CN108884030B - 使用双吡啶改善亲核物质的标记 - Google Patents

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Abstract

双吡啶改善亲核物质的标记，包括胺和硫醇，并且对改善酸性和碱性标签的标记特别有用。与使用双吡啶的方案相比，双吡啶与此类标签一起使用显着增加了标记。然后能对经标记的亲核物质采用标准分析方法。

Description

使用双吡啶改善亲核物质的标记
相关文献的交叉引用
本申请要求2016年2月26日提交的美国临时专利申请No.62/300,609的权益，以上内容通过引用并入本文并用于所有目的。
联邦资金的声明
不适用。
技术领域
本发明涉及通过亲电子标签改善亲核生物分子的标记的领域，尤其涉及标记糖胺(glycosylamines)。
背景技术
由真核细胞产生的许多蛋白质在翻译后通过添加共价连接、直链或支链的碳水化合物链进行修饰。这些蛋白质-碳水化合物偶联物被称为糖蛋白；连着碳水化合物的点称为糖基化位点。连着的多糖或寡糖称为聚糖。在特定糖蛋白的不同糖基化位点上发现了多种聚糖。特定糖蛋白上的聚糖的特定模式决定于产生该蛋白质的特定细胞系和该细胞生长的条件。
由于与蛋白质偶联的聚糖能影响对其功能至关重要的特征，包括药代动力学、稳定性、生物活性或免疫原性，在许多应用中确定存在哪些聚糖是重要的。因此，从蛋白质中除去一些或所有聚糖并分析聚糖以确定其组成的能力对确定糖蛋白是否具有其预期效果是有用的。例如，美国食品和药物管理局(“FDA”)要求对连接于生物制剂(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的碳水化合物进行表征以显示物质组成和制造的一致性，引起了广泛地对产品表征的需求。分析释放的碳水化合物谱对于重组蛋白质生产中的质量控制也是重要的，其中碳水化合物谱的变化可以指示系统中的压力、可能需要丢弃昂贵蛋白质的商业规模发酵罐的信号条件。因此，生物化学家、临床化学家和药物制造商对确定生物样品中，诸如治疗性糖蛋白，聚糖的分布特征具有相当大的兴趣。
聚糖通常以两种方式中的一种与糖蛋白连接。第一种方式中，称为N-聚糖，聚糖通过天冬酰胺残基上的N-糖苷键连接。第二种方式中，称为O-聚糖，聚糖与氨基酸残基上的氧原子连接。例如，N-乙酰基-半乳糖胺可以酶促连接到丝氨酸或苏氨酸残基的氧上。
N-聚糖可以通过各种酶，诸如PNGase F(肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶，EC 3.5.1.52.)的酶促切割从糖蛋白中酶促释放。在本领域中，通过酶从诸如糖蛋白的糖结合物释放聚糖有时称为“酶促消化”。N-聚糖的酶促消化(诸如通过PNGase F)通常在水溶液中发生，并且引起作为β-糖胺的N-聚糖的最初释放，其中释放的聚糖的游离还原端与氨偶联(参见，例如，Tarentino,et al.TIGG 1993,23:163-170；RasmussenJ.R.J.Am.Chem.Soc.1992,114:1124-1126；Risley,et al.J.Biol.Chem.1985,260:15488-15494,1985)。PNGase F-释放的N-聚糖最常通过还原胺化标记，其中聚糖的游离还原端与标签的游离氨基偶联，诸如荧光染料或电荷。根据所使用的标签，可以通过各种分析方法，诸如高效液相色谱(“HPLC”)、毛细管电泳(“CE”)、碳水化合物凝胶电泳或微流体分离来分析标记的聚糖。例如，在共同拥有的美国专利Nos.8,124,792和8,445,292中教导了N-聚糖的标记。
糖胺的稳定性取决于pH：较低的pH有利于糖胺快速水解成具有游离还原端的聚糖和铵(ammonium)，而更高的pH减缓糖胺的水解，这使得作为糖胺释放的聚糖被对氨基反应而不是游离还原端的试剂标记。因此，释放的糖胺在约pH 7.5至约pH 9的pH范围内更稳定且与标记性试剂更具反应性。不幸的是，许多与不同分析技术相容的胺反应性染料是酸性或碱性的，并且在低于6的pH的条件下更加稳定。在最有利于糖胺稳定性的条件与最有利于碱性或酸性染料稳定性的条件之间的存在分歧，这种分歧会导致通过酶促消化从糖蛋白释放的聚糖的不完全标记。
本领域仍然需要改善糖胺和其他亲核物质标记的组合物和方法。令人惊讶的是，本发明满足了这些需求和其他需求。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了体外标记感兴趣的亲核物质的方法。该方法包括将亲核物质与溶液一起孵育的步骤，所述溶液包含(a)溶剂、(b)与所述亲核物质反应的亲电子标签和(c)可溶于所述溶剂的双吡啶，从而标记亲核物质。在一些实施方案中，亲核物质是胺。在一些实施方案中，胺是糖胺。在一些实施方案中，在孵育步骤之前从糖蛋白释放糖胺。在一些实施方案中，通过酶促消化从糖蛋白释放糖胺。在一些实施方案中，所述糖蛋白的酶促消化包括酶PNGase F的消化。在一些实施方案中，亲核物质是硫醇。在一些实施方案中，亲核物质是蛋白质或肽上的胍或咪唑基团。在一些实施方案中，亲核物质是核酸上的环外胺。在一些实施方案中，双吡啶是4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶。在一些实施方案中，溶剂是二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。在一些实施方案中，亲电子标签在水溶液中是酸性的。在一些实施方案中，亲电子标签在水溶液中是碱性的。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于标记从感兴趣的糖蛋白释放的N-聚糖的方法。该方法包括(a)将糖蛋白与酶一起孵育，所述酶从糖蛋白释放作为糖胺的N-聚糖，和(b)在允许通过胺反应性标签来标记糖胺的条件下，将糖胺与包含溶剂、胺反应性标签和双吡啶的溶液接触，从而标记从糖蛋白释放的N-聚糖。在一些实施方案中，糖蛋白是抗体。在一些实施方案中，在步骤(b)之前将糖蛋白固定在固体支持物上。在一些实施方案中，去糖基化酶是内切糖苷酶。在一些实施方案中，去糖基化酶是酰胺酶。在一些实施方案中，酰胺酶是PNG F。在一些实施方案中，溶剂是二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。在一些实施方案中，双吡啶是4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶。在一些实施方案中，通过分析方法分析标记的糖胺。在一些实施方案中，分析方法选自由高压液相色谱、毛细管电泳、微流体分离和质谱分析组成的组。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于标记目标亲核物质的试剂盒。试剂盒包含(a)双吡啶、(b)与感兴趣的亲核物质反应的标签，和(c)标记亲核物质的说明书。在一些实施方案中，亲核物质是糖胺。在一些实施方案中，标签是胺反应性染料。在一些实施方案中，双吡啶是4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶。在一些实施方案中，标签是干燥的4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯，并且所述双吡啶是4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶。在一些实施方案中，双吡啶在溶剂中。在一些实施方案中，溶剂是二甲基甲酰胺。
附图说明
图1、图1是显示在1M吡啶(“PYR”，由方块表示)，1M 4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶(“BPE”，由菱形表示)，或1M 4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶(“TMD”，由三角形表示)的存在下，用酸性染料8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸标记通过PNGase F从示例性糖蛋白，猪丙种球蛋白释放的糖胺的总聚糖信号的图。将这些化学品中的每一种溶解在作为溶剂的无水二甲基亚砜(“DMSO”)中。对照(由圆圈表示)是不含吡啶或双吡啶的DMSO溶剂。纵轴：430nm处测量的相对荧光单位(“RFU”)的总聚糖信号。横轴：实验中存在的染料(“ANTS”)的微升数。使用的染料量为：0.1μl、1μl、2.5μl和5μl。
图2、图2是显示在溶解于无水二甲基甲酰胺(“DMF”)中的1M 4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶(“TMD”)、溶解于DMF中4M TMD，或者不含TMD的DMF(“对照”)的存在下，用不同的酸性染料4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸标记通过PNGase F从示例性糖蛋白，猪丙种球蛋白释放的糖胺的总聚糖信号的图。纵轴：430nm处测量的以RFU表示的总聚糖信号。横轴：柱表示对照或所述TMD浓度存在时RFU的平均值，为方便比较在柱上方示出了所述的平均值的数值。误差线表示一个标准偏差。
图3、图3是显示TMD浓度对总聚糖信号的效果的范围研究的图。通过PNGase F从猪丙种球蛋白释放的糖胺用溶解在无水DMSO中的碱性染料InstantPC,TM标记，并通过HPLC分析，在345nm处测量总荧光信号。纵轴：圆圈显示在所测试的每个TMD浓度下以RFU表示的聚糖信号。横轴：测试的TMD的摩尔浓度。
具体实施方式
如背景技术中所述，连接于糖蛋白的聚糖的分析对于满足各种规章要求变得重要，这些需求包括表示治疗性糖蛋白的物质组成和制造的一致性以及用于在重组糖蛋白的生产过程中提供质量控制。如背景技术中进一步所描述的，通常用以下方式分析N-聚糖：通过酶促消化释放N-聚糖，然后用胺反应性染料标记所得的糖胺。不幸的是，虽然从糖蛋白释放的糖胺在约pH 7.5至约pH 9的pH范围内更稳定并且与标记试剂更具反应性，但许多用于标记糖胺的胺反应性染料是酸性或碱性的，并且在pH低于6时更稳定。在较高的pH下(诸如高于pH)，虽然糖胺是稳定的，但亲核物质反应性标签快速地水解，尤其是如果水是主要溶剂时。因此，在加入到糖胺之前中和胺反应性染料是有利的。在最有利于糖胺稳定性的条件和最有利于碱性或酸性染料稳定性的条件之间的存在分歧，这种分歧降低了对通过酶促消化从糖蛋白释放的聚糖进行完全标记的能力。
尽管存在这种分歧，但目前在标记方案中通常不将缓冲剂添加到有机溶剂部分中。典型的方案推荐仅用水性溶液缓冲，即用诸如pH 7-9的碳酸钠缓冲液。这些方案通常应用于稳定的亲核物质，诸如伯胺并且不考虑的糖胺的瞬时性质(即在低pH下快速水解)。这可能是因为常见的实验室缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水)是自身水解胺反应性染料和其他标签水性溶液。因此，如果要使用水性溶液缓冲液，则必须在将标签或染料加入含有聚糖的溶液之前或之后立即将其加入到胺反应性标签或染料中。这是因为缓冲中的任何延迟都可能导致一些糖胺在被标记前水解，在对存在于溶液中聚糖进行测量中，添加这种缓冲液本身的时机可能会引入不希望的变化。优选在标记含水亲核物质之前缓冲亲电子标签。此外，许多胺反应性染料或其它标签以粉末形式出售，由使用者重新溶解然后储存直至使用，或者在需要额外的储存寿命时，在冰箱中储存。因此，如果可以在染料首次重新溶解时添加缓冲液，从而在标记方案期间避免额外的时机关键步骤，对于使用者来说是更方便的。出于上述原因，对于加入到使用前的重新溶解的胺反应性染料来说，水性溶液缓冲液是不相容的。
令人惊讶的是，现已发现，与目前的标记方案相比，通常用于聚合物化学中的双吡啶显着改善了使用酸性或碱性染料对糖胺的标记。如以下内容及实施例中所示，使用两种不同的双吡啶、两种不同的酸性胺反应性染料和一种碱性胺反应性染料以及两种不同溶剂的研究表明，与不存在双吡啶的标准标记程序相比，标记过程中双吡啶的存在引起令人惊讶的对糖胺的更完全的标记。
图1显示了在(a)在无水DMSO中制备的双吡啶4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶(“BPE”，下面的双吡啶列表中的化合物1)，(b)在无水DMSO中制备的双吡啶4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶(“TMD”，在下面的双吡啶部分的结构列表中的化合物2)，(c)在DMSO中的吡啶(“PYR”)或(d)不含吡啶或双吡啶的DMSO(“对照”)的存在下，使用酸性胺反应性染料标记从示例性糖蛋白释放的糖胺进行研究的结果。如图1所示，使用DMSO中吡啶所引起聚糖标记与仅DMSO对照的聚糖标记大致相同。相反，一旦存在足够的标签(2.5μl)以提供相对足够的标记，与对照和吡啶溶液相比，TMD的存在引起所标记的糖胺的量几乎加倍，而当使用5μl染料时，与含有吡啶或DMSO对照的混合物相比，TMD或BPE的存在引起标记超过两倍的聚糖。
不希望受理论束缚，据信双吡啶的存在缓冲了溶液并稳定了糖胺、胺反应性染料或它们两者，使得更大量的糖胺在其或者染料被水解之前被标记。然而，结果可能不能通过单独的缓冲作用来解释，因为在pH 8的含有缓冲液HEPES的溶液中通过用酶PNGase F酶促消化从糖蛋白释放糖胺，并且该缓冲液已经存在于每个稍后经过染料标记的样品中。
基于本发明实施方案下的研究，据信双吡啶可由改善亲核物质的亲电子标签的标记，该亲核物质包括胺和硫醇，以及蛋白质和肽上的胍和咪唑基团和核酸上的环外胺。在一些实施方案中，标记是用胺反应性染料的胺标记。在一些实施方案中，标记是用硫醇活性染料的硫醇标记。在一些实施方案中，亲核物质是胺。在一些实施方案中，亲核物质是硫醇。标签可以是能光学检测的标签，诸如荧光染料，或者能添加可由MS检测的固定电荷的标签，或者可以通过电动分离技术诸如毛细管电泳来促进标记的部分的分离和检测的标签。
本发明实施方案下的进一步研究揭示了在不同溶剂中不同双吡啶之间的能力或在溶剂中经历冷冻存在的一些差异。在优选的实施方案中，所选的双吡啶在室温下的溶剂中是可溶，该溶剂中染料是可溶的。如上所述，由于水水解胺反应性染料，对于期望储存染料-双吡啶混合物的用途，溶剂优选不是水。
例如，研究发现，上面讨论的示例性双吡啶TMD和BPE都可溶于DMSO，并且TMD也可溶于溶剂二甲基甲酰胺(“DMF”)。所研究的另一种双吡啶，4,4'-亚甲基双吡啶(下列列表中的化合物21)不溶于DMF，但预计可溶于可用于某些标记步骤的其它有机溶剂，诸如二甲基亚砜。双吡啶BPE(如上所讨论的，其相比于不含双吡啶的相似混合物显着增加了聚糖的标记)可溶于水溶液。然而，这种双吡啶在冷冻时从溶液中析出，并且当染料-双吡啶混合物解冻时不会返回到溶液中。因此，对于从业者不需要通过冷冻来储存混合物的实施方案来说，这种双吡啶非常有用；但对于使用者希望通过冷冻混合物来延长储存寿命的实施方案而言，不太优选这种双吡啶。
双吡啶还可用于标记通过例如β-消除(β-elimination)从O-聚糖释放的糖胺。进一步地，双吡啶可用于标记硫醇的方案中，诸如蛋白质或肽中存在的半胱氨酸。其还可用于改善蛋白质上亲核基团的标记，诸如N-末端(其能具有可用于标记的伯胺)，或赖氨酸、精氨酸或组氨酸，其每个亲核基团可用于标记。类似地，其也可用于改善核酸碱基上的亲核基团的标记，诸如腺嘌呤和鸟嘌呤的环外胺。最后，其还可用于在溶液中储存期间改善亲电子标签的稳定性。本领域技术人员将理解，可以使用糖胺作为待标记的示例性亲核物质，用与实施例中讨论的相同的方案来标记亲核物质(例如蛋白质、肽或核酸上的胺和硫醇)。
通过简单地将任何特定的双吡啶与所选溶剂在试管中混合并观察其是否溶入溶液，可以容易地测试该双吡啶以确定其在室温下是否可溶于选定的溶剂中。类似地，通过将任何特定的双吡啶置于选定的溶剂中，冷冻产生的混合物、解冻，并观察双吡啶在冷冻后是否保持在溶液中，或者如果其沉淀，观察其是否在解冻时在混合物中重新溶解，可以容易地测试该双吡啶以确定其是否适合用于这样的用途中：使用者会冷冻含有所选溶剂中的所选染料的溶液以便随后使用。进一步地，通过(a)在有和没有双吡啶的情况下储存标签的平行等分试样(b)然后通过添加过量的任何一种上述提到的亲核物质至每个等分试样中，然后对其测试，(c)测量标记的亲核物质的量，和(d)相比不含双吡啶的等分试样，确定含双吡啶的等分试样中所得标记亲核物质的量是否更大或更小，可以容易地测试任何特定的双吡啶，以观察其是否改善溶液中任何特定亲电子标签的储存。
本文报道的研究表明，当使用在水性溶液中呈酸性或碱性的标签时，双吡啶是特别有用的。当溶解于仅可能存在微量水的有机溶剂中时，在水性溶液中呈中性的标签可能以未完全表征的方式起作用。如上一段所述，通过测试具有和不具有双吡啶的中性标签的平行等分试样，可以容易地测试任何特定的中性标签以确定如果存在特定的双吡啶，是否将更好地标记感兴趣的亲核物质。
双吡啶
如名称所示，双吡啶是一类包含两个吡啶环的化合物。如维基百科所表征的，吡啶环是类似于苯的杂环，但是一个甲烷基团被氮取代。化合物吡啶具有令人不快的似鱼气味并且是危险的。相比之下，双吡啶不具有令人不愉快的气味并且不易燃，这使得其比吡啶更安全且更乐于被使用。如图1所示，双吡啶在用于标记糖胺(以及通过扩展，其他胺和亲核物质)的方案中令人惊讶的是比吡啶更好的试剂，一旦有足够量的标签存在时，用该研究中使用的胺反应性染料的糖胺标记，具有实质性的改善。
双吡啶通常用于聚合物化学中。搜索由Chemical Abstract Services(“CAS”)维护的
Figure GDA0003364679940000081
数据库，得到了来自3个或更多供应商的100多种市售双吡啶。以下21种双吡啶是列出的可从最多数量的供应商购买的。每个都由其CAS登记号、其结构、其化学成分和其科学名称确定。应理解，下面的列表仅旨在作为可用于本发明方法的双吡啶的示例，而并不打算作为限定。
1.
4916-57-8
Figure GDA0003364679940000091
C12H12N2
4，4′-(1，2-乙二基)双吡啶
2.
17252-51.6
Figure GDA0003364679940000092
C13H14N2
4，4′-(1，3-丙二基)双吡啶
3.
64048-12-0
Figure GDA0003364679940000093
C24H16N4S
4，4′，4″，4″′-(2，3，4，5-噻吩四基)四吡啶
4.
6950-04-5
Figure GDA0003364679940000101
C12H12N2O2
1，2-二-4-吡啶基-1，2-乙二醇
5.
6918-15-6
Figure GDA0003364679940000102
C11H8N2O
二-4-吡啶-甲酮
6.
871361-88-5
Figure GDA0003364679940000103
双键几何结构如图所示。
C18H16N2O
2，6-双(4-吡啶基亚甲基)-，(2E，6E)-环己酮
7.
105431-72-9
Figure GDA0003364679940000111
C26H21N3O
1，3-二氢-1-苯基-3，3-双(4-吡啶基甲基)-2H-吲哚-2-酮
8.
69267-29-4
Figure GDA0003364679940000112
C14H16N202
2，3-二-吡啶基-2，3-丁二醇
9.
4972-49-0
Figure GDA0003364679940000113
相对立体化学
C12H12N2O2
1，2-二-4-吡啶基，(1R，2S)-rel-1，2-乙二醇
10.
122955-42-4
Figure GDA0003364679940000121
C26H20N2O
10，10-双(4-吡啶基甲基)-9(10H)-蒽酮
11.
298685-12-8
Figure GDA0003364679940000122
C25H24N4O4
1-(3-甲氧基苯基)-5，5-双[2-(4-吡啶基)乙基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮
12.
300589-57-5
Figure GDA0003364679940000131
C20H22N4O3
1，3-二甲基-5，5-双[2-(4-吡啶基)乙基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮
13.
42899-65-0
Figure GDA0003364679940000132
C12H10N2O
1，2-二-4-吡啶基-乙酮
14.
2029-58-5
Figure GDA0003364679940000141
C14H16N2
4，4′-(1，4-丁二基)双吡啶
15.
346449-67-0
Figure GDA0003364679940000142
C25H24N4O3
1-(苯甲基)-5，5-双[2-(4-吡啶基)乙基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮
16.
346449-73-8
Figure GDA0003364679940000143
C26H26N4O4
1-(4-乙氧苯基)-5，5-双[2-(4-吡啶基)乙基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮
17.
1311317-18-6
Figure GDA0003364679940000151
C13H11N3
α-4-吡啶基-4-吡啶丙腈
18.
6630-22-4
Figure GDA0003364679940000152
C14H18N4
N，N-二甲基-1，2-二-4-吡啶基-1，2-乙二胺(9Cl)
19.
23974-93-8
Figure GDA0003364679940000161
C18H13N5
4，4′，4″-(1H-咪唑-2，4，5-三基)三吡啶
20.
672339-36-5
Figure GDA0003364679940000162
C18H18N4O2S
二氢-5，5-双[2-(4-吡啶基)乙基]-2-硫基-4，6(1H，5H)-嘧啶二酮
21.
60776-05-8
Figure GDA0003364679940000163
C11H10N2
4，4′-亚甲基双吡啶
亲核物质反应性标签
本领域已知许多胺反应性标签。例如，Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)的网站在“胺反应性荧光团、生物素、量子点和其他标签”标题下列出了152种试剂，包括：1-芘丁酸、琥珀酰亚胺酯、2',7'-二氟荧光素(Oregon
Figure GDA0003364679940000173
488)、5(6)-CR 6G、SE(5-(和-6)-羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺基酯)、混合异构体(mixed isomers)和7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸。ProZyme,Inc.(Hayward，CA)销售各种胺反应性标签，包括碱性染料，InstantPCTM(4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯)。共同拥有的美国专利No.8,124,792中公开的两种酸标签，8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸(“InstantANTSTM”)和4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸(“InstantAATM”)用于下面报道的实施例中。InstantANTSTM为聚糖添加了3个负电荷和荧光团，便于通过毛细管电泳和检测进行分离。此外，Waters Corporation(Milford，MA)销售用于标记糖胺的“RapiFluor-MSTM”。预计双吡啶可用于改善用这些胺反应性标签中的每一种进行的标记。
类似地，本领域已知大量硫醇反应性标签。例如，Thermo Fisher Scientific的网站在“硫醇-反应性荧光团、生物素及其他标签”标题下列出的94种试剂，包括：
Figure GDA0003364679940000171
IA(N-(4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-并二苯并-2-基)碘乙酰胺、5-(溴甲基)荧光素、Alexa
Figure GDA0003364679940000172
C5马来酰亚胺和DACM,N-(7-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-基))马来酰亚胺。预计双吡啶可用于改善用这些硫醇反应性标签中的每一种进行的标记。
尽管上面讨论的化合物是由供应商指定为“胺反应性”或“硫醇反应性”的亲电试剂，但是本领域技术人员将理解，许多化合物还将在感兴趣的亲核物质上标记其他基团，诸如蛋白质或肽上的胍或咪唑基团，以及核酸上的环外胺，并可用于标记这些亲核物质。通过运行亲核物质的平行等分试样，其中第一等分试样中为研究的标签和第二等分试样中为已知标记亲核物质的标签，然后分析两个等分试样并确定所研究的标签是否至少与已知标记亲核物质的标签一样标记亲核物质，可以容易地测试任何特定的标签，来观察其是否充分标记任何给定的亲核物质或目标亲核的部分。
浓度
通常，双吡啶的使用浓度为约0.5M至约2.5M，在一些实施方案中，将以约0.5M至约2.25M的浓度使用，在一些实施方案中，将以约0.75M至约2.0M的浓度使用，在一些实施方案中，将以约0.8M至约1.75M的浓度使用，更优选地，浓度为约1M至1.75M，在一些实施方案中，将以约1M至约1.5M的浓度使用，并且在一些实施方案中，将以约0.8M至约1.25M的浓度使用，并且还更优选地以约1M的浓度使用，其中术语“约”意指加或减0.2M。
双吡啶的去除
在一些实施方案中，可能需要在将标记化合物进行分析技术(诸如质谱分析)之前，去除双吡啶。可以通过本领域已知的任何方便的方法去除双吡啶。在优选的实施方案中，通过使用本领域中从溶液中除去不需要组分的固相柱体(cartridge)或其他固相提取装置而去除双吡啶。标记的聚糖通常上样到选定的清除柱体上，洗涤以除去大部分非聚糖污染物，然后洗脱。标记聚糖的清除程序通常用于本领域，并且预期其为聚糖标记和分析领域的从业者所熟知的。
实施例
实施例1
该实施例阐述了在以下一些实施例中使用示例性双吡啶进行的去糖基化和标记程序的示例性工作流程中使用的一些试剂的缩写。
“HEPES”：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
“DMF”：二甲基甲酰胺
“DMSO”：二甲基亚砜
“TMD”：4,4'-(1,3-丙二基)双-吡啶
“BPE”：4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶
“PNGase F混合剂”：PNGase F(～1mg/ml)和750mM HEPES pH 8.0缓冲液的1:1混合剂。
实施例2
该实施例阐述了使用示例性双吡啶对胺反应性化合物进行去糖基化和标记的示例性工作流程。
变性步骤
将20μl的2mg/ml糖蛋白加入PCR板的底部。加入2μl去污剂，诸如月桂酰肌氨酸钠。可选地，可以加入诸如双(2-巯基乙基)砜的还原剂。将混合物在90℃下孵育3分钟。
酶促消化步骤
加入2μl的PNGaseF混合剂。将得到的混合物在50℃下孵育5分钟。
标记步骤
用所选染料标记释放的糖胺。该染料通常是荧光染料并且在一些实施方案中还与质谱分析相容。例如，染料可以是以InstantPC(ProZyme,Inc.,Hayward,CA)出售的活化的普鲁卡因。例如，通过PNGase F的作用从糖蛋白释放的聚糖最初作为糖胺释放，其可以通过例如添加5μl新配制的DMSO中的0.2M 4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-二乙基氨基乙基酯与1M TMD的1:1混合物来标记。标记允许进行2分钟。
清除步骤：
如果需要，可以在分析之前通过对标记的聚糖进行固相萃取来对其进行清除。例如，通过将经标记的聚糖上样到柱体上，然后通过一种或多种分析技术对其进行分析。例如，可以用200μl 1:3:96的甲酸:水:乙腈溶液在300x g下洗涤柱体3分钟，并用50μl 200mM甲酸铵，pH7，含有20％DMSO的溶液洗脱样品。
分析步骤
洗脱后，可以分析通过PNGase F释放的聚糖。例如，可以注射1μl洗脱的样品用于高效液相色谱(HPLC)分析。
实施例3
该实施例报道了关于双吡啶在糖胺标记上使用的研究的效果。
通过示例性去糖基化酶，PNGase F对示例性糖蛋白，猪丙种球蛋白进行酶促消化。在2.5μl且各自配制于无水DMSO中以下项存在的情况下：(a)1M 4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶(“TMD”)、(b)1M 4,4'-(1,2-乙二基)双吡啶(“BPE”)、或(c)1M吡啶(“PYR”)，使用以无水二甲基亚砜(“DMSO”)作为溶剂的四种不同量(0.1μl、1μl、2.5μl或5μl)，浓度为0.2M的酸性染料，8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸，标记从pH8含有缓冲液HEPES的糖蛋白释放的糖胺。作为对照，还使用相同量的染料，但仅含DMSO溶剂(“对照”)标记糖胺。通过HPLC分析标记的聚糖，并使用310nm的荧光波长激发和430nm的荧光波长发射测量总荧光信号。
如图1所示，在所有试验中，当吡啶存在于混合物中时，标记的量非常接近于当不含吡啶的DMSO存在时标记的量。相比之下，一旦存在足够量的染料以标记存在的大多数糖胺，在双吡啶存在下标记的量令人惊讶地大于通过对照或在吡啶存在下标记的量。当存在2.5μl染料时，BPE的存在使标记的糖胺的量比仅使用DMSO时标记的量增加约70％，而TMD的存在使标记的聚糖增加了略低于100％。当使用5μl染料时，BPE和TMD均引起标记的糖胺的量增加一倍以上，如相对荧光单位或“RFU”所示。
实施例4
该实施例报道了确定不同浓度的双吡啶对标记糖胺的影响的研究的效果。
通过示例性去糖基化酶，PNGase F对示例性糖蛋白，猪丙种球蛋白进行酶促消化。在(a)仅DMF，作为对照，(b)2.5μl的4M TMD，或(c)1M TMD的存在下，使用2.5μl浓度为0.2M，使用无水二甲基甲酰胺(“DMF”)作为溶剂的酸性染料4-[(2,5-二氧代吡咯烷酮)1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸，标记从糖蛋白释放的糖胺。通过HPLC分析标记的聚糖，并使用380nm的荧光波长激发和430nm的荧光波长发射测量总荧光信号。
如图2所示，1M TMD的使用引起标记的糖胺的量略低于使用对照(仅溶剂)的两倍。使用4M TMD引起标记的糖胺增加超过69％，而使用1M TMD引起标记的糖胺增加86％。为方便起见，标记的糖胺的量的平均读数在图2中以数字显示在每个柱上，带有显示1个标准偏差的误差柱。
实施例5
该实施例报道了确定双吡啶在标记糖胺上的最佳浓度的研究的效果。
通过示例性去糖基化酶，PNGase F对示例性糖蛋白，猪丙种球蛋白进行酶促消化。使用2.5μl在DMF中浓度为0.2M的碱性染料InstantPCTM(ProZyme,Inc.,Hayward,CA)，与2.5μl 0.5M、1M、1.5M或2M的TMD混合，标记从糖蛋白释放的糖胺。然后通过HPLC分析标记的聚糖，并使用285nm的荧光波长激发和345nm的荧光波长发射测量总荧光信号。如图3所示，使用1M、1.5M和2M的TMD与该染料，观察到非常相似的标记量。
实施例6
该实施例阐述了用于制备使用在含有示例性双吡啶的溶液中的示例性标签标记示例性亲核物质，糖胺的溶液的示例性方案。
制备在无水DMF中的0.5M TMD溶液。将150μl该溶液加入至30mg干燥InstantPCTM((4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯)。将5μl该溶液(在DMF中具有0.5M TMD的InstantPCTM)添加至25μl在pH8的HEPES缓冲液中含有糖胺的蛋白质消化物中。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且对于本领域技术人员而言，本领域技术人员可以鉴于其进行各种修改或改变，并且包括在本申请的精神和权限以及附加权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入。

Claims (20)

1.一种用于非诊断和非治疗目的的在体外标记感兴趣的亲核物质的方法，所述方法包括将所述亲核物质与溶液一起孵育的步骤，所述溶液包含(a)溶剂，所述溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，(b)与所述亲核物质反应的亲电子标签，和(c)可溶于所述溶剂的双吡啶，从而标记所述亲核物质，其中所述亲核物质是在所述孵育步骤之前从糖蛋白释放的糖胺，且所述亲电子标签选自8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸、4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸和4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯，和
其中所述双吡啶为4,4’-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4’-(1,2-乙二基)双吡啶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中进一步地，通过酶促消化从所述糖蛋白释放所述糖胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述糖蛋白的所述酶促消化包括通过酶PNGase F的消化。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲电子标签在水性溶液中是酸性的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲电子标签在水性溶液中是碱性的。
6.一种用于非诊断和非治疗目的的标记从感兴趣的糖蛋白释放的N-聚糖的方法，所述方法包括：
(a)将所述糖蛋白与酶一起孵育，所述酶从所述糖蛋白释放作为糖胺的所述N-聚糖，和
(b)在允许通过胺反应性标签来标记所述糖胺的条件下，将所述糖胺与包含为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜的溶剂、所述胺反应性标签选自8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸、4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸和4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯和双吡啶的溶液接触，从而标记从所述糖蛋白释放的所述N-聚糖，
其中所述双吡啶为4,4’-(1,3-丙二基)双吡啶或4,4’-(1,2-乙二基)双吡啶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述糖蛋白是抗体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中进一步地，在步骤(b)之前将所述糖蛋白固定在固体支持物上。
9.根据权利要求6所述的方法，其中进一步地，所述酶为去糖基化酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述去糖基化酶为内切糖苷酶。
11.根据权利要求9所述的方法，其中进一步地，所述去糖基化酶是酰胺酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中进一步地，所述酰胺酶是PNG F。
13.根据权利要求6所述的方法，其中进一步地，为所述标记的糖胺提供分析方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述分析方法选自由高压液相色谱、毛细管电泳、微流体分离和质谱分析组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述分析方法是高压液相色谱。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述分析方法是质谱分析。
17.一种用于标记感兴趣的亲核物质的试剂盒，所述试剂盒包括，
(a)双吡啶，所述双吡啶选自4,4’-(1,3-丙二基)双吡啶和4,4’-(1,2-乙二基)双吡啶，
(b)与所述感兴趣的亲核物质反应的标签，其中所述亲核物质是糖胺，且所述标签选自8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]萘-1,3,5-三磺酸、4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸和4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯，和
(c)关于标记所述亲核物质的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，所述标签是干燥的4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氨基]苯甲酸2-(二乙基氨基)乙基酯。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中进一步地，所述双吡啶是在溶剂中。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，所述溶剂是二甲基甲酰胺。
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