en) 2021-02-17
EA202092361A1 (ru) 2021-02-02
US20210023113A1 (en) 2021-01-28
KR20210018208A (ko) 2021-02-17
EP3773735B1 (en) 2024-07-10
KR102840665B1 (ko) 2025-07-30
KR20250117704A (ko) 2025-08-05
CA3095146A1 (en) 2019-10-10
PT3773735T (pt) 2024-10-10
IL277693A (en) 2020-11-30
LT3773735T (lt) 2024-10-25
AU2019248589B2 (en) 2025-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7728821B2 (ja) 抗体－薬物コンジュゲートの改良製造方法
AU2019248589B2 (en) Conjugate of cytotoxic drug and prodrug form of said conjugate
CA3224492A1 (en) Immunoconjugates and methods
AU2017237186A1 (en) Process for the preparation of PEGylated drug-linkers and intermediates thereof
KR20230133312A (ko) 캄프토테신 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법
CA3208591A1 (en) Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US12274754B2 (en) Immunoconjugates and methods
CA3226897A1 (en) Tumor-associated calcium signal transducer 2 (tacstd2) antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
US12077606B2 (en) Cyclic peptide analogs and conjugates thereof
EA043080B1 (ru) Конъюгат цитотоксического лекарственного средства и пролекарственная форма указанного конъюгата
EA049882B1 (ru) Производные бис-октагидрофенантренкарбоксамида и их белковые конъюгаты