RS57709B1 - Dozni režim fgf-18 jedinjenja - Google Patents

Description

Tehnička oblast pronalaska

Sadašnji pronalazak se odnosi na tretman poremećaja hrskavice i hrskavica/kosti, osteoartritisa i posebno povredu hrskavice. Konkretnije, odnosi se na FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema posebnim režimima tretmana. Specifično, obezbeđuje šeme tretmana koje sadrže unutar zglobna davanja svake 3 nedelje, 4 nedelje ili 5 nedelja FGF-18 jedinjenja po ciklusu tretmana. Dozni režim može dalje da se sastoji od davanja anti-inflamatornog leka sa dejstvima na simptome (bol i funkcija) kao što su anakinra ili diklofenak.

Stanje tehnike

Hrskavica je sastavljena od hondrocita (ćelije izvedene iz mezenhimalnih ćelija) koje se rasipaju u matricu (čvrsta, gelu-slična osnovna supstanca). Hrskavičava matrica se proizvodi od strane ovih ćelija i sadrži uglavnom Tip II kolagen vlakna (osim fibrohrskavice koja takođe sadrži tip I kolagen vlakna), proteoglikane, i elastin vlakna. Hrskavice se nalazi između ostalih mesta u zglobovima, grudnom košu, uhu, nosu, u grlu, u trahejama i u intervertebralnim (interkičmenim) diskovima. Postoje tri glavna tipa hrskavice: hijalin, elastik i fibrohrskavica, koja obezbeđuju primetno različita funkcionalna svojstva prema njihovoj histološkoj morfologiji. Zglobna hrskavica, na primer, je hijalin hrskavica, koja ima viskoelastična svojstva, pokrivajući zglobne površine kostiju. Glavna svrha zglobne hrskavice je da pruži glatke površine kako bi se obezbedilo kretanje zglobnih kostiju skoro bez trenja.

Poremećaji hrskavice široko gledano upućuju na bolesti koje se karakterišu degeneracijom / dezintegracijom hrskavice i abnormalnostima u vezivnim tkivima koje se manifestuju inflamacijom, bolom, krutošću i ograničenjem kretanja delova tela koji su pod tim uticajem. Ovi poremećaji mogu biti zbog patologije ili mogu biti rezultat traume ili povrede. Zrela hrskavica ima vrlo ograničenu sposobnost samo obnavaljanja, naročito zato što zreli hondrociti imaju mali potencijal proliferacije zbog ograničenog snabdevanja hranljivim materijama povezanim sa odsustvom krvnih sudova u hrskavici. Zamena oštećene hrskavice, posebno zglobne hrskavice, izazvane bilo povredom ili bolešću, je glavni izazov za lekare, i dostupne procedure hirurškog tretmana se smatraju nepredvidivim i efektivnim samo ograničeni vremenski period kod mlađih pacijenata bez osteoartritičnih promena. Prema tome, najveći broj pacijenata ili ne traži tretman ili se savetuju da odlože tretman što je moguće duže. Kada je neophodan tretman, standardna procedura je zavisna od starosti i varira između potpune ili delimične zamene zgloba, transplantacije delova hrskavice ili hondrocita ili tehnika stimulisanja srži (kao što je mikrofraktura). Mikrofraktura je jeftina i uobičajena procedura koja uključuje penetraciju subhondralne kosti da stimuliše taloženje hrskavice od strane koštane srži izvedene iz stem ćelija. Ipak, pokazano je da ova tehnika nedovoljno popravlja hondralni defekt i da je novo formirana hrskavica uglavnom fibrohrskavica, rezultirajući u kratkotrajnoj popravci tkiva. Zaista, fibrohrskavica nema iste biomehaničke osobine kao hijalin zglobna hrskavica i nedostaje joj često odgovarajuća lateralna (bočna) integracija u okružujuću hrskavicu. Iz ovog razloga, novo sintetizovana fibrohrskavica može se lakše oštetiti (očekivani vremenski okvir: 5-10 godina).

Za pacijente sa osteoartritisom (OA) sve ove tehnike popravke hrskavice su neuspešne. Preostali ne-hirurški tretman se sastoji naročito od fizikalne terapije, modifikacije životnog stila (npr., smanjenje telesne težine), upotrebe pomagala, oralnih lekova (npr. ne-steroidni anti-inflamatorni lekovi), ubrizgavanja lekova (npr. hijaluronske kiseline i kortikoida) i suplementacije ishrane. Svi ovi tretmani ne mogu da zaustave progresiju OA bolesti. Ukoliko terapija bola takođe ne uspe, operacija, kao što je zamena zgloba ili visoka tibijalna osteotomija za zglob kolena, je preostala opcija za ove pacijente. Tibijalne ili femoralne osteotomije (sečenje kosti da se izbalansira trošenje zgloba) mogu da umanje simptome, pomognu održavanje aktivnog životnog stila, i odlaganje potrebe za punom zamenom zgloba. Puna zamena zgloba može da obezbedi olakšanje simptoma uznapredovalog osteoartritisa, ali generalno zahteva značajnu promenu u životnom stilu i/ili nivou aktivnosti pacijenta.

Trenutno dostupni tretmani lekovima su uglavnom usmereni na oslobađanje od bola. Sve ovo vreme, ne postoji komercijalno dostupni tretman koji obnavlja oštećenja hrskavice (videti Lotz, 2010.god.).

Interleukin-1 alfa (IL-1α) i interleukin-1 beta (IL-1β) su prirodno nastali agonisti tipa I IL-1 receptora (IL-1RA). Za prekomernu ekspresiju proinflamatornih citokina, kao što je IL-1, je pokazano da igra glavnu ulogu u patogenezi imunoinflamatornih bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA) (Bingham, 2002) ili osteoartritis (OA) (Lee et al., 2013.god.). Istražena je primena kliničke primene antagonišućih IL-1α i IL-1β kod RA sa anakinrom (Kineret<TM>), rekombinantnim, ne-glikozilovanim iz humanog IL-1ra. Korišćenje ovog terapeutskog proteina je dovelo do smanjenja u frekvenciji i ozbiljnosti oštećenja zgloba kod pacijenata sa RA (Bresnihan, 2002; St. Clair, 2002), kao i do smanjenja bola (Mertens et al., 2009). Ovaj molekul je odobren 2001.godine za tretman nekih tipova RA. Iako je IL-1 takođe uključen u OA, Anakinra terapija nije značajno povezana sa poboljšanjima kod simptoma OA upoređeno sa placebom, iako je primećena tendencija ka smanjenju bola sa anakinra 150 mg spram placeba (Chevalier et al., 2009).

Fibroblast faktor rasta 18 (FGF-18) je član Fibroblast faktor rasta (FGF) familije proteina, blisko povezanih sa FGF-8 i FGF-17. Pokazano je da je FGF-18 proliferativno sredstvo za hondrocite i osteoblaste (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). FGF-18 je predložen za tretman poremećaja hrskavice kao što je osteoartritis i povreda hrskavice bilo samostalno (WO2008/023063) ili u kombinaciji sa hijaluronskom kiselinom (WO2004/032849).

Razni dozni režimi su sugerisani za FGF-18. Na primer, Moore et al. (2005) otkriva davanje dva puta nedeljno tokom 3 nedelje, a WO2008/023063 govori o davanju jedanput nedeljno tokom 3 nedelje. Ovaj poslednji dozni režim je istraživan u kliničkim probama (za više detalja videti na primer NCT01033994, NCT00911469 i NCT01066871).

Iako dozni režim opisan u WO2008023063 daje dobre rezultate kod popravke zglobne hrskavice, i dalje postoji rizik od akutnog sinovitisa. Iz ovog razloga, postoji potreba za postupkom za smanjenje rizika radi tretmana povezanog sa akutnim sinovitisom kao i za povećanjem pacijentove tolerancije unutar zglobnog ubrizgavanja, dok se istovremeno održava efikasnost tretmana poremećaja hrskavice, naročito putem proliferacije hondrocita i potonje popravke hrskavice. Takav postupak ne treba samo da dopusti popravku zglobne hrskavice, ukoliko je moguće uz odsustvo sinovitisa, već takođe da dopusti ponovo formiranje nove hrskavice koja ima dobre osobine (odnosno, uglavnom hijalin hrskavice). Zaista, generisanje navedene hijalin hrskavice je vredno kako kao terapeutsko sredstvo tako i kao komponenta za biološke matrice (Getgood et al., 2010). Postoji takođe potreba za postupkom smanjenja bola/poboljšanja funkcije, dok se istovremeno održava efikasnost tretmana poremećaja hrskavice. Zaista, bol nije samo vrlo često povezan sa poremećajima hrskavice već predstavlja vodeći simptom za kliničku detekciju ovih poremećaja.

Suština pronalaska

Otkriven je postupak tretiranja pacijenta koji ima poremećaj hrskavice koji se sastoji od davanja FGF-18 jedinjenja pri čemu se FGF-18 jedinjenje daje unutar-zglobno bar tri puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3 do 5 nedelja, poželjno sa mesec dana (mesečna davanja). U poželjnoj realizaciji navedena davanja su odvojena regularnim intervalom od oko 3, 4 ili 5 nedelja svako.

Poželjno, FGF-18 jedinjenje se daje u regularnim intervalima jedanput mesečno.

Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje FGF-18 jedinjenje za korišćenje u tretmanu pacijenata koji imaju poremećaj hrskavice gde se FGF-18 jedinjenje ima dati unutarzglobno bar tri puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3 do 5 nedelja, poželjno sa oko mesec dana (mesečna davanja). U poželjnoj realizaciji navedena davanja su odvojena regularnim intervalom od oko 3, 4 ili 5 nedelja svako. Poželjno, FGF-18 jedinjenje se daje u regularnim intervalima jedanput mesečno.

Poželjno, FGF-18 jedinjenje koje se daje je FGF-18 fragment ovde označen kao trFGF-18 (ili sprifermin) i posološki ciklus je 3 do 300 μg po unutar-zglobnom ubrizgavanju, jedanput mesečno tokom 3 uzastopna meseca (jedan ciklus tretmana).

U kontekstu sadašnjeg pronalaska kao celine, bilo koji tretman (ili bilo koji postupak tretmana) sa FGF-18 jedinjenjem može dalje da se sastoji od davanja antiinflamatornog leka sa efektima na simptome (bol i funkcija), kao što su anakinra ili diklofenak. Poželjno, takvo davanje se obavlja u isto vrema kada se daje i FGF-18 jedinjenje. Ukoliko je anti-inflamatorni lek neophodan, iz toga sledi da bi navedeni antiinflamatorni lek ima biti dat istovremeno sa FGF-18 jedinjenjem bar tri puta po ciklusu tretmana, gde bi navedena davanja bila odvojena sa oko 3 do 5 nedelja, poželjno sa oko mesec dana (mesečna davanja).

Poželjno je anti-inflamatorni lek anikinra ili diklofenak a posološki ciklus je 0,01 do 500 mg po davanju, jedanput mesečno tokom 3 uzastopna meseca (jedan ciklus tretmana).

U poželjnoj realizaciji takav ciklus tretmana (odnosno, FGF-18 jedinjenje samo ili u kombinaciji sa anti-inflamatornim lekom sa efektima na simptome (bol i funkcija)) može biti ponovljen nekoliko meseci nakon poslednjeg ubrizgavanja u prethodnom ciklusu tretmana, na primer, nakon 2, 4 ili 6 meseca ili čak nakon godinu dana.

U poželjnim realizacijama ovog pronalaska, poremećaj hrskavice koji se ima tretirati je artritis, kao što je osteoartritis ili povreda hrskavice sa ili bez hirurške intervencije kao što je mikrofraktura. Iznenađujuće je pronađeno da postupci i korišćenja sadašnjeg pronalaska značajno poboljšavaju popravku hrskavice i stimulišu proliferaciju hondrocita, a u međuvremenu, povećavaju toleranciju pacijenta na unutar zglobno ubrizgavanje. Dalje je iznenađujuće pronađeno da kada se anakinra ili diklofenak koriste zajedno sa FGF 18, moguće je efikasno obnoviti proliferativnu aktivnost FGF-18 jedinjenja. Sledeća prednost sadašnjeg pronalaska je da će sinovitis biti umanjen upoređeno sa primećenim kod drugih režima.

Definicije

- Pojam „FGF-18 jedinjenje“ ili „FGF-18“, kako se ovde koristi, ima nameru da bude protein koji održava bar jednu biološku aktivnost humanog FGF-18 proteina. FGF-18 može biti prirodan, u svom zrelom obliku, rekombinantni oblik ili njegov skraćeni oblik. Biološke aktivnosti humanog FGF-18 proteina uključuju značajno povećanje proliferacije hondrocita ili osteoblasta (videti WO98/16644) ili formiranja hrskavice (videti WO2008/023063). Prirodni, ili divljeg tipa, humani FGF-18 je protein koji se ekspresuje od strane hondrocita zglobne hrskavice. Humani FGF-18 je prvo naznačen kao zFGF-5 i u potpunosti je opisan u WO98/16644. SEQ ID NO:1 korespondira sa sekvencom amino kiseline prirodnog humanog FGF-18, sa signalnim peptidom koji sadrži ostatke amino kiseline 1(Met) do 27(Ala). Zreli oblik humanog FGF-18 korespondira sa sekvencom amino kiseline od ostatka 28(Glu) do ostatka 207(Ala) iz SEQ ID NO: 1 (180 amino kiselina).

FGF-18, u sadašnjem pronalasku, može biti proizveden rekombinantnim postupkom, kao što nam govori prijava WO2006/063362. U zavisnosti od sistema ekspresije i uslova, FGF-18 u sadašnjem pronalasku se ekspresuje u rekombinantnu ćeliju domaćina sa početnim Metionin (Met) ostatkom ili sa signalnom sekvencom za izlučivanje. Kada se ekspresuje u prokariotskog domaćina, kao što je E. Coli, FGF-18 sadrži dodatni Met ostatak na N-završetku njegove sekvence. Na primer, sekvenca amino kiseline humanog FGF-18, kada se ekspresuje u E. Coli, počinje sa Met ostatkom na N-završetku (pozicija 1) praćeno ostacima 28(Glu) do ostatka 207(Ala) iz SEQ ID NO: 1.

- Pojam „skraćeni oblik“ FGF-18, kako se ovde koristi, upućuje na protein koji se sastoji od ili sadrži ostatke 28(Glu) do 196(Lys) iz SEQ ID NO: 1. Poželjno, skraćeni oblik FGF-18 proteina je polipetid označen kao „trFGF-18“ (170 amino kiselina; takođe poznat kao rhFGF 18 ili sprifermin), koji započinje sa Met ostatkom (na N-završetku) praćeno sa osatcima amino kiseline 28 (Glu) – 196 (Lys) divljegtipa humanog FGF-18. Sekvenca amino kiseline trFGF-18 je prikazana u SEQ ID NO: 2 (ostaci amino kiseline 2 do 170 iz SEQ ID NO: 2 korespondira sa ostacima amino kiselina 28 do 196 iz SEQ ID NO: 1). trFGF-18 je rekombinantni skraćeni oblik humanog FGF-18, proizveden u E. Coli (videti WO2006/063362). Pokazano je za trFGF-18 da prikazuje slične aktivnosti kao zreli humani FGF-18, npr., povećava proliferaciju hondrocita i taloženje hrskavice što dovodi do popravke i rekonstrukcije različitih hrskavičavih tkiva (videti WO2008/023063).

- Pojmovi „anti-inflamatorni lek sa efektima na simptome (bol i funkcija)“ ili „antiinflamatorni lek“ kako se ovde koriste upućuju na anti-inflamatorni lek koji ima efekte na simptome povezane sa poremećajima hrskavice koji se imaju tretirati kao što su bol i funkcija. Poželjni „anti-inflamatorni lekovi“ koji se imaju koristiti prema ovom pronalasku su anakinra i diklofenak. Anakinra je rekombinantni, neglikozilovani oblik humanog interleukin-1 receptor antagonista (IL-1Ra). Komercijalizovan je pod imenom Kineret<®>. Njegova sekvenca korespondira sa SEQ ID NO: 3. Diklofenak (odnosno, 2-(2,6-dihloroanilino) fenilsirćetna kiselina) je dobro poznati lek za smanjenje inflamacije i kao analgetik smanjuje bol u određenim stanjima. Komercijalizovan je pod različitim trgovinskim nazivima.

- Pojam „oko“ i „oko 3 do 5 nedelja“ ili „oko mesec dana“ obuhvata davanja odvojena sa 3 nedelje (21 dan) do 5 nedelja (35 dana) ili sa mesec dana, kao i davanja odvojena 3 do 5 nedelja ± nekoliko dana ili odvojena jedan mesec ± nekoliko dana (npr., ± 1, 2, 3, 4 dan(a)). Zaista, treba razumeti da, značajno sa praktične strane, davanje FGF-18 jedinjenja, na primer trFGF-18, ne može uvek da bude obavljeno u egzaktnim intervalima, npr., tačno 4 nedelje (28 dana) dan za dan nakon prethodnog davanja. Zbog toga, u kontekstu ovog pronalaska, 4 nedelje znači 28 dana, ali može takođe biti 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32 dana nakon prethodnog davanja, zbog pogodnosti za pacijenta. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, pojam „4 nedelje“ je sličan pojmu „1 mesec“ i mogu se koristiti jedan umesto drugog (Slika 1). „4 nedelje“ će poželjno biti korišćeno ukoliko se upućuje na „dane“ (npr. prvo ubrizgavanje u ponedeljak, sledeće ubrizgavanje ponedeljak 4 nedelje kasnije) a „mesec“ će se poželjno koristiti ukoliko se upućuje na „datum“ (npr., prvo ubrizgavanje 1-og avgusta. Sledeće ubrizgavanje 1-og septembra).

- Pojam „ciklus tretmana“ ili „ciklus“ korespondira sa periodom gde se FGF-18 jedinjenje daje svakih 3, 4 ili 5 nedelja ili svaki mesec (uzastopna davanja). Kao primer, ciklus tretmana može da se sastoji od 3 ubrizgavanja u intervalu od 3 nedelje svako ili može da se sastoji od 3 ubrizgavanja u intervalu od 4 nedelje svako. Takav „ciklus tretmana“ može biti ponovljen. Na primer, drugi „ciklus tretmana“ može biti obavljen 3, 4, 5 ili 6 meseci nakon poslednjeg ubrizgavanja u prvom ciklusu. Alternativno, drugi ciklus može takođe biti obavljen 1. godinu ili 2. godine nakon prvog ubrizgavanje u prvom ciklusu. Kao primer, prvi ciklus tretmana koji se sastoji od 3 ubrizgavanje u intervalu od 4 nedelje svako može biti praćeno sa, 3 meseca nakon poslednjeg ubrizgavanje u navedenom ciklusu, drugim ciklusom tretmana od 3 ubrizgavanje u intervalu od 4 nedelje svako.

- Pojam „poremećaj hrskavice“, kako se ovde koristi, obuhvata poremećaje koji rezultiraju iz oštećenja zbog povrede, kao što su traumatska povreda, hondropatija ili artritis. Primeri poremećaja hrskavice koji mogu biti tretirani davanjem FGF-18 formulacije koja je ovde opisana uključuju ali nisu ograničeni na artritis, kao što je osteoartritis, i povredu hrskavice. Degenerativne bolesti/poremećaji hrskavice ili zgloba, kao što su hondrokalcinoza, polihondritis, recidivni polihondritis, ankilozni spondilitis ili kostohondritis su takođe obuhvaćeni ovim rečima. Društvo za međunarodnu popravku hrskavice (International Cartilage Repair Society) je predložilo artroskopski sistem ocenjivanja kako bi se procenila ozbiljnost defekta hrskavice: ocena 0: (normalna) zdrava hrskavica, ocena 1: hrskavica ima meku tačku ili mehure, ocena 2: manja kidanja vidljiva u hrskavici, ocena 3: lezije imaju duboke pukotine (više od 50% sloja hrskavice) i ocena 4: kidanje hrskavice otkriva ispod ležeću (subhronalnu) kost. (videti ICRS publikaciju: http://www.cartilage.org/files/contentmanagement/ICRSevaluation.pdf, strana 13).

- Pojam „artritis“ kako se ovde koristi obuhvata poremećaje kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, infektivni artritis, psorijatički artritis, Still-ova bolest (brz početak juvenilnog reumatoidnog artritisa) ili disekantni osteohondritis. On poželjno uključuje bolesti ili poremećaje u kojima je nekada hrskavica oštećena.

- Pojam „Osteoartritis“, ili „OA“, se koristi da se označi najuobičajeniji oblik artritisa.

Pojam „osteoartritis“ obuhvata kako primarni osteoartritis tako i sekundarni osteoartritis (videti na primer The Merck Manual, 17-to izdanje, strana 449). Osteoartritis može biti izazvan oštećenjem hrskavice. Delovi hrskavice mogu se odvojiti i izazvati bol i oticanje zgloba između kostiju. Tokom vremena, hrskavica se može u potpunosti istrošiti, i kosti će se trljati jedna sa drugom. Osteoartritis može da utiče na bilo koji zglob ali uobičajeno se tiče ruku, ramena i zglobova koji nose težinu kao što su kukovi, kolena, stopala i kičma. U poželjnom primeru, osteoartritis može biti osteoartritis kolena ili osteoartritis kuka. Izraz obuhvata naročito oblike osteoartritisa koji se klasifikuju kao faza 1 do faza 4 ili ocena 1 do ocena 6 prema OARSI sistemu klasifikacije. Stručnjak iz ove oblasti je u potpunosti svestan klasifikacije osteoartritisa koje se koriste u nauci, posebno navedenog OARSI sistema procene (takođe se naziva OOCHAS; videti na primer Custers et al., 2007). Osteoartritis je jedan od poželjnih poremećaja hrskavice koji može biti tretiran davanjem FGF-18 jedinjenja prema sadašnjem pronalasku.

- Pojam „povreda hrskavice“ kako se ovde koristi je poremećaj hrskavice ili oštećenje hrskavice naročito nastalo od traume. Povrede hrskavice mogu da nastanu naročito nakon traumatične mehaničke destrukcije, naročito nakon nesrećnog slučaja ili hirurške intervencije (na primer operacije mikrofakture). Ovaj pojam „povreda hrskavice“ takođe uključuje hondralnu ili osteohondralnu frakturu i oštećenje meniskusa. Takođe se smatra okvirom definicije povreda povezana sa sportskom aktivnošću ili trošenje tkiva zgloba usled sportske aktivnosti. Pojam takođe uključuje mikrooštećenje ili otvorenu traumu, hondralnu frakturu, osteohondralnu frakturu ili oštećenje meniskusa.

- U kontekstu sadašnjeg pronalaska, „efikasnost“ tretmana može biti merena na osnovu promena u debljini hrskavice, na primer debljini artikularne hrskavice zgloba. Debljina može biti ocenjena, na primer, putem kompjuterizovane tomografije X-zracima, Snimanja magnetnom rezonancom (MRI) ili ultrazvučnim merenjima.

Detaljan opis pronalaska

Sadašnje otkriće obezbeđuje šeme davanja za tretman različitih poremećaja hrskavice, kao što su osteoartritis i povreda hrskavice, sa FGF-18 jedinjenjem. Poželjno, navedeno FGF-18 jedinjenje je trFGF-18 kako je gore definisano. U kontekstu sadašnjeg pronalaska pokazano je da FGF-18 jedinjenja imaju optimalna dejstva ublažavanja bolesti ili simptoma na poremećaje hrskavice kada se daju u skladu sa postupcima i korišćenjima koja su ovde otkrivena. Iznenađujuće je pronađeno da režimi doziranja sadašnjeg pronalaska (odnosno, manje česti rasporedi davanja doze od jedanput nedeljno do tri nedelje po ciklusu tretmana) izazivaju smanjeni status inflamacije (npr. akutni sinovitis) tokom sledećeg ubrizgavanja i zbog toga se može primetiti puna aktivnost FGF-18 jedinjenja. Ovaj nalaz nije očekivan zbog prilično kratkog polu-života FGF-18 u zglobu (manje od 24 sata).

1

U kontekstu sadašnjeg pronalaska kao celine, bilo koji tretman (ili bilo koji postupak tretiranja) sa FGF-18 jedinjenjem može dalje da se sastoji od davanja antiinflamatornog leka sa efektima na simptome (bol i funkcija), kao što anakinra ili diklofenak. Poželjno, takvo davanje (ili ko-davanje) se obavlja u isto vreme (odnosno istovremeno sa) sa davanjem FGF-18 jedinjenja.

U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak otkriva postupak tretiranja pacijenta koji ima poremećaj hrskavice koji se sastoji od davanja FGF-18 jedinjenja gde se FGF-18 jedinjenje daje unutar-zglobno (intra-artikularno) bar tri puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3 do 5 nedelja, poželjno oko mesec dana. Poželjno FGF-18 jedinjenje je trFGF-18. U poželjnoj realizaciji FGF-18 jedinjenje se daje 3 uzastopna meseca po ciklusu tretmana (odnosno 3 puta po ciklusu tretmana, u regularnim intervalima jedanput mesečno ili jedanput svake četiri nedelje). Alternativno, FGF-18 jedinjenje može biti dato 3 puta po ciklusu tretmana, u regularnim intervalima od 3 do 5 nedelja. Takav tretman se može sastojati od 1, 2 ili 3 ciklusa tretmana godišnje. Anti-inflamatorni lek, kao što je anakinra ili diklofenak, mogu biti dati u isto vreme kada i FGF-18 jedinjenje.

U sledećem aspektu sadašnjeg pronalaska obezbeđeno je FGF-18 jedinjenje za korišćenje u tretmanu pacijenta koji ima poremećaj hrskavice pri čemu se FGF-18 jedinjenje daje unutar zglobno bar tri puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3 do 5 nedelje, poželjno oko 1 mesec. Poželjno FGF-18 jedinjenje je trFGF-18. U poželjnoj realizaciji FGF-18 jedinjenje se daje 3 uzastopna meseca po ciklusu tretmana (odnosno 3 puta po ciklusu tretmana, u redovnim intervalima jedanput mesečno ili jedanput svake četiri nedelje).

Alternativno, FGF-18 jedinjenje može biti dato 3 puta po ciklusu tretmana, u regularnim intervalima od 3 nedelje ili od 5 nedelja. Takav tretman može da sadrži 1, 2 ili 3 ciklusa tretmana godišnje. Anti-inflamatorni lek sa efektima na simptome (bol i funkcija), kao što je anakinra ili diklofenak, može biti dat istovremeno kada i FGF-18 jedinjenje.

U skladu sa sadašnjim pronalaskom, davanje FGF-18 jedinjenja, bilo samog ili u kombinaciji sa anti-inflamatornim lekom, kao što je anakinra ili diklofenak, se ima obaviti u redovnim intervalima, pa ipak blage varijacije od /- nekoliko dana su dopuštene (poželjno ne više od 3 ili 4 dana). Na primer, gde je davanje odvojeno oko 4 nedelje, ukoliko je prvo davanja u ciklusu dato u utorak, drugo davanje može biti učinjeno u utorak, 4 nedelje nakon prvog davanja (redovan interval) ili nekoliko dana pre ili posle (na primer ponedeljak pre ili četvrtak kasnije. Slično, gde su davanja odvojena oko 1 mesec, ukoliko je prvo davanje dato na primer 1-og avgusta, drugo davanje može biti učinjeno 1-og septembra (na primer četvrtak), odnosno jedan mesec nakon prvog davanja (redovan interval) ili nekoliko dana nakon ili pre (na pirmer u ponedeljak, utorak ili sreda pre 1-og septembra ili petak ili ponedeljak nakon 1-og septembra). Takva fleksibilnost dopušta režim doziranja da bude značajno manje restriktivan i pogodniji za pacijenta.

Poželjno, davanja se obavljaju na osnovu redovnog intervala, odnosno svakih 3, 4 ili 5 nedelja ili svakog meseca. U posebnoj realizaciji, navedena davanja su odvojena oko mesec dana (ili oko 4 nedelje). U jednoj poželjnoj realizaciji ona su odvojena za mesec dana ili za 4 nedelje (odnosno mesečno ubrizgavanje). Poželjno, FGF-18 jedinjenje se ima dati u redovnim intervalima jedanput mesečno (ili jedanput svake četiri nedelje). Alternativno, FGF-18 jedinjenje može biti dato u redovnim intervalima jedanput svake tri nedelje ili jedanput svakih 5 nedelja.

U kontekstu sadašnjeg pronalaska kao celine, FGF-18 jedinjenje se daje bar 3 puta ili bar 4 puta po ciklusu tretmana. Poželjno, daje se 3 puta ili 4 puta po ciklusu tretmana.

U poželjnoj realizaciji, FGF-18 jedinjenje, bilo samostalno ili u kombinaciji sa antiinflamatornim lekom (kao što su anakinra ili diklofenak), se ima davati bar 3 uzastopna meseca ili bar 4 uzastopna meseca po ciklusu tretmana. U daljoj poželjnoj realizaciji FGF-18 jedinjenje, bilo samostalno ili u kombinaciji sa anti-inflamatornim lekom (kao što su anakinra ili diklofenak), se daje 2 uzastopna meseca, 3 uzastopna meseca ili 4 uzastopna meseca po ciklusu tretmana. U još poželjnijoj realizaciji, daje se 3 uzastopna meseca. U kontekstu sadašnjeg pronalaska kao celine, takav tretman može da se sastoji od nekoliko ciklusa tretmana godišnje, kao što je to 1, 2 ili 3 ciklusa tretmana godišnje. U jednoj poželjnoj realizaciji, takav tretman se sastoji od 2 ciklusa godišnje. Kao alternativa, tretman se sastoji od 1-og ciklusa godišnje, koji se ponavlja 1 godinu ili 2 godine nakon početka prvog ciklusa tretmana. Kao primer ukoliko ima samo 1 ciklus, navedeni tretman može se sastojati od 3 ubrizgavanje u vremenskom intervalu od 3 nedelje ili se može sastojati od 3 ubrizgavanja u vremenskom intervalu od 4 nedelje svaki. Kao dalji primer, ukoliko se tretman sastoji od bar 2 ciklusa, prvi ciklus tretmana koji se sastoji od 3 ubrizgavanja u vremenskom intervalu od 3 nedelje svaki može biti praćen, nekoliko meseci nakon poslednjeg ubrizgavanja u navedenom ciklusu, drugim ciklusom tretmana od 3 ubrizgavanja u vremenskom intervalu od 3 nedelje svaki, ili prvi ciklus tretmana koji se sastoji od 3 ubrizgavanja u vremenskom intervalu od 4 nedelje svaki može biti praćen, nekoliko meseci nakon poslednjeg ubrizgavanja u navedenom ciklusu, drugim ciklusom tretmana od 3 ubrizgavanja u vremenskom intervalu od 4 nedelje svaki.

FGF-18 jedinjenje ovog pronalaska je poželjno odabrano iz grupe koja se sastoji od a) polipeptida koji sadrži ili se sastoji od humanog FGF-18 zrelog oblika koji sadrži ostatke 28-207 iz SEQ ID NO: 1, ili b) polipeptida koji sadrži ili se sastoji od FGF-18(170AA)(SEQ ID NO: 2). Posebno, ovo jedinjenje je odabrano od humanog divljeg tipa zrelog FGF-18 ili trFGF-18. Navedeno jedinjenje povećava taloženje hrskavice i dopušta popravku hrskavice.

U daljoj poželjnoj realizaciji, tretman se sastoji od davanja FGF-18 jedinjenja sa dozom 3-600 mikrograma ( μg ili mcg), poželjno 3-300 μg, ili poželjno 10-200 μg, ili poželjnije 30-150 μg, ili čak još poželjnije 30-120 μg po jednom unutar zglobnom ubrizgavanju. U poželjnoj realizaciji tretman se sastoji od davanja doze od oko 3, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 240 ili 300 μg po jednom unutar zglobnom davanju FGF-18 jedinjenja. Poželjne doze uključuju 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 ili 300 μg po jednom unutar zglobnom davanju FGF-18 jedinjenja. Treba razumeti da će doza FGF-18 koja se ima davati biti različiti ukoliko je pacijent koji se ima tretirati humani ili ne-humani sisar. Na primer, za pse, doza će poželjno biti 5-puta manje važna od one za ljude. Kao primer, ukoliko je humana doza u rasponu od 30 do 120 μg po jednom unutar zglobnom davanju, doza za psa može biti u rasponu od 5 do 20 μg po jednom unutar zglobnom davanju. Primeri doziranja za pacove i zečeve mogu biti pronađeni u delovima sa primerima.

1

U kontekstu sadašnjeg pronalaska kao celine, FGF-18 jedinjenje može biti korišćeno u kombinaciji sa anti-inflamatornim lekom sa efektima na simptome (bol i funkcija). Poželjni anti-inflamatorni lek je anakinra (videti SEQ ID NO: 3) ili diklofenak. Kada se daje bilo anakinra ili diklofenak, tretman se sastoji od davanja doza od 0,01-500 miligrama (mg), poželjno 0,1-250 mg, ili poželjnije 0,5-150 mg po jednom davanju, bilo unutar zglobno (poželjan način za anakinra-u na primer) ili oralno (poželjan način za diklofenak na primer). U poželjnoj realizaciji tretman se sastoji od davanja doza od oko 0,03, 0,1, 0,25, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili 300 mg po jednom davanju anti-inflamatornog leka. Poželjne doze uključuju 0,5, 1, 5, 1,5, 10, 50, 100 i 150 mg po jednom davanju. Treba razumeti da će doza koja se ima dati biti različita ukoliko je pacijent koji se ima tretirati humani ili nehumani sisar. Na primer, za pse, doza će poželjno biti 6-puta manje značajna od one za ljude. Kao primer, ukoliko je humana doza anakinra 150 mg po jednom unutar zglobnom davanju, doza za psa može biti 25 mg po jednom unutar zglobnom davanju. Lekar će adaptirati dozni režim za anti-inflamatorni lek od slučaja do slučaja, u zavisnosti od pacijenta i od anti-inflamatornog leka koji se ima dati. Na primer, za diklofenak dat oralno, dozni režim može biti 50 ili 75 mg, dva ili tri puta dnevno.

FGF-18 jedinjenja mogu biti formulisana kao farmaceutska kompozicija, odnosno, zajedno sa farmaceutski prihvatjivim nosačem, ekscipijentima ili slično. Definicija „farmaceutski prihvatljivo“ ima nameru da obuhvati bilo koji nosač, ekscipijente i slično, kojima se ne utiču na biološku aktivnost aktivnog sastojka i koji nisu toksični za pacijenta kome se daju. Na primer, za parenteralno davanje, aktivni protein(i) može(gu) biti formulisan(i) u obliku jedinice doze za ubrizgavanje u tečnim nosačima kao što su slani rastvor, rastvor dekstroze, serum albumin ili Ringer-ov rastvor. Formulacija za unutar zglobnu primenu će biti u skladu sa najvećim brojem zahteva koji se takođe primenjuju na druge formulacije za ubrizgavanje, odnosno, potrebno je da budu sterilne i kompatibilne sa fiziološkim uslovima položaja primene (npr., zglob kolena, sinovijalni fluid). Ekscipijenti koji se koriste za unutar zglobno ubrizgavanje mogu takođe biti prisutni u drugim formulacijama za ubrizgavanje, npr., za intramuskularnu ili potkožnu primenu. Na takve formulacije FGF-18 jedinjenja, koje uključuju bar jedan dalji farmaceutski prihvatljivi nosač, ekscipijente ili slično, se ovde upućuje kao na „FGF-18 kompozicije“ ili „FGF-18 formulacije“. Navedene „FGF-18 kompozicije“ ili „FGF-18 formulacije“ su takođe korisne u kontekstu sadašnjeg pronalaska.

Ukoliko se anti-inflamatorni lek, kao što je anakinra ili diklofenak, koristi zajedno sa FGF-18 jedinjenjem, on može biti bilo dodat formulaciji FGF-18 jedinjenja pre davanja, ili istovremeno dat bilo korišćenjem 2 različita šprica/igle, ili korišćenjem 2 različita šprica ali poželjno sa istom iglom kako bi se povećala pogodnost za pacijenta. Alternativno, anti-inflamatorni lek može biti dat oralno ili putem bilo kog drugog načina davanja.

FGF-18 jedinjenja, kao što su trFGF-18, i kompozicije koje sadrže FGF-18 jedinjenja („FGF-18 kompozicije“) će biti korisni za tretiranje poremećaja hrskavice. Posebno mogu biti korisni za tretiranje defekata zglobne hrskavice u sinovijalnim zglobovima koje predstavljaju, na primer, zbog površinske fibrilacije (rani osteoartritis), degeneracija hrskavice zbog osteoartritisa, i hondralni ili osteohondralni defekti zbog povrede ili bolesti. FGF-18 jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni za tretiranje bolesti zgloba izazvane disekantnim osteohondritisom i degenerativnim bolestima zgloba. Na polju rekonstruktivne i plastične hirurgije, FGF-18 jedinjenja i kompozicije će biti korisni za autogenu ili alogenu ekspanziju hrskavice i transfer za rekonstrukciju ekstenzivnih defekata tkiva. FGF-18 kompozicije mogu biti korišćene da se popravi oštećenje hrskavice u spoju sa lavažom zgloba, stimulacijom koštane srži, abrazivnom atroplastikom, subhondralnim bušenjem ili mikrofrakturom subhondralne kosti. Opciono zajedničko davanje sa anti-inflamatornim lekom sa efektima na simptome (bol i funkcija), kao što je anakinra ili diklofenak, će smanjiti bol povezan sa poremećajem hrskavice koji se ima tretirati.

U poželjnoj realizaciji, poremećaj hrskavice koji se ima tretirati prema ovom pronalasku je osteoartritis, kao što je osteoartritis kolena ili osteoartritis kuka. Osteoartritis koji se ima tretirati može biti, na primer, i bez ograničenja na, primarni osteoartritis ili sekundarni osteoartritis, kao i osteoartritis koji je klasifikovan kao faza 1 do faza 4 ili ocena 1 do ocena 6 prema OARSI sistemom klasifikacije.

U drugoj poželjnoj realizaciji, poremećaj hrskavice koji se ima tretirati prema ovom pronalasku je povreda hrskavice sa ili bez hirurških intervencija, kao što su

1

mikrofrakture. Dodatno, nakon rasta hrskavice zbog davanja FGF-18 kompozicije (data bilo samostalno ili zajedno sa anti-inflamatornim lekom, kao što je anakinra ili diklofenak), može biti neophodan hirurški tretman da na odgovarajući način oblikuje novo formiranu površinu hrskavice.

U poželjnoj realizaciji, tretman se sastoji od unutar zglobnog davanja FGF-18 jedinjenja ili FGF-18 kompozicije, bilo samostalno ili zajedno sa anti-inflamatornim lekom sa dejstvima na simptome (bol i funkcija), kao što je anakinra ili diklofenak. FGF-18 jedinejnja ili FGF-18 kompozicje mogu biti primenjeni, bilo samostalno ili zajedno sa anti-inflamatornim lekom, kao što je anakinra ili diklofenak, direktnim ubrizgavanjem u sinovijalni fluid zgloba ili direktno tamo gde se nalazi defekt, bilo samostalno ili u kompleksu sa odgovarajućim nosačem za produženo oslobađanje proteina (npr., formulacije sa odloženim oslobađanjem) ili restriktivnim lokalnim oslobađanjem. Poželjno, način davanja FGF-18 jedinjenja, bilo samostalno ili zajedno sa anti-inflamatornim lekom, kao što je anakinra ili diklofenak koji je ovde opisan, je odabran od grupe koja se sastoji od: peri-sinovijalnog davanja, intra-sinovijalnog davanja, peri-artikularnog davanja i intra-artikularnog davanja. U poželjnoj realizaciji, FGF-18 jedinjenje koje je ovde opisano se daje, bilo samostalno ili zajedno sa antiinflamatornim lekom, kao što je anakinra ili diklofenak, poželjno unutar zgloba (intraartikularno). Anti-inflamatorni lek se daje poželjno unutar zglobno (poželjan način za anakinra) ili oralno (poželjan način za diklofenak). Unutar zglobno (intra-artikularno) davanje se obavlja u zglobu koji je odabran od grupe kuk, koleno, lakat, ručni zglob, članak, kičma, stopalo, ručni prst, nožni prst, šaka, rame, rebra, lopatice, butine, potkolenice, pete i duž koštanih tačaka kičme. U još jednoj poželjnoj realizaciji unutar zglobno davanje se obavlja u zglobu kuka ili kolena.

Opis slika:

Slika 1: Naznačeni vremenski redosled tretmana. Slika 1a: dozni režim jedanput nedeljno; Slika 1b: dozni režim jedanput mesečno (ili svake 4 nedelje); Slika 1c: dozni režim jedanput mesečno (ili svake 4 nedelje) ± nekoliko dana varijacija prihvaćenih kao pogodnost za pacijenta.

Slika 2: FGF-18 kao jedinjenja koja izazivaju od doze zavisno taloženje zglobne matrice kod pacova OA model ilustrovano kvantifikacijom Safranin-O bojenjem

1

Slika 3: Ukupan zajednički rezultat bez femura

Slika 4: Ukupan zajednički rezultat

Slika 5: Značajna širina tibijalne degeneracije hrskavice

Slika 6: Ćelijska koncentracija nakon 8 dana kulture svinjskih hondrocita stimulisanih ili ne sa IL1α, stimulisani ili ne sa IL1 dana kulture (A) ili nakon odlaganja od 6 sati (B) sa rhFGF18100 ng/mL i/ili Anakinra 100 ng/mL. N=4 za (A) i N=6 za (B).

Slika 7: Nivoi seruma α2MG tokom vremena

Slika 8: AUC (oblast pod krivom) razlike prečnika između ciljanog kolena (OA zglob) i kontralateralnog zgloba (zdravo koleno) tokom vremena

Slika 9: zapremina hrskavice (u mm<3>) na medijalnoj tibiji

Opis sekvenci:

SEQ ID NO.1: Sekvenca amino kiseline prirodnog humanog FGF-18.

SEQ ID NO. 2: Sekvenca amino kiseline rekombinantnog skraćenog FGF-18 (trFGF-18).

SEQ ID NO. 3: Sekvenca amino kiseline rekombinantnog humanog iIL-1 receptor antagonista (anakinra)

Primeri

Materijal

Rekombinantni skraćeni FGF-18 (trFGF-18) sadašnjeg pronalaska se priprema ekspresijom u E.coli, prema tehnici opisanoj u prijavi WO2006/063362. U sledećim primerima, trFGF-18 i FGF-18 se koriste naizmenično.

Rekombinantni humani interleukin-1 receptor antagonist (anakinra) se dobija preko Pharmacia-e.

Ocenjivanje zglobova

Nakon žrtvovanja, uklanja se desno koleno i dekalcifikuje u 5%-noj mravljoj kiselini tokom 4-6 dana pre sečenja na pola u frontalnoj ravni i fiksiranja u parafin vosku. Tri

1

dela se odsecaju u koracima od 200 μm, oboje se sa toluidin plavim, i analiziraju korišćenjem ImagePro Plus<TM>softvera (Media Cybernetics).

U ocenjivanju tri dela zgloba, utvrđen je scenario najgoreg slučaja za dve polovine na svakom slajdu za leziju hrskavice kao degeneracija širine ( μm). Ovo reflektuje oblasti lezije tibijalne hrskavice u kojima i gubitak hondrocita i proteoglikana prelazi ≥50% debljine hrskavice. Ovo merenje je urađeno preko oblasti najveće ozbiljnosti lezije u svakoj od tri zona preko tibijalne površine.

Utvrđuje se tretman grupa Srednja vrednost ± SE za svaki rezultat i merenje.

Podaci se analiziraju korišćenjem jednosmerne analize varijacija (1-smerna ANOVA) ili Kruskal-Wallis testa (ne-para-metrijski), zajedno sa odgovarajućim post-testom višestrukog upoređivanja. Merenja kalipera desnog kolena se upoređuju sa levim korišćenjem studentskog t-testa. Osim ukoliko nije naznačeno, Bolder BioPATH, Inc. obavlja statističku analizu samo na sirovim (netransformisanim) podacima. Statistički testovi čine određene pretpostavke u vezi normalnosti podataka i homogenosti varijacije, i može biti neophodna dalja analiza ukoliko je testiranje rezultiralo u povredama ovih pretpostavki. Značaj svih testova je postavljen na p ≤0,05. Upoređenja su učinjena između svake grupe i kontrolne grupe sa nosačem, kao i između parova.

Primer 1

Postupak: Model nestabilnosti transekcijom prednjeg kružnog ligamenta sa resekcijom medijalnog meniskusa (ACLT+tMx) koji izaziva OA se obavlja na Lewis pacovima mužjacima 10-15 nedelja starim. Ukratko, pod anestezijom sa izofluranom, kapsula zgloba desnog kolena svakog pacova se otvara, prednji kružni ligamenti i ligamenti koji fiksiraju meniskus se oštro presecaju, meniskus se uklanja i kapsula, mišići i koža se zatvaraju šavovima. Životinje se nasumično alociraju u 10 grupa sa n=10 u svakoj. Istraživane su sledeće doze od 0, 0,3, 1, 3 i 10 μg po unutar zglobnom ubrizgavanju. Grupe 1-5 primaju jedan ciklus od tri pojedinačna ubrizgavanja u nedeljnim intervalima, grupe 6-10 tri pojedinačna ubrizgavanja u mesečnim intervalima. Unutar

1

zglobni tretman započinje tri nedelje nakon operacije. U to vreme se već manifestuju pato-fiziološke promene, npr., gubitak matrice hrskavice. Životinje se eutanizuju 17 nedelja nakon operacije i ispituju se zglobovi.

Rezultati: trFGF-18 izaziva od doze zavisno novo formiranje hrskavičavog tkiva koje postaje značajno u lateralnoj tibiji sa 1 μg/zglob nezavisno od režima ubrizgavanja (videti Sliku 2a). trFGF-18 izaziva od doze zavisno novo formiranje hrskavičavog tkiva koje postaje značajno u medijalnoj tibiji sa 1 μg/zglob prema jednonedeljnom režimu i sa 0,3 μg/zglob prema jednomesečnom režimu (videti Sliku 2b).

Primer 2

Postupak: Lewis pacovi mužjaci se podvrgavaju hirurškoj intervenciji (pod anestezijom sa Izofluranom) da se izazove medijalno meniskusno cepanje u desnom zglobu kolena. Životinje se doziraju IA (unutar zglobno) sa nosačem ili FGF-18 pod jednim od dva različita režima (videti donju tabelu), a onda se ubijaju na dan 105. Merenja kalipera kolena se obavljaju na početku i dane 21, 42, 56, 84 i 105. Serum sa procenjuje na α2makroglobulin nivoe na početku i na dane 21, i 105, kao i nedelju dana nakon konačne doze (dan 42 ili 84). Desna kolena se sakupljaju radi procene histopatologije.

Tabela 1: tretman grupe

1

Rezultati i zaključci:

Sve životinje su povratile težinu koju nose odmah nakon hirurške intervencije po oporavku od anestezije. Sve životinje su dobile na težini tokom studije i ne postoje značajne razlike u promeni telesne težine među grupama.

Prečnici kolena, izmereni kaliper merenjem i nivoi seruma a2MG se povećavaju nakon FGF-18 ubrizgavanja ali jasna korist jednog specifičnog režima tretmana nad drugim nije demonstriran u ovoj studiji korišćenjem ovih parametara. Nasuprot tome strukturalna korist je bila najviša sa šemom mesečnog ubrizgavanja (Slike 3, 4, 5).

Sve ukupno, rezultati ove studije ukazuju da je tretman sa FGF-18, bez obzira na režim, značajno povećao oticanje u tretiranom kolenu nakon prvog ubrizgavanja. Procena histopatologije ukazuje da je tretman generalno povećao razmeru povrede preko tibijalne površine, posebno u pogledu oštećenja kolagena, dok se istovremeno smanjuje njena ozbiljnost. Ovo dejstvo je najočiglednije u grupama tretmana koje primaju tri doze pre nego dve, i u grupama koje primaju njihovu poslednju dozu u najkasnijoj vremenskoj tački (dan 77). Primećeno je nekoliko drugih sporednih efekata tretmana, uključujući hipertrofiju hrskavice, sinovitis i sinovijalnu fibrozu. Ove promene su najočiglednije i ozbiljnije kod životinja koje su primale tri doze koje slede vrlo brze jednu posle druge (Grupe 3 i 4), dok životinje koje su primile samo dve doze (Grupe 6 i 7) ili primaju svoje doze u većem vremenskom razmaku (Grupa 5) imaju nešto manje ozbiljne promene.

Režim tretmana koji rezultira u najboljoj ukupnoj morfologiji je tri ubrizgavanja, jedanput mesečno (Grupa 5; ubrizgavanja na dane 21, 49 i 77), naznačavajući da je određeni oporavak u vremenu između doza bio koristan.

Primer 3

Postupci:

60 odraslih mužjaka, naivnih, novozelandskih belih zečeva se koristi u ovoj studiji. Životinje su otprilike 3-4 meseca stare. Zečevi se podvrgavaju kreiranju defekta

2

hrskavice desnog kolena. Površine 2 mm sa 6 mm defekt pune debljine je napravljen u zglobnoj hrskavice trohlearnog useka. Mikrofraktura se kreira korišćenjem igli kalibra 18, dve 3 mm duboke mikro frakture su učinjene kroz subhondralnu kost na osnovi defekta, jedna proksimalno i jedna distalno. Svaki otvor mikro frakture je otprilike prečnika 1,5 mm i otvori se odvajaju sa 2 mm.

Eksperiment se sastoji od sledećih šest tretman grupa, sa 10 životinja u svakoj grupi za ukupno 60 zečeva (Tabela 2). Zečevi u Grupama 3, 4, 5 i 6 se tretiraju sa unutar zglobnim rhFGF18 bilo u nekom od ciklusa od tri nedeljna ubrizgavanja 100 μg rhFGF18 (Grupe 3 i 5) ili u nekom ciklusu od tri mesečna ubrizgavanja 100 μg rhFGF18 (Grupe 4 i 6). Sve životinje se eutanizuju i na njima se vrši autopsija 6 meseci nakon hirurške intervencije.

Tabela 2: tretman grupe

Rezultat:

Nalazi autopsije (Tabela 3): ICRS ukupna ocena hrskavice je 1,9+/-0,3 SE za Grupu 5 životinja a 2,4+/-0,2 SE za Grupu 6 životinja ukazujući da je mesečna šema ubrizgavanja superiorna upoređeno sa nedeljnom. U Grupi 6 životinja interkondularni usek je napunjen kod 3/10 životinja sa finom granularnom do granularnom hrskavicom, a preostalih 7/10 životinja imaju usek 50% napunjen do skoro potpuno napunjen sa granularnom do grubo granularnom hrskavicom. Sumarno, ubrizgavanje rhFGF18 samostalno ili u kombinaciji sa mikrofrakturom, dato kao jedno nedeljno ili mesečno ubrizgavanje, rezultira u zadebljanju ili uvećanju regionalne femoralne kondile i proliferaciji grube ili grubo granularnom hrskavicom u leziji inetkondularnog useka i stimulaciji oseetofita na medijalnim i lateralnim trohlearnim grebenima, povremenom formiranju osteofita tibijalnog platoa, ili abnormalnom rastu hrskavice na pateli ili susedno pateli u sinovijalnoj masnoj podlozi.

Morfološka patologija kada nema mikrofrakture: Delovi lezija desnog femura sa životinja tretiranih mesečno tokom tri meseca sa rhFGF18 su značajno povećale procente punjenja defekta (48%), rezultirajući u značajnom povećanju od 49% u rezultatu punjenja defekta. Drugi rezultati nemaju značajno povećanje koje je od 20-23%. Ukupna širina useka lezije je beznačajno povećana za 36%, dok je širina lezije sa neodrživom hrskavicom značajno smanjena za 94%. Svi delovi imaju degeneraciju koja je u rasponu od minimalne do ozbiljne, generalno fokalno, i tipično viđeno zajedno sa fibrohrskavicom. Centralna MFC debljina je značajno povećana za 120%.

Morfološka patologija – kada ima mikrofrakture: Površina delova lezije hrskavice od netretiranih kontrola sa mikrofrakturom ima sveukupno blagu rekonstituciju osteohondralnog čvora, blago umanjeno bojenje matrice, i 50% ispunjen defekt. Ćelijska morfologija je uglavnom fibrohrskavica.

Površina delova lezije od životinja tretiranih nedeljno tokom tri nedelje sa rhFGF18 imaju značajna 44-69% povećanja (prema normalnom) u svim ocenjenim parametrima, kao i procentu punjenja defekta. Ukupni rezultati su značajno povećani za 53%. Ukupna širina lezije useka je blago povećana za 5% dok je širina lezija bez održive hrskavice smanjena (ne-značajno) za 59%. Svi delovi imaju hipertrofiju hrskavice. Centralna MFC debljina u ovim delovima je značajno povećana za 112%.

Površine delova lezije od životinja tretiranih mesečno tokom tri meseca sa rhFGF18 imaju značajna 61-97% povećanja (prema normalnom) u svim ocenjenim parametrima, kao i u procentu punjenja defekta. Ukupni rezultati su značajno povećani za 76%. Ukupna širina lezije useka i širina lezije bez održive hrskavice nije značajno smanjena za 19% i 69%, u svakom slučaju posebno. Svi delovi imaju hipertrofiju hrskavice. Centralna MFC debljina u ovim delovima je značajno povećana za 106%.

Zaključci:

Abnormalni klinički znaci su blagi i konzistentni sa onima koji se tipično vide kod zečeva nakon hirurške intervencije na kolenu i/ili kao rezultat ponavljanog sakupljanja uzorka, bilo sakupljanjem uzorka krvi sa lateralnih ušnih vena ili sinovijalnog fluida sakupljenog iz zgloba kolena. Upoređivanje lečenja inter-kondularnog useka životinja u Grupi 1 i Grupi 2 pokazuje dobro spontano punjenje useka sa onim što u najvećoj meri izglade da je hrskavica. Postoji sugestija da mikrofraktura može povećati ponovan rast hrskavice u useku pošto 9/10 životinja u Grupi 2 ima punjenje useka sa hrskavicom upoređeno sa 7/10 životinja u Grupi 1, ali ova rezlika je mala.

Na isti način, ne postoji razlika između ICRS ili osteofit rezultata između dve grupe tako da je kvalitet lečenja hrskavice dobar, i postoji u bilo kojoj od grupa manja stimulacija formiranja osteofita. Od preostalih grupa tretiranih sa rhFGF18, izgleda da Grupa 4 (inter-kondularni usek i tri mesečna unutar zglobna ubrizgavanja do 100 μg rhFGF18) pokazuje najbolji odgovor sa 6/9 životinja koje imaju inter-kondularni usek napunjen sa hrskavicom koja se pojavila skoro normalna do blago gruba ili granularna u ukupnoj pojavi. Dodatno, Grupa 4 ima sledeći do najnižeg ICRS rezultat hrskavice (2,1 /- 0,3) od četiri grupe tetirane sa rhFGF18, i ova grupa ima najniži rezultat osteofita (3,8 /- 0,8) u odnosu na bilo koju od rhFGF18 grupa. Nasuprot tome, Grupa 6 (inter-kondularni usek sa mikrofrakturom i tri mesečna unutar zglobna ubrizgavanja od 100 μg rhFGF18) ima punjenje inter-kondularnog useka kod samo 3/10 životinja, ICRS rezultat je najviši u bilo kojoj grupi (2,4 /- 0,2) a rezultat osteofita je bio drugi najviši (5,1 /- 0,7) u odnosu na bilo koju od rhFGF18 tretiranih grupa. Na isti način, Grupa 5 (inter-kondularni usek sa mikrofrakturom i tri nedeljna unutar zglobna ubrizgavanja od 100 μg rhFGF18) ima najviši rezultat osteofita u odnosu na bilo koju od grupa (5,7 /- 0,7).

2

Korisni efekti su veći kada se tretman daje tokom produženog vremenskom perioda (3 meseca spram 3 nedelje), i efekti su očigledniji kod zečeva sa mikrofrakturama nego kod zečeva bez mikrofrakture.

Primer 4

Postupak:

Svinjski hondrociti se izoluju iz hrskavice femoralne glave kuka svinje (svinja je otprilike godinu dana stara). Nakon disekcije zglobova, hrskavica se sakuplja i razbija 45 minuta sa kolagenazom 0,25% (1/10 razblaženje sa kolagenazom NBG4 2,5 % u HAM’s F12) na sobnoj temperaturi. Opuštene ćelije se odbacuju i hrskavica se dalje razbija preko noći sa kolagenazom 0,1% (1/25 razblaženje kolagenaze NBG42,5% u HAM’s F12) na 37°C da se ekstrakuju hondrociti. Za ovu studiju, hondrociti su kultivisani u monosloju.

Primarni zglobni svinjski hondrociti se stimulišu ili ne sa 10 ng/mL IL1α i ili su tretirani odmah ili 6 sati kasnije sa Anakinra 100 ng/mL i/ili trFGF-18100 ng/mL. Svaki uslov se obavlja u 4 ili 6-plikatima (4 ili 6 kopija). Kao kontrola, ćelije se takođe kultivišu samo sa Anakinra, samo sa trFGF-18 ili u odsustvu bilo kakvog tretmana (Medijum).

Pre-kultura: Nakon ćelijskog izolovanja svinjski hondrociti se inokulišu na 20 000 ćelija/cm2 i kultivišu nedelju dana u potpunom HAM’s F12. Ćelije se onda pokupe sa akutazom, prebroje i koriste kako je niže u tekstu opisano.

Za ćelije tretirane direktno sa Anakinra-om: Hondrociti se inokulišu na ploči sa 24 bazenčića pri 15000 ćelija/bazenčić u 0,5 mL kompletnog HAM’s F12. Onda se, 0,25 mL trFGF-18 400 ng/mL i/ili 0,25 mL Anakinra-e 400 ng/mL doda ćelijama. U izazvanim uzorcima, 10 μL IL1α pri 1000 ng/mL, se takođe doda ćelijama. trFGF-18, Anakinra i IL1α se svi razblaže u kompletnom HAM’s F12.

Konačna zapremina kulture se podesi na 1 mL sa kompletnim HAM’s F12. Konačne koncentracije su 10 ng/mL IL1α, 100 ng/mL trFGF-18 i 100 ng/mL Anakinra-e a ukupno vreme kulture je osam dana. Potpuna promena medijuma se obavlja nakon četiri dana. N=4.

Za ćelije tretirane sa Anakinra-om i trFGF-18 šest sati nakon IL1α izazivanja: Hondrociti se inokulišu na ploči sa 24 bazenčića pri 15 000 ćelija/bazenčić u 1 mL kompletnog HAM’s F12 koji sadrži ili ne sadrži IL1α 10 ng/mL. Nakon 6 sati medijum se uklanja i menja sa 0,25 mL trFGF-18 400 ng/mL i/ili 0,25 mL Anakinra-e 400 ng/mL. U izazvanim uzorcima, 0,25 mL IL1α pri 40 ng/mL se takođe doda ćelijama. trFGF-18, Anakinra i IL1α se svi razblaže u kompletnom HAM’s F12. Konačna zapremina kulture se podesi na 1 mL sa kompletnim HAM’s F12. Konačne koncentracije su 10 ng/mL IL1α, 100 ng/mL trFGF-18 i 100 ng/mL Anakinra-e i ukupno vreme kulture je osam dana. Kompletna promena medijuma se obavlja nakon 4 dana. N=6.

Nakon osam dana kulture, ćelije se sakupe sa akutazom i rezultirajuće ćelijske suspenzije se analiziraju na ćelijsku koncentraciju i ćelijsku održivost sa ViCell<TM>Ćelijskim analizatorom (od Beckman Coulter-a). Statistička analiza se sastoji od jednosmerne ANOVA praćeno sa Dunnett-ovom post hoc analizom.

Rezultati i zaključci:

Kao što se očekuje za rhFGF18 je pronađeno da povećava proliferaciju svinjskih hondrocita u odsustvu IL1α. U oba eksperimenta u poređenju sa kontrolom (medijum, bez IL1α) primećeno je 11,25 i 7,75 puta povećanje u ćelijskom broju u prisustvu rhFGF18 100 ng/mL nakon 8 dana kulture (Slika 6).

Ipak, u prisustvu IL1α 10 ng/mL, stimulacije proliferacije od strane rhFGF18 je samo 2,38 i 2,44 puta, u svakom slučaju posebno, u poređenju sa kontrolom (medijum, IL1α, 10 ng/mL) u oba eksperimenta. Anakinra 100 ng/mL, kako za direktne tako i za odložene tretmane, prikazuje da u potpunosti ponovo uspostavlja rhFGF18 aktivnost. Za gustinu ćelija za ćelije kultivisane sa rhFGF18 i bez IL1α ili izazvane sa IL1α ali tretirane sa Anakinra-om je pronađeno da nije statistički različita. Konačno, Anakinra samostalno nema dejstvo na proliferaciju hondrocita.

U sadašnjoj studiji, za Anakinra-u 100 ng/mL je pokazano da u potpunosti blokira inhibitorno dejstvo IL1α na proliferativnu aktivnost rhFGF18. Ovo, u skladu sa

2

činjenicom da je Anakinra IL1 receptor antagonist, blokira inflamatorno signaliziranje pokrenuto sa IL1. Sada je demonstrirano da anakinra uspostavlja proliferativno dejstvo rhFGF18 u svinjskim hondrocitima izazvanim sa IL1α.

Primer 5

Postupak:

Lewis pacovi mužjaci se podvrgavaju hirurškoj intervenciji da se izazove medijalno meniskusno cepanje u desnom zglobu kolena. Životinje se doziraju i.a. (i.a.= intraartikularno = unutar zglobno) na dane 21, 28 i 35 i doziraju oralno sa diklofenakom (bilo 1 mg/kg ili 3 mg/kg) ili nosačem na dane 21-23, 28-30 i 35-37, onda ubijaju na dan 42 ili dan 63. Serum se sakuplja i procenjuje za alfa 2 makroglobulin (α2MG) nivoe na dane -3, 21, 42 i 63. α2MG je inflamacioni serum biomarker. Veza između α2MG i inflamacije je već ranije prikazana (Kuribayashi et al., 2013).

Rezultati

FGF-18+nosač kontrole imaju blago do umereno oticanje na dan 24, koje se povećava do ozbiljnog do dana 36, iako nije primećeno šepanje. Oticanje kolena je blago umanjeno prema označenoj ozbiljnosti sa početkom na dan 44. Merenja kalipera podržavaju ove opservacije, sa značajnim razlikama između desnih i levih kolena na dan 21 i u kasnijim vremenskim tačkama, ali ne i na počektu tretmana. Životinje kojima je dato 3 mg/kg diklofenaka imaju značajno umanjene rezultate oticanja na dane 24-29, 31 i 36-43, upoređeno sa nosačkim kontrolama. Merenja kalipera kolena su značajno smanjena na dan 42, ali nema značajnog uticanja u bilo kojoj drugoj vremenskoj tački. Životinje kojima je dato 1 mg/kg diklofenaka imaju značajno umanjenje rezultate oticanja na dane 24-29, 31 i 36-43, upoređeno sa nosačkim kontrolama. Merenja kalipere kolena su značajno smanjena na dan 42, ali nema značajnog uticanja u bilo kojoj drugoj vremenskoj tački. (podaci nisu prikazani).

α2MG nivoi su viši na dan -3 (pre hirurške intervencije) nego na dan 21 nakon hirurške intervencije. Nivoi kod životinja kojima je dato 3 mg/kg diklofenaka su blago, ali značajno smanjeni upoređeno sa onima u nosačkim kontrolama u vremenskoj tački

2

pre hirurške intervencije. Nivoi na dan 21, pre tretmana, su u osnovi isti za sve grupe. Na dan 42, kontrole bolesti imaju primetno povišene α2MG nivoe (otprilike četiri puta više nego nivoi na dan 21), što je značajna razlika između dve diklofenak grupe. Na dan 63, nivoi za sve grupe su ponovo slični. (Slika 7).

Zaključci:

Sve ukupno, rezultati ove studije ukazuju da je davanje 1 ili 3 mg/kg diklofenaka pacovima sa medijalnim meniskusnim cepanjem kojima je takođe dat FGF-18 značajno smanjilo oticanje kolena, zasnovano kako na kliničkim obzervacijama tako i na merenjima kalipera. Ova dejstva su očigledna za otprilike jednu nedelju nakon konačne doze diklofenaka. Nivoi seruma α2MG prate nosačke kontrole na dane -3, 21 i 63, ali ipak oštro smanjenje je viđeno na dan 42 kao rezultat povećanja u nivoima kontrole.

Primer 6

Postupak:

Cilj ove studije je da se proceni dejstvo različite, u ciklusu, frekvencije doziranja jednake ukupne doze (3x 1 μg) sprifermina na zapreminu hrskavice u modelu pacova sa OA. Transekcija (isecanje po transverzali) prednjeg kružnog ligamenta (ACLT) sa resekcijom medijalnog meniskusa (tMx) se obavlja kako je otkriveno u primeru 1. Zglobovi mužjaka Lister Hooded pacova (200-260 g, Charles River) se koriste u ovoj studiji. Životinje se eutaniziraju 18 nedelja nakon hirurške intervencije.

Promene u zglobu se odnose na kliničke procene OA (gubitak hrskavice, osteofiti, subhondralna skleroza). Jedan μg sprifermina u slanom rastvoru se ubrizga tri puta bilo nedeljno, svake druge, svake treće, svake četvrte ili svake pete nedelje i upoređuju se sa odgovarajućim grupama nosača. Telesna težina, prečnici zglobova i rezultati kliničkog zdravlja se istražuju nedeljno.

2

Rezultati

Rezultati pokazuje da unutar zglobna ubrizgavanja nemaju uticaja na dobijanje telesne težine: Ne vidi se značajno dejstvo leka ili režima tretmana na životne parametre. Ipak, grupe kojima se vrše ubrizgavanja svake druge nedelje sa slanim rastvorom (n=4) kao tendencija najviše dobijaju na telesnoj težini (podaci nisu prikazani).

Za ubrizgavanjima u nedelji 3, 4 i 5, prečnici zgloba su značajno veći nego nakon ubrizgavanja u nedelji 3, 8 i 13 (videti sliku 8). Nisu viđene značajne razlike između ubrizgavanja svake druge, treće ili četvrte nedelje. Samo kada se ubrizgava svake pete nedelje AUC prečnika zgloba je isti kao kod ubrizgavanja slanog rastvora. Tako, kao tendencija, prečnik zgloba AUC se smanjuje sa nižom frekvencijom ubrizgavanja.

Kvantitativna histološka analiza putem sterologije otkriva ozbiljne sa OA-slične promene u zglobovima na koje se utiče. rhFGF18 sprečava više ili manje potpunu razgolićenost hrskavice. Jedan μg/zglob i ubrizgavanje dato jedanput svake treće nedelje (ukupno tri ubrizgavanja) rezultira u smislenoj i statistički značajnoj razlici u odnosu na slani rastvor (krajnja tačka: zapremina hrskavice na medijalnoj tibiji, videti Sliku 9).

Zaključci:

Manje frekvencije ubrizgavanja od jedanput nedeljno tokom tri nedelje izgleda da dopuštaju bolji oporavak od oticanja zgloba nakon ubrizgavanja. Sve grupe tretirane sa rhFGF18 prikazuju strukturalnu korist ilustrovanu vrednostima veće zapremine hrskavice upoređeno sa placebom. Ipak, pod okolnostima vremenski fiksirane studije (isto trajanje studije za sve životinje) i fiksnih doza, frekvencija ubrizgavanja svake treće nedelje rezultira u najkorisnijem strukturalnom ishodu. Može se spekulisati da su duže pauze između ubrizgavanja rhFGF18 korisnije zato što bolje prevode proliferaciju hondrocita u proizvodnju ekstracelularne matrice upoređeno sa režimom ubrizgavanja jednom nedeljno tokom tri nedelje.

2

Rezultirajuća kriva oblika zvona je uobičajena opservacija čitanja efikasnosti faktora

rasta.

2

LISTA SEKVENCI

�

�

Claims (19)

PATENTNI ZAHTEVI

1. FGF-18 jedinjenje za korišćenje u tretmanu poremećaja hrskavice, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje unutar zglobno bar tri puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3, 4 ili 5 nedelja.

2. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što su navedena davanja odvojena sa oko 3 nedelje ili sa oko 4 nedelje.

3. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što su navedena davanja odvojena sa oko mesec dana.

4. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje bar 3 puta ili bar 4 puta po ciklusu tretmana.

5. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se ciklus tretmana ponavlja nakon 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci.

6. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se sastoji od 1, 2 ili 3 ciklusa tretmana godišnje.

7. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje pri dozi od 3-300 μg, ili poželjno 10-200 μg, ili poželjnije 30-150 μg, ili još poželjnije 30-120 μg po jednom unutar zglobnom davanju.

8. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 7, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje pri dozi od oko 3, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 240 ili 300 μg po jednom unutar zglobnom davanju FGF-18 jedinjenja.

9. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što hrskavicu predstavlja hrskavica zgloba.

4

10. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što poremećaj hrskavice predstavlja osteoartritis.

11. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od zahteva 1-9, naznačeno time, što poremećaj hrskavice predstavlja povreda hrskavice.

12. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što je FGF-18 jedinjenje odabrano od grupe koja se sastoji od: a) Polipeptida koji sadrži ili se sastoji od humanog FGF-18 zrelog oblika koji sadrži ostatke 28-207 iz SEQ ID NO:1, ili

b) Polipeptida koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:2.

13. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje zajedno sa anti-inflamatornim lekom.

14. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 13, naznačeno time, što je antiinflamatorni lek anakinra ili diklofenak.

15. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, naznačeno time, što se anti-inflamatorni lek daje pri dozi od 0,001-500 mg, ili poželjno 0,1-250 mg, ili još poželjnije 0,5-150 mg po jednom davanju.

16. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema zahtevu 15, naznačeno time, što se antiinflamatorni lek daje pri dozi od 0,03, 0,1, 0,25, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili 300 mg po jednom davanju.

17. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje 3 puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 3 nedelje.

18. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje 3 puta po ciklusu tretmana, pri čemu su navedena davanja odvojena sa oko 4 nedelje.

19. FGF-18 jedinjenje za korišćenje prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se FGF-18 jedinjenje daje jednaput mesečno tokom 3 uzastopna meseca.