RO134522A0 - Metodă de izolare şi cultivare a celulelor tumorale din biopsiile de cancer mamar - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o metodă de izolare şi cultivare a celulelor tumorale mamare din biopsii de sân recoltate prin tehnica aspirării cu ac fin, sub ghidaj ecografic. Metoda, conform invenţiei, constă în procesarea mecanică şi enzimatică cu colagenază a fragmentelor bioptice la stadiul de suspensie unicelulară heterogenă, cultivarea acestei suspensii pe un substrat de colagen şi fibronectină într-un mediu de cultură înalt selectiv de creştere a celulelor epiteliale-EGM2, rezultând culturi primare de populaţii tumorale relativ omogene cu fenotip epitelial şi de tranziţie epitelo-mezenchimală care păstrează caracteristicile iniţiale observate la momentul izolării celulelor tumorale şi pot fi utilizate în terapia personalizată a concerului de sân.

Description

Prezenta invenție se referă la o metoda de izolare si cultivare a celulor tumorale mamare din biopsii recoltate de la paciente cu cancer de san. Cancerul mamar este principala cauza de deces in rândul populației feminine, iar din punct de vedere histologic, molecular si clinic este o boala extrem de heterogena, stabilirea unui regim terapeutic adecvat fiind o provocare majora. Deși schemele terapeutice disponibile iau in considerare factori multiplii prognostici, precum numărul de ganglioni afectați, dimensiunea tumorală, gradul histologic și statusul receptorilor hormonali, datele epidemiologice arata ca răspunsul la terapie este unul foarte variat. Potrivit recomandărilor ASCO, tratamentul cancerului poate sa ridice mari probleme datorita creșterii numărului pacienților care prezintă rezistență la terapie, iar aceștia sunt în continuare tratați cu o serie de terapii care eșuează. Date recente arata ca diversitatea morfologica și moleculara a celulelor tumorale mamare [1], însoțită de o plasticitate dinamică a micromediul tumoral [2] precum si prezența unor populatii de celule stern tumorale (stemlike) [3], face dificila încadrarea si clasificarea tumorilor mamare din punct de vedere al agresivității sau al răspunsului la terapie [4], Toate aceste aspecte evidențiază nevoia unor modele preclinice adecvate care să poata predictiona răspunsul clinic al pacientelor cu cancer de san. Posibilitatea izolării si cultivării celulelor tumorale proprii fiecărei paciente constituie o platformă de testare foarte valoroasa si utila pentru avansarea conceptului de terapie personalizata, deoarece reflectă mult mai precis caracteristicile tumorale individuale ale fiecărei paciente [5].

Stadiul actual al cunoașterii

Inițierea in vitro a unor culturi de celule primare din punctii bioptice este o misiune dificila si provocatoare, cu o rată de succes relativ mică. Disponibilitatea limitata a materialului biologic (tesut recoltat prin punctie biopsie) precum si dificultățile întâmpinate in validarea si implementarea protocoalelor în practica de laborator sunt principalii factori determinanti in stabilirea cu success a unor culturi primare de celule tumorale mamare [6].

Dificultățile inițierii unei culturi primare din fragmentele de tesut mamar:

1. Fragmentele tumorale sunt paucicelulare și bogate în țesut conjunctiv

2. Prezenta unei heterogenitati celulare in tesutul biopsiat: celule tumorale in diferite stadii de diferențiere: de tip epitelial (CD24+, exprima cytokeratin 8, 18, 19, E-cadherin, claudine, occludine), in tranziție epitelio-mezenchimala (TEM) (celulele cu supraexprimare de markeri mezenchimali: vimentin, N-cadherin, CD44+, CD24-, pierderea moleculei E-cadherin, pierderea adeziunii intercelulare si a polarității celulare, castigarea proprietății de migrare si invazie), celule stern tumorale (CSC)populatie heterogena in diferite stadii (dormante, înalt proliferative, activitate crescută ALDH, excluzie Hoechst 33342, markeri de celule stern; Celule asociate tumorii: fibroblasti asociati tumorii, celule ale sistemului imun (polimorfo-nucleare-PMN, limfocite, macrophage, celule dendritice-DC), celule stern mezenchimale normale, celule endoteliale, adipocite, miofibroblaste.

3. Celulele din tumori se află în diferite etape de diferențiere, cu o rată de proliferare în general scăzută la cultivarea in vitro și capacitate scăzută de aderență la plăcile de cultură cu suprafețe din plastic. Astfel, celulele tumorale in cultura concurează pentru adeziunea la placa de cultura cu alte tipuri de celule, cum ar fi celulele mezenchimale stromale, celulele endoteliale, monocitele sau celulele dendritice. Inițierea unei culturi poate dura de la câteva zile la 4-6 săptămâni.

4. Menținerea unei culturi primare în stare proliferativă este dificilă, celulele necesitând anumiți factori de creștere sau alte bio-molecule active.

a 2020 00197

13/04/2020

5. Cultivarea in vitro a culturilor primare din biopsiile tumorale poate sa duca la modificarea caracteristicilor inițiale ale celulelor tumorale, astfel încât acestea isi pot schimba fenotipul de celule epiteliale diferențiate spre celule mai puțin diferențiate, cu pierderea markerilor epiteliali specifici.

Datorita aspectelor menționate mai sus, majoritatea cercetătorilor în domeniul oncologiei prefera sa utilizeze linii tumorale mamare imortalizate. O linie celulara stabilizata sau imortalizată este prin definiție o populație celulara izolata din tumori primare care prezintă din start anomalii cromozomiale sau mutatii ce le permit sa prolifereze la nesfârșit si pot fi astfel cultivate pentru perioade lungi de timp fara sa-si modifice semnificativ fenotipul. Aceste populatii celulare pot fi obținute si prin manipulare genetica prin transfectarea unor gene implicate in proliferare sau inhibiția mortii celulare. Studiile de cercetare fundamentale ce folosesc celule mamare tumorale se bazeaza majoritatea pe linii celulare imortalizate care sunt derivate în principal din metastaze ale cancerului mamar uman sau celule primare murine. Astfel cele mai cunoscute linii celulare (MCF-7 și MDA-MB231) au fost obținute din metastazele tumorale, sau au fost stabilizate din probe tumorale provenite de la paciente care au fost deja supuse radioterapie! și chimioterapiei. Aceste linii tumorale conțin celule aflate intr-o faza avansata de evoluție a fenotipului tumoral si caracteristicile lor moleculare si funcționale nu pot fi intodeauna extrapolate la cancerele mamare din cazuistica clinica, in practica de zi cu zi. O singura linie celulara stabilizata este cunoscuta ca fiind intr-un stadiu precoce al progresiei tumorale (MCF-10), dar aceasta nu este derivata din celule de tip epitelial.

Liniile celulare imortalizate comerciale prezintă mai multe dezavantaje:

1. Reprezintă tipuri de celule tumorale extrem de invazive, deoarece majoritatea sunt derivate din efuziuni pleurale, deci nu recapitulează diferitele stadii de creștere a tumorilor.

2. Nu conțin celule care sa simuleze caracteristicile tumorilor neinvazive in stadii incipiente, precum carcinomul ductal in situ.

3. Majoritatea liniilor imortalizate sunt disponibile la pasaje relativ avansate, iar acest fapt poate duce la modificări de genotip si fenotip, sub presiunea unei selectii pozitive sau negative datorita multiplelor pasaje.

4. In general, sunt foarte puține informații despre originea liniilor disponibile.

Cunoscute fiind aceste limite ale cercetării cu linii celulare stabilizate, s-a încercat dezvoltarea de metode de obținere si menținere in cultura a celulelor din tumorile pacientelor cu cancer de san. Inca din anii' 80 s-a încercat izolarea acestora mai ales pentru personalizarea terapiilor in cancer, pornind in special de la caracterele particulare si individuale ale fiecărei tumori, aparand astfel noțiunea de oncobiograma. Numeroase teste de predicție au fost elaborate în ultimii 50 ani, dar niciunul nu a fost încă implementat în practica clinică, majoritatea testelor rămânând la stadiul de cercetare clinică. Unul dintre motive este dat de heterogenitatea probelor care nu permite o standardizare a metodelor. Un alt obstacol este diferența de comportament a celulelor cultivate in vitro față de cele aflate in vivo. Cultivarea celulelor izolate din tumorile primare si testarea in vitro nu poate reproduce perfect micromediul tumoral și influența factorilor externi indusa de celulele sistemului imun sau circulația sanguină. Obținerea unor culturi primare tumorale cu selecția doar a celulelor tumorale si propagarea acestora in cultura este astfel o sarcina dificila. Exista cateva studii care raportează utilizarea de culturi primare de san in cercetarea oncologica, fiind descrise diferite metode de izolare si cultivare. Astfel, lipsa unor metode standardizate de procesare a fragmentelor tumorale obținute de la pacienti, a protocoalelor de izolare a celulelor tumorale, dar si de cultivare a acestora in cadrul diferitelor laboratoare, duce la obținerea de rezultate diferite al celulelor epiteliale mamare in experimentele in vitro.

Ca urmarea a acestui fapt, exista o nevoie imediata pentru identificarea unor proceduri care sa duca la izolarea populațiilor tumorale din biopsiile analizate, ce poate fi ulterior a 2020 00197

13/04/2020 standardizate si transferate si altor laboratoare implicate in acest tip de analize, pentru a face posibila compararea rezultatelor.

Metode disponibile de procesare a tumorilor

Majoritatea metodelor de procesare a fragmentelor tisulare, descrise in literatura, presupun o fragmentare mecanica si o digestie enzimatică cu colagenaza ± tripsina-EDTA ± dispaza sau hialuronidaza [7],

O provocare importantă în izolarea celulelor epiteliale mamare este reprezentată de procedura de digestie și de fracționare a țesuturilor pentru obținerea subseturilor de celule existente intr-o tumora. Au fost raportate diferite metode de obținere a celulelor epiteliale mamare din țesutul proaspăt, iar abordările variază în ceea ce privește manipularea mecanică (eliminarea țesutului adipos sau nu, marimea pieselor tumorale), digestia enzimatică (timpul digestiei, tipul de enzime/concentrația enzimelor adăugate-precum colagenază, hialuronidaza sau o combinație a ambelor) sau separarea fracției celulare (prin filtrare secvențială sau centrifugare diferențială).

O alta abordare a separării fracției celulare tumorale vizeaza utilizarea de anticorpi monoclonali care au ca tinta celulele de tip epitelial (de ex. MUCI, CD227, CD44, CD24 sau EpCAM specifici celulelor epiteliale mamare) folosind bilute imuno-magnetice sau sortare prin citometrie de flux [8, 9],

Fiecare dintre aceste proceduri diferă în randamentul (numărul de celule) și viabilitatea celulelor izolate, datorită tipului de digestie aplicata, a etapelor de fracționare celulara și a mediilor de cultura folosite. Este important de asemenea de menționat ca celulele din culturile primare se vor propaga limitat datorita apariției senescenței ce apare după 10-40 replicări celulare respectiv a fenomenului de anoikis (moarte programata dependenta de ancorajul celulelor la matricea extracelulara) ceea ce va împiedica cultivarea lor pe termen lung. Pana acum nu exista metode standardizate care sa indice timpul optim de digestie enzimatică, concentrația enzimelor care este cea mai potrivita sa extraga celulele tumorale din rețeaua de tesut conjunctiv, tipul de mediu de cultura si moleculele biologic active care ar permite proliferarea si creșterea celulara dar si pastrarea caracterelor primare ale celulelor izolate.

Metode de cultivare disponibile

Metodele de cultivare clasice se bazeaza pe aplicarea patentului elaborat de Stampfer et al in 1983 [10], care a stat de fapt la baza elaborării a numeroase protocoale de izolare a celulelor epiteliale. In cadrul acestui patent sunt descrie metodele de procesare si cultivare a celulelor din epiteliul mamar. Mediul dezvoltat in patentul lui Stampfer et al. (1983) [10] conține insulina (5-10pg/ml), hidrocortizon (0.05-0.15pg/ml), EGF (factor de creștere epidermal, 3-8ng/ml), mediu condiționat obtinut de la diferite linii celulare imortalizate (Hs74Int - linie de epiteliu intestinal fetal uman, si Hs767Bl - linie de cellule umane epiteliale de vezica), estradiol (10'⁹M), triiodotironina (10'⁸M), toxina holerica (l-10ng/ml) si concentratii foarte scăzute de ser fetal bovin (0.2-0.7%). Acest mediu este înalt selectiv pentru celulele de tip epitelial, carora le oferă un avantaj de adeziune si proliferare fata de celelalte subtipuri celulare existente in tumora.

Mai târziu Bând si Sager [11] au folosit in plus fata de hormoni si factori de creștere si extractul din glanda pituitara bovina, pentru a menține pe termen lung culturile de celule epiteliale mamare, adaugarea extractului de glanda puituitara permițând subculturi pentru 1020 de pasaje, cu pastrarea caracterelor de tip epitelial.

In anii '90 s-a pus la punct un mediu serum-free (fara ser fetal bovin) si fara extract de glanda pituitara. Eliminarea serului fetal bovin si extractului de glanda pituitara este unul din dezideratele bio-ingineriei moderne pentru a evita riscurile unor boli transmise prin aceste derivate bovine cum este encefalita spongiformă precum si riscul de respingere a xenogrefelor a 2020 00197

13/04/2020

[12, 13]. Mediul bazai descris in patentul Stampfer et al. (1983) [10] era unul minimal convențional cum este mediul F-12 Ham sau mediul Dulbecco's Minimal Essential Medium. In prezent mediul de cultură celulară cel mai frecvent utilizat pentru a susține creșterea in vitro a celulelor mamare de tip epitelial este mediul MCDB 170 fără ser, dezvoltat în anii 1980 de Ham și Stampfer [14], (ex, Lonza-MEGM), un mediu suplimentat cu hormoni estrogenici si factori de creștere si extract de glanda pituitara. Un dezavantaj al acestui mediu este inducerea unei senescente rapide a culturilor celulare.

în ciuda acestui aparent succes în dezvoltarea metodelor de cultură a celulelor epiteliale mamare, niciunul dintre aceste medii nu susține creșterea celulelor epiteliale mamare luminale, care exprima intens citokeratine (in special citokeratina 19) [15],

Un alt aspect de urmărit, arata ca pentru propagarea si creșterea celulelor epiteliale izolate este esențial să se adapteze condițiile de cultură in care mediile și suplimentele de cultură celulară adecvate sunt esențiale in reușita cultivării. Este de asemenea important de observat că majoritatea celulelor de tip epitelial depind de substrat (care reprezintă de obicei unul din componentele matricei extracelulare). Substratul imita mediul in vivo, promovează adeziunea celulară si menține celulele in stare diferențiata. Cel mai folosit substrat este colagenul, iar o alternativa este fibronectina. In țesuturi, celulele interacționează atat intre ele cat și cu matricea extracelulară. Pentru menținerea interacțiunii normale și a semnalizării, factorul cheie este reprezentat de densitatea de însămânțare a celulelor tumorale, deoarece aceasta poate afecta atat producția de matrice extracelulară cat si metabolismul si viabilitatea acestora [16, 17,18].

Interogarea bazelor de date naționale si internaționale cu privire la existenta unor brevete de invenții similare a identificat un număr de 4 brevete care descriu metode de izolare si cultivare de celule tumorale:

US4423145A se refera la elaborarea unui mediu de cultura complex selectiv pentru izolarea celulelor epiteliale mamare umane si creșterea lor ca agregate celulare in cultura. Metoda include descrierea izolării agregatelor celulare prin metoda enzimatica, a mediului de cultivare si a obținerii unor clone celulare prin subcultivare. Mediul descris este serum-free, conține factori de creștere (EGF) si hormoni (insulina, hidrocortizon), toxina holerica precum si mediu condiționat obtinut de la alte linii celulare stabilizate umane (Hs74Int-linie de epiteliu intestinal fetal) si Hs767Bi (linie de epiteliu de vezica urinara fetala). Metoda nu descrie evaluarea expresiei de markeri caracteristici epiteliali. Un dezavantaj major este folosirea mediului condiționat obtinut de la culturile celulare de epiteliu fetal uman, care nu poate fi ușor standardizat si care ar putea prezenta diferente de la o cultura la alta. Patentul a stat la baza a numeroase cercetări in domeniul culturilor primare de epiteliu mamar. Metoda prezentata este destul de laborioasa si costisitoare.

US5026637A prezintă metoda de obținere a doua linii imortalizate de celule epiteliale mamare, cu descrierea obținerii culturilor din tesut mamar normal prin digestie enzimatica cu colagenaza si hialuronidaza. Mediul de cultura este DMEM+F12, cu 5% ser de cal, toxina holerica 100 ng/ml, EGF 20ng/ml, insulina 10pg/ml si cortizol 1.4xlO’⁶M. Cele doua linii izolate MCF-10A si MCF10B se caracterizează prin diviziuni nelimitate (imortalizate) datorate achiziției unei mutatii in timpul cultivării cu concentratii crescute cu ioni de Ca²⁺, după ziua 667. Brevetul oferă un instrument de cercetare a celulelor epiteliale mamare normale.

USOO6074874A prezintă o metoda de izolare a celulelor epiteliale din tesut mamar normal, folosind doar procesarea mecanica si cultivarea pe substrat de Matrigel in mediul Magee-Women's Research Institute-I (“MWRI-I): mediu DMEM cu diferite concentratii de ser fetal bovin tip Hyclone, si β-mercapto-etanol. Dezavantajul metodei prezentate consta in utilizarea substratului de Matrigel, produs comercial mai greu de manipulat, fiind necesar sa fie utilizat la temperaturi de 4°C pentru a nu permite gelificarea necontrolata.

a 2020 00197

13/04/2020

US20080176267A1 prezintă o metoda de izolare a celulelor tumorale de tip epitelial din cancerul mamar prin obținere de explante (fragmente tisulare intre 0.5 si 3mm diametru), fara a folosi digestia enzimatica, si cultivarea acestora fara substrat, intr-un mediu comercial MaCA medium (Mammary Epithelial Growth Medium Promocell) suplimentat cu extract de glanda pituitara bovina 13mg/ml, hidrocortizon 0.5mg/ml, EGF lOgg/ml, insulin 5mg/ml. Celulele care vor migra in afara explantelor sunt apoi tripsinizate si filtrate pentru obținerea unei suspensii monocelulare. Dezavantajul acestei metode este folosirea extractului bovin pituitar in mediul de cultura.

Descrierea invenției

Problema tehnica pe care o rezolva prezenta inventive se refera la obținerea de celule tumorale de tip epitelial cu un timp de procesare cat mai scurt si costuri cat mai scăzute, avand in vedere numărul mare de cazuri noi diagnosticate intr-un spital oncologic, care ar necesita o testare cat mai rapida. Prin aplicarea acestei metode se va permite procesarea probelor tisulare si investigarea celulelor tumorale de la pacientele cu cancer mamar, facilitând stabilirea unor terapii personalizate in cel mai scurt timp.

Procedeul de obținere de celule tumorale mamare de tip epitelial consta in aceea ca in prima etapa se obține o suspensie monocelulara prin procesare mecanica si enzimatica a fragmentelor bioptice. Digestia enzimatica propusa folosește un protocol in care fragmentele tisulare sunt imersate in soluție tampon salina suplimentată cu clorura de calciu si clorura de magneziu (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with calcium chloride and magnesium chloride-Sigma Aldrich) si expuse la o soluție de colagenaza (concentrație finala de 0.1 mg/ml) la o temperatura de 37°C timp de 20-30 de minute, pe un agitator rotativ la 150-200 rpm. Majoritatea protocoalelor din literatura descriu acesta digestie enzimatica in prezenta de mediu cu ser fetal sau soluție tampon fosfat fara adaugarea ionilor de Ca²⁺ si Mg²⁺, care sunt activatori enzimatici. De asemenea in aceste protocoale expunerea probelor tisulare la activitatea colagenazei este prelungita de la 40 min la 24 ore. In metoda expusa aici activitatea enzimei este stopata prin adaugarea de mediu rece DMEM+F-12 HAM suplimentat cu 10% FBS. Fragmentele tisulare si celulele eliberate din biopsii sunt procesate prin filtrare cu filtre Filcons cu rețea cu pori de 70μιη pentru obținerea unei suspensii monocelulare care este ulterior centrifugata. Celulele obținute in peletul celular se resuspenda si se numără automat cu ajutorul unui cell counter (EVE^TM) care permite si evaluarea viabilității celulare. In a doua etapa este descrisa pregătirea plăcilor de cultura cu substrat de colagen si fibronectina, substrat care va permite adeziunea celulelor de tip epitelial si activarea cailor de semnalizare specifice acestor celule. In etapa 3 se insamanteaza celulele tumorale in plăcile cu substrat in mediu EGM2 si se mențin in cultura pana la obținerea unui număr suficient pentru evaluarea fenotipica si genetica/genomica.

Avantajele aduse de aplicarea acestei invenții:

Rata mare de succes (din 65-70% din biopsiile procesate s-au izolat celule si s-au obtinut culturi celulare cu viabilitate si diviziune celulara crescută). Eficienta de obținere de culturi primare este in jur de 70%, in funcție de calitatea materialului bioptic

Folosirea unei cantitati reduse de tesut tumoral, obținute prin punctie biopsie, recoltata simultan cu fargmentele tisulare necesare diagnosticului.

Timpul de prelucrare al fragmentelor bioptice este relativ scurt, înjur de 2 ore

Nu necesita condiții speciale de cultivare, procedura poate fi efectuata intr-un laborator clasic de culturi de celule, fara a necesita aparatura suplimentara costisitoare.

Se poate obține un număr suficient de celule tumorale (de ordinul 1-2x10⁶) in timp relativ scurt, de 2-3 saptamani.

a 2020 00197

13/04/2020

A

In continuare se prezintă un exemplu de realizare a procedeului de obținere de celule tumorale de tip epitelial si in tranziție epitelio-mezenchimala din cancerele mamare, cu caracterizarea acestora din punct de vedere fenotipic pentru cei mai importanti markeri epiteliali si mezenchimali.

Procedeul presupune mai multe etape, conform protocolului din Figura 1.

Etapa 1.

Recoltarea biopsiilor : biopsiile sunt recoltate pre-terapeutic prin tehnica aspirarii cu ac fin sub ghidaj ecografic. Fragmentul tisular este imersat in 5 ml de mediu de cultura complet (DMEM 4.5 g/1 glucoza+F-12 HAM, suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 1% antibiotic (penicilina+streptomicina), 1% aminoacizi neesentiali, 2mM L-glutamina) si trimise la laboratorul de culturi de celule pentru prelucrare. Fragmentele tisulare pot fi procesate imediat sau in interval de 24 ore de la recoltare, daca acestea sunt păstrate in mediul de recoltare la 4°C pana la procesare.

Procesarea biopsiilor·. Fragmentul tisular este transferat in placi Petri cu diametru de 3 cm si procesat mecanic cu forfecute fine in fragmente cat mai mici de ordinul 2-3 mm. întreg procesul are loc in condiții sterile (nisa in flux laminar, instrumente si consumabile sterile). Celulele eliberate prin dezagregarea mecanica sunt preluate periodic cu o seringa pentru insulina, filtrate prin filtre Filcons cu rețea de 70 pm si colectate in erubeta tip Falcon de 15 ml pentru obținerea unei suspensii monocelulare. Celulele sunt centrifugate si spalate in PBS (Phosphate Balanced Salt Solution), un tampon fosfat salin cu pH în domeniul fiziologic (pH 7.2-7.4) cu rol in menținerea unui echilibru osmotic intra- si extracelular si asigurarea necesarul de apă și ioni anorganici esențiali pentru metabolismul celular normal.

Digestia enzimatica: pentru eficientizarea metodei de izolare a celulelor din biopsiile tumorale, pe langa procesarea mecanica se aplica un protocol de digestie enzimatica cu colagenaza 0.1% in PBS. Fragmentele tisulare procesate mecanic ramase in plăcută Petri sunt spalate de 3 ori cu PBS conținând CaCb (0.133g/l) si MgCh (0.1 g/1) si la final imersate in 900 μΐ PBS cu CaCh si MgCb. Se adauga 100 μΐ de soluție stock de colagenaza de 100 mg/ml, rezultând o concetratie finala a colagenazei de 10 mg/ml. Plăcută Petri cu fragmentele tumorale este plasata intr-un incubator la 37°C timp de 20 min pe un dispozitiv rotativ (setat la 150200rpm). După terminarea perioadei de incubare, se adauga 3 ml de mediu complet la fragmentele tisulare (explantele) ramase si se reia procesul de procesare mecanica descris mai sus. Suspensia celulara rezultata este fitrata prin filtre Filcons si celulele sunt colectate in alta eprubeta de 15 ml. Suspensiile monocelulare si explantele sunt apoi centrifugate la 1100 rpm timp de 5 min, iar peletul de celule obtinut este resuspendat in 1 ml de mediu EGM2. Celulele astfel obținute sunt numărate si evaluate din punct de vedere al viabilității celulare cu Tripan blue.

Etapa 2

Pregătirea substratului de colagen cu fibronectina: se folosesc placi de 6 godeuri cu suprafața tratata pentru culturi celulare. Se pregătește un amestec vol/vol de soluție de colagen (20 pg/ml in PBS) si o soluție de fibronectina (10 pg/ml PBS) cu o concetratie finala de colagen de 10 pg/ml si fibronectina de 5 pg/ml. Din acesta soluție stoc se adauga in fiecare godeu al plăcii cate 1 ml si se incubeaza la 37°C timp de 20 min. După terminarea perioadei de incubare soluția este recuperata (se poate permite refolosirea ei la 3-4 astfel de proceduri) si plăcile se lașa cu capacul deschis in nisa de flux laminar petru uscare.

Etapa 3

Cultivarea suspensiilor monocelulare in mediu de tip epitelial (EGMZy. suspensia monocelulara, după numararea si stabilirea viabilității celulare, este insamantata pe plăcile cu 6 godeuri acoperite cu substratul de colagen si fibronectina in 3 ml mediu EGM-2 (Epithelial Growth Medium) per godeu. Acest mediu conține factori de creștere ce permit selecția celulelor a 2020 00197

13/04/2020 tumorale de tip epitelial (diferențiate) si este formulat după cum urmeaza: mediu DMEM cu 4.5g glucoza/1 : F-12 HAM (vol:vol), 10% ser fetal bovin, 50 pg/ml toxina holerica, 30 ng/ml factor de creștere epidermal (EGF-Epidermal Growth Factor), 20 ng/ml factor basic de creștere al fibroblastilor (basicFGF-Fibroblast Growth Factor), 1% supliment N2 (din soluția stock xlOO, reactiv Gibco obtinut după formula lui Bottenstein; conține transferina umana, insulina, progesteron, putresceina si selenit de sodiu), 1% supliment B27 (din soluția stock x50 reactiv Gibco; conține un cocktail antioxidant), 10 nM dexametazona, 1% ITS (insulina, transferina, selenium-reactiv Gibco). Culturile se mențin la 37 °C intr-un incubator cu 5% CO? si se vizualizează periodic la un microscop inversat in contrast de faza. După aderare, mediul se schimba periodic la 3-4 zile. In Figura 2A se observa un placard de celule de tip epiteliale si in tranziție epitelio-mezenchimala aderate la substratul de collagen + fibronectina cultivate in mediul EGM2 timp de 4 zile (BMG 79) In Figura 2B se observa o cultura primara la 21 de zile de la insamantare pe substrat de collagen+fibronectina in mediu EGM2 (BMG 64). Aspectul celulelor este de tip epitelial organizate in placarde. In Figura 3A este ilustrata o cultura de 30 zile, ajunsa la confluenta, pe substrat de colagen+fibronectina in mediu EGM2, cu aspect mixt de celule epiteliale si celule in tranziție epitelio-mezenchimala (BMG 118). Aceeași cultura (BMG118) este ilustrata in Figura 3B, la pasajul 3 după 60 de zile. Acesta cultura a suferit o tranziție epitelio-mezenchimala la pasajul 3, pastrand o rata de proliferare crescută.

Etapa 4

Caracterizarea fenotipica a celulelor izolate prin coloratii imunocitochimice: validarea culturilor obținute se realizează prin coloratii imunocitochimice cu anticorpi specifici celulelor mezenchimale (vimentin) si celulelor de tip epithelial (EpCAM, Pancitokeratina si ECadherin). La pasajul 1 celulele sunt tripsinizate si insamantate pe plăcute camerale cu 8 godeuri. După 2 zile, celulele aderate sunt fixate cu paraformaldhida 4% (soluție in PBS) timp de 20 min după care sunt spalate de 3 ori cu PBS. Fixarea este urmata de o etapa de permeabilizare cu triton X100, soluție 0.1% timp de 15 min, urmata de 3 spălări cu PBS. Posibilitatea unor legări nespecifice a anticorpilor este blocata prin incubare cu 10% BSA (Bovin Serum Albumin), timp de 20 min, după care se efectuează marcarea cu anticorpii monoclonali primari: colorație cu EpCAM (anticorp maraca cu FITC), pancitokeratina maracata cu PE (phycoerthrine), Vimentin FITC si E-Cadherina PE. Probele sunt incubate peste noapte la 4°C, iar apoi sunt splate de 3X cu PBS. Plăcutele camerale sunt montate cu colorantul DAPI pentru evidențierea nucleilor si vizualizate in fluorescenta folosind filtrele de 346, 488 si 546 nm, cu un microscop Zeiss Axiovert Dl. Preluarea si prelucrarea de imagini se efectuează cu un program de morfometrie Axiovert 4.6. In Figura 3 se observa expresia celulelor izolate dintr-o tumora mamara pentru markerii epiteliali (EpCAM, pancitokeratina, E-cadherina) si mezenchimali (vimentin). Se oberva o co-expresie a markerilor atat epiteliali (mai intens pentru EpCAM) cat si mezenchimali (vimentin), sugerând un fenotip de tranziție epitelio-mezenchimala.

Caracterizarea fenotipica a celulelor izolate prin citometrie de flux

Biopsiile procesate, care au prezentat o rata de izolare buna a celulelor, care au proliferat si au prezentat un număr suficient de celule au fost fixate cu paraformaldehida 4% timp de 20 min. Fixarea celulelor s-a efectuat după tripsinizarea lor si spalare cu PBS prin centrifugare timp de 5 min la 1200 rpm. După fixare s-a mai efectuat o spalare cu PBS si celulele au fost păstrate la 4°C pana la marcarea lor. Marcarea s-a efectuat după cum urmeaza: celulele au resuspendate in 90-95μ1 PBS rece. La acesta suspensie s-au adaugat 5-10 μΐ din anticorpii monoclonali conjugati cu fluorocromi: CD24 PE, CD44 FITC, EpCAM FITC, pancitokeratina PE, CD29 PE. Pentru Vimentina, care este situata intra-citoplasmatic s-a aplicat permeabilizarea timp de 5 min cu Perm Wash Buffer xlO (Intracellular staining- Biolegend). Celulele au fost incubate timp de 30 min la 4°C la întuneric. Suspensiile celulare au fost apoi a 2020 00197

13/04/2020

SI) spalate cu PBS rece si resuspendate in 100 μΐ PBS rece si au fost analizate cu un flowcitometru BIORAD. Rezultatele obținute sunt prezentate in Figura 3 si Tabelul 2. Majoritatea culturilor primare analizate au prezentat un fenotip de tranziție epitelio-mezenchimal. Markerii CD24, EpCAM, E-cadherina si pan-citokeratina sunt exprimati de celulele epiteliale. Markerii de celule mezenchimale sunt CD44 vimentina si CD29. Se observa ca expresia de CD 44 si vimentin au avut valori foarte mari in cazurile BMG 89, 98 si 99.

Tabel 2. Evaluarea markerilor epiteliali si mezenchimali in celulele tumorale izolate si cultivate conform procedurii descrise in propunerea de brevet._______________________________________

Proba	%
CD24	Ecaderina	EpCAM	Pancitokeratina	CD44	Vimentin	CD29
BMG 75	64.16	-	8.72	-	-	58.94	-
BMG 89	13.80	-	-	-	80.10	88.16	-
BMG 98	22.21	1.23	-	6.59	99.81	98.06	-
BMG 99	6.68	-	-	-	84.71	63.49	-
BMG 108	10.77	6.26	-	-	98.93	-	20.26
BMG 110	-	2	1	-	90	25	30
BMG 119	-	-	-	-	96	98	95
BMG 123	-	-	1.8	-	80	30	87

Descriere figuri:

Figura 1. Diagrama etapelor de procesare a biopsiilor tumorale pentru obținerea culturilor primare

Figura 2. Aspectul in microscopia optica a celulelor izolate din biopsiile mamare cultivate in mediul EGM2 pe substrat de colagen+fibronectina la A) 4 zile si B) 21 zile

Figura 3. Aspectul in microscopia optica a celulelor izolate din biopsiile mamare cultivate in mediul EGM2 pe substrat de colagen+fibronectina la A) 30 de zile si B) la pasajul 3, la 60 zile de la inițierea culturii primare

Figura 4. Expresia celulelor izolate dintr-o tumora mamara pentru markerii epiteliali: A) EpCAM, B) pancitokeratina, E) E-cadherina) si mezenchimali: D) Vimentina. Nucleii sunt marcati cu DAPI (C, F)

Referințe:

1. Wellenstein MD, de Visser KE. Cancer-Cell-Intrinsic Mechanisms Shaping the Tumor Immune Landscape. Immunity. 2018;48(3):399-416

2. Binnewies M, Roberts EW, Kersten K, et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 2018;24(5):541 -550

3. Bhat V, Allan AL, Raouf A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stern Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers (Basel). 2019; 11(9)

4. Ferdinando Mannello Understanding breast cancer stern cell heterogeneity: time to move onto a newresearch paradigm. BMC Med. 2013; 11: 169. Published online 2013 Jul 23. doi: 10.1186/1741-7015-11-169.

5. Rodon J, Soria JC, Berger R, et al. Genomic and transcriptomic profiling expands precision cancer medicine: the WINTHER trial. Nat Med. 2019;25(5):751 -758.

a 2020 00197

13/04/2020

6. Janik K, Popeda M, Peciak J, Rosiak K, Smolarz M, Treda C, Rieske P, StoczynskaFidelus E, Ksiazkiewicz M. Efficient and simple approach to in vitro culture of primary epithelial cancer cells. Biosci Rep. 2016 Dec 9;36(6). pii: e00423. doi: 10.1042/BSR20160208. Prinț 2016 Dec.

7. Linnemann JR, Miura H, Meixner LK, Irmler M, Kloos UJ, Hirschi B, Bartsch HS, Sass S, Beckers J, Theis FJ, Gabka C, Sotlar K, Scheel CH. Quantification of regenerative potențial in primary human mammary epithelial cells. Development.2015 Sep 15; 142(18):3239-51. doi: 10.1242/dev. 123554. Epub 2015 Jun 12.

8. Zubeldia-Plazaola A, Ametller E, Mancino M, Prats de Puig M, Lopez-Plana A, Guzman F, Vinyals L, Pastor-Arroyo EM, Almendro V, Fuster G, Gascon P. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 2015 May 21;3:32. doi: 10.3389 /fcell. 2015. 00032. eCollection 2015.]

9. Speirs V, Green AR, Walton DS, Kerin MJ, Fox JN, Carleton PJ, Desai SB, Atkin SL. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 1998 Dec;78(l 1):1421-9.]

10. Stampfer, Martha R., Smith, Helene S., and Hackett, Adeline J. Enhanced growth medium and method for culturing human mammary epithelial cells. United States: N. p., 1983. Web. https://www.osti.gov/biblio /864822-enhanced-growth-medmmmethod-culturing-human-mamman -epithelial-cells

11. Bând. V, and Sager, R. Distinctive trails of normal and tumor derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 1249-1253, 1989. |[Hammond SL, Ham RG, Stampfer MR. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Sep;81(17):5435-9

12. Petersen, O. W., and van Deurs. B. Preservation of defined phenotypic traits in shortterm cultured human breast carcinoma derived epithelial cells. Cancer Res., 47: 856866, 1987.

13. Ethier SP, Mahacek ML, Gullick WJ, Frank TS, Weber BL. Differential isolation of normal luminai mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res. 1993 Feb 1 ;53(3):627-35.

14. Lee JK, Bloom J, Zubeldia-Plazaola A, Garbe JC, Stampfer MR, LaBarge MA. Different culture media modulate growth, heterogeneity, and senescence in human mammary epithelial cell cultures. PLoS One. 2018 Oct l;13(10):e0204645. doi: 10.1371/journaLpone.0204645. eCollection 2018

15. Bartek. J., Papadimilriou. J. T. Miller. N.. and Millis. R. Patterns of expression of keratin 19 as detecled with monoclonal antibodies in human breast tissues and tumors. Int. J. Cancer. 36: 299-306, 1985.

16. Emerman JT, Burwen SJ, Pitelka DR. Substrate properties influencing ultrastructural differentiation of mammary epithelial cells in culture. Tissue Cell. 1979;! 1(1):109-19.

17. Chandrasekaran S., Guo N. H., Rodrigues R. G., Kaiser J., et al. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by alpha3betal integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem, 1999; 274 (16): 11408-11416.

18. Williams CM, Engler AJ, Slone RD, Galante LL, Schwarzbauer JE. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 2008 May 1 ;68(9):3185-92. doi: 10.1158/00085472.CAN-07-2673.

Claims (4)

1. Procedeu de izolare si expansionare a celulelor tumorale de tip epitelial si a celulelor in tranziție epitelio-mezenchimala din biopsiile de cancer mamar, constând in mai multe etape de procesare a pieselor bioptice. Procedeul este caracterizat prin aceea ca in prima etapa se obțin celule in suspensie monocelulara prin procesare mecanica si digestie enzimatică, cultivarea acestora pe placi acoperite de substrat de colagen si fibronectina in mediu selectiv EGM2, rezultând celule tumorale cu fenotip epitelial si de tranziție epitelio-mezenchimala.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca procesarea pieselor bioptice se face mecanic si prin digestie enzimatică cu colagenaza obtinuta din filtratul culturilor de Clostridium histolyticum la o concentrație de O.lmg/ml in soluție de tampon fosfat salin cu CaCl₂ si MgCl₂ la 37°C pentru 20-30 min. Activitatea colagenazei este inactivată cu mediu rece cu 10% ser fetal bovin, iar fragmentele tisulare ramase sunt din nou procesate mecanic. Suspensia celulara rezultata este fitrata prin filtre Filcons, colectata si centrifugata la 1100 rpm timp de 5 min.

3. Procedeu conform revedicarii 2, caracterizat prin pregătirea plăcilor de culturi celulare prin tapetare cu substrat de colagen si fibronectina. In plăcile de cultura se adauga o soluție de soluție de colagen (20pg/ml in PBS) si o soluție de fibronectina (10pg/ml PBS) cu o concetratie finala de colagen de 10pg/ml si fibronectina de 5pg/ml. Plăcile se incubeaza 37°C timp de 20 min, după care soluția este recuperata si plăcile tratate se usucă in nisa in flux laminar.

4. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea ca suspensia monocelulara de celule obtinuta prin procesare mecanica si enzimatică este insamantata pe plăcile cu substrat de colagen si fibronectina in mediu de cultura selectiv de creștere a celulelor epiteliale- EGM2 (Epithelial Growth Medium), care este formulat după cum urmeaza: mediu DMEM cu 4.5g glucoza/1 : F-12 HAM (vol:vol), 10% ser fetal bovin, 50pg/ml toxina holerica, 30ng/ml factor de creștere epidermal, 20ng/ml factor basic de creștere al fibroblastilor, 1% supliment N2, 1% supliment B27, lOnM dexametazona, 1% ITS (insulina, transferina, selenium).