RS49595B - Primena 2-fenil-1,2- benzizoselenazol-3(2h)-ona za izradu farmaceutskog preparata za lečenje alchajmerove bolesti - Google Patents

Abstract

2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-ona za dobijanje farmaceutskog preparata za profilkasu i/ili lečenje Alchajmerove bolesti. Prijava sadrži još 1 patentni zahtev.

Description

Prikazani se pronalazak odnosi na preventivni i/ili terapeutski farmaceutski preparat za lečenje Alchajmerovc bolesti, koji kao aktivnu materiju ima 2-fenil-l,2-benzizoselenazol-3(2H)-on, pri čemu ova aktivna materija smanjuje neuronsku toksičnost izazvanu B-amiloidnim proteinom.

U nekim zemljama se inhihitori acctilholinesteraze, na primer fizosti-gmen ili tetrahidroaminoakridin (TMA), koriste kao preventivno i/ili terapeutsko lekovito sredstvo za Alchajmerovu holest. Nisu primećeni neki povoljni rezultati. Takođe su vršena istraživanja na razvoju 5-1IT antagonista koji deluju na nervni sistem, međutim njihov mehanizam još nije u potpunosti razjašnjen.

Patološka svojstva Alchajmerovc bolesti obuhvataju senilne pločice i gomilanje PHF (sparena zavojna vlakna) u mozgu.

8-amiloidni protein, u daljem tekstu označen sa Afi i koji predstavlja glavni sastojak senilnih pločica, jeste jedan nerastvorljivi peptid koji se sastoji od oko 40 ostataka amino kiselina. Utvrđeno je da AB biohemijski oštećuje neurone i da posebno zgusnuti, koagulisani a ne rastvoreni AB izaziva takvo delovanje.

Zbog toga je bio poželjan razvoj jedne supstance koja bi sprečila napre-dovanje senilne demencije Alchajmcrovog tipa i/ili bi je lečila, pri čemu bi se ta supstanca sastojala od farmaceutskog preparata koji bi suzbijao odumiranje neurona izazvano toksičnim AB.

Autori ovog pronalaska su vršili dve opsežne studije za razvoj nisko-molckulskih jedinjenja koja su u stanju da prođu kroz barijeru krv-mozak i da smanje neoronsku toksičnost AB. Pri tome je neočekivano utvrđeno da 2-fenil-l,2-benzizoselenazol-3(2I I)-on (u daljem tekstu skraćeno označen kao jeđinjenje A) ima odlično delovanje koje dopunjuje prikazani pronalazak.

Jeđinjenje A koje se koristi u prikazanom pronalasku suzbija odumiranje neurona koje je posledica postojanja AB. Zbog toga je korišćenje prema pronalasku jedinjenja A kao preventivnog i/ili terapeutskog farmaceutskog preparata pogodno za lečenje Alchajmerovc bolesti.

AB je identifikovan kao glavni glavni sastavni deo senilnih pločica, patolo-ške odlike Alchajmerovc bolesti. Sastoji se od 39-40 ostataka amino-kiselina. Dalje je poznato da AB deluje neurotoksično i time izaziva odumiranje ćelija. Nedavno je utvrđeno da će odumiranje PCI2 ćelija izazvano neurotoksičnim AB u prisustvu AB biti suzbijeno kada se doda jeđinjenje A (ebselen). Zbog toga se očekuje da jeđinjenje A predstavlja odličan preventivni i/ili terapeutski farmaceutski preparat za lečen je Alchajmerovc bolesti.

Jeđinjenje A, koje se koristi u ovom pronalasku, može se sintetizovati jednim postupkom prikazanim u japanskom patentnom spisu (kokoku) br. 2-38591 (japanska objava (kokai) br. 97-67568).

Jeđinjenje A može se davati u različitim oblicima, kao što su, na primer,

tablete, kapsule, prašak, granule i injekcije, primenom poznatih tehnika izrade, uz korištenje dodatnih materija, nosača, veziva, sredstava za razlaganje i rastvarača.

Sledeća tabela daje u vidu primera sastav jedne tablete:

Jeđinjenje A zadržava svoje primarno zahtevano delovanje kod svakog oblika davanja, na primer kod uobičajene oralne primene ili kod peroralne primene, na primer kod davanja injekcije.

U slučaju oralne primene, doza jedinjenja za odraslog u opsegu je između 100 i 2000 mg/dan, najbolje između 200 i 1000 mg/dan, pri čemu se ta doza može, u zavisnosti od kliničke situacije pacijenta, u odgovarajućoj meri povećati ili smanjiti.

Kod provere toksičnosti jedinjenja A određivana je vrednost LD5() kod miševa i pacova. Prema istraživanjima pronalazača, kod miševa su utvrđene vrednosti LD50>6810 mg/kg za oralno davanje i 740 mg/kg za intraperitonalno davanje. Kod pacova su određene vrednosti LD5O>6810 mg/kg za oralno davanje i 580 mg/kg za intraperitonalno davanje. Ove LD50vrednosti dokazuju da je jeđinjenje A vrlo sigurno.

Pored toga, kada je miševima ili pacovima đata velika doza jedinjenja A nisu se mogla primetiti neka problematična sporedna dejstva.

Prikazani će pronalazak biti detaljnije opisan preko primera izvođenja, pri čemu ovi primeri ne ograničavaju prikazani pronalazak.

Primer 1

Delovanje jedinjenja A kao inibitora odumiranja neurona izazvanog od strane AB a u prisustvu AB: Kultivisane PC12 ćelije (poreklom oil pacova, hromafinski tumor) pot-kultivisane su u posudi prečnika 100 mm (načinjenoj od Corning-a), obloženoj polilizinom, a koja je sadržala jedan DMEM medijum, kome je dodano 10 % FCS i 5 % seruma konja (proizvodi Sigma). Drugim rečima, PC12 ćelije (1 x IO<6>ćelija po posudi) odgajane se u posudi prečnika 100 m prevučenoj polilizinom. Da bi se izazvala diferencijacija PCI 2 ćelija, PC12 ćelije su sazrevale sedam dana u jednom DMEM medij um u koji je sadržao 5 % FCS, 50 ng/ml NGF i 1 % seruma konja. Potom su PC12 ćelije pipetom sastrugane i suspendovane u jednom pogodnom medijumu da hi se pripremila suspenzija ćelija. Suspenzija ćelija stavljena je u svako od udubljenja suda obloženog polilizinom sa 96 udubljenja (1 x IO<4>ćelija po udubljenju). Potom je dodan AB (Bachem Feinchemikalien AG) tako da je ostvarena krajnja koncentracija od 10/xM. Jeđinjenje A je takode dodano, tako da je ostvarena krajnja koncentracija od 0,1, 1,0 ili 2,5fiM. Kao kontrolna supstanca korišćeno je jeđinjenje B (jeđinjenje A supstituisano sumporom, koje nema dejstvo slično glutation peroksidazi; 2-fenil-l,2-benzotiazol-3(2H)-on; isporučilac Nattermann) u istoj koncentraciji i na isti način dodavano. Ćelije su kultivisane 48 časova posle dodavanja jedinjenja A ili jedinjenja B.

Jedan MTT reagens (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid) dodan je ovako obrađenim ćelijama. Vršena je inkubacija tokom 4 časa pa su ćelije lizovane. Slcdcća je obrada vršena korišćenjem takozvanog MTT postupka, koji deluje kolorimatrijski na bazi redukcione reakcije reagensa, da bi se time utvrdila sposobnost za život ćelija u suspenziji (Behl, C. i dr., Cell, 77: 817-827, 1994).

T-test je primenjen na grupe kojima je dodan AB (10/xM).

Kao što se jasno vidi iz Tabele 1, AB izaziva odumiranje neurona, pri čemu se brzina odumiranja nije mogla suzbiti dodavanjem jedinjenja B. Kada je dodano jeđinjenje A u količini od 0,1/aM, I/xM ili 2,5/xM, moglo sc u svim slučajevima odumiranje neurona značajno suzbiti (P<0,01, P <. 0,002, i P <; 0,0001).

Primer 2

Kultivisane PC12 ćelije (poreklom od pacova, hromafinski tumor) pot-kultivisane su u posudi prečnika 100 mm (načinjenoj od Corning-a), obloženoj polilizinom, a koja je sadržala jedan DMKM medijum, kome je dodano 10 % FCS i 5 % seruma konja (proizvodi Sigma). Drugim rečima, PC1.2 ćelije (1 x 10h ćelija po posudi) odgajane se u posudi prečnika 100 m prevučenoj polilizinom. Da bi se izazvala diferencijacija PC12 ćelija, PC12 ćelije su sazrevale sedam dana u jednom DMEM medijumu koji je sadržao 5 % FCS, 50 ng/ml NGF i 1 % seruma konja. Potom su PC 12 ćelije pipetom sastrugane i suspendovanc u jednom pogodnom medijumu da bi se pripremila suspenzija ćelija. Suspenzija ćelija stavljena je u svako od udubljenja suda prečnika 60 mm obloženog polilizinom sa 96 udubljenja (1 x 10<4>ćelija po udubljenju). Nakon što je utvrđena adhezija ćelija, izveden je sledeći postupak: Ovako slepljene PC 12 ćelije stavljene su ujedan DMEM medijum. Ćeli-jama je dodano 10/aM SNAP-a i 2,5/xM jedinjenja A. Jednoj kontronoj grupi dodan je samo SNAP. Svaki od uzoraka inkubiran je 3 časa. Posle toga je sva-kom od uzoraka koji su sadržali PC12 dodan pripremljen rastvor DCFH-DA (Molecular Probes, Inc.) u DMSO (I mg/423/a1), tako da je ostvarena krajnja koncentracija od 5/aM. Potoni su uzorci inkubirani 30 minuta. Ćelije su uklo-njene primenom tripsin-EDTA i ponovo dobijene centrifugiranjem (1000 min 1 x 5 min). Ovako dobijene ćelije su suspendovane u 50 /ti PBS (-), pri čemu su hlađene ledom. Količina unutarćelijskog vodonikperoksida određena je jednim protočnim citometrom. Suspenzija ćelija podvrgnuta je FACS-u (fluorescence-activated cell sorting - sortiranje ćelija aktivisanih fluorescencijom) pa je merena količina fluorescentne supstance. 2',7'-dihlorofluoresceina (DCFH) oksidicanc peroksidom. Kao rezultat je utvrđeno da je u slučaju dodavanja SNAP nastajanje vodonikperoksida 1,3 - 1,4 puta veće nego u slučaju kada nije dodavan SNAP. Dalje je povećano nastajanje vodonikperoksida usled dodavanja SNAP očigledno suzbijeno dodavanjem 2,5 itM jedinjenja A (P <. 0,0015).

SNAP: S-nitrozo-N-acctil-DL-pcnicilinamin

P < 0,0015 (poklapa se sa Studcnt-ovini T-testom u odnosu na SNAP (10/aM); n = 3]

Smatra se da NO koji potiče od AB obrzava nastajanje vodonikperoksida. Kao što se može videti u Tabeli 2. nastajanje vodonikperoksida zadovoljavajuće je suzbijeno dodavanjem 2.5ju.M jedinjenja A.

Nedavno je ukazano da kod Alchajmcrove bolesti apoptoza može biti povezana sa odumiranjem neurona. Dalje je objavljeno da AB izaziva odumiranje neurona i da je neurotoksičnost izazvana nastajanjem vodonikperoksida (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 7951-7955, 1993).

Kao što je napred opisano, nastajanje vodonik peroksida izazvano od strane AB biće znatno suzbijeno dodavanjem jedinjenja A. Iz toga se može zaključiti da da jeđinjenje A ima izvanredno preventivno ili terapeutsko delovanje na Alchajmerovu bolest. Jeđinjenje A korišćeno u prikazanom pronalasku tako predstavlja jedan posebno koristan preventivni ili terapeutski preparat za senilnu demenciju, naročito za Alchajmerovu bolest.

Skraćenice korišćene u ovoj prijavi imaju sledeća značenja:

Polilizin je jedan lizin-polipeptid sa promenljivom dužinom niza, DMEM je Delbecco-ov modifikovan Eagle-ov medijum,

DCFH je 2',7-dihlorfluoresccin,

FCS označava serum fetusa govečeta (fetal calf serum),

DMSO je dimetilsulfoksid.

tripsin EDTA je sredstvo za obrazovanje kompleksa na bazi etilendiamin-tetrasirćetne kiseline, a

NO je oksid azota.

Prikazani pronalazak odnosi se na jedan farmaceutski preparat za spre-čavanje i/ili lečenje Alzhajmerovc bolesti. Farmaceutski preparat prema pronalasku sadrži kao aktivnu materiju 2-fenil-l,2-benzizoselenazol-3(2H)-on (nazna-čen kao jeđinjenje A) čija je efikasnost na smanjenju neuronske toksičnosti izazvane B-amiloidnim proteinom dokazana.

Claims (2)

1. Primena 2-fenil-l ,2-benzizoselenazol-3(2H)-ona za dobijanje farmaceutskog preparata za profdkasu i/ili lečenje Alchajmerove bolesti.

2. Primena prema Zahtevu 1, naznačena time, što je farmaceutski preparat tableta, kapsula, prašak, granula, sirup ili kao injekcija.