RS58580B1 - Imunomodulatori - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetna objava obezbeđuje nove makrociklične peptide koji inhibiraju PD-1/PD-L1 i CD80/PD-L1 protein/protein interakciju, i prema tome su korisni za olakšavanje raznih bolesti, uključujući kancerske i infektivne bolesti.

[0002] Protein Programirane Smrti (Programmed Death 1 - PD-1) je inhibitorni član CD28 familije receptora, koja takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 je eksprimiran na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama i mijeloidnim ćelijama (Agata et al., iznad; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)).

[0003] PD-1 protein je transmembranski protein tipa I od 55 kDa koji je deo Ig genske superfamilije (Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)). PD-1 sadrži membranski proksimalni imunoreceptorski tirozinski inhibitorni motiv (ITIM) i membranski distalni tirozin-bazirani prekidač motiv (ITSM) (Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)). Iako strukturno sličan sa CTLA-4, PD-1 nema MYPPY motiv koji je kritičan za CD80 CD86 (B7-2) vezivanje. Dva liganda za PD-1 su identifikovana, PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (b7-DC). Pokazano je da je aktivacija T ćelija koje eksprimiraju PD-1 negativno regulisana nakon interakcije sa ćelijama koje eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)). I PD-L1 i PD-L2 su članovi B7 proteinske familije koji se vezuju za PD-1, ali se ne vezuju za druge članove CD28 familije. PD-L1 ligand je obilan u raznim humanim kancerima (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). Interakcija između PD-1 i PD-L1 rezultuje smanjenjem tumor infiltrirajućih limfocita, smanjenjem proliferacije posredovane T-ćelijskim receptorom, i izbegavanjem imunskog sistema od strane kancerskih ćelija (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). Imunska supresija može biti preokrenuta pomoću inhibiranja lokalne interakcije od PD-1 sa PD-L1, i efekat je aditivan kad je interakcija PD-1 sa PD-L2 blokirana takođe (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266(2003)).

[0004] Takođe je pokazano da PD-L1 interaguje sa CD80 (Butte MJ et al, Immunity;27:111-122 (2007)). Interakcija PD-L1/CD80 na eksprimirajućim imunskim ćelijama je takođe pokazana kao inhibitorna. Blokada ove interakcije je pokazana da ukida ovu inhibitornu interakciju (Paterson AM, et al., J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)).

[0005] Kada PD-1 eksprimirajuće T ćelije stupe u kontakt sa ćelijama koje eksprimiraju njegove ligande, funkcionalne aktivnosti u odgovoru na antigenične stimuluse, uključujući proliferaciju, sekreciju citokina, i citotoksičnost, su smanjene. PD-1/PD-L1 ili PD-L2 interakcije negativno regulišu imunske odgovore na infekciju ili tumor, ili tokom razvoja samotolerancije (Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)). Hronična antigena stimulacija, kao što je ona koja se javlja tokom tumorske bolesti ili hroničnih infekcija, rezultuje u T ćelijama koje eksprimiraju povišene nivoe PD-1 i disfunkcionalne su u odnosu na aktivnost prema hroničnom antigenu (razmotreno u Kim et al., Curr. Opin. Imm. (2010)). Ovo se naziva "iscrpljenost T ćelija". B ćelije takođe ispoljavaju supresiju PD-1/PD-liganda i "iscrpljenost".

[0006] Blokada PD-1/PD-L1 ligacije korišćenjem antitela za PD-L1 je pokazana da obnavlja i povećava T ćelijsku aktivaciju u mnogim sistemima. Pacijenti sa uznapredovalim kancerom imaju korist od terapije sa monoklonskim antitelom za PD-L1 (Brahmer et al., New Engl. J. Med. (2012)). Preklinički životinjski modeli tumora i hroničnih infekcija su pokazali da blokada PD-1/PD-L1 puta pomoću monoklonskih antitela može da poboljša imunski odgovor i rezultuje u odbacivanju tumora ili kontroli infekcije. Antitumorska imunoterapija preko PD-1/PD-L1 blokade može da poveća terapijski imunski odgovor na nekoliko histološki različitih tumora (Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)).

[0007] Interferencija sa PD-1/PD-L1 interakcijom poboljšava T ćelijsku aktivnost u sistemima sa hroničnom infekcijom. Blokada PD-L1 je uzrokovala poboljšani virusni klirens i obnovila imunitet kod miševa sa hromoičnom infekcijom virusom limfocitnog horiomeningitisa (Barber, D.L. et al., "Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006)). Humanizovani miševi inficirani sa HIV-1 pokazali su poboljšanu zaštitu od viremije i virusne deplecije CD4+ T ćelija (Palmer et al., J. Immunol. (2013)). Blokada PD-1/PD-L1 preko monoklonskih antitela za PD-L1 može da obnovi in vitro antigen-specifičnu funkcionalnost za T ćelije iz HIV pacijenata (Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)), HCV pacijenata (Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoS Path. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)) i HBV pacijenata (Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology (2009); Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (2008)).

[0008] Pokazano je da bokada PD-L1/CD80 interakcije stimuliše imunitet (Yang J., et al., J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)). Pokazano je da se imunska stimulacija koja rezultuje iz blokade PD-L1/CD80 interakcije poboljšava preko kombinacije sa blokadom daljih PD-1/PD-L1 ili PD-1/PD-L2 interakcija.

[0009] Pretpostavlja se da su promene u fenotipovima imunskih ćelija važan faktor u septičkom šoku (Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013)). Ove uključuju povećane nivoe PD-1 i PD-L1 (Guignant, et al, Crit. Care (2011)), ćelije iz pacijenata sa septičkim šokom sa povećanim nivoima PD-1 i PD-L1 ispoljavaju povećani nivo apoptoze T ćelija. Antitela usmerena na PD-L1, mogu redukovati nivo apoptoze imunskih ćelija (Zhang et al, Crit. Care (2011)). Pored toga, miševi koji nemaju PD-1 ekspresiju su rezistentniji na simptome septičkog šoka od miševa divljeg tipa. Yang J., et al.. J Immunol. Aug 1;187(3):1113-9 (2011)). Studije su otkrile da blokada interakcija PD-L1 primenom antitela može suprimirati neodgovarajuće imunske odgovore i ublažiti znakove bolesti.

[0010] Pored poboljšavanja imunoloških odgovora na hronične antigene, blokada PD-1/PD-L1 puta je takođe pokazana da poboljšava odgovore na vakcinaciju, uključujući terapijsku vakcinaciju u kontekstu hronične infekcije (Ha, S.J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A.C. et al., "PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M.-Y. et al., "Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ tcell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)).

[0011] Dokument WO 2014/151634 stavlja na uvid javnosti makrociklične inhibitore za PD-1/PD-L1 i CD80/PD-L1 protein/protein interakciju koji mogu biti korišćeni za kancerske i infektivne bolesti.

[0012] Molekuli ovde opisani pokazuju sposobnost da blokiraju interakciju PD-L1 sa PD-1, u biohemijskim i ćelijski-zasnovanim eksperimentalnim sistemima. Ovi rezultati su u saglasnosti sa potencijalom terapijske administracije da poboljša imuniteta kod kancera ili hronične infekcije, uključujući terapijsku vakcinu.

[0013] Makrociklični peptidi ovde opisani su sposobni da inhibiraju interakciju PD-L1 sa PD-1 i sa CD80. Ova jedinjenja su pokazala veoma efikasno vezivanje za PD-L1, blokadu interakcije PD-L1 sa ili PD-1 ili CD80, i sposobna su da podstaknu poboljšanu funkcionalnu aktivnost T ćelija, što ih čini kandidatima za parenteralne, oralne, pulmonalne, nazalne bukalne i formulacije sa produženim oslobađanjem.

[0014] U predmetnoj objavi je stavljeno na uvid javnosti jedinjenje sa formulom (I)

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde:

A je odabrano od veze,

gde:

označava tačku vezivanja za karbonil grupu i označava tačku vezivanja za atom azota;

z je 0, 1, ili 2;

w je 1 ili 2;

n je 0 ili 1;

m je 1 ili 2;

m' je 0 ili 1;

p je 0, 1, ili 2;

R<x>je odabrano od vodonik, amino, hidroksi, i metil;

R<14>i R<15>su nezavisno odabrani od vodonik i metil; i

R<z>je odabrano od vodonik i -C(O)NHR<16>; gde R<16>je odabran od vodonik, -CHR<17>C(O)NH2, -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NH2, i -CHR<17>C(O)NHCHR<18>C(O)NHCH2C(O)NH2; gde R<17>je odabran od vodonik i -CH2OH i gde R<18>je odabrano od vodonik i metil;

R<v>je vodonik ili bočni lanac prirodne aminokiseline;

R<c>, R<f>, R<h>, R<i>, i R<m>su vodonik;

R<n>je vodonik ili metil ili R<v>i R<n>formiraju pirolidinski prsten;

R<a>, R<e>, R<j>, i R<k>, su svaki nezavisno odabrani od vodonik i metil;

svako R<20>je nezavisno odabrano od vodonik i C1-C6alkil;

svako R<21>je nezavisno odabrano od vodonik i C1-C6alkil;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, R<12>, i R<13>su nezavisno odabrani od bočnog lanca prirodne aminokiseline i bočnog lanca neprirodne aminokiseline ili može svaki nezavisno formirati tri- do šest-očlani karbociklični prsten ili šest-očlani prsten koji sadrži atom kiseonika ili azota sa odgovarajućom geminalnom R<20>grupom, gde je prsten po izboru supstituisan sa jednim, dva, ili tri supstituenta nezavisno odabranih od C1-C3alkoksi, C1-C3alkil, C2-C4alkenil, halo, hidroksi, i amino i gde pet- i šest-očlani prsten je po izboru fuzionisan za fenil prsten; ili

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, R<12>, i R<13>mogu svaki nezavisno formirati prsten sa odgovarajućom vicinalnom R grupom kao što je opisano ispod;

R<e>i R<k>može svaki formirati prsten sa odgovarajućom vicinalnom R grupom i atomima za koje su oni vezani odabran od azetidin, pirolidin, morfolin, piperidin, piperazin, i tetrahidrotiazol; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabrane od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi;

R<b>je metil ili, R<b>i R<2>, zajedno sa atomima za koje su oni vezani, formiraju prsten odabran od azetidin, pirolidin, morfolin, piperidin, piperazin, i tetrahidrotiazol; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabrane od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi; ili, kada R<2>i geminalni R<20>nijedan nije vodonik, R<b>je vodonik;

R<d>je vodonik ili metil, ili, R<d>i R<4>, zajedno sa atomima za koje su oni vezani, mogu formirati prsten odabran od azetidin, pirolidin, morfolin, piperidin, piperazin, i tetrahidrotiazol; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabrane od amino, cijano, metil, halo, hidroksi, i fenil;

R<g>je vodonik ili metil ili R<g>i R<7>, zajedno sa atomima za koje su oni vezani, mogu formirati prsten odabran od azetidin, pirolidin, morfolin, piperidin, piperazin, i tetrahidrotiazol; gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabrane od amino, benzil po izboru supstituisan sa halo grupom, benziloksi, cijano, cikloheksil, metil, halo, hidroksi, izohinoliniloksi po izboru supstituisan sa metoksi grupom, hinoliniloksi po izboru supstituisan sa halo grupom, i tetrazolil; i gde pirolidin i piperidin prsten su opciono fuzionisani za cikloheksil, fenil, ili indol grupu; i

R<1>je metil ili, R<1>i R<12>, zajedno sa atomima za koje su oni vezani, formiraju prsten odabran od azetidin i pirolidin, gde svaki prsten je po izboru supstituisan sa jednom do četiri grupe nezavisno odabrane od amino, cijano, metil, halo, i hidroksi;

pod uslovom da jedinjenje sa formulom (I) sadrži najmanje jedan ugljenik na osnovnom lancu prstena koji ima četiri supstituenta koja nisu vodonik i nije alfa-metilsupstituisani prsten.

[0015] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje odabrano od: Primera 1001, Primera 5001, Primera 9001, Primera 9002, Primera 9003, Primera 9004, Primera 9005, Primera 9006, Primera 9007, Primera 9008, Primera 9009, Primera 9011, Primera 9012, Primera 9013, Primera 9014, Primera 9015, Primera 9016, Primera 9017, Primera 9018, Primera 10001, Primera 10002, Primera 10003, Primera 10004, Primera 10005, Primera 10006, Primera 10007, Primera 10008, Primera 10009, i Primera 10010; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0016] U još jednom tehničkom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili njegovu terapijski prihvatljivu so za primenu u poboljšavanju, stimulisanju, i/ili povećavanju imunskog odgovora kod subjekta kod koga postoji potreba za tim. U još jednom tehničkom rešenju pronalazak dalje sadrži administriranje dodatnog agensa pre, nakon, ili simultano sa jedinjenjem formule (I) ili njegovom terapijski prihvatljivom soli. U još jednom tehničkom rešenju dodatni agens je antimikrobni agens, antivirusni agens, citotoksični agens, i/ili modifikator imunskog odgovora. U još jednom tehničkom rešenju dodatni agens je HDAC inhibitor. U još jednom tehničkom rešenju dodatni agens je TLR7 i/ili TLR8 agonist.

[0017] U još jednom tehničkom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili njegovu terapijski prihvatljivu so za primenu u inhibiranju rasta, proliferacije, ili metastaze kancerskih ćelija kod subjekta kod koga postoji potreba za tim. Trebalo bi razumeti da pomenuta inhibicija može biti direktna ili indirektna. U još jednom tehničkom rešenju kancer je odabran od odabran od melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, skvamoznog nesitnoćelijskog kancera pluća (squamous non-small cell lung cancer -NSCLC), ne-skvamoznog NSCLC, kolorektalnog kancera, kancera prostate rezistentnog na kastraciju, kancera ovarijuma, kancera želuca, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, karcinoma jednjaka, gestrointestinalnog trakta i grudi, i hematološkog maligniteta.

[0018] U još jednom tehničkom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili njegovu terapijski prihvatljivu so za primenu u lečenju infektivne bolesti kod subjekta kod koga postoji potreba za tim. U još jednom tehničkom rešenju infektivna bolest je uzrokovana virusom. U još jednom tehničkom rešenju virus je odabran od HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, herpes virusa, i influence.

[0019] U još jednom tehničkom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje jedno ili više makrocikličnih peptidnih jedinjenja u skladu sa pronalaskom ili njihovu terapijski prihvatljivu so za primenu u lečenju septičkog šoka kod subjekta kod koga postoji potreba za tim. Takođe su opisani jedno ili više makrocikličnih peptidnih jedinjenja u skladu sa pronalaskom ili njegove terapijski prihvatljive soli za primenu u blokiranju interakcije PD-L1 sa PD-1 i/ili CD80 kod subjekta.

[0020] U jedinjenjima sa formulom (I) gde R bočni lanci su deo prstena koji je supstituisan sa metil, razume se da metil grupa može biti na bilo kom ugljenikovom atomu koji se može supstituisati u prstenu, uključujući ugljenik koji je deo makrociklične osnovne strukture. U jedinjenjima iz predmetne objave, postoji najmanje jedan ugljenik na osnovnom lancu prstena koji ima četiri supstituenta koji nisu vodonik i koji nije alfa-metil-supstituisani prsten sa formulom (II)

gde A je prsten kao što je opisano u patentnim zahtevima i gde označava tačke vezivanja za ostatak makrociklične strukture.

[0021] U jedinjenjima sa formulom (I), poželjni R<1>bočni lanci su: fenilalanin, tirozin, 3-tien-2-il, 4-metilfenilalanin, 4-hlorofenilalanin, 3-metoksifenilalananin, izotriptofan, 3-metilfenilalanin, 1-naftilalanin, 3,4-difluorofenilalanin, 4-fluorofenilalanin, 3,4-dimetoksifenilalanin, 3,4-dihlorofenilalanin, 4-difluorometilfenilalanin, 2-metilfenilalanin, 2-naftilalanin, triptofan, 4-piridinil, 4-bromofenilalanin, 3-piridinil, 4-trifluorometilfenilalanin, 4-karboksifenilalanin, 4-metoksifenilalanin, bifenilalanin, i 3-hlorofenilalanin; i 2,4-diaminobutan.

[0022] U jedinjenjima sa formulom (I) gde R<2>nije deo prstena, poželjni R<2>bočni lanci su: alanin, serin, i glicin.

[0023] U jedinjenjima sa formulom (I), poželjni R<3>bočni lanci su: asparagin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, glutamin, serin, ornitin, lizin, histidin, treonin, leucin, alanin, 2,3-diaminopropan, i 2,4-diaminobutan.

[0024] U jedinjenjima sa formulom (I) gde R<4>nije deo prstena, poželjni R<4>bočni lanci su: valin, alanin, izoleucin, i glicin.

[0025] U jedinjenjima sa formulom (I), poželjni R<5>bočni lanci su: aminometan, histidin, asparagin, 2,3-diaminopropan, serin, glicin, 2,4-diaminobutan, treonin, alanin, lizin, asparaginska kiselina, alanin, i 3-tiazolilalanin.

[0026] U jedinjenjima sa formulom (I), poželjni R<6>bočni lanci su: leucin, asparaginska kiselina, asparagin, glutaminska kiselina, glutamin, serin, lizin, 3-cikloheksan, treonin, ornitin, 2,4-diaminobutan, alanin, arginin, i ornitin (COCH3).

[0027] U jedinjenjima sa formulom (I) gde R<7>nije deo prstena, poželjni R<7>bočni lanci su: glicin, 2,4-diaminobutan, serin, lizin, arginin, ornitin, histidin, asparagin, glutamin, alanin, i 2,4-diaminobutan (C(O)ciklobutan).

[0028] U jedinjenjima sa formulom (I) poželjni R<8>bočni lanci su triptofan i 1,2-benzizotiazolinilalanin.

[0029] U jedinjenjima sa formulom (I) poželjni R<9>bočni lanci su: serin, histidin, lizin, ornitin, 2,4-dibutilamin, treonin, lizin, glicin, glutaminska kiselina, valin, 2,3-diaminopropan, arginin, asparaginska kiselina, i tirozin.

[0030] U jedinjenjima sa formulom (I) poželjni R<10>bočni lanci su: po izboru supstituisan triptofan, benzizotiazolilalanin, 1-naftilalanin, i metionin.

[0031] U jedinjenjima sa formulom (I) poželjni R<11>bočni lanci su: norleucin, leucin, asparagin, fenilalanin, metionin, etoksimetan, alanin, triptofan, izoleucin, fenilpropan, glutaminska kiselina, heksan, i heptan.

[0032] U jedinjenjima sa formulom (I) gde R<12>nije deo prstena, poželjni R<12>bočni lanci su: norleucin, alanin, etoksimetan, metionin, serin, fenilalanin, metoksietan, leucin, triptofan, izoleucin, glutaminska kiselina, heksan, heptan, i glicin.

[0033] U jedinjenjima sa formulom (I) poželjni R<13>bočni lanci : arginin, ornitin, alanin, 2,4-diaminobutan, 2,3-diaminopropan, leucin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, serin, lizin, treonin, ciklopropilmetan, glicin, valin, izoleucin, histidin, i 2-aminobutan.

[0034] U skladu sa predmetnom objavom, mi smo otkrili peptide koji se specifično vezuju za PD-L1 i sposobni su da inhibiraju interakciju PD-L1 sa PD-1 i CD80. Ovi makrociklični peptidi ispoljavaju in vitro imunomodulatornu efikasnost tako čineći ih terapijskim kandidatima za lečenje raznih bolesti uključujući kancer i infektivne bolesti.

[0035] Termini "specifično povezivanje" ili "specifično vezivanje" odnose se na interakciju između proteina i vezujućeg molekula, kao što je jedinjenje ili ligand. Interakcija je zavisna od prisustva posebne strukture (t.j., vezujućeg mesta enzima, antigenične determinante ili epitopa) proteina koja je prepoznata od strane vezujućeg molekula. Na primer, ako jedinjenje ima specifično vezivanje za proteinsko vezujuće mesto "A", prisustvo jedinjenja u reakciji koja sadrži protein koji uključuje vezujuće mesto A, i obeleženi peptid koji se specifično vezuje za proteinsko vezujuće mesto A će smanjiti količinu obeleženog peptida vezanog za protein. Nasuprot tome, nespecifično vezivanje, jedinjenja za protein ne rezultuje izmeštanjem, zavisnim od koncentracije, obeleženog peptida sa proteina.

[0036] Predmetna objava bi trebalo da uključi sve izotope atoma koji se javljaju u predmetnim jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj ali različite masene brojeve. Kao opšti primer i bez ograničenja, izotopi vodonika obuhvataju

1

deuterijum i tricijum. Izotopi ugljenika uključuju<13>C i<14>C. Izotopski-obeležena jedinjenja pronalaska se generalno mogu pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima iz oblasti ili procesima analognim onima koji su ovde opisani, koristeći odgovarajući izotopski-obeleženi reagens umesto ne-obeleženog reagensa koji se inače koristi. Takva jedinjenja mogu imati različite potencijalne primene, na primer kao standardi i reagensi za određivanje biološke aktivnosti. U slučaju stabilnih izotopa, takva jedinjenja mogu imati potencijal da povoljno modifikuju biološka, farmakološka ili farmakokinetička svojstva.

[0037] Dodatni aspekt predmetne teme koji je ovde opisan je primena peptida stavljenih na uvid javnosti kao radioobeleženih liganada za razvoj testova za vezivanje liganada ili za praćenje in vivo adsorpcije, metabolizma, distribucije, receptorskog vezivanja ili zauzimanja, ili dispozicije jedinjenja. Na primer, makrociklični peptid opisan ovde može biti pripremljen korišćenjem radioaktivnog izotopa<125>I i rezultujući radioaktivni peptid može biti korišćen za razvijanje testa za vezivanje ili za studije metabolizma. Alternativno, i radi iste svrhe, makrociklični peptid opisan ovde može biti konvertovan u radioobeleženi oblik pomoću katalitičke tricijacije koristeći metode poznate prosečnim poznavaocima oblasti.

[0038] Makrociklični peptidi predmetne objave mogu takođe biti korišćeni kao PET imidžing agensi dodavanjem radioaktivnog obeleživača korišćenjem metoda poznatih prosečnim poznavaocima oblasti.

[0039] Poželjni peptidi uključuju najmanje jedan od ovde obezbeđenih makrocikličnih peptida i ovi peptidi mogu biti uključeni u farmaceutske kompozicije i kombinacije.

[0040] Definicije koje su ovde obezbeđene primenjuju se, bez ograničenja, na termine kao što je korišćeno u ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije ograničeno u specifičnim slučajevima.

[0041] Prosečni poznavaoci oblasti hemije aminokiselina i peptida su svesni da aminokiselina uključuje jedinjenje predstavljeno opštom strukturom:

gde R i R' su kao što je ovde razmotreno.

[0042] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "aminokiselina" kao što je ovde korišćeno, sam ili kao deo druge grupe, uključuje, bez ograničenja, amino grupu i karboksil grupu vezanu za isti ugljenik, koji se naziva "α" ugljenik, gde je R i/ili R' može biti prirodni ili neprirodni bočni lanac, uključujući vodonik. Apsolutna "S" konfiguracija na "α" ugljeniku se obično naziva "L" ili "prirodna" konfiguracija. U slučaju gde su i "R" i "R" (primarni) supstituenti jednaki vodoniku, amino kiselina je glicin i nije hiralna.

[0043] Termini "bočni lanac prirodne aminokiseline" i " bočni lanac aminokiseline koja se prirodno javlja," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bočni lanac bilo koje od aminokiselina koje se prirodno javljaju (tj., alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin,-histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin) obično u S-konfiguraciji (tj., L-aminokiselina).

[0044] Termini "bočni lanac neprirodne aminokiseline" i "bočni lanac aminokiseline koja se ne javlja u prirodi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bočni lanac bilo koje aminokiseline koja se prirodno javlja obično u R-konfiguraciji (tj., D-aminokiselina) ili na grupu osim bočnog lanca aminokiseline koja se prirodno javlja u R- ili S-konfiguraciji (tj., D-ili L-aminokiselina, redom) odabrane od:

C2-C7alkenil, C1-C3alkoksiC1-C3alkil, C1-C6alkoksikarbonilC1-C3alkil, C1-C7alkil, C1-C3alkilsulfanilC1-C3alkil, amidoC1-C3alkil, aminoC1-C3alkil, azaindolilC1-C3alkil, benzotiazolilC1-C3alkil, benzotienilC1-C3alkil, benziloksiC1-C3alkil, karboksiC1-C3alkil, C3-C14cikloalkilC1-C3alkil, difenilmetil, furanilC1-C3alkil, imidazolilC1-C3alkil, naftilC1-C3alkil, piridinilC1-C3alkil, tiazolilC1-C3alkil, tienilC1-C3alkil;

bifenilC1-C3alkil gde bifenil je nezavisno supstituisan sa metil grupom;

heterorociklil po izboru supstituisan sa jednom, dve, tri, četiri, ili pet grupa nezavisno odabranih od C1-C4alkoksi, C1-C4alkil, C1-C3alkilsulfonilamino, amido, amino, aminoC1-C3alkil, aminosulfonil, karboksi, cijano, halo, haloC1-C3alkil, hidroksi, -NC(NH2)2, nitro, i -OP(O)(OH)2;

indolilC1-C3alkil, gde indolil deo je po izboru supstituisan sa jednom grupom odabranom od C1-C3alkil, karboksiC1-C3alkil, halo, hidroksi, i fenil, gde fenil je dalje po izboru supstituisan sa jednom, dve, ili tri grupe nezavisno odabrane od C1-C3alkoksi, C1-C3alkil, i halo;

NR<y>R<y'>(C1-C7alkil), gde R<y>i R<y'>su nezavisno odabrani od vodonik, C2-C4alkeniloksikarbonil, C1-C3alkil, C1-C3alkilkarbonil, C3-C14cikloalkilkarbonil, furanilkarbonil, i fenilkarbonil. Kada alkil veznik sadrži više od jednog ugljenika dodatna NR<y>R<y'>grupa može biti na lancu.

NR<q>R<t>karbonilC1-C3alkil, gde R<q>i R<t>su nezavisno odabrani od vodonik, C1-C3alkil, i trifenilmetil;

fenil po izboru supstituisan sa jednom, dve, tri, četiri ili pet grupa nezavisno odabranih od C1-C4alkoksi, C1-C4alkil, C1-C3alkilsulfonilamino, amido, amino, aminoC1-C3alkil, aminosulfonil, karboksi, cijano, halo, haloCi-C3alkil, hidroksi, -NC(NH2)2, nitro, i -OP(O)(OH)2;

NR<a'>R<b'>(C1-C7alkil), gde R<a'>i R<b'>su nezavisno odabrani od vodonik, C2-C4alkeniloksikarbonil, C1-C3alkil, C1-C3alkilkarbonil, C3-C6cikloalkilkarbonil, furanilkarbonil, i fenilkarbonil. Kada alkil veznik sadrži više od jednog ugljenika dodatna NR<a'>R<b'>grupa može biti na lancu.

NR<c'>R<d'>karbonilC1-C3alkil, gde R<c'>i R<d'>su nezavisno odabrani od vodonik, C1-C3alkil, i trifenilmetil;

fenilC1-C3alkil gde fenil deo je nezavisno supstituisan sa jednom, dve, tri, četiri ili pet grupa nezavisno odabranih od C1-C4alkoksi, C1-C4alkil, C1-C3alkilsulfonilamino, amido, amino, aminoC1-C3alkil, aminosulfonil, karboksi, cijano, halo, haloC1-C3alkil, hidroksi, -NC(NH2)2, nitro, i -OP(O)(OH)2; i

fenoksiC1-C3alkil gde fenil je nezavisno supstituisan sa C1-C3alkil grupom.

[0045] Termin "C2-C4alkenil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu u vidu ravnog ili razgranatog lanca od dva do četiri ugljenikova atoma koji sadrže najmanje jednu ugljenikugljenik dvostruku vezu.

[0046] Termin "C2-C7alkenil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu u vidu ravnog ili razgranatog lanca od dva do sedam ugljenikovih atoma koji sadrži najmanje jednu ugljenikugljenik dvostruku vezu.

[0047] Termin "C2-C4alkeniloksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C2-C4alkenil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

[0048] Termin "C1-C3alkoksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

[0049] Termin "C1-C4alkoksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C4alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

1

[0050] Termin "C1-C6alkoksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

[0051] Termin "C1-C3alkoksiC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkoksi grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0052] Termin "C1-C6alkoksikarbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkoksi grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0053] Termin "C1-C6alkoksikarbonilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C6alkoksikarbonil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0054] Termin "C1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz zasićenog ugljovodonika sa ravnim ili razgranatim lancem koji sadrži od jedan do tri ugljenikova atoma.

[0055] Termin "C1-C4alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz zasićenog ugljovodonika sa ravnim ili razgranatim lancem koji sadrži od jedan do četiri ugljenikovih atoma.

[0056] Termin "C1-C6alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na grupu izvedenu iz zasićenog ugljovodonika sa ravnim ili razgranatim lancem koji sadrži od jedan do šest ugljenikovih atoma.

[0057] Termin "C1-C3alkilkarbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0058] Termin "C1-C3alkilsulfanil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma sumpora.

[0059] Termin "C1-C3alkilsulfanilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkilsulfanil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0060] Termin "C1-C3alkilsulfonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko sulfonil grupe.

[0061] Termin "C1-C3alkilsulfonilamino," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkilsulfonil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko amino grupe.

[0062] Termin "amido," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -C(O)NH2.

[0063] Termin "amidoC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amido grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0064] Termin "amino," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -NH2.

[0065] Termin "aminoC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amino grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0066] Termin "aminosulfonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na amino grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko sulfonil grupe.

[0067] Termin "azaindolilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na azaindolil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Azaindolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0068] Termin "benzotiazolilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzotiazolil grupu vezanu za osnovni molekularni preko C1-C3alkil grupe. Benzotiazolil grupa može takođe biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0069] Termin "benzotienilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzotienil grupu vezanu za osnovni molekularni preko C1-C3alkil grupe. Benzotienil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0070] Termin "benziloksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benzil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

[0071] Termin "benziloksiC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na benziloksi grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0072] Termin "bifenilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na bifenil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Bifenil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0073] Termin "karbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -C(O)-.

[0074] Termin "karboksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -CO2H.

[0075] Termin "karboksiC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na karboksi grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0076] Termin "cijano," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -CN.

[0077] Termin "C3-C14cikloalkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na zasićeni monociklični, biciklični, ili triciklični ugljovodonični prstenasti sistem koji ima tri do četrnaest ugljenikovih atoma i nula heteroatoma. Biciklični i triciklični prstenasti sistemi mogu biti fuzionisani, spirociklični, ili premošteni. Reprezentativni primeri cikloalkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklopentil, biciklo[3.1.1]heptil, i adamantil.

1

[0078] Termin "C3-C14cikloalkilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C3-C14cikloalkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0079] Termin "C3-C14cikloalkilkarbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C3-C14cikloalkil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0080] Termin "furanilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na furanil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Furanil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0081] Termin "furanilkarbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na furanil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0082] Termini "halo" i "halogen," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na F, Cl, Br, ili I.

[0083] Termin "haloC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na C1-C3alkil grupu supstituisanu sa jednim, dva, ili tri halogena atoma.

[0084] Termin "halometil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na metil grupu supstituisanu sa jednim, dva, ili tri halogena atoma.

[0085] Termin "heterociklil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na pet-, šest-, ili sedmočlani prsten koji sadrži jedan, dva, ili tri heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika, i sumpora. Pet-očlani prsten ima nula do dve dvostruke veze i šest- i sedm-očlani prstenovi imaju nula do tri dvostruke veze. Termin "heterociklil" takođe uključuje biciklične grupe u kojima heterociklil prsten je fuzionisan za četvor- do šest-očlani aromatični ili nearomatični karbociklični prsten ili drugu monocikličnu heterociklil grupu. Heterociklil grupe predmetne objave su vezane za osnovni molekularni segment preko ugljenikovog atoma u grupi. Primeri heterociklil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzotienil, furil, imidazolil, indolinil, indolil, izotiazolil, izoksazolil, morfolinil, oksazolil, piperazinil, piperidinil, pirazolil, piridinil, pirolidinil, pirolopiridinil, pirolil, tiazolil, tienil, i tiomorfolinil.

[0086] Termin "hidroksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -OH.

[0087] Termin "imidazolilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na imidazolil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Imidazolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0088] Termin "indolilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na indolil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Indolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

1

[0089] Termin "naftilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na naftil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Naftil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0090] Termin "nitro," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -NO2.

[0091] Termin "NR<a'>R<b'>," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na dve grupe, R<a'>i R<b'>, koje su vezane za osnovni molekularni segment preko atoma azota. R<a'>i R<b'>su nezavisno odabrani od vodonik, C2-C4alkeniloksikarbonil, C1-C3alkilkarbonil, C3-C6cikloalkilkarbonil, furanilkarbonil, i fenilkarbonil.

[0092] Termin "NR<a'>R<b'>(C1-C3)alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<a'>R<b'>grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0093] Termin "NR<c'>R<d'>," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na dve grupe, R<c'>i R<d'>, koje su vezane za osnovni molekularni segment preko atoma azota. R<c'>i R<d'>su nezavisno odabrani od vodonik, C1-C3alkil, i trifenilmetil.

[0094] Termin "NR<c'>R<d'>karbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<c'>R<d'>grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0095] Termin "NR<c'>R<d'>karbonilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na NR<c'>R<d'>karbonil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0096] Termin "fenoksi," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko atoma kiseonika.

[0097] Termin "fenoksiC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenoksi grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0098] Termin "fenilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe.

[0099] Termin "fenilkarbonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na fenil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko karbonil grupe.

[0100] Termin "piridinilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na piridinil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Piridinil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0101] Termin "sulfanil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -S-.

[0102] Termin "sulfonil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na -SO2-.

1

[0103] Termin "tiazolilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na tiazolil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Tiazolil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0104] Termin "tienilC1-C3alkil," kao što je korišćeno ovde, odnosi se na tienil grupu vezanu za osnovni molekularni segment preko C1-C3alkil grupe. Tienil grupa može biti vezana za alkil segment preko bilo kog atoma koji se može zameniti u grupi.

[0105] Termin "lečenje" odnosi se na: (i) sprečavanje bolesti, poremećaja, ili stanja da se javi kod pacijenta koji može biti predisponiran za bolest, poremećaj i/ili stanje ali nije još dijagnostikovno kao da je ima; (ii) inhibiranje bolesti, poremećaja, ili stanja, tj., zaustavljanje njihovog razvoja; i (iii) ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja, tj. uzrokovanje regresije bolesti, poremećaja i/ili stanja i/ili simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem i/ili stanjem.

[0106] Vezanje makrocikličnih peptida za PD-L1 može se meriti, na primer, metodama kao što su homogena vremenski razlučiva fluorescencija (homogeneous time-resolved fluorescence - HTRF), površinska plazmonska rezonanca (Surface Plasmon Resonance -SPR), izotermalna titraciona kalorimetrija (isothermal titration calorimetry - ITC), nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija (NMR), i slično. Dalje, vezivanje makrocikličnih peptida za PD-L1 eksprimirane na površini ćelija može se izmeriti kao što je opisano ovde u testovima ćelijskog vezivanja.

[0107] Administracija terapijskog agensa opisanog ovde uključuje, bez ograničenja, administraciju terapijski efikasne količine terapijskog agensa. Termin "terapijski efikasna količina" kao što je korišćeno ovde se odnosi, bez ograničenja, na količinu terapijskog agensa za lečenje ili prevenciju stanja koje se može lečiti administracijom kompozicije inhibitora vezivanja PD-1/PD-L1 koji su ovde opisani. Ta količina je količina dovoljna da ispolji uočljiv terapijski ili preventivni ili ublažavajući efekat. Efekat može uključivati, na primer i bez ograničenja, lečenje ili prevenciju stanja koja su ovde navedena. Precizna efikasna količina za subjekta će zavisiti od veličine i zdravlja subjekta, prirode i stepena stanja koje se leči, preporuka lekara koji sporovodi lečenje, terapeutika ili kombinacije terapeutika izabranih za administraciju. Prema tome, nije korisno odrediti tačnu efikasnu količinu unapred.

[0108] U drugom aspektu, objava se odnosi na makrociklične peptide predmetnog pronalaska za primenu u inhibiranju rasta tumorskih ćelija kod subjekta. Kao što je ovde prikazano, makrociklični peptidi predmetne objave su sposobni da se vežu za PD-L1, narušavajući

1

interakciju između PD-L1 i PD-1, takmičeći se sa vezivanjem PD-L1 sa anti-PD-1 monoklonskim antitelima za koja je poznato da blokiraju interakciju sa PD-1, pojačavajući SMV-specifičnu T ćelijsku IFNy sekreciju, i pojačavajući HIV-specifičnu T ćelijsku IFNg sekreciju. Kao rezultat toga, makrociklični peptidi predmetne objave su korisni za modifikovanje imunskog odgovora, lečenje bolesti kao što su kancer ili infektivna bolest, stimulisanje zaštitnog autoimunskog odgovora ili za stimulisanje antigen-specifičnih imunskih odgovora (npr., koadministracijom PD-L1 blokirajućih peptida sa antigenom od interesa).

[0109] Da bi se predmetna objava lakše razumela, prvo se definišu određeni termini. Dodatne definicije su izložene u detaljnom opisu.

[0110] Termini "ligand programirane smrti 1", "ligand programirane ćelijske smrti 1", "Protein PD-L1", "PD-L1", "PDL1", "PDCDL1", "hPD-L1", "hPD-LI", "CD274" i "B7-H1" su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, homologe vrsta humanog PD-L1, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa PD-L1. Kompletna PD-L1 sekvenca može biti nađena pod GENBANK® pristupnim br. NP_054862.

[0111] Termini "programirana smrt 1", "programirana ćelijska smrt 1", "Protein PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" i "hPD-I" su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, homologe vrsta humanog PD-1, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa PD-1. Kompletna PD-1 sekvenca može biti nađena pod GENBANK® pristupnim br. U64863.

[0112] Termini "citotoksični T limfocit-povezani antigen-4", "CTLA-4", "CTLA4", "CTLA-4 antigen" i "CD152" (videti, npr., Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)) su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, homologe vrsta humanog CTLA-4, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa CTLA-4 (videti, npr., Balzano, Int. J. Cancer Suppl., 7:28-32 (1992)). Kompletna sekvenca nukleinske kiseline za CTLA-4 može biti nađena pod GENBANK® pristupnim br. L15006.

[0113] Termin "imunski odgovor" odnosi se na dejstvo, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i solubilnih makromolekula proizvedenih od strane gorenavedenih ćelija ili jetre (uključujući makrociklične peptide, citokine, i komplement) koje rezultira selektivnim oštećenjem, uništavanjem ili eliminacijom iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kancerskih ćelija, ili, u slučajevima autoimunosti ili patološke inflamacije, normalnih ljudskih ćelija ili tkiva.

1

[0114] "Neželjeni događaj" (adverse event - AE) kao što je korišćeno ovde je bilo koji nepovoljan i generalno nenameran, čak i nepoželjan, znak (uključujući abnormalni laboratorijski nalaz), simptom ili bolest povezani sa upotrebom medicinskog lečenja. Na primer, neželjeni događaj može biti povezan sa aktivacijom imunskog sistema ili ekspanzijom ćelija imunskog sistema (npr., T ćelija) kao odgovor na lečenje. Medicinsko lečenje može imati jedan ili više povezanih AE i svaki AE može imati isti ili različit nivo težine. Pozivanje na metode sposobne za "promenu neželjenih događaja" označava režim lečenja koji smanjuje incidencu i/ili težinu jednog ili više AE, povezanih sa primenom drugačijeg režima lečenja.

[0115] Kao što je korišćeno ovde, "hiperproliferativna bolest" odnosi se na stanja gde rast ćelija je povećan iznad normalnih nivoa. Na primer, hiperproliferativne bolesti ili poremećaji uključuju maligne bolesti (npr., kancer jednjaka, kancer debelog creva, kancer bilijarnog sistema) i ne-maligne bolesti (npr., ateroskleroza, benigna hiperplazija, i benigna prostatična hipertrofija).

[0116] Kao što je korišćeno ovde, "oko" ili "koji suštinski sadrži" označava u okviru prihvatljivog opsega greške za posebnu vrednost, kao što je određeno od strane prosečnog poznavaoca oblasti, što će delom zavisiti od toga kako se vrednost meri ili određuje, tj., ograničenja sistema za merenje. Na primer, "oko" ili "koji suštinski sadrži " mogu označavati unutar jedne ili više od jedne standardne devijacije po praksi u oblasti. Alternativno, "oko" ili "koji suštinski sadrži " može označavati opseg do 20%. Dalje, naročito u odnosu na biološke sisteme ili procese, termini mogu da označavaju do reda veličine ili do 5-ostruke vrednosti. Kada su date posebne vrednosti u prijavi i patentnim zahtevima, osim ako nije drugačije navedeno, značenje "oko" ili "koji suštinski sadrži " treba smatrati da je unutar prihvatljivog opsega greške za tu određenu vrednost.

[0117] Kao što je ovde opisano, treba razumeti da bilo koji raspon koncentracija, raspon procenata, raspon odnosa ili raspon celih brojeva obuhvata vrednost bilo kog celog broja u navedenom opsegu i, kada je pogodno, njegove frakcije (kao što je jedna desetina i jedna stotina celog broja), osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

Testovi kompeticije

[0118] Predmetna objava je takođe usmerena na makrociklične peptide koji su sposobni da kompetiraju sa vezivanjem referentnog anti-PD-Ll antitela (MDX-1105) za najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, i najmanje oko 100%. Takvi

2

makrociklični peptidi mogu da dele strukturnu homologiju sa jednim ili više makrocikličnih peptida stavljenih ovde na uvid javnosti, uključujući mutant, konzervativnu supstituciju, funkcionalnu susptituciju, i delecione oblike, pod uslovom da se oni specifično vezuju za PD-L1. Na primer, ako se makrociklični peptid vezuje suštinski za isti region od PD-L1 kao referentno anti-PD-Ll antitelo, makrociklični peptid treba da se veže za epitop od PD-L1 koji se bar preklapa sa PD-L1 epitopom za koji se anti-PD-Ll monoklonsko antitelo vezuje. Preklapajući region može da se kreće od jednog aminokiselinskog ostatka do nekoliko stotina aminokiselinskih ostataka. Makrociklični peptid treba da kompetira sa i/ili blokira vezivanje anti-PD-L1 monoklonskog antitela za PD-L1 i na taj način smanjuje vezivanje anti-PD-L1 monoklonskog antitela za PD-L1, poželjno najmanje 50% u testu kompeticije.

[0119] Anti-PD-Ll antitela koja mogu biti korišćena kao referentna antitela u svrhe testa kompeticije su poznate u oblasti. Na primer, sledeća reprezentativna anti-PD-L1 antitela mogu biti korišćena: MDX-1105 (BMS); L01X-C (Serono), L1X3 (Serono), MSB-0010718C (Serono), i PD-L1 Probody (CytomX), i PD-L1 antitela stavljena na uvid javnosti u WO 2007/005874 koji je u zajedničkom vlasništvu.

[0120] Anti-PD-1 antitela koja mogu biti korišćena kao referentna antitela za svrhe testa kompeticije su poznata u oblasti. Na primer, sledeća reprezentativna anti-PD-1 antitela mogu biti korišćena: nivolumab (BMS); 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 i 5F4 svako stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu koji je u zajedničkom vlasništvu sa br.8,008,449 (BMS), MK-3475 (Merck, stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu br. 8,168,757), i antitela stavljena na uvid javnosti u američkom patentu br.7,488,802.

Farmaceutske kompozicije

[0121] U još jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedan ili kombinaciju makrocikličnih peptida predmetne objave, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključe jedan ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) makrocikličnih peptida, ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula objave. Na primer, farmaceutska kompozicija objave može da sadrži kombinaciju makrocikličnih peptida (ili imunokonjugata ili bispecifika) koji se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koji imaju komplementarne aktivnosti.

[0122] Farmaceutske kompozicije objave mogu takođe biti administrirane u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovane sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može uključivati makrociklični peptid kombinovan sa najmanje jednim drugim antiinflamatornim ili imunosupresivnim agensom. Primeri terapijskih agenasa koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisani niže u odeljku o primenama makrocikličnih peptida objave.

[0123] Kao što je korišćeno ovde, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense koji odlažu apsorpciju, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu administraciju (npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta administracije, aktivno jedinjenje, tj. makrociklični peptid, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može biti obložen materijalom da bi se zaštitilo jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0124] Farmaceutska jedinjenja objave mogu da uključe jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" ili "terapijski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost osnovnog jedinjenja i ne uzrokuje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforna i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i atromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoskičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0125] Farmaceutska kompozicija objave takođe može da uključi farmaceutski prihvatljiv anti-oksidans. Primeri za farmaceutski prihvatljive antioksidanse uključuju: (1) antioksidanse rastvorne u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorne u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovan hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) metal helirajuće agense, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0126] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskoj kompoziciji uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.

[0127] Ove kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, agensi za emulzifikaciju i disperzioni agensi. Prevencija prisustva mikroorganizama može se obezbediti i procedurama za sterilizaciju, iznad, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično u kompozicije. Pored toga, produžena apsorpcija injekcionog farmaceutskog oblika može biti postignuta uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0128] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Primena takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti. Osim u onoj meri u kojoj je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskoj kompoziciji. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe biti inkorporirana u kompozicije.

[0129] Terapijske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se ostvariti uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

[0130] Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka

2

nabrojanih gore, prema potrebi, praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjne metode pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno-filtriranog rastvora istog.

[0131] Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da bi se proizveo jedan oblik doze će varirati u zavisnosti od subjekta koji se tretira, i od posebnog načina administracije. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da bi se proizveo pojedinačni dozni oblik će generalno biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenata do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenata do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0132] Dozni režimi su podešeni da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, jedan bolus se može administrirati, nekoliko podeljenih doza se može administrirati tokom vremena ili se doza može srazmerno smanjiti ili povećati kako je naznačeno potrebama terapijske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u jediničnom doznom obliku za olakšavanje administracije i uniformnost doziranja. Dozni jedinični oblik kao što je korišćeno ovde odnosi se na fizički zasebne jedinice koje su pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvodi željeni terapijski efekat zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija doznih jediničnih oblika objave se diktira i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i specifičnog terapijskog efekta koji se postiže, (b) ograničenja koja su inherentna u oblasti formulisanja takvog aktivnog jedinjenja za tretman osetljivosti kod pojedinaca.

[0133] Za administraciju makrocikličnog peptida, dozni opsezi od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne mase, 1 mg/kg telesne mase, 3 mg/kg telesne mase, 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili unutar opsega 1-10 mg/kg. Režim lečenja kao primer zahteva administraciju jednom dnevno, dva puta dnevno, dvo-nedeljno, tro-nedeljno, nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca ili jednom svakih tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi za makrociklični peptid objave uključuju 1 mg/kg telesne mase ili 3 mg/kg telesne mase preko intravenske administracije, sa makrociklusom koji se daje korišćenjem jednog od sledećih doznih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne mase jednom praćeno sa 1 mg/kg telesne mase svake tri nedelje.

[0134] U nekim metodama, dva ili više makrocikličnih peptida sa različitim specifičnostima vezivanja su administrirana simultano, pri čemu doza svakog jedinjenja administriranog pada unutar opsega koji su naznačeni. Jedinjenja su obično administrirana u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali mogu takođe biti neregularni kao što je naznačeno merenjem nivoa u krvi makrocikličnog peptida za ciljni antigen kod pacijenta. U nekim metodama, doza je podešena da se postigne koncentracija u plazmi od oko 1-1000 .mu.g/ml i u nekim metodama oko 25-300 .mu.g/ml.

[0135] Alternativno, makrociklični peptid se može administrirati kao formulacija sa neprekidnim oslobađanjem, pri čemu se zahteva manje česta administracija. Doziranje i učestalost administracije mogu varirati u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza se administrira u relativno retkim intervalima tokom dugog perioda vremena. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja života. U terapijskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima dok se ne smanji progresija bolesti ili prekine, i poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može administrirati profilaktički režim.

[0136] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetne objave mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna da se postigne željeni terapijski odgovor za određenog pacijenta, kompozicija, način administracije, a da nisu toksični za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od raznih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija predmetne objave koje se koriste, ili njihovog estra, soli ili amida, puta administracije, vremena administracije, brzine izlučivanja određenog jedinjenje koje se koristi, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, mase, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj oblasti.

[0137] "Terapijski efikasna doza" makrocikličnog peptida objave poželjno rezultuje u smanjenju težine simptoma bolesti, povećanja u učestalosti i trajanju perioda bez simptoma

2

bolesti, ili prevenciji pogoršanja ili invalidnosti usled bolesti. Na primer, za tretman tumora, "terapijski efikasna doza" poželjno inhibira ćelijski rast ili tumorski rast za najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, čak poželjnije za najmanje oko 60%, i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na netretirane subjekte. Sposobnost jedinjenja da inhibira tumorski rast i/ili HIV može biti procenjena u sistemu životinjskog modela prediktivnog za efikasnost u humanim tumorima ili virusnu efikasnot. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije može biti procenjeno ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira, takva inhibicija in vitro pomoću testova poznatih prosečnom poznavaocu oblasti. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, smanjiti virusno opterećenje ili drugačije ublažiti simptome kod subjekta. Prosečan poznavalac oblasti bi trebalo da je sposoban da odredi takve količine bazirane na takvim faktorima kao što su veličina subjekta, težina simptoma kod subjekta, i posebna kompozicija ili put administracije koji je odabran.

[0138] U još jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje farmaceutski komplet delova koji sadrži makrociklični peptid i drugi imumodulator, kao što je opisano ovde. Komplet može takođe dalje da sadrži uputstva za primenu u lečenju hiperproliferativne bolesti (kao što je kancer kako je opisano ovde) i/ili anti-virusne bolesti.

[0139] Kompozicija iz predmetne objave može biti administrirana putem jednog ili više puteva administracije korišćenjem jedne ili više raznih metoda poznatih u oblasti. Kao što će razumeti iskusan poznavalac oblasti, put i/ili način administracije će zavisiti od željenih rezultata. Poželjni putevi administracije za makrociklične peptide objave uključuju intravenske, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, subkutane, spinalne ili druge parenteralne puteve administracije, na primer putem injekcije ili infuzije. Izraz "parenteralna administracija" kao što je korišćeno ovde označava načine administracije drugačije od enteralne i topikalne administracije, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrasrčanu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0140] Alternativno, makrociklični peptid objave može biti administriran preko neparenteralnog puta, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozalni put administracije, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0141] Aktivna jedinjenja mogu biti pripremljena sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući

2

implante, transedrmalne flastere, i mikroenkapsulirane sisteme isporuke. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu biti korišćeni, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Mnoge metode za pripremanje takvih formulacija su patentirane ili generalno poznate prosečnim poznavaocima oblasti. Videti, npr., Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Njujork (1978).

[0142] Terapijske kompozicije mogu biti administrirane medicinskim uređajima poznatim u oblasti. Na primer, u poželjnom tehničkom rešenju, terapijska kompozicija objave može biti administrirana uređajem za hipodermijsko ubrizgavanje bez igle, kao što su uređaji stavljeni na uvid javnosti u američkim patentima br. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, ili 4,596,556. Primeri dobro-poznatih implantata i modula korisnih u predmetnoj objavi uključuju: američki patent br. 4,487,603, koji stavlja na uvid javnosti implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za dispenzovanje leka pri kontorlisanoj brzini; američki patent br.4,486,194, koji stavlja na uvid javnosti terapijski uređaj za administriranje leka kroz kožu; američki patent br. 4,447,233, koji stavlja na uvid javnosti infuzionu pumpu za lek za isporučivanje leka pri preciznoj brzini infuzije; američki patent br. 4,447,224, koji stavlja na uvid javnosti implantabili infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinualnu isporuku leka; američki patent br. 4,439,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka koji ima odeljke sa više komora; i američki patent br.4,475,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka. Ovi patenti su uključeni ovde putem reference. Mnogi drugi kao implanti, sistemi isporuke, i moduli su poznati prosečnim poznavaocima oblasti.

[0143] U određenim tehničkim rešenjima, makrociklični peptidi objave mogu biti formulisani da osiguraju podesnu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (blood-brain barrier - BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Kako bi se osiguralo da terapijska jedinjenja prelaze BBB (ako je poželjno), ona mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje lipozoma, videti, npr. američke patente br. 4,522,811, 5,374,548, i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više segmenata koji su selektivno transportovani u specifične ćelije ili organe, tako poboljšavajući ciljnu isporuku leka (videti, npr., Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989)). Ciljajući segmenti kao primer uključuju folat ili biotin (videti, npr., američki patent br.5,416,016 od Low et al.); manozide (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153:1038 (1988)); makrociklične peptide (Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob.

2

Agents Chemother., 39:180 (1995)); receptor surfaktantnog proteina A (Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)); p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)); videti takođe Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J.J. et al., Immunomethods 4:273 (1994).

Primene i metode objave

[0144] Makrociklični peptidi, kompozicije i metode iz predmetne objave imaju brojne in vitro i in vivo koristi, uključujući, na primer, detekciju PD-L1 ili poboljšanje imunskog odovora pomoću blokade PD-L1. Na primer, ovi molekuli mogu biti administrirani ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr., in vivo, za poboljšanje imuniteta u različitim situacijama. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje makrociklični peptid iz predmetnog pronalaska za upotrebu u modifikovanju imunskog odgovora kod subjekta. Poželjno, odgovor je pojačan, stimulisan ili pozitivno-regulisan. U drugim pogledima, makrociklični peptid može imati anti-cino, anti-mišje, i/ili anti-mrmotsko vezivanje i terapijsku aktivnost.

[0145] Kao što je korišćeno ovde, termin "subjekat" bi trebalo da obuhvati humana i nehumana bića. Ne-humana bića uključuju sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, kokoške, mrmoti, vodozemci, i gmizavci, iako sisari su poželjni, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave i konji. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente kod kojih postoji potreba za poboljšanjem imunskog odgovora. Metode su posebno pogodne za lečenje humanih pacijanata koji imaju poremećaj koji može biti tretiran povećavanjem imunskog odgovora posredovanog T ćelijama. U posebnom tehničkom rešenju, metode su posebno pogodne za lečenje kancerskih ćelija in vivo. Da bi se postiglo antigen-specifično poboljšanje imuniteta, makrociklični peptidi se mogu administrirati zajedno sa antigenom od interesa. Kada se makrociklični peptidi za PD-L1 administriraju zajedno sa drugim agensom, ova dva mogu biti administrirana bilo kojim redosledom ili simultano.

[0146] Objava dalje obezbeđuje metode za detektovanje prisustva humanog, mrmotskog, cino, i/ili mišjeg PD-L1 antigena u uzorku, ili merenje količine humanog, mrmotskog, cino, i/ili mišjeg PD-L1 antigena, koje obuhvataju kontaktiranje uzorka, i kontrolnog uzorka, sa referentnim makrocikličnim peptidom koji se specifično vezuje za humani, mrmotski, cino, i/ili mišji PD-L1, u uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između makrociklusa i humanog, mrmotskog, cino, i/ili mišjeg PD-L1. Formiranje kompleksa je zatim detektovano,

2

gde različito formiranje kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na prisustvo humanog, mrmotskog, cino, i/ili mišjeg PD-L1 antigena u uzorku.

[0147] S obzirom na specifično vezivanje makrocikličnih peptida objave za PD-L1, u poređenju sa CD28, ICOS i CTLA-4, makrociklični peptidi objave mogu se koristiti za specifično detektovanje ekspresije PD-L1 na površini ćelija i, pored toga, mogu se koristiti za prečišćavanje PD-L1 preko imunoafinitetnog prečišćavanja.

Kancer

[0148] Blokada PD-1 pomoću makrocikličnih peptida može da poboljša imunski odgovor na kancerske ćelije kod pacijenta. Ligand za PD-1, PD-L1, nije eksprimiran u normalnim humanim ćelijama, ali je obilan u raznim humanim kancerima (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). Interakcija između PD-1 i PD-L1 rezultuje smanjenjem tumor infiltrirajućih limfocita, smanjenjem proliferacije T-ćelija posredovane receptorom, i izbegavanjem imunskog sistema od strane kancerskih ćelija (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). Imunska supresija može biti preokrenuta inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1 i efekat je aditivan kada je interakcija PD-1 sa PD-L2 blokirana takođe (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)). Dok su prethodne studije pokazale da T-ćelijska proliferacija može biti obnovljena inhibiranjem interakcije PD-1 sa PD-L1, ne postoje izveštaji direktnog efekta na kancerski tumorski rast in vivo blokiranjem PD-1/PD-L1 interakcije. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u in vivo tako da je rast kancerskih tumora inhibiran. Makrociklični peptid može biti korišćen zasebno da inhibira rast kancerskih tumora. Alternativno, makrociklični peptid može biti korišćen zajedno sa drugim imunogenskim agensima, standardnim tretmanima kancera, ili drugim makrocikličnim peptidima, kao što je opisano ispod.

[0149] Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, pronalazak obezbeđuje makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u inhibiranju rasta tumorskih ćelija kod subjekta.

[0150] Poželjni kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem makrocikličnih peptida objave uključuju kancere koji tipično odgovaraju na imunoterapiju. Ne-ograničavajući primeri poželjnih kancera za tretman uključuju melanom (npr., metastatski maligni melanom), karcinom bubrežnih ćelija (npr., karcinom svetlih ćelija), kancer prostate (npr., hormonski refraktorni adenokarcinom prostate i kancer prostate rezistentan na kastraciju), kancer dojke, kolorektalni kancer i kancer pluća (npr., skvamozni i ne-skvamozni ne-

2

sitnoćelijski kancer pluaća). Dodatno, objava uključuje refraktorne ili rekurentne malignitete čiji rast može biti inhibiran upotrebom makrocikličnih peptida objave.

[0151] Primeri drugih kancera koji se mogu lečiti korišćenjem metoda objave uključuju kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni maligni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer stomaka/želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hočkinova bolest, ne-Hočkinov limfom, kancer jednjak, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tireoidne žlezde, kancer paratireoidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, hronične ili akutne leukemije uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, solidne tumore detinjstva, limfocitni limfom, kancer bešike, kancer bubrega ili uretre, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS-a, angiogenezu tumora, tumor kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, karcinom skvamoznih ćelija, limfom T-ćelija, kancer izazvan okolinom, uključujući one izazvane azbestom, i kombinacije navedenih kancera. Predmetna objava je takođe korisna za lečenje metastatskih kancera, posebno metastatskih kancera koji eksprimiraju PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)).

[0152] Po izboru, makrociklični peptidi za PD-L1 mogu biti kombinovani sa imunogenskim agensom, kao što su kancerske ćelije, prečišćeni tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i ugljenohidratne molekule), ćelije, i ćelije transfektovane sa genima koji kodiraju imunski stimulirajuće citokine (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Ne-ograničavajući primeri tumorskih vakcina koje mogu biti korišćene uključuju peptide melanomskih antigena, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigena, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaze, ili tumorske ćelije transfektovane da eksprimiraju citokinski GM-CSF (razmotreno dalje ispod).

[0153] Kod ljudi, neki tumori su pokazani kao imunogenski kao što su melanomi. Predviđeno je da povećanjem praga aktivacije T ćelija pomoću blokade PD-L1, možemo očekivati da aktiviramo odgovore tumora kod domaćina.

[0154] PD-L1 blokada je verovatno najefikasnija u kombinaciji sa protokolom vakcinacije. Razvijene su mnoge eksperimentalne strategije za vakcinaciju protiv tumora (videti Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); videti takođe Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, poglavlje 61, str. 3023-3043, u DeVita, V. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, peto izdanje (1997)). U jednoj od ovih strategija, vakcina se priprema korišćenjem autolognih ili alogenih tumorskih ćelija. Pokazalo se da su ove ćelijske vakcine najefikasnije kada se tumorske ćelije transdukuju da eksprimiraju GM-CSF. Pokazano je da GM-CSF predstavlja snažan aktivator prezentacije antigena za vakcinaciju tumora (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)).

[0155] Studija genske ekspresije i šabloni genske ekspresije velikih razmera u raznim tumorima vodila je ka definiciji takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999)). U mnogim slučajevima, ovi tumor specifični antigeni su diferencirani antigeni eksprimirani u tumorima i u ćeliji iz koje je tumor iznikao, na primer antigeni melanocita gp100, MAGE antigeni, i Trp-2. Još važnije, mnogi od ovih antigena mogu biti pokazani da su mete tumor specifičnih T ćelija nađenih kod domaćina. PD-L1 blokada može biti korišćena u vezi sa grupom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimiranih u tumoru kako bi se generisao imunski odgovor na ove proteine. Ovi proteini su normalno opaženi od strane imunskog sistema kao sopstveni antigeni i stoga su tolerantni prema njima. Tumorski antigen može takođe da uključi proteinsku telomerazu, koja je potrebna za sintezu telomera hromozoma i koja je eksprimirana u više od 85% humanih kancera i u samo ograničenom broju somatskih tkiva (Kim, N et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Ova somatska tkiva mogu biti zaštićena od napada imunskog sistema raznim načinima). Tumorski antigeni mogu takođe biti "neo-antigeni" eksprimirani u kancerskim ćelijama zbog somatskih mutacija koje menjaju proteinsku sekvencu ili kreiraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfija hormozomu), ili idiotip iz B ćelijskih tumora.

[0156] Druge tumorske vakcine mogu da uključe proteine iz raznih virusa koji su umešani u humane kancere kao što su Humani Papiloma Virusi (HPV), Hepatitis Virusi (HBV i HCV) i Kapošijev Herpes Sarkom Virus (KHSV). Drugi oblik tumor specifičnog antigena koji može biti korišćen u spoju sa PD-L1 blokadom su proteini toplotnog šoka (heat shock proteins -HSP) izolovani iz samog tumorskog tkiva. Ovi proteini toplotnog šoka sadrže fragmente proteina iz tumorskih ćelija i ovi HSP su visoko efikasni za isporuku antigen prezentujućim

1

ćelijama za izazivanje tumorske imunosti (Suot, R. et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)).

[0157] Dendritske ćelije - dendritic cells (DC) su potentne antigen prezentujuće ćelije koje mogu biti korišćene da proizvedu antigen-specifične odgovore. DC mogu biti proizvedene ex vivo i napunjene različitim proteinskim i peptidnim antigenima, kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). DC mogu takođe biti transdukovane genetičkim sredstvima da bi se eksprimirali ovi tumorski antigeni takođe. DC su takođe fuzionisane direktno za tumorske ćelije u svrhe imunizacije (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Kao metoda vakcinacije, DC imunizacija može biti efikasno kombinovana sa PD-L1 blokadom kako bi se aktivirali potentniji anti-tumorski odgovori.

[0158] PD-L1 blokada može takođe bitikombinovana sa standardnim lečenjima kancera. PD-L1 blokada može biti efikasno kombinovana sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, može biti moguće smanjiti dozu hemoterapijskog reagensa koji je administriran (Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Primer takve kombinacije je makrociklični peptid u kombinaciji sa dakarbazinom za lečenje melanoma. Drugi primer takve kombinacije je makrociklični peptid u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno obrazloženje za kombinovanu primenu PD-L1 blokade i hemoterapije je da ćelijska smrt, koja je posledica citotoksičnog dejstva većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da dovede do povećanja nivoa antigena tumora u putu prezentacije antigena. Druge kombinovane terapije koje mogu rezultovati sinergijom sa PD-L1 blokadom kroz ćelijsku smrt su zračenje, operacija, hormonska deprivacija. Svaki od ovih protokola stvara izvor tumorskog antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa PD-L1 blokadom. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti tumorskih ćelija, koja može uneti tumorski antigen u puteve prezentacije antigena domaćina.

[0159] PD-L1 blokirajući makrociklični peptidi mogu takođe biti korišćeni u kombinaciji sa bispecifičnim makrocikličnim peptidima koji ciljaju efektorske ćelije koje eksprimiraju Fc alfa ili Fc gama receptor za tumorske ćelije (videti, npr., američke patente br. 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifični makrociklični peptidi mogu biti korišćeni da ciljaju dva odvojena antigena. Na primer anti-Fc receptor/anti tumorski antigen (npr., Her-2/neu) bispecifični makrociklični peptidi su korišćeni da ciljaju makrofage na mesta tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati tumor specifične odgovore. T ćelijska grana ovih odgovora bi bila poboljšana upotrebom PD-L1 blokade. Alternativno, antigen se može dostaviti direktno DC

2

ćelijama upotrebom bispecifičnih makrocikličnih peptida koji se vezuju za tumorski antigen i specifični marker na ćelijskoj površini dendritskih ćeija.

[0160] Tumori izbegavaju imunološki nadzor pomoću velikog broja različitih mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama mogu se prevazići inaktivacijom proteina koji su eksprimirani od strane tumora i koji su imunosupresivni. Oni uključuju između ostalog TGF-beta (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), i Fas ligand (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). Makrociklični peptidi za svaki od ovih entiteta mogu biti korišćeni u kombinaciji sa anti-PD-Ll da bi se suprotstavili efektima imunosupresivnog agensa i favorizovali imunološke odgovore tumora od strane domaćina.

[0161] Drugi makrociklični peptidi koji mogu biti korišćeni da aktiviraju imunsku reakciju domaćina mogu biti korišćeni u kombinaciji sa anti-PD-Ll. Ovi uključuju molekule na površini dendritskih ćelija koji aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Anti-CD40 makrociklični peptidi su sposobni da efikasno zamene aktivnost T pomoćnih ćelija (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) i mogu biti korišćeni u spoju sa PD-1 antitelima (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Aktivirajući makrociklični peptidi za T ćelijske kostimulatorne molekule kao što su CTLA-4 (npr., američki patent br. 5,811,097), OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), i ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) mogu takođe da obezbede povećane nivoe aktivacije T ćelija.

[0162] Transplantacija koštane srži se trenutno koristi za lečenje raznih tumora hematopoetskog porekla. Iako je bolest kalem protiv domaćina posledica ovog tretmana, terapijska korist se može dobiti od odgovora kalema protiv tumora. PD-L1 blokada se može koristiti za povećanje efikasnosti donorskih nakalemljenih T-ćelija specifičnih za tumore.

[0163] Postoji i nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja koji uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer ovih ćelija u primaoce kao antigen-specifičnih T ćelija protiv tumora (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Ove metode mogu takođe biti korišćene da bi se aktivirali T ćelijski odgovori na infektivne agense kao što je CMV. Može se očekivati da ex vivo aktivacija u prisustvu makrocikličnih peptida poveća učestalost i aktivnost adoptivno transferovanih T ćelija.

Infektivne bolesti

[0164] Druge metode objave se koriste za lečenje pacijenata koji su bili izloženi određenim toksinima ili patogenima. Prema tome, još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje makrociklični peptid prema pronalasku za primenu u lečenju infektivne bolesti kod subjekta.

[0165] Slično njegovoj primeni na tumore kao što je gore razmotreno, PD-L1 blokada se može koristiti samostalno, ili kao adjuvans, u kombinaciji sa vakcinama, da bi se stimulisao imunski odgovor na patogene, toksine, i sopstvene-antigene. Primeri patogena za koje ovaj terapijski pristup može biti posebno koristan, uključuju patogene za koje trenutno ne postoji efikasna vakcina, ili patogene za koje su konvencionalne vakcine manje nego potpuno efikasne. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na HIV, Hepatitis (A, B, i C), Influencu, Herpes, Đardija, Malarija (Butler, N.S. et al., Nature Immunology 13, 188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al. PLOS Pathogens; 2. februar 2012)), Lajšmanija, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. PD-L1 blokada je posebno korisna za utvrđene infekcije pomoću agenasa kao što je HIV koji predstavljaju izmenjene antigene tokom trajanja infekcije. Ovi novi epitopi su prepoznati kao strani u vreme administracije anti-humanog PD-L1, tako izazivajući jak T ćelijski odgovor koji nije oslabljen negativnim signalima preko PD-L1.

[0166] Neki primeri patogenih virusa koji uzrokuju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju HIV, hepatitis (A, B, ili C), herpes virus (npr., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, i CMV, Epstein Barr virus), adenovirus, influenca virus, flavivirusi, ehovirus, rinovirus, koksaki virus, kornovirus, respiratorni sincicijski cirus, virus zauški, rotavirus, virus morbila, virus rubeole, parvovirus, virus vakcinije, virus HTLV, denga virus, papilomavirus, moluskum virus, poliovirus, virus besnila, virus JC i virus arboviralnog encefalitisa.

[0167] Neki primeri patogenih bakterija koje uzrokuju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju hlamidiju, rikecijalne bakterije, mikobakterije, stafilokoke, streptokoke, pneumonokoke, meningokoke i konokoke, klebsielu, proteus, seraciju, pseudomonas, legionelu, difteriju, salmonelu, bacile, koleru, tetanus, botulizam, antraks, kugu, leptospirozu, i bakterije Lajmske bolesti.

[0168] Neki primeri patogenih gljiva koje uzrokuju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, itd.), Criptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, itd.), Rod Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrik schenkii, Blastomices dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis i Histoplasma capsulatum.

[0169] Neki primeri patogenih parazita koji uzorkuju infekcije koje se mogu lečiti metodama objave uključuju Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba

4

sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, i Nippostrongylus brasiliensis.

[0170] U svim gorepomenutim metodama, PD-L1 blokada može biti kombinovana sa drugim oblicima imunoterapije kao što je citokinski tretman (npr., interferoni, agensi koji ciljaju VEGF aktivnost ili VEGF-receptore, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ili terapija bispecifičnim antitelom, koja obezbeđuje poboljšanu prezentaciju tumorskih antigena (videti, npr., Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Autoimunske reakcije

[0171] Makrociklični peptidi mogu izazvati i pojačati autoimunske odgovore. Zaista, indukcija anti-tumorskih odgovora korišćenjem tumorskih ćelija i peptidnih vakcina otkriva da mnogi anti-tumorski odgovori uključuju anti-samo reaktivnosti (depigmentacija opažena u anti-CTLA-4+GM-CSF-modifikovanom B 16 melanomu u van Elsas et al. iznad; depigmentacija u Trp-2 vakcinisanim miševima (Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2982-2987 (1999)); autoimuni prostatitis izazvan TRAMP tumorskim ćelijskim vakcinama (Hurwitz, A., supra (2000)), vakcinaciju peptidom za antigen melanoma i vitiligo opažene u kliničkim ispitivanjima na ljudima (Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1):81-84 (1996)).

[0172] Prema tome, moguće je razmotriti upotrebu anti-PD-Ll blokade u sprezi sa različitim sopstvenim proteinima kako bi se osmislili protokoli za vakcinaciju kako bi se efikasno generisali imunski odgovori protiv ovih sopstvenih proteina za lečenje bolesti. Na primer, Alchajmerova bolest uključuje neodgovarajuću akumulaciju A.beta. peptida u amiloidnim naslagama u mozgu; odgovori antitela na amiloid su sposobni da očiste ove amiloidne naslage (Schenk et al., Nature, 400:173-177 (1999)).

[0173] Drugi sopstveni proteini se takođe mogu koristiti kao mete kao što je IgE za lečenje alergije i astme, i TNF.alfa za reumatoidni artritis. Konačno, odgovori antitela na različite hormone mogu biti indukovani primenom makrociklusa ovde stavljenih na uvid javnosti. Neutrališući odgovori antitela na reproduktivne hormone mogu se koristiti za kontracepciju. Neutrališući odgovor antitela na hormone i druge solubilne faktore koji su potrebni za rast određenih tumora mogu se takođe smatrati mogućim ciljevima vakcinacije.

[0174] Analogne metode kao što je gore opisano za primenu anti-PD-L1 makrociklusa mogu se koristiti za indukciju terapijskih autoimunskih odgovora za lečenje pacijenata koji imaju neodgovarajuću akumulaciju drugih sopstvenih-antigena, kao što su amiloidni depoziti, uključujući A.beta. kod Alchajmerove bolesti, citokini kao što je TNF.alfa., i IgE.

Vakcine

[0175] Makrociklični peptidi se mogu koristiti za stimulaciju antigen-specifičnih imunskih odgovora pomoću koadministracije anti-PD-1 makrociklusa sa antigenom od interesa (npr., vakcinom). Prema tome, u još jednom aspektu objava obezbeđuje metodu za poboljšanje imunskog odgovora na antigen kod subjekta, koji sadrži administriranje subjektu: (i) antigena; i (ii) anti-PD-1 makrociklusa tako da se poboljša imunski odgovor na antigen kod subjekta. Antigen može biti, na primer, tumorski antigen, virusni antigen, bakterijski antigen ili antigen iz patogena. Ne-ograničavajući primeri takvih antigena uključuju one koji su razmatrani u gornjim odeljcima, kao što su tumorski antigeni (ili tumorske vakcine) razmotreni iznad, ili antigeni iz virusa, bakterija ili drugih patogena opisanih gore.

[0176] Pogodni putevi administriranja kompozicija (npr., makrocikličnih peptida, multispecifičnih i bispecifičnih molekula i imunokonjugata) objave in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti i mogu biti izabrani od strane prosečnih poznavaoca oblasti. Na primer, kompozicije mogu biti administrirane injekcijom (npr., intravenski ili subkutano). Pogodne doze korišćenih molekula će zavisiti od starosti i mase subjekta i koncentracije i/ili formulacije kompozicije.

[0177] Kao što je prethodno opisano makrociklični peptidi objave mogu biti koadministrirani sa jednim ili više drugih terapijskih agenasa, npr., citotoksičnim agensom, radiotoksičnim agensom ili imunosupresivnim agensom. Pepetid može biti povezan sa agensom (kao imunokompleks) ili može biti administriran odvojeno od agensa. U drugom slučaju (odvojena administracija), peptid može biti administriran pre, posle ili istovremeno sa agensom ili može biti ko-administriran sa drugim poznatim terapijama, npr., antikancerskom terapijom, npr., zračenjem. Takvi terapijski agensi uključuju, između ostalog, antineoplastične agense kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, dekarbazin i ciklofosfamid hidroksiureu koji su, sami po sebi, efikasni samo na nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se intravenski administrira kao 100 mg/dozi jednom svake četiri nedelje i adriamicin se intravenski administrira kao doza od 60-75 mg/ml jednom svakih 21 dan. Ko-administracija makrocikličnih peptida predmetne objave sa hemoterapijskim agensima obezbeđuje dva antikancerska agensa koja deluju preko različitih mehanizama koji proizvode citotoksični efekat na humane tumorske ćelije. Takva ko-administracija može rešiti probleme zbog razvoja rezistencije na lekove ili promene u antigeničnosti tumorskih ćelija koje bi ih učinile nereaktivnim sa peptidima.

[0178] Takođe u okviru obima predmetne objave su kompleti koji sadrže kompozicije objave (npr., makrociklični peptidi, bispecifični ili multispecifični molekuli, ili imunokonjugati) i uputstva za primenu. Komplet može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedan ili više dodatnih makrocikličnih peptida objave (npr., humano antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koja se vezuje za epitop u PD-L1 antigenu različitom od makrociklusa). Kompleti tipično uključuju oznaku koja označava nameravanu primenu sadržaja kompleta. Termin oznaka uključuje bilo koji pisani, ili zabeleženi materijal koji je obezbeđen na ili sa kompletom, ili koji na drugi način prati komplet.

Kombinovana terapija

[0179] Kombinacija makrocikličnih peptida predmetne objave sa drugim PD-L1 antagonistom i/ili drugim imunomodulatorom je korisna za poboljšanje imunskog odgovora protiv hiperproliferativne bolesti. Na primer, ovi molekuli se mogu administrirati ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr., in vivo, kako bi se poboljšala imunost u raznim situacijama. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje makrociklični peptid u skladu sa pronalaskom za primenu u modifikovanju imunskog odgovora kod subjekta. Poželjno, odgovor je poboljšan, stimulisan ili pozitivno-regulisan. U još jednom tehničkom rešenju, predmetna objava obezbeđuje metodu za menjanje neželjenih događaja povezanih sa tretmanom hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim terapijskim agensom, koja obuhvata administriranje makrocikličnog peptida predmetne objave i subterapijsku dozu drugog imunomodulatora subjektu.

[0180] Blokada PD-L1 makrocikličnim peptidima može da poboljša imunski odgovor na kancerske ćelije kod pacijenta. Kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem makrocikličnih peptida predmetne objave uključuju kancere koji odgovaraju na imunoterapiju. Reprezentativni primeri kanceri za lečenje kombinovanom terapijom predmetne objave uključuju melanom (npr., metastatski maligni melanom), kancer bubrega, kancer prostate, kancer dojke, kancer debelog creva i kancer pluća. Primeri drugih kancera koji mogu da se tretiraju korišćenjem metoda trenutne objave uključuju kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni maligni melanom, kancer materice, karcinom jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hočkinovu bolest, ne-Hočkinov limfom, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, hronične ili akutne leukemije uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, solidne tumore detinjstva, limfocitni limfom, kancer bešike, kancer bubrega ili uretre, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS-a, angiogenezu tumora, tumor kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, limfom T-ćelija, kancere izazvane okolinom uključujući one indukovane azbestom, i kombinacije navedenih kancera. Predmetna objava je takođe korisna za lečenje metastatskih karcinoma.

[0181] U određenim tehničkim rešenjima, kombinacija terapijskih agenasa koja sadrže najmanje jedan makrociklični peptid razmotren ovde može biti administrirana istovremeno kao pojedinačna kompozicija u farmaceutski prihvatljivom nosaču, ili istovremeno kao odvojene kompozicije gde svaki agens može biti administriran sekvencijalno. Na primer, drugi imunomodulator i makrociklični peptid predmetne objave može biti administriran sekvencijalno, kao drugi imunomodulator koji se administrira prvi i makrociklični peptid drugi, ili makrociklični peptid koji se administrira prvi i drugi imunomodulator drugi. Pored toga, ako više od jedne doze kombinovane terapije se administrira sekvencijalno, redosled sekvencijalne administracije može biti preokrenut ili zadržan po istom redu u svakoj vremenskoj tački administracije, sekvencijalne administracije mogu biti kombinovane sa istovremenim administracijama, ili bilo kojim njihovim kombinacijama. Na primer, prva administracija drugog imunomodulatora i makrocikličog peptida može biti istovremena, druga administracija može biti sekvencijalna sa drugim imunomulatorom prvim i makrocikličnim peptidom drugim, i treća administracija može biti sekvencijalna sa makrocikličnim peptidom prvim i drugim imunomodulatorom drugim, itd. Još jedna reprezentativna shema doziranja može da uključi prvu administraciju koja je sekvencijalna sa makrocikličnim peptidom prvim i drugim imunomodulatorom drugim, i naknadne administracije mogu biti istovremene.

[0182] Po izboru, kombinacija makrocikličnog peptida i drugog imunomodulatora može biti dalje kombinovana sa imunogenskim agensom, kao što su kancerske ćelije, prečišćeni tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i ugljenohidratne molekule), ćelije, i ćelije transfektovane sa genima koji kodiraju citokine koji stimulišu imunski sistem (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Ne-ograničavajući primeri tumorskih vakcina koje mogu biti korišćene uključuju peptide melanomskih antigena, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigena, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaza, ili tumorske ćelije transfektovane da eksprimiraju citokinski GM-CSF (razmotren dalje ispod).

[0183] Kombinovani PD-L1 makrociklični peptid i drugi imunomodulator mogu biti dalje kombinovani sa protokolom za vakcinaciju. Mnoge eksprimentalne strategije za vakcinaciju protiv tumora su osmišljene (videti Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); videti takođe Restifo et al., Cancer Vaccines, poglavlje 61, str. 3023-3043 in DeVita et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, peto izdanje (1997)). U jednoj od ovih strategija, vakcina je pripremljena korišćenjem autolognih ili alogeničnih tumorskih ćelija. Ove ćelijske vakcine su pokazane kao najefikasnije kada su tumorske ćelije transdukovane da eksprimiraju GM-CSF. GM-CSF je pokazan da je potentnog aktivatora antigen prezentacije za tumorsku vakcinaciju (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 90:3539-3543 (1993)).

[0184] Studija genske ekspresije i šablona genske ekspresije velikih razmera u raznim tumorima je vodila definiciji takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999)). U mnogim slučajevima, ovi tumor specifični antigeni su diferencijacioni antigeni eksprimirani u tumorima u ćeliji iz koje je tumor iznikao, na primer melanocitni antigeni gp100, MAGE antigeni, i Trp-2. Još važnije, mnogi od ovih antigena mogu biti pokazani da su mete tumor specifičnih T ćelija nađenih u domaćinu. U određenim tehničkim rešenjima, kombinovani PD-L1 makrociklični peptid i drugi imunomodulator mogu biti korišćeni u spoju sa grupom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimiranih u tumoru u cilju generisanja imunskog odgovora kao sopstvenih-antigena i, stoga su, tolerantni na njih. Tumorski antigen može takođe da uključi proteinsku telomerazu, koja je potrebna za sintezu telomera hromozoma i koja je eksprimirana u više od 85% humanih kancera i u samo ograničenom broju somatskih tkiva (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Ova somatska tkiva mogu biti zaštićena od napada imunskog sistema raznim načinima). Tumorski antigeni mogu takođe biti "neo-antigeni" eksprimirani u kancerskim ćelijama zbog somatskih mutacija koje menjaju proteinsku sekvencu ili kreiraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfija hromozomu), ili idiotip iz B ćelijskih tumora.

[0185] Druge tumorske vakcine mogu uključivati proteine iz virusa koji su uključeni u humane kancere, kao što su Humani Papiloma Virusi (HPV), virusi hepatitisa (HBV i HCV) i Kapošijev herpes sarkom virus (KHSV). Drugi oblik tumor specifičnog antigena koji se može koristiti zajedno sa blokadom PD-L1 makrocikličnog peptida su prečišćeni proteini toplotnog šoka (HSP) izolovani iz samog tkiva tumora. Ovi proteini toplotnog šoka sadrže fragmente proteina iz tumorskih ćelija i ovi HSP proteini su visoko efikasni pri isporuci u antigen prezentujuće ćelije za izazivanje tumorskog imuniteta (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997)).

[0186] Dendritske ćelije (dendritic cells - DC) su potentne antigen prezentujuće ćelije koje mogu biti korišćene da proizvedu antigen-specifične odgovore. DC mogu biti proizvedene ex vivo i napunjene različitim proteinskim i peptidnim antigenima kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). DC mogu takođe biti transdukovane genetičkim sredstvima da bi se eksprimirali ovi tumorski antigeni takođe. DC su takođe fuzionisane direktno za tumorske ćelije u svrhe imunizacije (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Kao metoda vakcinacije, DC imunizacija može biti efikasno kombinovana sa kombinovanim anti-PD-L1 makrocikličnim peptidom i drugim imunomodulatorom kako bi se aktivirali potentniji anti-tumorski odgovori.

[0187] Kombinovani anti-PD-L1 makrociklični peptid i dodatni imunomodulator mogu takođe biti dalje kombinovani sa standardnim tretmanima za kancer. Na primer, kombinacija makrocikličnog peptida i drugog imunomodulatora može biti efikasno kombinovana sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, kao što je opaženo sa kombinacijom makrocikličnog peptida i drugog imunomodulatora, može biti moguće smanjiti dozu drugog hemoterapijskog reagensa administriranog sa kombinacijom predmetne objave (Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Primer takve kombinacije je kombinacija makrocikličnog peptida i drugog imunomodulatora dalje u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. Još jedan primer je kombinacija makrocikličnog peptida i drugog imunomulatornog agensa dalje u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno obrazloženje iza kombinovane primene PD-L1 makrocikličnog peptida i još jednog imunomodulatora sa hemoterapijom je da ćelijska smrt, koja je posledica citotoksičnog dejstva većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da rezultuje povećanim nivoima tumorskog antigena u putu prezentovanja antigena. Druge kombinovane terapije koje mogu rezultovati u sinergiji sa kombinovanim anti-PD-L1 makrocikličnim peptidom i dodatnim imunomodulatorom kroz ćelijsku smrt uključuju zračenje, operaciju ili hormonsku deprivaciju. Svaki od ovih protokola kreira izvor tumorskog antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze mogu takođe biti kombinovani sa kombinovanim PD-L1 i drugim

4

imunomodulatorom. Inhibicija angiogeneze vodi smrti tumorske ćelije, što može takođe biti izvor tumorskog antigena koji treba da bude uveden u puteve antigen prezentacije kod domaćina.

[0188] Kombinacija PD-L1 i još jednog imunomodulatora može takođe biti primenjena u kombinaciji sa bispecifičnim makrocikličnim peptidima koji ciljaju Fc.alfa. ili Fc.gama. receptor-eksprimirajuće efektorske ćelije za tumorske ćelije (videti, npr., američke patente br.. 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifični makrociklični peptidi mogu takođe biti korišćeni da ciljaju dva odvojena antigena. Na primer anti-Fc receptor/anti tumor antigen (npr., Her-2/neu) bispecifični makrociklični peptidi su korišćeni da ciljaju makrofage na mesta tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati tumor specifične odgovore. T ćelijska grana ovih odgovora bi bila poboljšana primenom kombinovanog PD-L1 i drugog imunomodulatora. Alternativno, antigen može biti isporučen direktno u DC ćelije primenom bispecifičnih makrocikličnih peptida koji se vezuju za tumorski antigen i specifični marker na ćelijskoj površini dendritske ćelije.

[0189] U još jednom primeru, kombinacija makrocikličnog peptida i drugog imunomodulatora može biti korišćena u spoju sa anti-neoplastičnim makrocikličnim agensima, kao što su RITUXAN® (rituksimab), HERCEPTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), Lymphocide (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), i TARCEVA® (erlotinib), i slično. Kao primer i bez želje vezivanja za teoriju, tretman sa anti-kancerskim antitelom ili anti-kancerskim antitelom konjugovanim za toksin može voditi smrti kancerske ćelije (npr., tumorskih ćelija) što bi pojačalo imunski odgovor posredovan drugom imunomodulatorskom metom ili PD-L1. U tehničkom rešenju koje služi kao primer, tretman hiperproliferativne bolesti (npr., kancerski tumor) može uključivati anti-kancersko antitelo u kombinaciji sa makrocikličnim peptidom i drugim imunomodulatorom istovremeno ili sekvencijalno ili bilo koju njihovu kombinaciju, koja može pojačati anti-tumorske imunske odgovore od strane domaćina.

[0190] Tumori izbegavaju nadzor imunskog sistema pomoću velikog broja različitih mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama mogu se prevazići inaktivacijom proteina, koji su eksprimirani od strane tumora i koji su imunosupresivni. Ovi uključuju, između ostalog, TGF-.beta. (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), i Fas ligand (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). U još jednom primeru, antitela za svaki od ovih entiteta mogu biti dalje kombinovana sa makrocikličnim peptidom i drugim imunomodulatorom da se suprotstave efektima imunosupresivnih agenasa i favorizuju anti-tumorske imunske odgovore od strane domaćina.

[0191] Drugi agensi koji se mogu koristiti za aktiviranje imunskih odgovora domaćina mogu se dalje koristiti u kombinaciji sa makrocikličnim peptidom predmetne objave. Ovi uključuju molekule na površini dendritskih ćelija koji aktiviraju funkciju DC i prezentaciju antigena. Anti-CD40 makrociklični peptidi su sposobni da efikasno zamene aktivnost T pomoćnih ćelija (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) i mogu se koristiti zajedno sa makrocikličnim peptidima predmetne objave, bilo samostalno ili u kombinaciji sa anti-CTLA-4 kombinacijom (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Aktivirajući makrociklični peptidi za T ćelijske kostimulatorne molekule, kao što su OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), i ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) mogu takođe obezbediti povećane nivoe T ćelijske aktivacije.

[0192] Transplantacija koštane srži se trenutno koristi za lečenje raznih tumora hematopoetskog porekla. Iako je bolest kalem protiv domaćina posledica ovog tretmana, terapijska korist se može dobiti iz odgovora kalema protiv tumora. Makrociklični peptid iz predmetne objave, ili sam ili u kombinaciji sa drugim imunomodulatorom, može se koristiti za povećanje efikasnosti donorskih nakalemljenih T ćelija specifičnih za tumor.

[0193] Postoji takođe nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja koji uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer ovih ćelija u primaoce kao antigen-specifičnih T ćelija protiv tumora (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Ove metode mogu takođe biti korišćene da bi se aktivirali T ćelijski odgovori na infektivne agense kao što je CMV. Ex vivo aktivacija u prisustvu makrocikličnog peptida predmetne objave, ili sama ili u kombinaciji sa još jednim imunomodulatorom, može se očekivati da poveća učestalost i aktivnost adoptivno transferovanih T ćelija.

[0194] U određenim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje metodu za menjanje neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulatornim agensom, koja obuhvata administriranje makrocikličnog peptida predmetne objave u kombinaciji sa subterapijskom dozom još jednog imunomodulatora subjektu. Na primer, metode predmetne objave obezbeđuju metodu smanjivanja incidence imunostimulatornog terapijskog antitelom-indukovanog kolitisa ili dijareje pomoću administriranja ne-apsorbujućeg steroida pacijentu. Pošto je svaki pacijent koji će primiti imunostimulatorno terapijsko antitelo u riziku da razvije kolitis ili dijareju indukovanu takvim tretmanom, ova cela populacija pacijenata je pogodna za terapiju u skladu sa metodama predmetne objave. Iako su steroidi administrirani za lečenje inflamatorne bolesti creva (inflammatory bowel disease - IBD) i prevenciju egzacerbracija kod IBD, oni nisu korišćeni da spreče (smanje incidencu od) IBD kod pacijenata kojima nije dijagnostikovana IBD. Značajni sporedni efekti povezani sa steroidima, čak ne-apsorbujućim steroidima, su obeshrabrili profilaktičku primenu.

[0195] U dodatnim tehničkim rešenjima, makrociklični peptid predmetne objave, ili sam ili u kombinaciji sa još jednim imunomodulatorom, može biti dalje kombinovan sa primenom bilo kog ne-apsorbujućeg steroida. Kao što je korišćeno ovde, "ne-apsorbujući steroid" je glukokortikoid koji pokazuje ekstenzivni metabolizam prvog prolaza tako da, nakon metabolizma u jetri, bioraspoloživost steroida je niska, tj., manja od oko 20%. U jednom tehničkom rešenju objave, ne-apsorbujući steroid je budesonid. Budesonid je lokalno delujući glukokortikosteroid, koji je ekstenzivno metabolisan, primarno od strane jetre, nakon oralne administracije. ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca) je pH- i vremenski-zavisna oralna formulacija budesonida razvijena da optimizuje isporuku leka u ileum i kroz debelo crevo. ENTOCORT® EC je odobren u SAD za lečenje blage do umerene Kronove bolesti koja zahvata ileum i/ili uzlazno debelo crevo. Uobičajena oralna doza ENTOCORT® EC za lečenje Kronove bolesti je 6 do 9 mg/dan. ENTOCORT® EC je oslobođen u crevima pre nego što se apsorbuje i zadržan u stomačnoj mukozi. Jednom kada prođe kroz ciljno tkivo mukoze stomaka, ENTOCORT® EC je ekstenzivno metabolisan od strane citohrom P450 sistema u jetri do metabolita sa zanemarljivom glukokortikoidnom aktivnošću. Prema tome, bioraspoloživost je niska (oko 10%). Niska bioraspoloživost budesonida dovodi do poboljšanog terapijskog odnosa u poređenju sa drugim glukokortikoidima sa manje ekstenzivnim metabolizmom prvog prolaza. Budesonid dovodi do manjeg broja neželjenih efekata, uključujući manje hipotalamično-hipofiznu supresiju, nego kortikosteroidi koji deluju sistemski. Međutim, hronična administracija ENTOCORT® EC može dovesti do sistemskih glukokortikoidnih efekata kao što su hiperkorticizam i andrenalna supresija. Videti Physicians' Desk Reference Supplement, 58. izdanje, 608-610 (2004).

[0196] U još dodatnim tehničkim rešenjima, kombinacija PD-L1 i još jednog imunomodulatora u vezi sa ne-apsorbujućim steroidom može dalje biti kombinovana sa salicilatom. Salicilati uključuju 5-ASA agense kao što su, na primer: sulfasalazin (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazin (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazid (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); i mesalamin (ASACOL®, Procter &

4

Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

Doza i formulacija

[0197] Pogodni peptid Formule I, ili specifičnije makrociklični peptid opisan ovde, može biti administriran pacijentima za lečenje dijabetesa i drugih povezanih bolesti kao jedinjenje samo ili pomešano sa prihvatljivim nosačem u obliku farmaceutskih formulacija. Prosečni poznavaoci oblasti za lečenje dijabetesa mogu lako da utvrde dozu i put administracije jedinjenja sisarima, uključujući ljude, kod kojih postoji potreba za takvim lečenjem. Put administracije može da uključi ali nije ograničen na oralnu, intraoralnu, rektalnu, transdermalnu, bukalnu, intranazalnu, pulmonarnu, subkutanu, intramuskularnu, intradermalnu, sublingvalnu, intrakolonsku, intraokularnu, intravensku, ili intestinalnu administraciju. Jedinjenje je formulisano u skladu sa putem administracije zasnovanom na prihvatljivoj farmaceutskoj praksi (Fingl et al., u The Pharmacological Basis of Therapeutics, poglavlje 1, str. 1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Publishing Co., Iston, PA (1990)).

[0198] Farmaceutski prihvatljive peptidne kompozicije opisane ovde mogu biti administrirane u više doznih oblika kao što su tablete, kapsule (od kojih svaka obuhvata formulacije sa kontinuiranim oslobađanjem ili odloženim oslobađanjem), pilule, praškove, granule, eliksire, in situ gelove, mikrosfere, kristalne komplekse, lipozome, mikroemulzije, tinkture, suspenzije, sirupe, aerosol sprejeve i emulzije. Kompozicije opisane ovde mogu takođe biti administrirane u oralnom, intravenskom (bolus ili infuzija), intraperitonealnom, subkutanom, transdermalnom ili intramuskularnom obliku, svi dozni oblici koji se koriste su dobro poznati prosečnim poznavaocima farmaceutskih oblasti. Kompozicije mogu biti administrirane same, ali generalno će biti administrirane sa farmaceutskim nosačem odabranim na osnovu izabranog puta administracije i standardne farmaceutske prakse.

[0199] Režim doziranja za kompozicije opisane ovde će, naravno, varirati u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenog agensa i njegov način i put administracije; vrste, starosti, pola, zdravlja, zdravstvenog stanja, i mase primaoca; prirode i obima simptoma; vrste istovremenog tretmana; učestalosti tretmana; puta administracije, renalne i hepatične funkcije pacijenta, i željenog efekta. Lekar ili veterinar mogu da odrede i prepišu efikasnu količinu leka potrebnu da spreči, suzbije, ili zaustavi progres stanja bolesti.

[0200] Kao opšte uputstvo, dnevna oralna doza aktivnog sastojka, kada se koristi za naznačene efekte, biće u rasponu od oko 0.001 do 1000 mg/kg telesne mase, poželjno između oko 0.01 do 100 mg/kg telesne mase dnevno, i najpoželjnije između oko 0.6 do 20 mg/kg/dan. Intravenski, dnevna doza aktivnog sastojka kada je korišćen za naznačene efekte će biti u opsegu između 0.001ng do 100.0 ng po min/po Kg telesne mase tokom infuzije konstantne brzine. Takva konstantna intravenska infuzija može biti poželjno administrirana pri brzini od 0.01 ng do 50 ng po min po Kg telesne mase i najpoželjnije pri 0.01 ng do 10.0 mg po min po Kg telesne mase. Kompozicije opisane ovde mogu biti administrirane u pojedinačnoj dnevnoj dozi, ili ukupna dnevna doza može biti administrirana u podeljenim dozama od dva, tri, ili četiri puta dnevno. Kompozicije opisane ovde mogu takođe biti administrirane depo formulacijom koja će omogućiti kontinuirano oslobađanje leka tokom perioda u danima/nedeljama/mesecima po želji.

[0201] Kompozicije opisane ovde mogu se administrirati u intranazalnom obliku preko topikalne primene pogodnih intranazalnih nosača, ili preko transdermalnih puteva, korišćenjem transdermalnih kožnih flastera. Kada se administrira u obliku transdermalnog sistema za isporuku, doza administracije će, naravno, biti kontinuirana pre nego isprekidana tokom režima doziranja.

[0202] Kompozicije se tipično administriraju u smeši sa pogodnim farmaceutskim razblaživačima, ekscipijensima ili nosačima (koji se kolektivno ovde označavaju kao farmaceutski nosači) koji su prikladno odabrani u odnosu na predviđeni oblik administracije, to jest, oralne tablete, kapsule, eliksiri, aerosolni sprejevi generisani sa ili bez propelenta i sirupi, i u skladu sa konvencionalnim farmaceutskim praksama.

[0203] Na primer, za oralnu administraciju u obliku tablete ili kapsule, aktivna komponenta leka može da se kombinuje sa oralnim, ne-toksičnim, farmaceutski prihvatljivim, inertnim nosačem kao što su ali bez ograničenja na, laktoza, skrob, sukroza, glukoza, metil celuloza, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, manitol, i sorbitol; za oralnu administraciju u tečnom obliku, oralne komponente leka mogu da se kombinuju sa bilo kojim oralnim, ne-toksičnim, farmaceutski prihvatljivim inertnim nosačem kao što su, ali bez ograničenja, etanol, glicerol, i voda. Pored toga, kada je poželjno ili neophodno, pogodna vezujuća sredstva, lubrikanti, agensi za raspadanje i agensi za bojenje mogu takođe biti inkorporirani u smešu. Pogodna vezujuća sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, skrob, želatin, prirodne šećere, kao što su, ali bez ograničenja na, glukoza ili beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetičke gume kao što su akacija, tragakant, ili natrijum alginat,

4

karboksimetilceluloze, polietilen glikol, i voskovi. Lubrikanti korišćeni u ovim doznim oblicima uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, i natrijum hlorid. Agensi za raspadanje uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob, metil celulozu, agar, bentonit, i ksantan gumu.

[0204] Kompozicije koje su ovde opisane mogu takođe biti administrirane u obliku mešanih micelarnih ili lipozomskih sistema za isporuku, kao što su male unilamelarne vezikule, velike unilamelarne vezikule, i multilamelarne vezikule. Lipozomi se mogu formirati od različitih fosfolipida, kao što su holesterol, stearilamin ili fosfatidilholini. Poboljšivači permeacije se mogu dodati da bi se poboljšala apsorpcija leka.

[0205] Pošto je poznato da prolekovi poboljšavaju brojne poželjne kvalitete farmaceutskih supstanci (tj., solubilnost, bioraspoloživost, proizvodnju, itd.) jedinjenja opisana ovde mogu biti isporučena u obliku prolekova.

[0206] Kompozicije opisane ovde mogu takođe biti sparene sa solubilnim polimerima kao nosačima ciljajućeg leka. Takvi polimeri mogu da uključe polivinil-pirolidon, piran kopolimer, polihidroksipropil- metakrilamid-fenol, polihidroksietilaspartamidfenol, ili polietilenoksid-polilizin supstituisan sa palmitoil ostacima. Pored toga, kompozicije opisane ovde mogu biti kombinovane sa klasom biorazgradivih polimera korisnih u postizanju kontrolisanog oslobađanja leka, na primer, polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina, kopolimeri polimečne i poliglikolne kiseline, poliepsilon kaprolakton, polihidroksi buterna kiselina, poliortoestri, poliacetali, polidihidropirani, policijanoacilati, i unakrsno vezani ili amfipatični blok kopolimeri hidrogelova.

[0207] Dozni oblici (farmaceutske kompozicije) pogodni za administraciju mogu da sadrže od oko 0.01 miligrama do oko 500 miligrama aktivnog sastojka po doznoj jedinici. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni sastojak će obično biti prisutan u količini od oko 0.5-95% po masi na osnovu ukupne mase kompozicije.

[0208] Želatinske kapsule mogu sadržati aktivni sastojak i praškaste nosače, kao što su laktoza, skrob, derivat celuloze, magnezijum stearat, i stearinska kiselina. Slični razblaživači se mogu koristiti za pravljenje komprimovanih tableta. I tablete i kapsule mogu biti proizvedene kao proizvodi sa kontinuiranim oslobađanjem da bi se obezbedilo stalno oslobađanje leka tokom perioda vremena. Komprimovane tablete mogu biti obložene šećerom ili obložene filmom kako bi se prikrio bilo koji neugodni ukus i zaštitila tableta od atmosfere, ili enterički obložene za selektivnu dezintegraciju u gastrointestinalnom traktu.

4

[0209] Tečni dozni oblici za oralnu administraciju mogu da sadrže boju i aromu kako bi se povećala prihvatljivost od strane pacijenta.

[0210] Generalno, voda, pogodno ulje, fiziološki rastvor, vodena dekstroza (glukoza), i srodni rastvori šećera i glikoli kao što su propilen glikol ili polietilen glikoli su pogodni nosači za parenteralne rastvore. Rastvor za parenteralnu administraciju poželjno sadrži u vodi rastvornu so aktivnog sastojka, pogodne agense za stabilizaciju, i ako je potrebno, puferske supstance. Antioksidativni agensi kao što su natrijum bisulfit, natrijum sulfit, ili askorbinska kiselina, bilo sama ili kombinovana, su pogodni agensi za stabilizaciju. Takođe se koriste limunska kiselina i njene soli i natrijum EDTA. Pored toga, parenteralni rastvori mogu da sadrže konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, metil- ili propil-paraben, i hlorobutanol.

[0211] Pogodni farmaceutski nosači su opisani u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, devetnaesto izdanje, Mack Publishing Company (1995), standardni referentni tekst u ovoj oblasti.

[0212] Reprezentativni korisni farmaceutski dozni oblici za administraciju jedinjenja opisani ovde mogu biti ilustrovani kao što sledi:

Kapsule

[0213] Veliki broj jediničnih kapsula može biti pripremljen punjenjem standardnih dvodelnih tvrdih želatinskih kapsula sa 100 miligrama praškastog aktivnog sastojka, 150 miligrama laktoze, 50 milligrama celuloze, i 6 miligrama magnezijum stearata.

Meke želatinske kapsule

[0214] Smeša aktivnog sastojka u digestibilnom ulju kao što je sojino ulje, ulje pamučnog semena ili maslinovo ulje može se pripremiti i ubrizgati pomoću pozitivne pumpe za istiskivanje u želatin da bi se formirale meke želatinske kapsule koje sadrže 100 miligrama aktivnog sastojka. Kapsule bi trebalo da budu oprane i osušene.

Tablete

[0215] Tablete mogu biti pripremljene konvencionalnim procedurama tako da dozna jedinica, na primer je 100 miligrama aktivnog sastojka, 0.2 miligrama koloidnog silicijum dioksida, 5 miligrama magnezijum stearata, 275 miligrama mikrokristalne celuloze, 11 miligrama skroba i 98.8 miligrama laktoze. Odgovorajući premazi bi mogli biti primenjeni kao bi se povećala palatabilnost ili odložila apsorpcija.

Injektabilne supstance

4

[0216] Injektabilna formulacija peptidne kompozicije opisana ovde može ili ne mora zahtevati upotrebu ekscipijenasa kao što su oni koji su odobreni od strane regulatornih tela. Ovi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvarače i ko-rastvarače, sredstva za solubilizaciju, emulzifikaciju ili zgušnjavanje, agense za helaciju, antioksidanse i agense za redukciju, antimikrobne konzervanse, pufere i agense za podešavanje pH, agense za povećanje volumena, agense za zaštitu i agense za podešavanje toničnosti i specijalne aditive. Injektabilne formulacije moraju biti sterilne, bez pirogena i, u slučaju rastvora, bez čestica.

[0217] Parenteralna kompozicija pogodna za administraciju pomoću injekcije može biti pripremljena mešanjem na primer, 1.5% po masi aktivnog sastojka u farmaceutski prihvatljivom puferu koji može ili ne mora da sadrži ko-rastvarač ili drugi ekscipijens. Rastvor bi trebalo da bude napravljen izotoničan sa natrijum hloridom i sterilisan.

Suspenzija

[0218] Vodena suspnezija može biti pripremljena za oralnu i/ili parenteralnu administraciju tako da, na primer, svakih 5 mL sadrži 100 mg fino podeljenog aktivnog sastojka, 20 mg natrijum karboksimetil celuloze, 5 mg natrijum benzoata, 1.0 g sorbitol rastvora, U.S.P., i 0.025 mL vanilina ili drugog palatabilnog agensa za ukus.

Biorazgradive mikročestice

[0219] Parenteralna kompozicija sa kontinuiranim oslobađanjem pogodna za administraciju injekcijom može se pripremiti, na primer, rastvaranjem pogodnog biorazgradivog polimera u rastvaraču, dodavanjem polimernom rastvoru aktivnog agensa koji treba da se inkorporira, i uklanjanjem rastvarača iz matriksa čime se formira matriks polimera sa aktivnim agensom raspoređenim kroz matriks.

Sinteza peptida

[0220] Opis predmetne objave ovde treba tumačiti u skladu sa zakonima i principima hemijskog vezivanja. Trebalo bi razumeti da su jedinjenja obuhvaćena predmetnom objavom ona koja su pogodno stabilna za primenu kao farmaceutski agens. Prosečan poznavalac oblasti će znati koja jedinjenja bi bila i ne bi bila stabilna na osnovu opštih principa hemijskog vezivanja i stabilnosti.

[0221] Hemijska sinteza makrocikličnog peptida predmetne objave može biti izvedena korišćenjem raznih metoda prepoznatih u oblasti, uključujući postepenu sintezu čvrste faze, semi-sintezu preko konformaciono-asistirane ponovne-ligacije peptidnih fragmenata, enzimsku ligaciju kloniranih ili sintetičkih peptidnih segmenata, i hemijsku ligaciju. Poželjna

4

metoda za sintezu makrocikličnih peptida i njihovih analoga opisanih ovde je hemijska sinteza korišćenjem raznih tehnika čvrste faze kao što su one opisane u Chan, W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oksford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part A", str. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, Njujork (1980); i u Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2. izdanje, Pierce Chemical Co., Rokford, Ilinois (1984). Poželjna strategija je zasnovana na Fmoc (9-Fluorenilmetil metil-oksikarbonil) grupi za privremenu zaštitu α-amino grupe, u kombinaciji sa terc-butil grupom za privremenu zaštitu aminoksielinskih bočnih lanaca (videti na primer Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", u The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 9: "Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", str.1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Dijego (1987).

[0222] Peptidi se mogu sintetisati postepeno na nesolubilnom polimernom nosaču (koji se takođe naziva "smola") počevši od C-terminusa peptida. Sinteza je započeta dodavanjem C-terminalne aminokiseline peptida smoli kroz formiranje amidne ili estarske veze. Ovo omogućava konačno oslobađanje rezultujućeg peptida kao C-terminalnog amida ili karboksilne kiseline, redom.

[0223] Potrebno je da C-terminalna aminokiselina i sve druge aminokiseline korišćene u sintezi imaju svoje α-amino grupe i funkcionalnosti bočnih lanaca (ako su prisutne) diferencijalno zaštićene tako da α-amino zaštitna grupa može biti selektivno uklonjena tokom sinteze. Kuplovanje aminokiseline je izvedeno aktivacijom njene karboksil grupe kao aktivnog estra i reakcijom iste sa neblokiranom α-amino grupom N-terminalne aminokiseline dodate na smolu. Niz deprotekcije i kuplovanja α-amino grupe se ponavlja dok cela peptidna sekvenca nije sastavljena. Peptid se zatim oslobađa iz smole sa pratećom deprotekcijom funkcionalnosti bočnog lanca, obično u prisustvu odgovarajućih skavendžera da se ograniče sporedne reakcije. Dobijeni peptid je na kraju prečišćen pomoću HPLC na reverznoj fazi.

[0224] Sinteza peptidil-smola koje su potrebne kao prekursori do finalnih peptida koristi komercijalno dostupne unakrsno-vezane polistiren polimer smole (Novabiochem, San Dijego, Kalifornija; Applied Biosystems, Foster Siti, Kalifornija). Poželjni čvrsti nosači su: 4-(2',4'-dimetoksifenil-Fmoc-aminometil)-fenoksiacetil-p-metil benzhidrilamin smola (Rink amid MBHA smola); 9-Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi-Merrifield smola (Sieber amid sola); 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoksifenoksi)valeril-aminometil-Merrifield smola (PAL smola), za C-terminalne karboksamide. Kuplovanje prve i narednih aminokiselina može biti

4

postignuto korišćenjem HOBt, 6-Cl-HOBt ili HOAt aktivnih estara proizvedenih od DIC/HOBt, HBTU/HOBt, BOP, PyBOP, ili od DIC/6-Cl-HOBt, HCTU, DIC/HOAt ili HATU, redom. Poželjni čvrsti nosači su: 2-Hlorotritil hlorid smola i 9-Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi-Merrifield smola (Sieber amid smola) za zaštićene peptidne fragmente. Nanošenje prve aminokiseline na 2-hlorotritil hlorid smolu je najbolje postignuto reagovanjem Fmoczaštićene aminokiseline sa smolom u dihlorometanu i DIEA. Ako je potrebno, mala količina DMF može biti dodata da olakša rastvaranje aminokiseline.

[0225] Sinteze peptidnih analoga opisanih ovde mogu biti izvedene korišćenjem multikanalnog uređaja za sintezu peptida, kao što je CEM Liberty mikrotalasni uređaj za sintezu, ili Protein Technologies, Inc. Prelude (6 kanala) ili Symphony (12 kanala) uređaj za sintezu.

[0226] Prekursori peptidil-smole za njihove odgovarajuće peptide mogu biti iscepani i deprotektovani korišćenjem bilo koje standardne procedure (videti, na primer, King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)). Poželjna metoda je primena TFA u prisustvu vode i TIS kao skavendžera. Tipično, peptidil-smola je mešana u TFA/voda/TIS (94:3:3, v:v:v; 1 mL/100 mg peptidil smole) tokom 2-6 sati na sobnoj temperaturi. Potrošena smola je zatim isfiltrirana i TFA rastvor je koncentrovan ili osušen pod smanjenim pritiskom. Rezultujući sirovi peptid je ili precipitiran i opran sa Et2O ili je ponovo rastvoren direktno u DMSO ili 50% vodenoj sirćetnoj kiselini za prečišćavanje pomoću preparativne HPLC.

[0227] Peptidi sa željenom čistoćom mogu biti dobijeni prečišćavanjem korišćenjem preparativne HPLC, na primer, na Waters Model 4000 ili Shimadzu Model LC-8A tečnom hromatografu. Rastvor sirovog peptida je ubrizgan u YMC S5 ODS (20X 100 mm) kolonu i eluiran sa linearnim gradijentom MeCN u vodi, oba puferovana sa 0.1% TFA, korišćenjem brzine protoka od 14-20 mL/min sa praćenjem efluenta pomoću UV apsorbance na 220 nm. Strukture prečišćenih peptida mogu biti potvrđene pomoću elektro-sprej MS analize.

Primeri

[0228] Skraćenice korišćene u predmetnoj prijavi, uključujući posebno u ilustrativnim shemama i primerima koji slede, su dobro poznate prosečnim poznavaocioma oblasti. Neke od skraćenica koje su korišćene su kao što sledi: HOBt za 1-hidroksibenzotriazol; HBTU za O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat; BOP za benzotriazol-1-iloksi-tris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat; PyBOP za (benzotriazol-1-iloksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat); HCTU za O-(6-Cl-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijumheksafluorofosfat; TFA za trifluorosirćetnu kiselinu; TIS za triizopropilsilan; DMSO za dimetilsulfoksid; MeCN ili ACN za acetonitril; DCM za 1,1dihlorometan; DIEA ili DIPEA za diizopropiletilamin; Fmoc za 9-fluorenilmetiloksikarbonil; NMM za N-metilmorfolin; NMP za N-metilpirolidon; Ac za acetil; i Et za etil.

Analitički podaci:

[0229] Masena spektrometrija: "ESI-MS(+)" označava elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-MS označava elektrosprej jonizacioni masenu spektrometriju izvedenu u negativnom jonskom modu; "ESI-HRMS(+)" označava visoko-rezolucionu elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-HRMS(-)" označava visoko-rezolucionu elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u negativnom jonskom modu. Detektovane mase su prijavljene praćenjem "m/z" jediničnog označavanja. Jedinjenja sa tačnim masama većim od 1000 su često detektovana kao dvostruko-naelektrisani ili trostruko-naelektrisani joni.

Analiza LCMS Uslov A:

[0230] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B:Acetonitril sa 0.05% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 98% B tokom 2 minuta, zatim 0.5 minutno zadržavanje na 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov B:

[0231] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.11 mL/min.

Analiza LCMS Uslov C:

[0232] Kolona: BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: voda sa 0.2% mravljom kiselinom i 0.01% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.2% mravljom kiselinom i 0.01% TFA; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 2% B do 80% B tokom 2 minuta, 80% B do 98% B tokom 0.1 minuta zatim 0.5 minutno zadržavanje na 98% B; Protok: 0.8 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov D:

[0233] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda

1

sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov E:

[0234] Kolona: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.75-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.11 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov F:

[0235] Kolona: Waters Xbridge C18, 2.1 x 50 mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 35 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 4 minuta, zatim 1-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 4 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov G:

[0236] Finnigan LTQ Maseni spektrometar; kolona: Phenomenex Jupiter C4, 1 x 50 mm; Mobilna faza A: 1% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu; Temperatura: 30 °C; Gradijent: 1% B, 1 min. zadržavanje; 1-95% B tokom 3 min., zatim 3-min. zadržavanje na 95% B; Protok: 0.15 mL/min.

Analiza LCMS Uslov H:

[0237] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1.0 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza LCMS Uslov I:

[0238] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 0.5 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC Uslov A:

[0239] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 35% B do 80% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

2

Analiza HPLC Uslov B:

[0240] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 75% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC Uslov C:

[0241] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 20% B do 70% B tokom25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC Uslov D:

[0242] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 15% B do 65% B tokom 25 min.; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC Uslov E:

[0243] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 60% B tokom 20 min.; Protok: 1.25 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC Uslov F:

[0244] Kolona: YMC Pack ODS-AQ 3um 150x4.6mm Mobilna faza A: voda sa 0.1% TFA; Mobilna faza B: Acetonitril sa 0.1% TFA; Temperatura: 60 °C; Gradijent: od 25% B do 65% B tokom 20 min.; Protok: 1.25 mL/min; Detekcija: UV na 217 nm.

Analiza HPLC Uslov G

[0245] Kolona: Sunfire C18 3.5um, 3.0x150mm; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 10-100% B tokom 12 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC Uslov H

[0246] Kolona: Xbridge Fenil 3.5x150um, Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 0.05% trifluorosirćetnom kiselinom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 10-100% B tokom 12 minuta, zatim 3-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Analiza HPLC Uslov I:

[0247] Kolona: Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 x 4.6 mm; mobilna faza A: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, mobilna faza B: acetonitril sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, Gradijent 5-100% B preko 20min, zatim 5 minutno zadržavanje na 100% B;Protok 1mL/min, Detekcija: UV na 220

Analiza HPLC Uslov J:

[0248] Kolona: Phenomenex Luna 5u C18(2) 150 x 4.6 mm; mobilna faza A: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, mobilna faza B: acetonitril sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom, Gradijent 10-100% B tokom 20min, zatim 5 minutno zadržavanje na 100% B;Protok 1mL/min, Detekcija: UV na 220

Opšte procedure:

Prelude metoda A:

[0249] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure su ako nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom na dnu. Epruveta se vezuje za Prelude uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati kroz vrh epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da bi stupili u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno nisu koristili posle tri nedelje od pripremanja. DMF = dimetilformamid; DIC = N,N'-diizopropilkarbodiimid; HOAt = 1-hidroksi 7-azabenzotriazol; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola je korišćena u Merrifield polimeru (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnog lanca naznačenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

4

[0250] Procedure "Prelude metode A" opisuju eksperiment izveden na skali od 0.100 mmol, gde se skala određuje količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole gore opisane. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole, opisanom u daljem tekstu kao "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje Fmoc-N-metil aminokiselina i kuplovanje za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru kuplovanja sekundarnog amina" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hlorida" ili "Procedure kuplovanja hlorosirćetne kiseline" izložene detaljno ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0251] U polipropilenski reakcioni sud od 40 mL za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je oprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično uzburkavana sa uvođenjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran. Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0252] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor aminokiseline i HOAt (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim DIC (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 60 min, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0253] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor aminokiseline i HOAt (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 5 ekv), zatim DIC (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 5 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 min, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida:

[0254] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodato 3.0 mL rastvora DIPEA (4.0 mmol, 0.699 mL, 40 ekv), i hloroacetil hlorid (2.0 mmol, 0.160 mL, 20 ekv) u DMF-u. Smeša je periodično uzburkavana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran.

Prelude metoda B:

[0255] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure su izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom na dnu. DMF i DCM mogu biti dodati kroz vrh epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmocamino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola koja je korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoczaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0256] Procedure iz "Prelude metode B" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru kuplovanja sekundarnog amina" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hlorida" ili "Procedure kuplovanja hlorosirćetne kiseline" detaljno izložene ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0257] U polipropilenski sud od 40 mL za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično uzburkavana sa uvođenjem mehurić N2sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0258] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 30 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[0259] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno 3 puta sa DMF-om (4.0 mL) kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0260] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 10 ekv), zatim HCTU (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 10 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 12 sati, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura A kuplovanja hloroacetil hlorida:

[0261] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodato 3.0 mL rastvora DIPEA (4.0 mmol, 0.699 mL, 40 ekv), i hloroacetil hlorid (2.0 mmol, 0.160 mL, 20 ekv) u DMF-u. Smeša je periodično uzburkavana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu.

Procedura B kuplovanja hlorosirćetne kiseline:

[0262] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu.

Prelude Metoda C:

[0263] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure ukoliko nije navedeno su izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom na dnu. Epruveta se vezuje za Prelude uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati kroz vrh epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0264] Procedure iz “Prelude Metode C" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru kuplovanja sekundarnog amina " opisanu ispod. Finalno ispiranje smole koristilo je "Proceduru finalnog ispiranja " opisanu ispod

Procedura bubrenja smole:

[0265] U polipropilenski sud od 40 mL za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično uzburkavana uvođenjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0266] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh

1

suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 5.0 mL, 10 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 60 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0267] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 1.5 mL, 12 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda

2

i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja prilagođenih aminokiselina:

[0268] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 0.5 do 2.5 mL, 1 do 5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.5 do 1.5 mL, 4 do 12 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 60 minuta do 600 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura finalnog ispiranja:

[0269] Smola je isprana sukcesivno dva puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja hlorosirćetne kiseline:

[0270] Napomena Manuelni korak. U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je uzburkavana pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu.

Prelude Metoda D:

[0271] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure ukoliko nije navedeno su izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 ili 45 mL opremljenoj sa fritom na dnu. Epruveta se vezuje za Prelude uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati kroz vrh epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor su korišćeni uokviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

4

[0272] Procedure iz “Prelude Metode D" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde je skala određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, svi nizovi sinteze peptida počeli su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru kuplovanja sekundarnog amina" opisanu ispod. Finalno ispiranje smole koristilo je "Proceduru finalnog ispiranja" opisanu ispod

Procedura bubrenja smole:

[0273] U polipropilenski sud od 40 mL za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (5.0 mL) i DCM (5.0 mL), nakon čega je smeša periodično uzburkavana uvođenjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0274] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 30 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0275] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 30 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat amino (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 2.5 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.75 mL, 5 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 30 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura finalnog ispiranja:

[0276] Smola je isprana sukcesivno dva puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja hlorosirćetne kiseline:

[0277] Napomena Manuelni korak. U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je uzburkavana pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), hlorosirćetna kiselina (1.2 mmol, 113 mg, 12 ekv), i N,N'-Diizopropilkarbodiimid (1.2 mmol, 0.187 mL, 12 ekv). Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 12 do 18 sati, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(4.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu.

CEM Metoda A:

[0278] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na CEM Liberty mikrotalasnom uređaju za sintezu peptida (CEM Corporation). Sve procedure su osim ako nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 30 ili 125 mL opremljenoj sa fritom na dnu za CEM Discovery mikrotalasnu jedinicu. Epruveta se vezuje za CEM Liberty uređaj za sintezu i preko dna i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati i preko vrha i dna epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete osim tokom prenošenja smole sa vrha. "Periodično propuštanje mehurića" opisuje kratko ispuštanje mehurića N2gasa kroz fritu na dnu. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole kao što su Rink, HloroTrityl, ili drugi veznici osetljivi na kiseline mogu biti upotrebljeni u sintezi, Seiber amid smola je korišćena osim ukoliko drugačije nije navedeno u specifičnim primerima. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Orn(Boc)-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0279] Procedure iz "CEM Metode A" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 140 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru kuplovanja sekundarnog amina" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetil grupe za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hlorida" ili "Procedure kuplovanja hlorosirćetne kiseline" izložene u detaljima iznad.

Procedura bubrenja smole:

[0280] U polipropilensku konusnu epruvetu od 50 mL je dodata Merrifield: Sieber smola (140 mg, 0.100 mmol). Zatim DMF (7 mL) je dodat u epruvetu praćeno sa DCM (7 mL). Smola je zatim prenešena u reakcioni sud sa vrha suda. Procedura je ponovljena dodatno dva puta. DMF (7 mL) je dodat praćeno sa DCM (7 mL). Smola je ostavljena da bubri sa propuštanjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 15 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu.

Standardna procedura kuplovanja:

[0281] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF-u, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana pomoću propuštanja mehurića N2 tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje su kuplovan na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično ključala tokom 2 minuta na 65 °C, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja dvostrukog-para:

[0282] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF-u, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana pomoću propuštanja N2 mehurića tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koji su kuplovani na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF-u, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana pomoću propuštanja N2 mehurića tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koji su kuplovani na 50 °C, reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično ključala tokom 2 minuta na 65 °C, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0283] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor 5% piperazina i 0.1 M HOBt u DMF-u (7 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta na 75 °C i zatim rastvor je dreniran. Ova procedura je ponovljena samo jedanput. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u,2.5 mL, 5 ekv), HCTU (0.5M u DMF-u, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana pomoću propuštanja N2mehurića tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline (50 °C za Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH), praćeno sa 6 sati bez zagravanja. Nakon dreniranja, smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično ključala tokom 2 minuta na 65 °C, zatim rastvor je dreniran. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja prilagođenih aminokiselina:

[0284] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodat aminokiselinski rastvor (1.25 mL do 5 mL, 2.5 ekv do 10 ekv) koji sadrži HATU (2.5 ekv do 10 ekv), i konačno DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL do 1 mL, 20 ekv). Smeša je mešana pomoću propuštanja N2 mehurića tokom 5 minuta do 2 sata na 25 °C do 75 °C, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). U reakcioni sud je dodat rastvor anhidrida sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično ključala tokom 2 minuta na 65 °C, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: ispiranje sa vrha sa DMF-om (7 mL), praćeno ispiranjem sa dna sa DMF-om (7 mL) i konačno ispiranjem sa vrha sa DMF-om (7 mL). Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Symphony Metoda A:

[0285] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Symphony uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u Symphony polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom na dnu. Epruveta se vezuje za Symphony uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. Svi rastvarači, DMF, DCM, aminokiseline i reagensi su dodati preko dna epruvete i propušteni su kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2 gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 15 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. HATU rastvor su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; NMM= n-Metil morfolin; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmocamino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole osetljive na kiselinu takođe mogu biti korišćene u sintezi kao što su Rink ili funktionalizovana Hloro tritil smola. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

1

Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0286] Procedure iz "Symphony Metode A" opisuju eksperiment izveden na 0.050 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 70 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.050 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru standradnog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Dvostruko koplovanje", prilagođene aminokiseline su kuplovane preko manuelne adicije probe aminokiseline "kuplovanja probe" opisano ispod.

Procedura bubrenja:

[0287] U Symphony polipropilenski sud za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Sieber smola (70 mg, 0.050 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) dodatim preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

2

Procedura standardnog kuplovanja:

[0288] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 putakao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0289] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja prilagođenih aminokiselina:

[0290] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Sinteza je pauzirana pomoću Simphony softvera kako bi se dodala manuelno u reakcioni sud prilagođena aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim je ponovo započeta automatizacija: dodati HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 300 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana šest puta kao što sledi sa DMF-om (2.5 mL) koji je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32.5 mL) smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku. Symphony Metoda B:

[0291] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Symphony uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u Simphony polipropilenskoj epruveti opremljenoj sa fritom na dnu. Epruveta se vezuje za Symphony uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. Svi rastvarači, DMF, DCM, aminokiseline i reagensi su dodoati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2 gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 15 sekundi. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja.

4

HATU rastvor su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HCTU = 2-(6-Hloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; NMM= n-Metil morfolin; DIPEA = diizopropiletilamin; Sieber = Fmoc-amino-ksanten-3-iloksi, gde "3-iloksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola koja je korišćena je Merrifield smola (polistiren) sa Sieber veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.71 mmol/g punjenje. Druge uobičajene smole osetljive na kiselinu takođe mogu biti korišćene u sintezi kao što su Rink ili funkcionalizovana Hloro tritil Smola. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0292] Procedure iz "Symphony Metode B" opisuje eksperiment izveden na 0.050 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 70 mg Sieber-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure mogu biti skalirane preko 0.050 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "proceduru standardnog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru B kuplovanja sekundarnog amina", prilagođene aminokiseline su kuplovane preko manuelne adicije probe aminokiseline "Procedure kuplovanja prilagođenih aminokiselina " opisane ispod, i hloroacetil anhidrid je dodat na finalnu poziciju sekvence korišćenjem "procedure finalnog kaptiranja" opisane ispod.

Procedura bubrenja:

[0293] U Symphony polipropilenski sud za čvrstu fazu je dodata Merrifield: Sieber smola (70 mg, 0.050 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) dodatim preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura standardnog kuplovanja:

[0294] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2.5 mL) smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja sekundarnog amina:

[0295] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) koji je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32.5 mL) smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja prilagođenih aminokiselina:

[0296] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Sistem je pauziran pomoću sistema za manuelnu adiciju prilagođene aminokiseline u reakcioni sud (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), zatim je automatizacija je ponovo započeta kako bi se dodala reakciji vezikula HATU (0.2M u DMF-u, 1.25 mL, 5 ekv), i konačno NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32.5 mL) smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura finalnog kaptiranja:

[0297] Smola je isprana tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.5 mL) nakon čega je smeša periodično uzburkavana propuštanjem mehurića N2 sa dna reakcionog suda tokom 30 sekundi pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.5 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 2.5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv) praćeno sa dodavanjem anhidrida hlorosirćetne kiseline (0.4M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sa DMF-om (6.25 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat NMM (0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv) praćeno sa dodavanjem anhidrida hlorosirćetne kiseline (0.4M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 6 puta kao što sledi: DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat Ac2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32.5 mL) smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DCM (2.5 mL) je dodat preko dna suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je zatim osušena sa strujom azota tokom 10 minuta.

Metoda A globalne deprotekcije:

[0298] Sve manipulacije su izvedene manuelno ukoliko nije naznačeno drugačije. Procedura iz "Metode A globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:voda:triizopropilsilan:ditiotreitol (92.5:2.5:2.5:2.5 v:v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u špric od 25 mL opremljen sa fritom. U špric je dodat "rastvor za deprotekciju" (5.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 85 min. Rastvor je filtiran kroz, koncentrovan i razblažen u dietil etru (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Metoda B globalne deprotekcije:

[0299] Sve manipulacije su izvedene manuelno ukoliko nije naznačeno drugačije. Procedura iz "Metode B globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.04 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana preko 0.04 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan (96:4; v:v). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u špric od 10 mL opremljen sa fritom. U špric je dodat "rastvor za deprotekciju" (2.0-3.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 1 h ili 1.5 h. Rastvor je filtriran kroz, ispran sa rastvorom za deprotekciju (0.5 mL), koncentrovan i razblažen u dietil etru (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Metoda C globalne deprotekcije:

[0300] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Metode C globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u Bio-Rad epruvetu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za deprotekciju" (4.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 60 minuta. Rastvor je filtiran kroz i rastvoren u dietil etru (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Metoda D globalne deprotekcije:

[0301] Sve manipulacije su izvedene manuelno ukoliko nije naznačeno drugačije. Procedura iz “Metode B globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (94:3:3 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u špric od 25 mL opremljen sa fritom. U špric je dodat "rastvor za deprotekciju" (5.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 5 minuta. Rastvor je filtiran kroz i rastvoren u dietil etru (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Metoda E globalne deprotekcije:

[0302] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Metode E globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Fmoc Gly-ClTrt veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u Bio-Rad epruvetu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za deprotekciju" (2.0 mL). Smeša je izmešan u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za deprotekciju" (2.0 mL). Smeša je izmešan u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. U Bio-Rad epruvetu je dodat "rastvor za deprotekciju" (2.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 3 minuta. Rastvor je filtriran, i sakupljen u epruveti za centrifugu. Rastvor u epruveti za centrifugu je ostavljen da odstoji tokom 60 minuta. Sakupljen rastvor je zatim razblažen sa dietil etrom (30 mL), i precipitat formiran. Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Metoda F globalne deprotekcije:

[0303] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Metode F globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen korišćenjem trifluorosirćetna kiselina:triizopropilsilan:ditiotreitol (95:2.5:2.5 v:v:m). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u Bio-Rad epruvetu od 6 ml. U Bio-Rad je dodat "rastvor za deprotekciju" (4.0 mL). Smeša je izmešana u šejkeru tokom 90 minuta. Rastvor je filtiran kroz i rastvoren u dietil etru (30 mL). Precipitirana čvrsta supstanca je centrifugirana tokom 3 minuta. Rastvor supernatanta je dekantovan i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta

1

supstanca je ponovo suspendovana dietil etar (25 mL). Suspenzija je centrifugirana tokom 3 minuta. Supernatant je dekantovan i preostala čvrsta supstanca je osušena pod visokim vakuumom. Sirovi peptid je dobijen kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Ciklizaciona metoda A

[0304] Sve manipulacije su izvedene manuelno ukoliko nije naznačeno drugačije. Procedura iz “Ciklizacione metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 8M Guanidin/50mM TRIS (1:3) (pH 8.6) (7 mL:18 mL ili sličan odnos), i rastvor je zatim podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M), ako je neophodno. Rastvor je zatim izmešan korišćenjem šejkera tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda C:

[0305] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Ciklizacione metode C" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 0.1M amonijum bikarbonatni pufer (11 mL:24 mL ili sličan odnos), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim izmešan korišćenjem šejkera tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda D:

[0306] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Ciklizacione metode D" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u

2

proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru acetonitril:vodeni 0.1M amonijum bikarbonatni pufer (11 mL:24 mL), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim izmešan uz mešanje tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u acetonitril:voda. Rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda E:

[0307] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Ciklizacione metode E" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u rastvoru vodenog 6M gvanidin HCl pufera (15 mL), rastvor je zatim izmešan uz mešanje tokom 12 do 18 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan i 15 mL DMSO je dodato u ostatak dajući gustu masu koja je filtrirana. Ovaj filtriran rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Procedura A manuelnog kuplovanja:

[0308] U Bio-Rad reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je periodično mućkana tokom 5 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno pet puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je mućkana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (1.2-10 ekvivalenata) tipična (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), zatim HATU (1.210 ekvivalenata) tipičan (0.2M u DMF-u, 2.5 mL, 5 ekv), i konačno DIPEA (2.4- 20 ekvivalenata)tipičan(0.8M u DMF-u, 1.25 mL, 10 ekv). Smeša je mućkana tokom 60 minuta do 18 sati, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (4.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je mućkana tokom 60 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu.

Metoda A N-metilacije na-smoli. (Turner, R. A.; Hauksson, N. E.; Gipe, J. H.;Lokey, R. S. Org. Lett.2013, 15(19), 5012-5015):

[0309] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz "Metode A N-metilacije na smoli" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Sieber veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom.

[0310] Smola je prebačena u fritovan špric od 25 mL. U smolu je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana 3 puta sa DMF-om (4.0 mL). U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 4.0 mL). Smeša je mućkana tokom 3 min. i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF-om (4.0 mL) i tri puta sa DCM-om (4.0 mL). Smola je suspendovana u DMF-u (2.0 mL) i ETIL TRIFLUOROACETAT (0.119 ml, 1.00 mmol), 1,8-DIAZABICIKLO[5.4.0]UNDEC-7-EN (0.181 ml, 1.20 mmol). Smeša je postavljena na šejker tokom 60 min. Rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF-om (4.0 mL) i tri puta sa DCM-om (4.0 mL).

[0311] Smola je isprana tri puta sa suvim THF-om (2.0 mL) da bi se uklonila bila kakva preostala voda. U bočicu od 4.0 mL osušenu u rerni je dodat THF (1.0 mL) i TRIFENILFOSFIN (131 mg, 0.500 mmol) preko suvih molekularnih sita od 4 Å (20 mg). Rastvor je prebačen na smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min. Rastvor je dreniran kroz fritu i Smola je isprana tri puta sa suvim THF-om (2.0 mL) da bi se uklonila bila kakva preostala voda. U bočicu od 4.0 mL osušenu u rerni je dodat THF (1.0 mL), TRIFENILFOSFIN (131 mg, 0.500 mmol) preko suvih molekularnih sita od 4 Å (20 mg). Rastvor je prebačen na smolu i diizopropil azodikarboksilat (0.097 mL, 0.5 mmol) je dodat polako. Smola je mešana tokom 15 min. Rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF-om (4.0 mL) i tri puta sa DCM-om (4.0 mL). Smola je suspendovana u Etanolu (1.0 mL) i THF-u (1.0 mL), i NATRIJUM BOROHIDRID (37.8 mg, 1.000 mmol) je dodat. Smeša je mešana tokom 30 min. i drenirana. Smola je isprana sukcesivno tri puta sa DMF-om (4.0 mL) i tri puta sa DCM-om (4.0 mL).

Mikrocepanje A:

[0312] U mali < 10 mg uzorak smole se doda 2 kapi TIS i 1 mL triflourosirćetne kiseline, promućka na sobnoj temperaturi. Nakon 1 h, uklonjen je mali alikvot i razblažen sa 0.5 mL acetonitrila, filtriran, i izvedena je analiza pomoću LC-MS.

4

Pripremanje Primera 1001

[0313]

[0314] Primer 1001 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem opštih sintetičkih procedura:

Fmoc-Gly-OH "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole" je praćena Fmoc-Cys(Trt)-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-Arg(Pbf)-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-nMetil-Nle-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-nMetil-Nle-OH "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", je praćena

Fmoc-Trp(Boc)-OH "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", je praćena

Fmoc-Ser(tBu)-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-Trp(Boc)-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja " je praćena

Fmoc-Ciklopenti-Gly-OH "Procedura A manuelnog kuplovanja " je praćena Fmoc-Leu-OH "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", je praćena

Fmoc-His(Trt)-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-Pro-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena Fmoc-Asn(Trt)-OH "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", je praćena

Fmoc-nMetil-Ala-OH "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja" je praćena

Fmoc-Phe-OH "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina" je praćena

"Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja" je praćena

"Metoda F globalne deprotekcije" je praćena

"Ciklizaciona metoda D" je praćena

[0315] Sirovi materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-65% B preko 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 6.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 947.2 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.57 min; ESI-MS(+) m/z 946.7 (M+2H).

Pripremanje referentnog primera 1002

[0316]

[0317] Primer 1002 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem opšteg sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1001, sačinjenog od sledećih opštih procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja ", "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Procedura A manuelnog kuplovanja", "Symphony Metoda B: Procedura finalnog kaptiranja", "Metoda F globalne deprotekcije", i "Ciklizaciona metoda D".

[0318] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B preko 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 6.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.60 min; ESI-MS(+) m/z 934.0 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.52 min; ESI-MS(+) m/z 933.9 (M+2H).

Pripremanje referentnog primera 1003

[0319]

[0320] Primer 1003 je pripremljen na Rink Smoli praćenjem opšteg sintetičkog niza opisanog za pripremanje Primera 1001, sačinjenog od sledećih opštog procedura: "Symphony Metoda B: Procedura bubrenja smole", "Symphony Metoda B: Procedura standardnog kuplovanja ", "Symphony Metoda B: Procedura kuplovanja sekundarnog amina", "Procedura A manuelnog kuplovanja", "Symphony Metoda B:

Procedura finalnog kaptiranja", "Metoda F globalne deprotekcije", i "Ciklizaciona metoda D".

[0321] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-65% B preko 25 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Analiza LCMS Uslov D: Vreme zadržavanja = 1.58 min; ESI-MS(+) m/z 926.7 (M+2H).

Analiza LCMS Uslov E: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 926.2 (M+2H).

Jedinjenje 5001 Analitički podaci:

[0322] Masena spektrometrija: "ESI-MS(+)" označava elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-MS(-)" označava elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u negativnom jonskom modu; "ESI-HRMS(+)" označava visoko-rezolucionu elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u pozitivnom jonskom modu; "ESI-HRMS(-)" označava visoko-rezolucionu elektrosprej jonizacionu masenu spektrometriju izvedenu u negativnom jonskom modu. Detektovane mase su prijavljene nakon "m/z" jedinične oznake. Jedinjenja sa tačnim masama većim od 1000 su često detektovane kao dvostruko-naelektrisani ili trostruko-naelektrisani joni.

Jedinjenje 5001 Analiza uslov A:

[0323] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 1 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm. Jedinjenje 5001 Analiza uslov B:

[0324] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetatom; Temperatura: 50 °C; Gradijent: 0%B, 0-100% B tokom 3 minuta, zatim 0.5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 0.5 mL/min; Detekcija: UV na 220 nm.

Pripremanje Primera 5001

[0325]

[0326] Primer 5001 je pripremljen kao što sledi. U polipropilenski reakcioni sud od 10 mL za čvrstu fazu je dodata Rink-Merrifield smola (178 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude uređaj za sintezu peptida. "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena. Zatim serija aminokiselinskih kuplovanja je sekvencijalno izvedena na Prelude praćenjem "Prelude Metode A: Procedure jednostrukog kuplovanja" ako N-terminus peptida vezanog za smolu je primarni amin ili "Prelude Metode A: Procedure dvostrukog kuplovanja" ako je N-terminus peptida vezanog za smolu bio sekundarni amin. "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida" je praćena; zatim "Metoda A globalne deprotekcije" je praćena; zatim "Ciklizaciona metoda A" je praćena. Kao što je naznačeno, 1-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)ciklopropankarboksilna kiselina (Fmoc-AcPc-OH) je korišćena u sintezi. Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 10-50% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 2.10 min; ESI-MS(+) m/z 888.3 (M-2H).

Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.85 min; ESI-MS(+) m/z 890.5 (M+2H).

[0327] Svi primeri prikazani ispod su pripremljeni pomoću gorepomenutog "Opšteg sintetičkog niza A"

Opšti sintetički niz A:

[0328] "Opšti sintetički niz A" opisuje opšti niz procedura koje su korišćene da bi se dobili ciklični peptidi opisani ovde. U svrhe ove opšte procedure, procedure iz "Symphony Metode A" su zamenljive sa onima iz "Prelude Metode A". U polipropilenski sud od 10 mL za čvrstu fazu je dodata Rink-Merrifield smola (178 mg, 0.100 mmol), i reakcioni sud je postavljen na Prelude uređaj za sintezu peptida. "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole" je praćena. zatim serija aminokiselinskih kuplovanja je sekvencijalno izvedena na Prelude praćenjem "Prelude Metode A: Procedure jednostrukog kuplovanja" ako je N-terminus peptida vezanog za smolu primarni amin ili "Prelude Metode A: Procedure dvostrukog kuplovanja" ako je N-terminus peptida vezanog za smolu sekundarni amin. "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida" je praćena; zatim "Metoda A globalne deprotekcije" je praćena; zatim "Ciklizaciona metoda A" je praćena.

Opšte procedure:

Prelude Metoda A:

[0329] Sve manipulacije su izvedene pod automatizacijom na Prelude uređaju za sintezu peptida (Protein Technologies). Sve procedure su ukoliko nije navedeno izvedene u polipropilenskoj epruveti od 10 mL opremljenoj sa fritom na dnu; gde skala reakcije je prekoračila 0.100 mmol, polipropilenska epruveta od 40 mL je opremljena sa fritom na dnu je korišćena. Epruveta se vezuje za Prelude uređaj za sintezu peptida i preko dna i preko vrha epruvete. DMF i DCM mogu biti dodati kroz vrh epruvete, što spira stranice epruvete jednako. Preostali reagensi su dodati kroz dno epruvete i propušteni kroz fritu da stupe u kontakt sa smolom. Svi rastvori su uklonjeni kroz dno epruvete. "Periodično uzburkavanje" opisuje kratak puls N2gasa kroz fritu na dnu; puls traje približno 5 sekundi i javlja se svakih 30 sekundi. Rastvori hloroacetil hlorida u DMF-u su korišćeni u okviru 24h od pripremanja. Aminokiselinski rastvori se generalno ne koriste posle tri nedelje od pripremanja. HATU rastvori su korišćeni u okviru 5 dana od pripremanja. DMF = dimetilformamid; HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; DIPEA = diizopropiletilamin; Rink = (2,4-dimetoksifenil)(4-alkoksifenil)metanamin, gde "4-alkoksi" opisuje poziciju i tip povezivanja za polistirensku smolu. Smola korišćena je Merrifield polimer (polistiren) sa Rink veznikom (Fmoc-zaštićen na azotu); 100-200 “mesh”-a, 1% DVB, 0.56 mmol/g punjenje. Uobičajene aminokiseline koje su korišćene su navedene ispod sa zaštitnim grupama bočnih lanaca navedenim unutar zagrada. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

[0330] Procedure iz “Prelude Metode A" opisuju eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Ova skala odgovara približno 178 mg Rink-Merrifield smole opisane iznad. Sve procedure se mogu skalirati van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Pre aminokiselinskog kuplovanja, sve serije sinteze peptida počele su sa procedurom bubrenja smole "Procedura bubrenja smole". Kuplovanje aminokiselina za primarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru jednostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje aminokiselina za sekundarni aminski N-terminus koristilo je "Proceduru dvostrukog kuplovanja" opisanu ispod. Kuplovanje hloroacetilhlorida za N-terminus peptida je opisano pomoću "Procedure kuplovanja hloroacetil hlorida" detaljno izložene ispod.

Procedura bubrenja smole:

[0331] U polipropilenski reakcioni sud od 10 mL za čvrstu fazu je dodata Merrifield:Rink smola (178 mg, 0.100 mmol). Smola je isprana (nabubrela) tri puta kao što sledi: u reakcioni sud je dodat DMF (2.0 mL), nakon čega je smeša periodično uzburkavana tokom 10 minuta pre nego što je rastvarač dreniran kroz fritu.

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0332] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat anhidrit

1

sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[0333] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodata aminokiselina (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), zatim HATU (0.2M u DMF-u, 1.0 mL, 2 ekv), i konačno DIPEA (0.8M u DMF-u, 0.5 mL, 4 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 15 minuta, zatim reakcioni rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je dva puta isprana kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat anhidrid sirćetne kiseline (2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 10 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je korišćena direktno u sledećem koraku.

Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida:

[0334] U reakcioni sud koji sadrži smolu iz prethodnog koraka je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat piperidin:DMF (20:80 v/v, 2.0 mL). Smeša je periodično uzburkavana tokom 3 minuta i zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je

2

isprana sukcesivno šest puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat kroz vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 30 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. U reakcioni sud je dodat DIPEA (0.8M u DMF-u, 3.0 mL, 24 ekv), zatim hloroacetil hlorid (0.8M u DMF-u, 1.65 mL, 13.2 ekv). Smeša je periodično uzburkavana tokom 30 minuta, zatim rastvor je dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno tri puta kao što sledi: za svako ispiranje, DMF (2.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Smola je isprana sukcesivno četiri puta kao što sledi: za svako ispiranje, CH2Cl2(2.0 mL) je dodat na vrh suda i rezultujuća smeša je periodično uzburkavana tokom 90 sekundi pre nego što je rastvor dreniran kroz fritu. Rezultujuća smola je postavljena pod struju N2tokom 15 minuta.

Symphony Metoda A:

[0335] Ova grupa procedura je identična onoj iz "Prelude Metode A" osim kako je navedeno. Za sve procedure Symphony X uređaj za sintezu peptida (Protein Technologies) je korišćen umesto Prelude uređaja za sintezu peptida i svi reagensi su korišćeni kroz vrh reakcionog suda.

Procedura bubrenja smole:

[0336] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura bubrenja smole".

Procedura jednostrukog kuplovanja:

[0337] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura jednostrukog kuplovanja" osim što je koncentracija DIPEA rastvora bila 0.4M i 1.0 mL ovog rastvora je oslobođen u reakciju.

Procedura dvostrukog kuplovanja:

[0338] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura dvostrukog kuplovanja" osim što je koncentracija DIPEA rastvora bila 0.4M i 1.0 mL ovog rastvora je oslobođen u reakciju.

Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida:

[0339] Ova procedura je identična kao "Prelude Metoda A: Procedura kuplovanja hloroacetil hlorida".

Metoda A globalne deprotekcije:

[0340] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Metode A globalne deprotekcije" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Rink veznika vezanog za smolu. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. "Rastvor za deprotekciju" je pripremljen kombinovanjem u staklenoj bočici od 40 mL sa trifluorosirćetnom kiselinom (22 mL), fenolom (1.325 g), vodom (1.25 mL) i triizopropilsilanom (0.5 mL). Smola je uklonjena iz reakcionog suda i prebačena u staklenu bočicu od 4 mL. U bočicu je dodat "rastvor za deprotekciju" (2.0 mL). Smeša je snažno izmešana u šejkeru (1000 RPM tokom 1 minuta, zatim 500 RPM tokom 1-2h). Smeša je filtrirana koz špric filter od 0.2 mikrona i čvrste supstance su ekstrakovane sa "rastvorom za deprotekciju" (1.0 mL) ili TFA (1.0 mL). U test epruvetu od 24 mL napunjenu sa kombinovanim filtratima je dodat Et2O (15 mL). Smeša je snažno izmešana nakon čega je značajna količina bele čvrste supstance precipitirala. Smeša je centrifugirana tokom 5 minuta, zatim rastvor je dekantovan od čvrste supstance i odbačen. Čvrste supstance su suspendovane u Et2O-u (20 mL); zatim smeša je centrifugirana tokom 5 minuta; i rastvor je dekantovan od čvrste supstance i odbačen. Poslednji put, čvrste supstance su suspendovane u Et2O (20 mL); smeša je centrifugirana tokom 5 minuta; i rastvor je dekantovan od čvrste supstance i odbačen da se dobije sirov peptid kao bela do prljavo bela čvrsta supstanca.

Ciklizaciona metoda A:

[0341] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Ciklizacione metode A" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Rink veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u MeCN:vod.

0.1M NH4OAc (30mL:30mL), i rastvor je zatim pažljivo podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim ostavljen da stoji bez mešanja tokom 12-18h. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u DMSO:MeOH. Rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Ciklizaciona metoda B:

[0342] Sve manipulacije su izvršene manuelno osim ako nije navedeno. Procedura iz “Ciklizacione metode B" opisuje eksperiment izveden na 0.100 mmol skali, gde skala je određena količinom Rink veznika vezanog za smolu koji je korišćen kako bi se generisao peptid. Skala nije zasnovana na direktnoj determinaciji kvantiteta peptida korišćenog u

4

proceduri. Procedura može biti skalirana van 0.100 mmol skale podešavanjem opisanih volumena višestrukom skalom. Sirove peptidne čvrste supstance su rastvorene u MeCN:vod.

0.1M NH4OAc (1:1) do ukupne zapremine od 18-22 mL, i rastvor je pažljivo zatim podešen do pH = 8.5-9.0 korišćenjem vod NaOH (1.0M). Rastvor je zatim ostavljen da odstoji bez mešanja tokom 12-18h. Reakcioni rastvor je koncentrovan i ostatak je zatim rastvoren u DMSO:MeOH. Rastvor je podvrgnut prečišćavanju pomoću HPLC na reverznoj fazi da se dobije željeni ciklični peptid.

Pripremanje Primera 9001

[0343]

Primer 9001

[0344] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 19.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.62 min; ESI-MS(+) m/z 963.4 (M+2H). Analiza uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 963.8 (M+2H). Pripremanje Primera 9002

[0345]

Primer 9002

[0346] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 24.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.63 min; ESI-MS(+) m/z 954.75 (M+2H). Analiza uslov B: Vreme zadržavanja = 3.11 min; ESI-MS(+) m/z 954.25 (M+2H).

Pripremanje Primera 9003

[0347]

Primer 9003

[0348] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 35.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 964.3 (M+2H). Analiza uslov B: Vreme zadržavanja = 2.84 min; ESI-MS(+) m/z 964.1 (M+2H). Pripremanje Primera 9004

[0349]

Primer 9004

[0350] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 23.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.48 min; ESI-MS(+) m/z 956.0 (M+2H). Analiza uslov B: Vreme zadržavanja = 2.67 min; ESI-MS(+) m/z 955.7 (M+2H). Pripremanje Primera 9005

[0351]

Primer 9005

[0352] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 18.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.64 min; ESI-MS(+) m/z 901.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9006

[0353]

Primer 9006

[0354] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 40.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.59 min; ESI-MS(+) m/z 900.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9007

[0355]

Primer 9007

[0356] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-90% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters CSH C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 19.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.95 min; ESI-MS(+) m/z 907.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9008

[0357]

Primer 9008

[0358] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 14.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.90 min; ESI-MS(+) m/z 906.6 (M+2H).

Pripremanje Primera 9009

[0359]

1

Primer 9009

[0360] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-80% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 5-45% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 2.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 91%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 901.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9011

[0361]

1 1

Primer 9011

[0362] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-85% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 29.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 98%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 914.8 (M+2H).

Pripremanje Primera 9012

[0363]

1 2

Primer 9012

[0364] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 40-85% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 16.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.97 min; ESI-MS(+) m/z 914.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9013

[0365]

Primer 9013

[0366] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 45-85% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne

1

evaporacije. Prinos proizvoda je 21.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.78 min; ESI-MS(+) m/z 901.4 (M+2H).

Pripremanje Primera 9014

[0367]

Primer 9014

[0368] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 50-90% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 35.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 900.2 (M+2H).

Pripremanje Primera 9015

[0369]

1 4

Primer 9015

[0370] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 15-55% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 15.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.56 min; ESI-MS(+) m/z 914.3 (M+2H).

Pripremanje Primera 9016

[0371]

1

Primer 9016

[0372] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: waters CSH c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 15-55% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 17.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 94%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 938.1 (M+2H).

Pripremanje Primera 9017

[0373]

Primer 9017

[0374] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Materijal je dalje prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: Waters CSH C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 25-65% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene

1

preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 20.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 927.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 9018

[0375]

Primer 9018

[0376] Sirov materijal je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: waters CSH c-18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 0.1% trifluorosirćetnom kiselinom; Gradijent: 20-60% B preko 30 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 4.8 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 96%. Analiza uslov A: Vreme zadržavanja = 184 min; ESI-MS(+) m/z 951.9 (M+2H).

Pripremanje Primera 10001

[0377]

1

Primer 10001

[0378] Sirov materijal Primera 10001 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 16.5 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 95%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.82 min; ESI-MS(+) m/z 962.8 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 962.8 (M+2H). Pripremanje Primera 10002

[0379]

1

Primer 10002

[0380] Sirov materijal Primera 10002 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 3.9 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.81 min; ESI-MS(+) m/z 970.9 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.98 min; ESI-MS(+) m/z 970.8 (M+2H). Pripremanje Primera 10003

[0381]

1

Primer 10003

[0382] Sirov materijal Primera 10003 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 33.4 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.76 min; ESI-MS(+) m/z 957.0 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 956.8 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.9633 (M+2H); Nađeno: 955.9610 (M+2H).

Pripremanje Primera 10004

[0383]

11

Primer 10004

[0384] Sirov materijal Primera 10004 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 17.2 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.72 min; ESI-MS(+) m/z 964.8 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.97 min; ESI-MS(+) m/z 964.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.9607 (M+2H); Nađeno: 963.9581 (M+2H).

Pripremanje Primera 10005

[0385]

Primer 10005

[0386] Sirov materijal Primera 10005 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 10.0 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.65 min; ESI-MS(+) m/z 956.6 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.87 min; ESI-MS(+) m/z 956.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.9633 (M+2H); Nađeno: 955.9601 (M+2H).

Pripremanje Primera 10006

[0387]

Primer 10006

[0388] Sirov materijal Primera 10006 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 12.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.61 min; ESI-MS(+) m/z 965.1 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.85 min; ESI-MS(+) m/z 965.0 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 963.9580 (M+2H); Nađeno: 963.9607 (M+2H).

Pripremanje Primera 10007

[0389]

11

Primer 10007

[0390] Sirov materijal Primera 10007 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 13.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.51 min; ESI-MS(+) m/z 956.7 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.66 min; ESI-MS(+) m/z 956.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 955.4801 (M+2H); Nađeno: 955.4766 (M+2H).

Pripremanje Primera 10008

[0391]

Primer 10008

[0392] Sirov materijal Primera 10008 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 16.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 100%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.73 min; ESI-MS(+) m/z 971.8 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.96 min; ESI-MS(+) m/z 971.7 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 970.9686 (M+2H); Nađeno: 970.9667 (M+2H).

Pripremanje Primera 10009

[0393]

11

Primer 10009

[0394] Sirov materijal Primera 10009 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 44.3 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 97%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.67 min; ESI-MS(+) m/z 963.2 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.86 min; ESI-MS(+) m/z 963.3 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 962.4880 (M+2H); Nađeno: 962.4857 (M+2H).

Pripremanje Primera 10010

[0395]

11

Primer 10010

[0396] Sirov materijal Primera 10010 je prečišćen preko preparativne LC/MS sa sledećim uslovima: Kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5-µm čestice; Mobilna faza A: 5:95 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Mobilna faza B: 95:5 acetonitril: voda sa 10-mM amonijum acetatom; Gradijent: 20-60% B preko 15 minuta, zatim 5-minutno zadržavanje na 100% B; Protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i osušene preko centrifugalne evaporacije. Prinos proizvoda je 31.1 mg, i njegova procenjena čistoća pomoću LCMS analize je bila 99%.

Uslov A analize: Vreme zadržavanja = 1.71 min; ESI-MS(+) m/z 955.2 (M+2H). Uslov B analize: Vreme zadržavanja = 2.89 min; ESI-MS(+) m/z 955.4 (M+2H). ESI-HRMS(+) m/z: Izračunato: 954.4905 (M+2H); Nađeno: 954.4881 (M+2H).

METODE ZA TESTIRANJE SPOSOBNOSTI MAKROCIKLIČNIH PEPTIDA DA KOMPETIRAJU ZA VEZIVANJE PD-1 ZA PD-L1 KORIŠĆENJEM TESTOVA VEZIVANJA POMOĆU HOMOGENE VREMENSKI-RAZLUČIVE FLUORESCENCE (HTRF)

[0397] Sposobnost makrocikličnih peptida predmetne objave da se vežu za PD-L1 je ispitana korišćenjem testa vezivanja PD-1/PD-L1 pomoću homogene vremenski razlučive fluorescencije (HTRF).

Metode

[0398] Testovi vezivanja pomoću homogene vremenski razlučive fluorescencije (HTRF) solubilnog PD-1 za solubilni PD-L1. Solubilni PD-1 i solubilni PD-L1 odnose se na proteine sa skraćivanjima na karboksil-kraju koja uklanjaju transmembranske regione i fuzionisani su

11

za heterologne sekvence, specifično za Fc deo sekvence humanog imunoglobulina G (Ig) ili heksahistidinsku epitopsku oznaku (His). Sve studije vezivanja su izvedene u HTRF test puferu koji se sastoji od dPBS obogaćenog sa 0.1% (m/v) goveđim serumskim albuminom i 0.05% (v/v) Tween-20. Za test vezivanja PD-1-Ig/PD-L1-His, inhibitori su prethodno inkubirani sa PD-L1-His (10 nM finalno) tokom 15m u 4 µl test pufera, praćeno sa dodavanjem PD-1-Ig (20 nM finalno) u 1 µl test pufera i daljom inkubacijom tokom 15m. PD-L1 fuzioni proteini iz ili čoveka, cinomolgus majmuna, miša, ili druge vrste su korišćeni. HTRF detekcija je postignuta korišćenjem europijum kriptatom-obeleženog anti-Ig monoklonskog antitela (1 nM finalno) i alofikocijaninom (APC) obeleženog anti-His monoklonskog antitela (20 nM finalno). Antitela su razblažena u HTRF puferu za detekciju i 5 µl je distribuirano na vrhu reakcije vezivanja. Reakcija je ostavljena da se dovede u ravnotežu tokom 30 minuta i signal (665nm/620nm ratio) je dobijen korišćenjem EnVision fluorometra. Dodatni testovi vezivanja su uspostavljeni između PD-1-Ig/PD-L2-His (20 i 5 nM, redom), CD80-His/PD-L1-Ig (100 i 10 nM, redom) i CD80-His/CTLA4-Ig (10 i 5 nM, redom). Studije vezivanja/kompeticije između biotinilovanog Jedinjenja br. 71 i humanog PD-L1-His su izvedene kao što sledi. Inhibitori makrocikličnih peptida su prethodno inkubirani sa PD-L1-His (10 nM finalno) tokom 60 minuta u 4 µl test pufera praćeno sa dodavanjem biotinilovanog Jedinjenja br. 71 (0.5 nM finalno) u 1 µl test pufera. Vezivanje je ostavljeno da se dovede u ravnotežu tokom 30 minuta praćeno sa dodavanjem europijum kriptatom obeleženog Streptavidina (2.5 pM finalno) i APC-obeleženog anti-His (20 nM finalno) u 5 µl HTRF pufera. Reakcija je ostavljena da ekvilibriše tokom 30m i signal (665nm/620nm odnos) je dobijen korišćenjem EnVision fluorometra.

[0399] Rekombinantni Proteini. Karboksil-skraćen humani PD-1 (aminokiseline 25-167) sa C-terminalnom epitopskom oznakom humanog Ig [hPD-1 (25-167)-3S-IG] i humani PD-L1 (aminokiseline 18-239) sa C-terminalnom His epitopskom oznakom [hPD-L1(19-239)-virusa šarenila nerava duvana proteazno mesto cepanja (TVMV)-His] su eksprimirani u HEK293T ćelijama i prečišćeni sekvencijalno pomoću rekombinantne Protein A afinitetne hromatografije i ekskluzione hromatografije po veličini. Humani PD-L2-His (Sino Biologicals), CD80-His (Sino Biologicals), CTLA4-Ig (RnD Systems) su svi dobijeni preko komercijalnih izvora.

[0400] Sekvenca humanog rekombinantnog PD-1-Ig

hPD1(25-167)-3S-IG

11

(SEK ID BR:1)

[0401] Sekvenca humanog rekombinantnog PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His) hPDL1(19-239)-TVMV-His

(SEK ID BR:2)

[0402] Rezultati su prikazani u Tabeli 1. Kao što je prikazano, makrociklični peptidi predmetne objave su pokazali potentnu inhibiciju PD-1-Ig vezujuće aktivnosti za PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His). Opsezi su kao što sledi: A = 0.10-10 µM; B = 0.01-0.099 µM; C = 0.004 - 0.0099 µM.

Tabela 1

11

12

[0403] Prosečnom poznavaocu oblasti će biti očigledno da predmetna objava nije ograničena na gorepomenute ilustrativne primere, i da može biti izražena u drugim specifičnim oblicima bez udaljavanja od njihovih suštinskih atributa. Stoga je poželjno da se primeri razmatraju u svim aspektima kao ilustrativni a ne restriktivni, upućivanjem na priložene zahteve, više nego na gorepomenute primere.

LISTA SEKVENCI [0404]

��

��

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje odabrano od:

   ��

   ��

   �

   11

   ��

   �

   ��

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegova terapijski prihvatljiva so za primenu u poboljšanju, stimulisanju, i/ili povećavanju imunskog odgovora kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
3. 3. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 2 koja dalje sadrži administriranje dodatnog agensa pre, nakon, ili simultano sa jedinjenjem iz patentnog zahteva 1 ili njegovom terapijski prihvatljivom soli.
4. 4. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 3 gde dodatni agens je antimikrobni agens, antivirusni agens, citotoksični agens, i/ili modifikator imunskog odgovora.
5. 5. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 3 gde dodatni agens je HDAC inhibitor.
6. 6. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 3 gde dodatni agens je TLR7 i/ili TLR8 agonist 1
7. 7. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegova terapijski prihvatljiva so za primenu u inhibiranju rasta, proliferacije, ili metastaze kancerskih ćelija kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
8. 8. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 7 gde kancer je odabran od melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, skvamoznog nesitnoćelijskog kancera pluća (squamous non-small cell lung cancer - NSCLC), ne-skvamoznog NSCLC, kolorektalnog kancera, kancera prostate rezistentnog na kastraciju, kancera ovarijuma, kancera želuca, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, karcinoma jednjaka, gestrointestinalnog trakta i grudi, i hematoloških maligniteta.
9. 9. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegova terapijski prihvatljiva so za primenu u lečenju infektivne bolesti kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
10. 10. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 9 gde infektivna bolest je uzrokovana virusom.
11. 11. Jedinjenje ili terapijski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 10 gde je virus odabran od HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, herpes virusa, i influence.
12. 12. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegova terapijski prihvatljiva so za primenu u lečenju septičkog šoka kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.
13. 13. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegova terapijski prihvatljiva so za primenu u medicini. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1