RS65622B1 - Kapilarna gel elektroforeza i njena upotreba sa složenim biološkim molekulima - Google Patents

Kapilarna gel elektroforeza i njena upotreba sa složenim biološkim molekulima

Info

Publication number
RS65622B1
RS65622B1 RS20240666A RSP20240666A RS65622B1 RS 65622 B1 RS65622 B1 RS 65622B1 RS 20240666 A RS20240666 A RS 20240666A RS P20240666 A RSP20240666 A RS P20240666A RS 65622 B1 RS65622 B1 RS 65622B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sample
biological molecule
calibration
cge
reducing agent
Prior art date
Application number
RS20240666A
Other languages
English (en)
Inventor
Oscar Vassallo
Original Assignee
Ares Trading Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ares Trading Sa filed Critical Ares Trading Sa
Publication of RS65622B1 publication Critical patent/RS65622B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
<Oblast pronalaska>
Ovde opisani pronalazak se odnosi na analitičku kapilarnu gel elektroforezu (CGE).
<Pozadina pronalaska>
Kapilarna gel elektroforeza (CGE) je senzitivna i svestrana tehnika koja je izbila u prvi plan<analitičke metodologije. Njegova primenljivost je poboljšana kratkim vremenima separacije, lakim i brzim metodama razvoja i zahtevom za veoma malim količinama analita. Kapilarna gel elektroforeza se oslanja na metode elektrokinetičke separacije izvedene u kapilarima submilimetarskih prečnika i u mikro- i nanofluidnim kanalima. U CGE analiti migriraju kroz rastvore elektrolita pod uticajem električnog polja. Analiti se mogu razdvojiti prema molekulskoj masi molekula prisutnih u analitu.>
<Identitet molekula i njihove relativne količine u uzorku za testiranje se često određuju korišćenjem CGE. Takva određivanja se oslanjaju na vreme(na) migracije različitih sastojaka u takvom uzorku za>testiranje. Uzimajući u obzir inter-eksperimentalne varijacije (tj. od eksperimenta do eksperimenta)u takvim vremenima migracije, neophodno je uspostaviti odgovarajuću kalibracionu krivu za svaki eksperiment. Takva kalibraciona kriva se obično dobija korišćenjem rastvora uzorka koji sadrži poznate količine više različitih molekula. Ovi molekuli su izabrani da pokriju opseg molekulskih težina, poželjno pokrivajući opseg molekulskih težina, koji opseg obuhvata očekivanu molekulsku težinu analita od interesa.
U takvim uzorcima/kalibracionim rastvorima se uobičajeno koriste standardni kalibracioni molekuli. U standardnim CGE metodama očekuje se da je vreme migracije bilo kog od molekula direktno povezano sa njihovom molekulskom težinom. Dakle, jedina karakteristika koja je od<značaja za molekule u uzorku/kalibracionom rastvoru je njihova molekulska težina.>
WO 86/06383 A1 otkriva metodu za detekciju i određivanje molekulske težine jednog ili višeuzoraka proteina.
<Primećeno je, međutim, da za složene biološke molekule ova direktna korelacija između vremena>migracije i molekulske težine nije dosledno posmatrana. Neki složeni biološki molekuli, posebnofuzioni proteini i antitela (koji proteini mogu biti glikozilovani), mogu imati vreme migracije<drugačije od očekivanog vremena migracije na osnovu njihove molekularne težine. Shodno tome, standardni molekuli dati u uzorku kalibracije ne daju kalibracionu krivu koja se može koristiti za>identifikaciju različitih složenih bioloških molekula. Pogrešna interpretacija identifikovanih pikovau CGE hromatogramu može rezultirati pogrešnom identifikacijom različitih molekula i njihovih relativnih količina u uzorku za testiranje.
Prema tome, u stanju tehnike postoji potreba za poboljšanim CGE metodom koji bi prevazišao oveprobleme uočene pri izvođenju analitičkog CGE sa složenim biološkim molekulima.
<Suština pronalaska.>
<Ovaj pronalazak pruža rešenje za probleme opisane iznad. Za analitički CGE za složene biološke molekule obezbeđena je poboljšana metoda. Konkretno, takva poboljšana metoda obuhvata dobijanje kalibracione krive sa delimično redukovanim kalibracionim rastvorom biološkog molekula analita od interesa. U jednom izvođenju obezbeđena je metoda za određivanje molekulske težine sastojaka test uzorka koji sadrži biološki molekul korišćenjem kapilarne gel elektroforeze>(CGE), metoda koja obuhvata korake: a.) dobijanje kalibracione krive za biološki molekul u CGE koji obuhvata korake delimične redukcije kalibracionog uzorka koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, dostavljanje delimično redukovanog kalibracionog uzorka CGE, određivanje vremena migracije komponenti delimično redukovanog biološkog molekula u delimično smanjeni kalibracioni uzorak i izračunavanja kalibracione krive za biološki molekul u CGE; b.) dostavljanje test uzorka koji sadrži biološki molekul u CGE; c.) određivanje vremena migracije sastojaka u uzorku za ispitivanje; i d.) identifikovanje molekulske težine sastojaka u test uzorku za<upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom dobijenom u koraku a). Takav metod je posebno koristan u analizi uzoraka koji sadrže složene biološke molekule kao što su antitela ili fuzioni proteini.>
U sledećoj varijanti opisan je metod za identifikaciju sastava uzorka za testiranje koji sadrži biološki molekul koji obuhvata: a.) određivanje molekulske težine sastojaka uzorka prema metodi opisanoj u prethodnom izvođenju koje sadrži korake dobijanja kalibracione krive za biološki molekul u CGE<delimičnom redukcijom kalibracionog uzorka koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, dostavljanje delimično redukovanog kalibracionog uzorka CGE, određivanje vremena migracije komponenti delimično redukovanog biološkog molekula u delimično redukovanom kalibracionom uzorku i izračunavanje kalibracione krive za biološki molekul u CGE, dostavljanje testnog uzorka koji sadrži biološki molekul u CGE, određivanje vremena migracije sastojaka u uzorku za testiranje, i identifikaciju molekularne težine sastojaka u uzorku za testiranje upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom; b.) identifikaciju sastojaka uzorka na osnovu njihove>molekulske težine, i određivanje relativnih količina svakog od sastojaka na osnovu CGE izvršenog u koraku a.).
U drugom izvođenju opisan je metod određivanja čistoće uzorka koji sadrži biološki molekul koji obuhvata: a.) identifikaciju kompozicije uzorka u skladu sa metodom korišćenjem metode opisane u prethodnom izvođenju i b.) određivanje relativne količine biološkog molekula od interesa prisutnog u uzorku.
<Kratak opis crteža>
<Slika 1; prikazuje vremena migracije uzorka koji sadrži uobičajene molekule kalibracije molekulske težine sa dodatkom kompleksnog biološkog molekula (Cetuximab (Erbitux®)). Jasno je prikazano>neslaganje između vremena migracije molekula standardne veličine (Std) i molekularnihpodjedinica/vrsta cetuksimaba (uzimajući u obzir njihove teorijske težine) (Erbitux LC i Eritux HC). Slika 2; prikazuje očekivane molarne odnose za laki lanac (LC) i težak lanac (HC) uključene u svaku od različitih molekularnih podjedinica/vrsta delimično redukovanog antitela.
<Slika 3; prikazuje različita vremena migracije i izračunate molekulske težine za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog humanog IgG2 Ne-Glikozilovanog antitela (anti-TIM3). Slika 4; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog humanog IgG2 Ne-Glikozilovanog antitela (anti-TM3) i rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na uočenim vremenima migracije.>
<Slika 5; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste dva delimično redukovana antitela u poređenju sa migracijom vrsta standardne veličine komercijalne veličine, sa relativnom kalibracionom krivom i znatnim odstupanjima pronađenim u poređenju račvastih krivih.>
<Slika 6; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog humanog IgG2 Ne-Glikozilovanog antitela (anti-TM3), rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na posmatranim vremenima migracije i poređenje između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.>
Slika 7; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog IgG1 Glikozilovanog antitela, rezultujuću kalibracionom krivu zasnovanu na posmatranim vremenima migracije i poređenje između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.
Slika 8; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog IgG1 Glikozilovanog antitela kappa lakog lanca, rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na uočenim vremenima migracije i poređenje između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.
Slika 9; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog IgG1.4 ostatka konjugovanog u Dolafleksin sa Cis linker glikozilovanim antitelom na bazi maleimida, rezultujuću kalibracionu krivu zasnovana na posmatranim vremenima migracije i<poređenja između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.>
<Slika 10; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog Himernog mišjeg/humanog IgG1 Ne-Glikozilovanog antitela, rezultujuću kalibracionu>krivu zasnovanu na posmatranim vremenima migracije i poređenje između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.
Slika 11; prikazuje različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste delimično redukovanog Fuzionog IgG1 sa Sirp-α domenom povezanim sa LC Glikozilovanim antitelom,rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na posmatranim vremenima migracije i poređenje između eksperimentalnog i teoretskog relativnog procenta molarnog odnosa.
<Detaljan opis>
<Kapilarna gel elektroforeza (CGE) je često korišćena analitička metoda za određivanje sastava uzorka analita. Metod se može koristiti kvalitativno i polu-kvantitativno za određivanje sastava>uzorka analita, kao što je na primer proizveden u proizvodnji aktivnog farmaceutskog sastojka. Kaoinicijalni korak u takvoj analitičkoj metodi, kalibracija metode se sprovodi pomoću kalibracione krive sa molekulima poznate molekulske težine. Identitet, u poređenju sa njihovom molekulskom težinom, molekula prisutnih u uzorku zasniva se na njihovim vremenima migracije u poređenju sa vremenima migracije molekula poznate molekulske težine kao na kalibracionoj krivoj napravljenoj<sa istim molekulom koji se istražuje. Metod se zasniva na direktnoj korelaciji između vremena migracije i molekulske težine molekula u ispitivanim uzorcima. Međutim, vremena migracije za složene biološke molekule u CGE možda neće uvek biti u direktnoj korelaciji sa njihovom molekulskom težinom u poređenju sa vremenima migracije za konvencionalne standardne molekule u kalibracionom uzorku.>
<Na Slici 1, dat je primer gde je uzorak koji sadrži standardne standarde molekulske težine pomešan sa određenom količinom antitela cetuksimaba (poznatog kao Erbitux®). Jasno je da podjedinice/vrste cetuksimaba, koje imaju molekulsku težinu od 23 kD i 53 kD, imaju različita>vremena migracije u poređenju sa konvencionalnim standardima koji imaju približno istu molekulsku masu. Kao rezultat, podjedinica/vrsta cetuksimaba od 23 kD migrira u poređenju sa standardom od 25 kD sa vremenom migracije koje se čini da je oko 30 kD. Isto tako, podjedinica/vrsta cetuksimaba od 53 kD ima vreme migracije u poređenju sa standardom od 50 kD (i 100 kD) koje izgleda bliže molekulu od oko 75 kD. Svaka takva neslaganja mogu biti posledica toga što se tako složeni molekuli nakon izlaganja reduktivima dezintegrišu u više komponenti ili su molekuli takve veličine ili sadrže određeni istaknuti naboj i složene šećere koji će izazvati njihovu migraciju pod električnim poljem i interakciju sa gel matricom zasnovanom na Dekstranu (kako se<obično koristi) u CGE da se ponaša drugačije od konvencionalnih standarda koji su uglavnom neglikozilirani.>
<U ovom pronalasku, kalibraciona kriva se dobija sa uzorkom biološkog molekula analita od interesa>umesto korišćenja konvencionalnih standarda za kalibraciju. Štaviše, kalibraciona kriva se dobija<korišćenjem nove metode za delimično smanjenje kompleksnog analita biološkog molekula od interesa. Metoda delimične redukcije analita biološkog molekula od interesa od interesa omogućava dobijanje kalibracione krive sa različitim komponentama (ili njihovim kombinacijama) analita biološkog molekula od interesa. Na primer, analit biološkog molekula od interesa je protein antitela.>Takav protein antitela je složen molekul koji se sastoji od više elemenata (podjedinica ili vrsta) dabi se formirao protein antitela. Dva laka i dva teška lanca proteina čine kompletno antitelo. Kao što je prikazano na Slici 2, delimična redukcija uzorka antitela dovodi do više različitih elemenata (podjedinica/vrsta) sa različitim molekulskim težinama i jednim specifičnim molarnim odnosom. Slika 2 prikazuje takve moguće podjedinice/vrste takve delimične redukcije antitela uključujući<pojedinačne lake lance (LC), individualne teške lance (HC), jednu kombinaciju lakog lanca i teškog lanca (1H1L), kombinaciju dva teška lanca (HH), kombinaciju dva teška lanca i jednog lakog lanca (2H1L), i intaktni molekul antitela (2H2L). Za humano IgG2 neglikozilovano primerno antitelo>(anti-TIM3) molekulska težina svake molekularne podjedinice/vrste je poznata kao što je prikazano na Slici 3.
Biološki molekul analita od interesa kako se koristi u postupku ovog pronalaska uključuje antitela,<jednolančana antitela, fuzione proteine, himerne proteine i sve druge proteine koji imaju jednu ili više podjedinica ili jedno ili više mesta redukcije (kao što su disulfidne veze). Poželjno, za takav biološki molekul analita od interesa molarni odnos molekulskih podjedinica/vrsta je poznat. Iako je>posebno koristan za biološke molekule analita, metoda ovog pronalaska nije ograničena na upotrebu sa složenim biološkim molekulima. Bilo koji molekul analita koji sadrži reducibilne podjedinice može da se koristi u postupku ovog pronalaska.
<Delimična redukcija biološkog molekula analita obuhvata najmanje dva glavna koraka. U prvom>koraku se koristi redukcioni agens da delimično redukuje složeni biološki molekul. U drugomkoraku se koristi alkilacioni agens koji gasi smešu kompleksnog biološkog molekula i redukcionog<agensa i sprečava dalju redukciju kompleksnog biološkog molekula. Dakle, delimična redukcija kalibracionog uzorka biološkog molekula analita od interesa obuhvata: a.) dodavanje redukcionog agensa puferovanom rastvoru koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, i b.) inkubiranje>kalibracionog uzorka iz koraka a) na neki vremenski period, pri čemu je dužina vremenskogperioda takva da biološki molekul nije u potpunosti redukovan. U okviru vremenskog perioda u kome biološki molekul nije u potpunosti redukovan, metoda može dalje da obuhvata: c.) dodavanje alkilacionog agensa delimično redukovanom kalibracionom uzorku iz koraka b, i d.) inkubiranje<delimično redukovanog kalibracionog uzorka iz koraka c) na određeno vreme.>
U gornjoj metodi delimične redukcije kompleksnog biološkog molekula, prvi korak (korak a.) jepoželjno da se izvede na sobnoj temperaturi u periodu od oko 30 minuta ili manje. Korak inkubacije<delimično redukovanog kalibracionog uzorka sa sredstvom za alkilovanje (korak d.) je poželjno da se izvede na temperaturi u opsegu od sobne temperature do oko 75°C, poželjno između oko 50°C i oko 75°C, poželjnije na oko 70°C. Inkubacija delimično redukovanog koraka kalibracije sa sredstvom za alkilovanje traje do oko 15 min, poželjno od oko 5 min do oko 15 min, poželjnije u periodu od oko 10 min. Izraz "oko" ovde je definisan kao iznos plus ili minus 10 procenata navedene vrednosti. Tako oko 50°C označava 50°C /- 5°C, a oko 30 min označava 30 min /- 3 min.>
<Koncentracije koje se koriste za redukciono sredstvo i sredstvo za alkilovanje u metodi delimične redukcije ovog pronalaska su od oko 15 do 500 mM, poželjno od oko 30 do oko 470 mM, poželjnije od oko 125 mM do oko 375 mM, još poželjnije od oko 200 mM do oko 300 mM. Redukcioni agens i agens za alkilovanje se poželjno koriste u odnosu koncentracija redukcionog sredstva: alkilaciono sredstvo od oko 0.6 do 0.80. Kao takav, odnos koncentracija redukcionog sredstva prema agensu za alkilovanje je u opsegu od 0.15:3, pogodno od 1:6.5 do 3:1. Poželjnije da je odnos redukcionog agensa prema agensu za alkilovanje 1:1. Poželjno, koncentracija redukcionog agensa i agensa za alkilovanje je 250 mM.>
<Kao redukciono sredstvo može se koristiti bilo koji konvencionalni redukcioni agens. Poželjno, redukcioni agensi su 2-merkaptoetanol, 2-merkaptoetilamin, ditiotreitol (DTT), Tris (2->karboksietil) fofin (TCEP) ili ditiobutilamin (DTBA). Poželjnije redukciono sredstvo je TCEP.
Kao agens za alkilovanje može se koristiti bilo koji konvencionalni agens za alkilovanje. Poželjno je da se agens za alkilovanje bira između maleimida ili njegovog derivata, 9-antracenemetanola ili njegovog derivata, 1-naftalinmetanola, 2,2-bifenildimetanola, 2-indanola, jodacetamida, ditiotreitola (DTT), amonijum bikarbonata, streptozocina, N-nitro-Netilurea, Prokarbazina, temozolomida, busulfana, 2-hloro-2-metilpropana, karmustina, ciklofosfamida, 2-bromo-3'-metoksiacetofenona, 4-hloro-1-butanola, 3-hloropropionamida, bromoacetil-hololin bromida, 1,10-dijodeodekana, 5-hlorovaleroil hlorida, R(-)-hloroetilnorapomorfina, etil metansulfonata, metil trifluorometansulfonata, tetrapentilamonijum bromida, N-N- dimetilizopropilamina, 1-hloro-2,4-dinitrobenzena, hidrata disodijum soli 4,4’-diizotiocijanatostilben-2,2’-disulfonske kiseline, etil-7-bromoheptanoata, 2-fluorobenzil bromida, 2,3-dihidro-3-okso-4H-1,4-benzoksazin-4-propionske kiseline, elaginske kiseline, fenetilamina, dakarbazina, cis-1,5-dimetilbiciklo[3.3.0]oktan-3,7-diona, 2,4'-dihloroacetofenona, 3,4 -dihlorobenzil hlorida, trimetilsilil bromoacetata, (3-bromopropoksi)-terc-butildimetilsilana, dietilsulfata, 2-(2-bromoetil)-1,3-dioksolana, 1,3-bezoditiolijum tetrafluoroborata, 4-(4-Nitrobenzil)piridina, 5-metoksiindol-2-karboksilne kiseline, fosfazin baze, etil p-toluensulfonata, N-Boc-5-metoksiindola, Iomeguatriba, i hloroacetonitrila. Kao što je ovde navedeno, pogodni derivati maleimida su propilmaleimid, N-etilmaleimid, N-metilmaleimid, N-(2-<hidroksietil) maleimid, N-hidroksimaleimid, N-(1-feniletil)-maleimid, N-(4-hlorfenil) maleimid, 2-malein-imidoetil-mezilat, 1-(4-aminofenil)-1H-pirol-2,5-dion, N-fenilmaleimid, 1-(2-aminoetil) maleimid, N-(2-aminoetil)-maleimid-trifluoroacetat, N-terc-butilmaleimid, N-benzilmaleimid i N-etilmaleimid. Pored toga, kako se ovde navodi, pogodni derivati 9-antracenmetanola su α-metil-9-antrilmetanol, 9-fluoronmetanol, metakrilacid-9-antracenilmetil estar, 9-antracenkarbaldehid, 9->antracenil-karbonska kiselina, 9-(metilaminometil)-antracen. Pogodniji agens za alkilovanje jeizabran između maleimida, jodoacetamida i 9-antracenemetanola. Još poželjniji agens za alkilovanje je maleimid.
Kao takav, poboljšani metod ovog pronalaska obuhvata dobijanje kalibracione krive sa delimično redukovanim kalibracionim rastvorom biološkog molekula analita od interesa. U jednom izvođenju
<obezbeđena je metoda za određivanje molekulske težine sastojaka testnog uzorka koji sadrži biološki molekul korišćenjem kapilarne gel elektroforeze (CGE), metoda koja obuhvata korake: a.)>dobijanja kalibracione krive za molekul biološkog analita u CGE koji obuhvata korake delimične redukcije kalibracionog uzorka koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, dostavljanjedelimično redukovanog kalibracionog uzorka u CGE, određivanje vremena migracije komponenti delimično redukovanog biološkog molekula analita u delimično redukovani kalibracioni uzorak i<izračunavanja kalibracione krive za biološki molekul analita u CGE; b.) dostavljanje ispitnog uzorka koji sadrži biološki molekul analita u CGE; c.) određivanja vremena migracije sastojaka u uzorku za ispitivanje; i d.) identifikovanje molekulske težine sastojaka u uzorku za ispitivanje upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom dobijenom u koraku a). Takav metod je posebno koristan u analizi uzoraka koji sadrže složene biološke molekule kao što su antitela ili fuzioni>proteini.
Kalibraciona kriva se može dobiti u skladu sa metodom kao što je gore opisano za dobijanje kalibracione krive kroz delimičnu redukciju poznatog uzorka biološkog molekula analita. Shodno tome, metod ovog pronalaska za određivanje molekulske težine sastojaka uzorka za testiranje obuhvata: a.) dobijanje kalibracione krive za biološki molekul analita u CGE koji obuhvata korake
<delimičnog smanjenja kalibracionog uzorka koji sadrži poznata količina biološkog molekula, dostavljanje delimično redukovanog kalibracionog uzorka u CGE, određivanje vremena migracije podjedinica/vrsta delimično redukovanog biološkog molekula analita u delimično redukovanom>kalibracionom uzorku i izračunavanje kalibracione krive za biološki molekul analita CGE. Delimična redukcija kalibracionog uzorka koja obuhvata korake dodavanja redukcionog agensa puferovanom rastvoru koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula i inkubiranje kalibracionog uzorka uodređenom vremenskom periodu tako da se biološki molekul ne redukuje u potpunosti. Takva<delimična redukcija može dalje uključivati naknadno dodavanje agensa za alkilovanje delimično redukovanom kalibracionom uzorku i inkubiranje delimično redukovanog kalibracionog uzorka na temperaturi od oko 0°C do oko 75°C u periodu do 15 minuta. U sledećem koraku metode (korak b.) dostavljanje testnog uzorka koji sadrži molekul biološkog analita u CGE i u koraku c.) određivanje vremena migracije sastojaka u test uzorku i u koraku d.) identifikaciju molekulske težine sastojaka u uzorku za ispitivanje upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom dobijenom u>koraku a).
Ovaj pronalazak dalje uključuje metodu određivanja ili potvrđivanja identiteta biološkog molekula analita u uzorku za ispitivanje. Na primer, takva metoda obuhvata dobijanje kalibracione krive sa poznatim biološkim molekulom analita kao što je gore opisano korišćenjem delimične redukcije biološkog molekula analita kao uzorka za kalibraciju. Nakon toga, koristi se delimična redukcija test uzorka i CGE metode prema ovom pronalasku da se odredi ili potvrdi identitet biološkog molekula<u uzorku za ispitivanje. Takav metod zato može da sadrži korake: a) dobijanja kalibracione krive za biološki molekul u CGE koji obuhvata korake delimičnog smanjenja kalibracionog uzorka koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, dostavljanja delimično redukovanog kalibracionog uzorka u CGE, određivanje vremena migracije podjedinica/vrsta delimično redukovanog biološkog molekula u delimično redukovanom kalibracionom uzorku, i izračunavanje kalibracione krive za biološki>molekul u CGE; b) dostavljanje testnog uzorka koji sadrži biološki molekul u CGE; c) određivanjevremena migracije sastojaka u uzorku za ispitivanje; i d) identifikaciju molekulske težine sastojaka u uzorku za ispitivanje upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom dobijenom u koraku a) i određivanje ili potvrđivanje identiteta biološkog molekula analita u uzorku za ispitivanje na osnovu identičnosti podjedinica/vrsta molekulske težine biološkog molekula analita u uzorku za ispitivanje i poznatog biološkog molekula u uzorku za kalibraciju.
<Slično, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za identifikaciju sastava uzorka koji sadrži biološki molekul od interesa koji se sastoji od određivanja molekulske težine vrste (sastojaka ili podjedinica) uzorka kao bilo kojim od gore opisanih koraka metoda, identifikujući vrste (sastojke ili podjedinice) na osnovu njihove molekularne težine i određuje relativne količine svake vrste>(sastojke ili podjedinice) dobijene Kapilarnom Gel Elektroforezom (CGE). Takav metod ovogpronalaska se dalje može primeniti za određivanje čistoće uzorka koji sadrži biološki molekul analita od interesa za određivanje relativne količine svake vrste (sastojaka ili podjedinica) da bi se odredila relativna količina celokupnog biološkog molekula analita od interesa u poređenju sa drugim molekulima u uzorku za ispitivanje koji imaju različite molekulske mase.
Primeri
Sledeći primeri su dati u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni ograničavanju obima pronalaska.
Različita vremena migracije za molekularne podjedinice/vrste dva delimično redukovana antitela u<poređenju sa migracijom vrsta standardne komercijalne veličine prikazana su na Slici 5. Znatne diskrepancije, u rasponu od 40 do 80 kDa razlike pronađene u poređenju račvastih krivih, napominju i demonstriraju potrebe za novom vrstom standardne kalibracione krive, koja je upravo>u vezi sa protokolom koji je ovde predstavljen.
Svi primeri 1-6 molekula sa njihovim molekularnim karakteristikama koji su dostavljeni ProtokoluDelimične Redukcije pokazali su pozitivan odgovor Protokola u smislu eksperimentalnih rezultata.U svim narednim primerima, Protokol Delimične Redukcije za biološke molekule sastojao se od<sledećih koraka. Biološki molekul u puferu za uzorke je sadržao 20 μl uzorka, 75 μl pufera za uzorke (50 mM Acetat pH 5.5 2 % SDS) tako da uzorak sadrži približno 5 mg/ml biološkog molekula od interesa. Ovom uzorku biološkog molekula od interesa u puferu za uzorke je dodato 5 µl od 250 mM TCEP na sobnoj temperaturi. Ova smeša je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi nakon čega je dodato 5 µl 250 mM Maleimida. Ova kombinovana smeša je zatim inkubirana 10 minuta na 70°C. Tako pripremljen delimično redukovani uzorak je zatim dostavljen u CGE pod standardnim uslovima (Sistem: PA 800 Plus Capillary Electrophoresis System (Beckman Coulter); Detektor: UV>(DAD) na 220 nm; Kapilarno: osnovni fuzirani kapilar silicijum dioksida (Beckman Coulter) 50 µm i.d. 30.2 cm, 20.2 cm efektivne dužine od ulaznog otvora za uzorak i prozora detektora, 200 µm aperturnog spoja u kertridžu; Temperatura kertridža: 25°C; Temperatura držača uzoraka: 15°C; Voltaža i tajming 15 kV (reverzni polaritet) tokom 35-45 minuta u zavisnosti od analita; Koraci pre ubrizgavanja: NaOH 0.1N za čišćenje kapilara (20 psi, 10 min), HCl 0.1 N za neutralizaciju kapilarne površine (20 psi, 5 min), Voda za uklanjanje kiselog rastvora (20 psi, 2 min), SDS Gel za punjenje kapilara (70 psi, 10 min), MilliQ voda po injekciji (injektiranje-pritisak 7 psi, 10 sec); Materijali i<potrošni materijal: KIT za analizu čistoće/heterogenosti IgG, SCIEX, kod A10663, SDS-MW Gel Pufer,>SCIEX, kod A30341, Osnovni Fuzirani-Silika Kapilar - 50 µm ID, 375 µm OD, 67 cm, SCIEX, kod33845).
<Primer 1>
<Humano IgG2 Ne-Glikozilovano antitelo (anti-TM3) je podvrgnuto delimičnoj redukciji kao što je gore opisano. Dobijeni delimično redukovani kalibracioni uzorak je podvrgnut kapilarnoj gel>elektroforezi (CGE) pod standardnim uslovima (kao što je gore opisano). Kao što je prikazano na Slici 6, humano IgG2 Ne-Glikozilovano antitelo (anti-TM3) koje je podvrgnuto Protokolu Delimične Redukcije proizvelo je sve očekivane podjedinice/vrste molekularnog antitela i rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na različitim vremenima migracije. Uočeno je potpuno podudaranjeizmeđu eksperimentalnog i teorijskog relativnog molarnog odnosa za LC i HC takvih vrsta.
<Primer 2>
<Glikozilovano antitelo IgG1 je podvrgnuto Protokolu Delimične Redukcije kao što je gore opisano i dobijeni delimično redukovani uzorak je dostavljen CGE (kao što je gore opisano). Kao što je>prikazano na Slici 7, Glikozilovano antitelo IgG1 proizvelo je sve očekivane podjedinice/vrste molekularnih antitela i rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na prilagođavanju različitih vremena migracije. Zapaženo je puno podudaranje.
<Primer 3>
<IgG1 sa glikozilovanim antitelom kappa lakog lanca je podvrgnut Protokolu Delimične Redukcije>kao što je gore opisano i dobijeni delimično redukovani uzorak je dostavljen CGE (kao što je gore opisano). Kao što je prikazano na Slici 8, IgG1 sa kappa lakim lancem Glikozilovano antitelo je proizvelo sve očekivane molekularne podjedinice/vrste i rezultujuću kalibraciju zasnovanu naprilagođavanju različitih vremena migracije. Uočeno je potpuno podudaranje izmeđueksperimentalnog i teorijskog relativnog molarnog odnosa za LC i HC takvih vrsta.
<Primer 4>
IgG1 IgG1.4 deo konjugovan sa Dolafleksinom sa Cis linker Glikozilovanim antitelom na bazimaleimida je podvrgnuto protokolu delimične redukcije kako je gore opisano da bi se dobio<delimično redukovani uzorak koji je dostavljen CGE (kao što je gore opisano). Kao što je prikazano na Slici 9, IgG1.4 deo konjugovan sa Dolafleksinom sa Cis linker Glikozilovanim antitelom na bazi>maleimida je proizveo sve očekivane podjedinice/vrste molekularnih antitela i rezultujućukalibracionu krivu zasnovanu na različitim vremenima migracije. Uočeno je potpuno podudaranjeizmeđu eksperimentalnog i teorijskog relativnog molarnog odnosa za LC i HC takvih vrsta.
<Primer 5>
<Himerno mišje/humano IgG1 Ne-Glikozilovano antitelo je podvrgnuto protokolu delimične>redukcije kako je gore opisano da bi se dobio delimično redukovani uzorak koji je dostavljen CGE (kao što je gore opisano). Kao što je prikazano na Slici 10, Himerno mišje/humano IgG1 Ne-Glikozilovano antitelo proizvelo je sve očekivane podjedinice/vrste molekularnih antitela irezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na prilagođavanju različitih vremena migracije. Uočeno je potpuno podudaranje između eksperimentalnog i teorijskog relativnog molarnog odnosa za LC i HCtakvih vrsta.
<Primer 6>
Fuzioni IgG1 sa Sirp-α domenom povezanim sa LC Glikozilovanim antitelom je podvrgnut Protokolu<Delimične Redukcije kao što je gore opisano da bi se dobio delimično redukovani uzorak koji je dostavljen CGE (kao što je gore opisano). Kao što je prikazano na Slici 11, fuzioni IgG1 sa Sirp-α domenom povezanim sa LC Glikozilovanim antitelom proizveo je sve očekivane podjedinice/vrste>molekularnog antitela i rezultujuću kalibracionu krivu zasnovanu na prilagođavanju različitih vremena migracije. Uočeno je potpuno podudaranje između eksperimentalnog i teorijskog relativnog molarnog odnosa za LC i HC takvih vrsta.

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi
    <1. Postupak za određivanje molekulske težine sastojaka testnog uzorka koji sadrži biološki molekul korišćenjem kapilarne gel elektroforeze (CGE), metoda koja obuhvata sledeće korake:>
    <a) dobijanje kalibracione krive za biološki molekul u CGE;>
    b) dostavljanje testnog uzorka koji sadrži biološki molekul u CGE;
    c) određivanje vremena migracije sastojaka u testnom uzorku; i
    d) identifikaciju molekulske težine sastojaka u testnom uzorku upoređivanjem vremena migracije sa kalibracionom krivom dobijenom u koraku a),
    <naznačen time, što se kalibraciona kriva dobija delimičnom redukcijom kalibracionog uzorka koji sadrži poznatu količinu biološkog molekula, dostavljanjem delimično redukovanog>kalibracionog uzorka u CGE, određivanjem vremena migracije podjedinica/vrsta delimičnoredukovanog biološkog molekula u delimično redukovanom kalibracionom uzorku iizračunavanjem kalibracione krive za biološki molekul u CGE.
    <2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što korak delimične redukcije kalibracionog uzorka obuhvata:>
    <a) dodavanje redukcionog agensa puferovanom rastvoru koji sadrži poznatu količinu>biološkog molekula, i
    b) inkubaciju kalibracionog uzorka iz koraka a) na neki vremenski period, pri čemu je dužina vremenskog perioda takva da biološki molekul nije u potpunosti redukovan.
    <3. Postupak prema zahtevu 2, naznačen time, što korak delimične redukcije kalibracionog uzorka obuhvata:>
    <a) dodavanje redukcionog sredstva puferovanom rastvoru,>
    <b) inkubiranje kalibracionog uzorka na sobnoj temperaturi na period od 30 minuta ili>manje, i dalje obuhvata korake
    c) dodavanja agensa za alkilovanje delimično redukovanom kalibracionom uzorku iz koraka b, i
    d) inkubacije delimično redukovanog kalibracionog uzorka iz koraka c) na temperaturi od 0°C do 75°C, poželjno na 70°C, u trajanju do 15 minuta, poželjno 10 minuta.
    <4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što se redukciono sredstvo i agens za alkilovanje>dodaju u rastvor u odnosu koncentracija redukciono sredstvo:agens za alkilovanje od 0.15 do3.
    <5. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što se redukciono sredstvo i agens za alkilovanje>dodaju u rastvor u odnosu koncentracija redukciono sredstvo:agens za alkilovanje od 1:6.5 do3:1.
    <6. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 5, naznačen time, što se redukciono sredstvo i>agens za alkilovanje dodaju u rastvor u opsegu koncentracija redukciono sredstvo:agens zaalkilovanje od 1:1.
    <7. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 6, naznačen time, što se redukciono sredstvo>dodaje u koncentraciji od 15 do 500 mM, a agens za alkilovanje se dodaje u koncentraciji od 15do 500 mM.
    <8. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 7, naznačen time, što se redukciono sredstvo>dodaje u koncentraciji od 250 mM, a agens za alkilovanje se dodaje u koncentraciji od 250 mM.
    9. Postupak prema bilo kom od zahteva 2 do 8, naznačen time, što je redukcioni agens Tris(2-karboksetil)fofin (TCEP).
    10. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 9, naznačen time, što je agens za alkilovanjemaleimid ili njegov analog.
    11. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 10, naznačen time, što se kalibracioni uzorakinkubira na sobnoj temperaturi sa redukcionim sredstvom u periodu do 20 minuta.
    12. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što je period oko 20 minuta.
    13. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je biološki molekulsloženi molekul koji sadrži dve ili više podjedinica/vrsta.
    14. Postupak prema zahtevu 13, naznačen time, što je biološki molekul izabran izmeđurekombinantnog proteina, antitela i fuzionog proteina.
    <15. Postupak za identifikaciju kompozicije uzorka koji sadrži biološki molekul naznačen time, što obuhvata:>
    <a) određivanje molekulske težine sastojaka uzorka u skladu sa metodom prema bilo kom od zahteva 1-14,>
    b) identifikaciju sastojaka uzorka na osnovu njihove molekularne težine,
    c) i određivanje relativnih količina svakog od sastojaka na osnovu CGE izvedene u koraku a.
    <16. Postupak za određivanje čistoće uzorka koji sadrži biološki molekul naznačen time, što sadrži:>
    a) identifikaciju kompozicije uzorka u skladu sa metodom prema zahtevu 15, ib) određivanje relativne količine svake podjedinice ili fragmenta biološkog molekula prisutnog u uzorku.
RS20240666A 2020-04-07 2021-04-01 Kapilarna gel elektroforeza i njena upotreba sa složenim biološkim molekulima RS65622B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20168561.7A EP3892989A1 (en) 2020-04-07 2020-04-07 Capillary gel electrophoresis and its use with complex biological molecules
EP21716415.1A EP4133263B1 (en) 2020-04-07 2021-04-01 Capillary gel electrophoresis and its use with complex biological molecules
PCT/EP2021/058775 WO2021204714A1 (en) 2020-04-07 2021-04-01 Capillary gel electrophoresis and its use with complex biological molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65622B1 true RS65622B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=70227903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240666A RS65622B1 (sr) 2020-04-07 2021-04-01 Kapilarna gel elektroforeza i njena upotreba sa složenim biološkim molekulima

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20230152275A1 (sr)
EP (2) EP3892989A1 (sr)
JP (1) JP7771078B2 (sr)
CN (1) CN115398219B (sr)
AU (1) AU2021253516A1 (sr)
CA (1) CA3171254A1 (sr)
DK (1) DK4133263T3 (sr)
ES (1) ES2983329T3 (sr)
FI (1) FI4133263T3 (sr)
HR (1) HRP20240744T1 (sr)
HU (1) HUE068054T2 (sr)
IL (1) IL296936A (sr)
LT (1) LT4133263T (sr)
PL (1) PL4133263T3 (sr)
PT (1) PT4133263T (sr)
RS (1) RS65622B1 (sr)
SI (1) SI4133263T1 (sr)
WO (1) WO2021204714A1 (sr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025209502A1 (zh) * 2024-04-02 2025-10-09 南京蓬勃生物科技有限公司 一种评估生物分子还原风险的方法及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ215967A (en) * 1985-05-01 1988-05-30 Commw Serum Lab Commission Composition of peptides of known weight for determining weight of unknown peptide
EP1311858B1 (en) * 2000-05-05 2006-11-02 Purdue Research Foundation Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification
ITMI20012564A1 (it) * 2001-12-05 2003-06-05 Pier Giorgio Righetti Procedimento per l'alchilazione selettiva di gruppi-sh in proteine e peptidi nello studio di miscele proteiche complesse
US20040259269A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Groton Biosystems Method for detection of molecular species in a crude sample using capillary electrophoresis
WO2007035864A2 (en) * 2005-09-20 2007-03-29 Cell Biosciences, Inc. Electrophoresis standards, methods and kits
EP2069386A4 (en) * 2006-07-21 2009-10-28 Life Technologies Corp PROTEIN MOLECULAR WEIGHT STANDARDS WITH HIGH DISINFECTION
EP2105736A1 (en) * 2008-03-28 2009-09-30 Novartis Ag Analysis of DNA by means of cappillary electrophoresis
CN101315384A (zh) * 2008-05-20 2008-12-03 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法
US8449880B2 (en) * 2010-11-22 2013-05-28 Vladislav Dolnik Chemical modification of proteins for their more accurate molecular-weight determination by electrophoresis
US9159537B2 (en) * 2012-05-03 2015-10-13 University Of Notre Dame Du Lac Method for analyzing sample components
BR112014029679A2 (pt) * 2012-05-29 2017-06-27 Health Diagnostic Laboratory Inc método para realizar a eletroforese com calibração in situ
EP2867672B1 (en) * 2012-06-28 2019-01-09 Bio-rad Laboratories, Inc. Multi-protein quantitation standard
MX368259B (es) * 2013-04-16 2019-09-25 Genentech Inc Variantes de pertuzumab y su evaluacion.
US10761054B2 (en) * 2016-05-13 2020-09-01 Agilent Technologies, Inc. Systems and methods for automated alignment, calibration and standardization of electrophoresis data

Also Published As

Publication number Publication date
CN115398219A (zh) 2022-11-25
FI4133263T3 (fi) 2024-06-05
HRP20240744T1 (hr) 2024-08-30
EP4133263A1 (en) 2023-02-15
CN115398219B (zh) 2025-04-01
WO2021204714A1 (en) 2021-10-14
EP3892989A1 (en) 2021-10-13
JP2023522589A (ja) 2023-05-31
CA3171254A1 (en) 2021-10-14
ES2983329T3 (es) 2024-10-22
JP7771078B2 (ja) 2025-11-17
EP4133263B1 (en) 2024-05-22
PL4133263T3 (pl) 2024-10-14
HUE068054T2 (hu) 2024-12-28
LT4133263T (lt) 2024-06-25
IL296936A (en) 2022-12-01
AU2021253516A1 (en) 2022-10-06
PT4133263T (pt) 2024-06-20
US20230152275A1 (en) 2023-05-18
SI4133263T1 (sl) 2024-07-31
DK4133263T3 (da) 2024-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Structural intermediates trapped during the folding of ribonuclease A by amide proton exchange
US10281473B2 (en) Compositions and methods for analysis of protein sequences and post-translational modifications
ES2981461T3 (es) Detección y cuantificación de péptidos glicosilados
Truffot et al. Simultaneous quantification of rituximab and eculizumab in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and comparison with rituximab ELISA kits
Walpurgis et al. Detection of the myostatin‐neutralizing antibody Domagrozumab in serum by means of Western blotting and LC‐HRMS
RS65622B1 (sr) Kapilarna gel elektroforeza i njena upotreba sa složenim biološkim molekulima
JP2022509200A (ja) 反応性ペプチド標識付け
US11193947B2 (en) B-type natriuretic peptide proteolytic assay for cardiovascular disease risk assessment
JP7668391B2 (ja) タンパク質バイオマーカーを定量するためのｌｃ－ｍｓ／ｍｓの使用
US20250059230A1 (en) An improved method for separation of low molecular weight proteins
CN108884030B (zh) 使用双吡啶改善亲核物质的标记
Dyck et al. Comparison of middle-and bottom-up mass spectrometry in forced degradation studies of bevacizumab and infliximab
KR20240067251A (ko) 약물 및 표적 농도의 정량화 검정
Gahoual et al. Biopharmaceutical applications of capillary electromigration methods
US20250123240A1 (en) Compositions and methods for protein electrophoresis
Yuan et al. Digestion-Free Middle-down Mass Spectrometry Method for Absolute Quantification of Conjugated Payload from ADCs
Chaibva et al. Analytical methods for the quantitative determination of oxytocin
CN1255681C (zh) 磺基异硫氢酸苯酯作化学修饰剂在多肽序列测定中的应用
EP3371592B1 (en) A method for quantifying therapeutic antibodies
WO2015086973A1 (fr) Stabilisation de la glutamate déshydrogénase en solution aqueuse
Yuan et al. Sample Preparation Strategies for LC–MS Bioanalysis of Proteins
EA047857B1 (ru) Применение жх-мс/мс для количественного определения белковых биомаркеров
WO2025207846A1 (en) Methods for characterizing proteins in serum samples
TWI402503B (zh) A method for quantitative analysis of collagen by capillary electrophoresis and kit reagents
CN101089608A (zh) 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度的测定方法