RO131883B1 - Compozit bioactiv stratificat, antibacterian, antifungic, antioxidant şi procedeu de obţinere a acestuia - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la un compozit bioactiv stratificat cu proprietăți antimicrobiene și antioxidante pentru ambalarea alimentelor, pe bază de poliesteri biodegradabili, cum arfi acidul polilactic (PLA), un polimer natural - chitosan și uleiuri vegetale, ca uleiul de argan și cel de cuișoare, și la un procedeu de obținere a acestui compozit.

Utilizarea uleiurilor vegetale în vederea obținerii de materiale bioactive pentru ambalarea alimentelor este intens studiată în ultimul deceniu datorită cerințelor consumatorilor și protecția alimentelor fără utilizarea aditivilor sintetici. în acest scop, s-au propus atât un număr mare de uleiuri, cât și de tehnici de obținere. Spre exemplu, folia de polietilenă de densitate joasă, utilizată frecvent în uzul casnic, a fost acoperită cu o soluție 10% în etanol de extract de rozmarin de uz alimentar comercial, solubil în lipide, care conține 4,5% acid carnosic. Soluția a fost distribuită uniform cu ajutorul unei pensule pe suprafața filmului și apoi solventul a fost evaporat. Acoperirea formată s-a dovedit eficientă în limitarea oxidării lipidelor din carne [Bolumar T., Andersen M.L., & Orlien V., “Antioxidant active packaging forchicken meatprocessedby high pressure treatment”, Food Chemistry, 129(4), 1406-1412, (2011); T. Bolumar, D. LaPena, L.H. Skibsted, V. Orlien, “Rosemary and oxygen scavenger in active packaging for prevention of high-pressure induced lipid oxidation in pork patties Food Packaging and Shelf Life 7', 26-33, (2016)], dar persistența acesteia timp îndelungat este limitată.

Este cunoscută atât activitatea antibacteriană a chitosanului, cât și cea antifungică, în cazul chitosanului conținând 10...25% oligomeri de chitosan [US 5965545, Compositions and method for controlling fungal disease in plants]. Datorită activitățtii antibacteriene, chitosanul a fost utilizat pentru a obține acoperiri antibacteriene [Arlete B. Reis, Cristiana M.P. Yoshida, Ana Paula C. Reis, Telma T Franco, “Application of chitosan emulsion as a coating on Kraft papei”, Polym Int; 60, 963-969 (2011); Gallstedt M., Brottman A. and Hedenqvist M.S., “Packaging-relatedproperties of protein- and chitosan-coated papei”, Packag Technol Sci 18:161-170 (2005), US 5919574; Biodegradable laminated films fabricated from pectin and chitosan; Peter D. Hoagland].

De asemenea, combinația chitosan/uleiuri esențiale s-a dovedit a avea efect antibacterian [WO 2015054377: Schiffman J. D.; Rieger K. A.; Wakimura M. L.; “Essential oils or volatile organics thereof electrospun in chitosan nanofiber mats”, 2015, Katrina

A. Rieger, Jessica D. Schiffman, “Electrospinning an essential oii: cinnamaldehyde enhances the antimicrobial efficacy of chitosan/polyfethylene oxide) nanofibers”, CarbohydrPolym. Nov26; 113:561-568(2014)], [Javid A., RazaZ.A, HussainT., Rehman

A., “Chitosan microencapsulation of various essential oils to enhance the funcțional properties ofcotton fabric”, J. Microencapsul. 31(5):461-468 (2014), CN104975513 (A) 2015-10-14, “Efficient antibacterial chitosan essential oii microcapsule preparation method”]. în acest sens, s-au obținut și analizat combinații de chitosan CU cinamaldehidă (0,5...5%) [WO2015054377: Schiffman J. D.; Rieger K. A.; Wakimura M. L.; “Essential oils or volatile organics thereof electrospun in chitosan nanofiber mats”, 2015], ulei de oregano și cuișoare (1%) [Emrah Torlak, Mustafa Nizamlioglu, “Antimicrobial effectiveness of chitosan-essential oii coated plastic films against foodborne pathogens”, Journal of Plastic Film and Sheeting, voi. 27 no. 3 235-248 (2011)], ulei de cimbru [Danijela Pecarski, Zorica Knezevic-Jugovic, Suzana Dimitrijevic-Brankovic, Katarina Mihajilovski, Slobodan Jankovic, “Preparation, characterization and antimicrobial activity of chitosan microparticles with thyme essential oiF, Polymers; SCIENTIFIC PAPER UDC 582.292.4:547.913:615.28:544.23 Hem. Ind. 68 (6) 721-729 (2014) doi: 10.2298/HEMIND140415048P 721 ], ulei de cuișoare [Paola Reyes-Champarro,

RO 131883 Β1

Nestor Gutierrez-Mendez, Erika Sala-Munoz, Juan Guillermo Ayala-Soto, David 1 Chavez-Flores and Leon Hernandez-Ochoa, “Effectoftheaddition of essential oils and funcțional extracts of clove on physicochemical properties of chitosan-based films”, 3 Intern. J. Polym. Sci., ArticollD 714254,6 pag], scorțișoară [Lina Wang, Fei Liu, Yanfeng Jiang, Zhi Chai, Pinglan Li, Yongqiang Cheng, Hao Jing, and Xiaojing Leng, 5 “Synergistic Antimicrobial Activities of Natural Essential Oils with Chitosan Films”,

J. Agric. Food Chem., 59 (23), pp. 12411-12419 (2011)]. De asemenea, combinația chito- 7 san/uleiuri esențiale s-a dovedit a avea efect antifungic pentru chitosan combinat cu polifenol extras din măr [CN 105145787 A, “Natural composite antioxidant and antioxidant 9 method thereof for inhibiting marine fish lipid oxidation”].

Multe studii și brevete raportează atât activitate antibacterială, cât și antioxidantă 11 pentru combinația chitosan/uleiuri esențiale: cu Garcinia mangostana [Natthan Charernsriwilaiwat, Theerasak Rojanarata, Tanasait Ngawhirunpat, Monrudee Sukma, 13 Praneet Opanasopit, “Electrospun chitosan-based nanofiber mats loaded with Garcinia mangostana extracts”, Int J Pharm. 16;452(1-2):333-43 (2013)], extract de 15 caprifoi, de goji, de semințe de struguri ori polifenoli extrași din ceai (20...25%) [CN 103275358 A, “Method for preparing chitosan-based composite preservative film or 17 coating”], ulei de Eucalyptusglobulus 1 ...4% [Jawhar Hafsa, Med aii Smach, Med Raâfet

Ben Khedher, Basscm Charfeddine, Khalifa Limem, Hatem Majdoub, Sonia Rouatbi, 19 ”Physical, antioxidant and antimicrobial properties of chitosan films containing Eucalyptus globulus essential oiF, LWT - Food Science and Technology, 68, 356-364 21 (2016)], chimen și oregano [N.M. Hromis, V.L. Lazic, S.L. Markov, Z.G. Vastag, Senka Popovic, D.Z. Suput, N.R. Dzinic, “Improvement of antioxidant and antimicrobial 23 activity of chitosan film with caraway and oregano essential oils”, Acta periodica technologica 45(45):33-43 (2014)], Aristotelia chilensis [E. Genskowsky, L.A. Puente, J.A. 25 Perez-Âlvarez, J. Fernandez-Lopez, L.A. Munoz, M. Viuda-Martos, “Assessment of antibacterial and antioxidant properties of chitosan edible films incorporated with 27 maqui berry (Aristotelia chilensis)”, LWT - Food Science and Technology 64, 10571062 (2015)]. 29 în multe cazuri chitosanul și elementele bioactive se amestecă inițial în aceeași soluție din care se obține filmul final (prin evaporarea solventului) [CN 103275358 A, “Method 31 for preparing chitosan-based composite preservative film or coating”·, Jawhar Hafsa,

Med aii Smach, Med Raâfet Ben Khedher, Bassem Charfeddine, Khalifa Limem, Hatem 33 Majdoub, Sonia Rouatbi, “Physical, antioxidant and antimicrobial properties of chitosan films containing Eucalyptus globulus essential oiF, LWT - Food Science and 35

Technology, 68, 356-364 (2016); N.M. Hromis, V.L. Lazic, S.L. Markov, Z.G. Vastag, Senka Popovic, D.Z. Suput, N.R. Dzinic, “Improvement of antioxidant and antimicrobial 37 activity of chitosan film with caraway and oregano essential oils”, Acta periodica technologica, 45(45):33-43 (2014); E. Genskowsky, L.A. Puente, J.A. Perez-Âlvarez, J. 39 Fernandez-Lopez, L.A. Munoz, M. Viuda-Martos, “Assessment of antibacterial and antioxidant properties of chitosan edible films incorporated with maqui berry 41 (Aristotelia chilensis)”, LWT -Food Science and Technology 64,1057-1062 (2015); CN 103159970 (A) 2013-06-19, “Preparation method of edible film with antibacterial and 43 antioxidant functions”·, Lina Wang, Fei Liu, Yanfeng Jiang, Zhi Chai, Pinglan Li, Yongqiang Cheng, Hao Jing, and Xiaojing Leng, “Synergistic AntimicrobialActivities 45 of Natural Essential Oils with Chitosan Films”, J. Agric. Food Chem., 59 (23), pp. 12411-12419 (2011)] sau din care se obțin nanofire prin metoda electrofilării 47

RO 131883 Β1 [WO2015054377: Schiffman J. D.; Rieger K. A.; Wakimura M. L. “Essential oils or volatile organics thereof electrospun in chitosan nanofiber mats”, 2015; Katrina A. Rieger, Jessica D. Schiffman, “Electrospinning an essential oii: cinnamaldehyde enhances the antimicrobial efficacy of chitosan/poly(ethylene oxide) nanofibers”, Carbohydr Polym. Nov 26; 113:561 -568 (2014); Natthan Charernsriwilaiwat, Theerasak Rojanarata, Tanasait Ngawhirunpat, Monrudee Sukma, Praneet Opanasopit, “Electrospun chitosan-based nanofiber mats loaded with Garcinia mangostana extracts”, Int. J. Pharm. 16;452(1 -2): 333-43 (2013)].

S-au raportat, de asemenea, încapsulări de uleiuri esențiale în particule de chitosan [CN104975513 (A) 2015-10-14, “Efficient antibacterial chitosan essential oii microcapsule preparation method] de ordinul micronilor (microparticule)[Gallstedt M, Brottman A and Hedenqvist MS, “ Packaging-related properties of protein- and chitosan-coated paper”, Packag Technol Sci 18:161-170 (2005); Jefferson M. Souza, Artemisia L. Caldas, Shafagh D. Tohidi, Javier Molina, Antonio P. Souto, Râul Fangueiro, Andrea Zille, “Properties and controlied release of chitosan microencapsulated limonene oif’, Rev. bras, farmacogn. 24, n. 6, pp. 691-698 (2014)] sau chiar mai mari (10 pm) [Jefferson M. Souza, Artemisia L. Caldas, Shafagh D. Tohidi, Javier Molina, Antonio P. Souto, Râul Fangueiro, Andrea Zille, “Properties and controlied release of chitosan microencapsulated limonene oii”, Rev. bras, farmacogn. 24, n. 6, pp. 691-698 (2014)], 100...1000 pm [US 9333178, “Essential oii microparticles and uses thereof for preventing enteric diseases”], și dezvoltarea de fibre antimicrobiene cu dimensiuni micrometrice (850 nm), prin electrofilarea chitosanului împreună cu polimeri ca poli(acidul lactic) [S. Torres-Giner, M.J. Ocio, J.M. Lagaron, “ Development of active antimicrobial fiber based chitosan polysaccharide nanostructures using electrospinning’’, Eng. Life Sci., 8(3), 303-314, (2008)].

Există și studii în care materialul bioactiv pe bază de chitosan și uleiuri esențiale este depus pe diverse substraturi, ca cel de polipropilenă [Emrah Torlak, Mustafa Nizamhoglu, “Antimicrobial effectiveness of chitosan-essential oii coated plastic films against foodborne pathogens”, Journal of Plastic Film and Sheeting, voi. 27 no. 3 235-248 (2011); CN 105169961 A, “Production method of composite film with optimized parameters”], sau pe material textil din bumbac [Javid A., Raza Z.A., Hussain T., Rehman A., “Chitosan microencapsulation of various essential oils to enhance the funcțional properties ofcotton fabric?’, J. Microencapsul. 31(5):461-468 (2014)].

Au fost propuse diverse proceduri pentru acoperirea cu agent antimicrobian (cu/fără polimer cu rol deîncapsulare/încorporare): prin aplicare cu un aplicator pentru cromatografie în strat subțire [Afef Ben Arfa, Laurence Preziosi-Belloy, Pascale Chalier, Nathalie Gontard, “Antimicrobial Paper Based on a Soy Protein Isolate or Modified Starch Coating Including Carvacrol and Cinnamaldehyde”, J. Agric. Food Chem. 55, 21552162 (2007)], banc de acoperire de laborator [Carolin Hauser, Joachim Wunderlich, “Antimicrobial packaging films with a sorbic acid based coating”·, 11^th Internațional Congress on Engineering and Food (ICEF11); Procedia Food Science 1, 197-202 (2011)], aplicator cu bară [Virginia Muriel-Galet, Josep P. Cerisuelo, Gracia LopezCarballo, Marta Lara, Rafael Gavara, Pilar Hernândez-Munoz, “Development of antimicrobial films for microbiological control of packaged salad”, Internațional Journal of Food Microbiology, 157,195-201 (2012)], pensulă [Tomas Bolumar, Mogens L. Andersen, Vibeke Orlien, “Antioxidant active packaging forchicken meat processed by high pressure treatment”, Food Chemistry, 129, 1406-1412, (2011)], pulverizare

RO 131883 Β1 (nebulizare) [Claudia Contini, Maria G. Katsikogianni, Feidhlim T. O'Neill, Michael. 1 O'SuIlivan, Denis. P. Dowling, Frank. J. Monahana, “ Development of active packaging containing natural antioxidante”, Procedia Food Science 1 (2011) 224-228; 3 doi :10.1016/j.profoo.2011.09.035; 11^th Internațional Congress on Engineering and Food (ICEF11)], laminare [US 5919574, “ Biodegradable laminated films fabricated from pectin 5 andchitosan”·, Peter D. Hoagland], imprimare prin gravură [Virginia Muriel-Galet, Josep P. Cerisuelo, Gracia Lopez-Carballo, Susana Aucejo, Rafael Gavara, Pilar Hernăndez- 7 Munoz, Evaluation of EVOH-coated PP films with oregano essential oii and citral to improve the shelf-life of packaged salad, Food Control 30 137-143 (2013)], imersie 9 [Bogdănel Silvestru Munteanu, Elena Pâslaru, Lidia Fras Zemljic, Anamaria Sdrobis, Gina Mihaela Pricope, Cornelia Vasile, “Chitosan coatings applied to polyethylene 11 surface to obtain food-packaging materials”, Cellulose Chem. Technol., 48 (5-6), 565575 (2014)]. Aceste procedee, deși sunt simple, nu asigură stabilitatea în timp a stratului 13 aplicat, iar substanțele conținute pot migra în alimentul ambalat.

Uleiul de argan obținut prin presare la rece este benefic în tratamentul artritelor sau 15 a altor boli reumatice, are beneficii pentru organism în lupta cu cancerul și alte boli grave, boli vasculare și obezitate. Uleiul esențial de cuișoare conține cei mai mulți agenți antioxi- 17 danți. Acesta este apreciat ca antifungic, agent antibacterian, antiseptic și analgezic, este o excelentă sursă de mangan, de acizi grași omega-3, vitamina K, vitamina C, calciu, 19 magneziu și fibre. Uleiul esențial de cuișoare conține o cantitate importantă de eugenol, care a făcut subiectul a numeroase studii de prevenire a toxicității produse de poluanții din mediu 21 (precum tetraclorura de carbon) și studii privind prevenirea cancerului tractului digestiv sau a inflamațiilor articulațiilor. Uleiul esențial de cuișoare poate reduce concentrația de glucide 23 din sânge la diabetici și este cunoscut ca fiind un potențial remediu împotriva cancerului pulmonar. 25

Acidul polilactic(PLA) este un poliesterbiodegradabil ce poate fi sintetizat din resurse regenerabile. Este pe larg studiat pentru posibile aplicații în producerea de ambalaje datorită 27 modulului de elasticitate mare și permeabilității scăzute pentru arome.

După cum s-a arătat mai sus, au fost propuse diverse proceduri pentru acoperirea 29 diverselor materiale cu agent antimicrobian (cu/fără polimer cu rol de încapsulare/încorporare). Aceste procedee, deși sunt simple, nu pot evita consumul mare de materiale 31 bioactive față de cantitatea mult mai mică necesară pentru obținerea efectelor antibacteriene/antifungice/antioxidante prin procedeul propus în prezenta invenție și, de aseme- 33 nea, nu asigură stabilitatea în timp a stratului aplicat, iar substanțele conținute pot migra în alimentul ambalat. 35

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția, constă în obținerea filmului de acid polilactic cu proprietăți antimicrobiene și antioxidante. 37

Compozitul bioactiv stratificat, antibacterian, antifungic, antioxidant, pe bază de acid polilactic și chitosan conform invenției, este constituit din 90...99,9% acid polilactic, 0,05...5% 39 chitosan și 0,05...5% ulei vegetal ales dintre uleiul de argan și uleiul de cuișoare.

Procedeul de obținere de filme pe bază de compozit bioactiv conform invenției, 41 constă într-o primă etapă în care se activează filmul de acid polilactic prin tratare în plasmă de azot la o frecvență de 1,3 MHz, o putere de 100 W și o presiune de lucru de 0,4 mbar 43 urmată de expunere la aer, iarîn a doua etapă filmul activat se acoperă propriu-zis prin electrofilare/electropulverizare coaxială la o intensitate a câmpului electric de 10 kV/cm cu un 45 debit de 1,2 μΙ/min, timp de 30 min cu o soluție de chitosan de concentrație 1,5% în greutate în acid acetic glacial și cu o soluție din elementul activ ne-electrofilabil de ulei vegetal 1,5% 47 în cloroform sau acid acetic, ales dintre uleiul de argan și uleiul de cuișoare din care se obține un compozit stratificat stabil, cu activitate antimicrobiană, antifungică și antioxidantă. 49

RO 131883 Β1

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- rezolvă problema lipsei caracterului antimicrobian și antioxidant al PLA prin adăugarea unui polimer natural, chitosanul, și a unor uleiuri vegetale, ca cel de argan obținut prin presare la rece sau cel esențial de cuișoare, care imprimă atât proprietăți antioxidante, cât și antimicrobiene, și, de asemenea, determină efecte biologice specifice materialelor obținute;

-înlătură dezavantajele menționate mai sus (consumul mare de materiale bioactive, instabilitatea în timp a stratului aplicat și migrarea substanțelor bioactive în alimentul ambalat) prin aceea că chitosanul în amestec cu uleiurile vegetale este depus sub formă de nanoacoperiri legate covalent pe suprafața poli(acidului lactic) (PLA) la temperatura camerei, își menține activitatea antimicrobiană și este împiedicat să difuzeze rapid în alimentele ambalate, menținându-se la suprafața ambalajului și prin încorporarea simultană în compoziție a uleiurilor vegetale de argan sau de cuișoare cu proprietățile specifice menționate.

Scopul invenției de față este obținerea de noi materiale pentru ambalarea alimentelor pe bază de PLA tratat în plasmă rece de înaltă frecvență, chitosan și uleiuri vegetale, în ideea de a combina caracteristicile unice ale acestora cu scopul de a obține materiale cu proprietăți antimicrobiene, antioxidante și biologic active, având în vedere calitățile particulare ale chitosanului și ale uleiurilor vegetale.

în practica uzuală, chitosanul și elementele bioactive sunt amestecate în masa filmului final care se dorește a avea proprietăți antibacteriene prin amestecarea chitosanului și a elementelor bioactive în aceeași soluție din care se obține filmul final fie sub formă compactă prin evaporarea solventului [Paola Reyes-Champarro, Nestor Gutierrez-Mendez, Erika Sala-Munoz, Juan Guillermo Ayala-Soto, David Chavez-Flores and Leon Hernandez-Ochoa, “Effect of the addition of essential oils and funcțional extracts of clove on physicochemicalproperties of chitosan-based films”, Intern. J. Polym. Sci., Articol ID 714254, p. 6], fie sub formă de meșă nanofibroasă prin metoda electrofilării [S. Torres-Giner, M.J. Ocio, J.M. Lagaron, “Development of active antimicrobial fiber basedchitosanpolysaccharidenanostructuresusingelectrospinning”, Eng. LifeSci., 8(3),303-314, (2008)]. O altă modalitate de a efectua imobilizarea compusului bioactiv este acoperirea prin electrofilare/electropulverizare a unui film polimeric. Electrofilarea este un proces prin care un jet polimeric încărcat electrostatic se deplasează spre un electrod colector metalic datorită forțelor electrostatice. în urma evaporării solventului, jetul de polimer se solidifică și se obține astfel pe colector o structură de micro/nanofire polimerice, cu raport suprafață/volum mare, cu diametre de ordinul 0,01...10 pm [Wendorff J.H., Agarwal S., Greiner A., Electrospinning: Materials, Proceing, and Applications. John Wiley & Sons, Germany (2012), Bogdanei Silvestru Munteanu, Elena Paslaru, Lidia Fras Zemljic, Anamaria Sdrobis, Gina Mihaela Pricope, Cornelia Vasile, “Chitosancoatingsapplied to polyethylene surface to obtain food-packaging materials”, Cellulose Chem. Technol., 48 (5-6), 565-575 (2014)]. în cazul în care pe colector nu se obțin fire, ci numai particule, procesul se mai numește electropulverizare.

Acoperirea prin electrofilare/electropulverizare este o metodă convenabilă datorită mai multor avantaje, dintre care se menționează:

- prin electrofilare se pot obține nanofibre foarte subțiri (de ordinul nanometrilor). Fibrele pot da naștere la o structură mai poroasă decât o aglomerare de particule, cu raport arie/volum mare;

- grosimea stratului acoperit poate fi ușor controlată prin varierea timpului de depunere și a debitului de curgere. Astfel, este posibil să se obțină acoperiri foarte subțiri utilizând cantități foarte mici de compus bioactiv, care pot fi suficiente pentru a imprima efectul antibacterian dorit. Dacă se compară grosimea stratului obținut prin alte metode (3 pm [J.

RO 131883 Β1

P. Cerisuelo, Virginia Muriel-Galet, Jose M. Bermudez, Susana Aucejo, Ramon Catalâ, 1 Rafael Gavara, Pilar Hernăndez-Munoz, “Mathematical model to describe the release of an antimicrobial agent from an active package constituted by carvacrol in a 3 hydrophilic EVOH coating on a PP film”, Journal of Food Engineering 110 26-37 (2012)], 2...9 pm [Funda Tihminlioglu, Isa Dogan Atik, Banu Ozen, Effect of Corn-Zein 5 Coating on the Mechanical Properties of Polypropylene Packaging Films, Journal of Applied Polymer Science, Voi. 119, 235-241 (2011)], 2...3 pm [Funda Tihminlioglu, Isa 7 Dogan Atik, Banu Ozen, Effect of Corn-Zein Coating on the Mechanical Properties of Polypropylene Packaging Films, Journal of Applied Polymer Science, Voi. 119,235-241 9 (2011)]) cu acoperirea foarte subțire (sute de nm) realizată prin electrofilare/electropulverizare, este evident, de asemenea, avantajul de a consuma o cantitate mică din mate- 11 rialul de acoperire.

Proprietățile uleiurilor vegetale (esențiale/obținute prin presare la rece) depind de 13 modul de distribuire al acestora pe suprafețele acoperite și de modul în care acestea intră în contact cu alimentul. Prin urmare, încorporarea acestora în interiorul fibrelor sau parti- 15 culelor de chitosan oferă ocazia de a produce materiale fibroase/poroase performante prin electrofilare. Datorită dimensiunilor nanometrice și a raportului mare suprafață/volum al 17 nanoparticulelor, înglobarea acestora în interiorul (și implicit și la suprafața) nanofirelor polimere conduce la creșterea cantității de agent bioactiv (AA) care este accesibil pentru inter- 19 acțiunea cu alimentul.

încorporarea agentului bioactiv (de exemplu în chitosan) duce la îmbunătățirea carac- 21 teristicilor materialului (filmului) mixt obținut.

Prin metoda coaxială de electrofilare/electropulverizare se pot obține fire și particule 23 de agent bioactiv (de exemplu chitosan) electrofilabil ce încapsulează un al doilea agent bioactiv (de exemplu ulei de cuișoare sau argan) care nu este electrofilabil. Prin acul exterior 25 se injectează agentul bioactiv electrofilabil (chitosanul), iar prin acul interior se injectează al doilea agent bioactiv non-electrofilabil (uleiul de cuișoare sau argan). 27

Datorită metodei de acoperire prin electrofilare se pot obține acoperiri cu grosimi controlabile mult mai subțiri (zeci de nm) comparativ cu celelalte metode utilizând implicit can- 29 tități mai mici de compus bioactiv, care pot fi suficiente pentru a imprima efectul antibacterial/antioxidant/antifungic dorit în timp ce legarea covalentă de substrat asigură o stabilitate 31 mai mare a acoperirii. Fibrele obținute pot da naștere la o structură mult mai poroasă decât un film/strat omogen de acoperire, structura care poate genera un contact mult mai bun între 33 alimentul ambalat și substanțele bioactive. Prin electrofilarea coaxială se poate obține încapsularea elementelor active, encapsulare ce asigură migrarea lentă (controlată) a unei 35 mai mari părți din materialul bioactiv încapsulat decât în cazul încapsulării într-un film/strat de acoperire compact și relativ gros față de nanofire unde este accesibilă migrării lente doar 37 materialele bioactive situate spre partea exterioară a filmului.

Procedeul conform invenției de obținere prin electrofilare/electropulverizare a unor 39 suprafețe bioactive constă în două etape:

I. Tratarea filmelor de poliester biodegradabil (PLA) în plasmă de azot în condiții 41 optime de descărcare (frecvența 1,3 MHz, putere 100 W, presiune de lucru 0,4 mbar).

II. Acoperirea propriu-zisă a filmelor de poliester biodegradabil (PLA) prin 43 electrofilare/electropulverizare coaxială care duce la încapsularea unui agent bioactiv nonelectrofilabil în interiorul agentului bioactiv electrofilabil. 45

Procedeul și suprafețele biocompatibile obținute în acest mod prezintă următoarele avantaje: 47

- tratarea suprafeței poliesteruIui biodegradabil (PLA) în plasmă de azot urmată de expunerea în aer asigură funcționalizarea suprafeței prin formarea de radicali activi și 49 conduce la implementarea pe suprafață a unor grupe polare reactive (peroxizi, carbonil, carboxil, amino, amida) de care se pot lega covalent chitosanul și unele componente din 51

RO 131883 Β1 uleiul vegetal folosit. în acest mod, stratul bioactiv se leagă prin legături covalente de substrat, devenind mai stabil, împiedicând pierderea agenților activi în timpul stocării și migrarea în alimentele ambalate, și asigură protecția alimentelor ambalate fără a migra;

- se pot depune straturi foarte subțiri cu grosime controlabilă. în acest mod, caracterul bioactiv se imprimă la costuri și cu consum minim de compuși bioactivi;

- se poate controla morfologia straturilor depuse prin modificarea condițiilor de electrodepunere (tensiunea aplicată, distanța dintre ac și colector, concentrația soluției utilizate și debitul de depunere) în scopul modificării caracteristicilor de suprafață ale substratului, fără a le modifica și pe cele de volum, caracteristicile depunerilor realizate fiind reproductibile;

- prezența nanofirelor/particulelor de chitosan imprimă suprafeței materialului polimeric o structură nano-poroasă, precum și caracter antibacterian/antifungic;

- prezența AA încapsulați în firele/particulele de chitosan conduce la îmbunătățirea proprietăților antibacteriene/antioxidante/antifungice ale chitosanului, cele două componente acționând sinergetic, acoperirile în ansamblu prezentând caracteristici superioare și efecte biologice specifice.

S-au utilizat următoarele materiale:

- Poli(acidul lactic) (PLA) - 2002D, are o densitate de 1,24 g/cm³, indicele de curgere (MFI) de 5...7 g/(10 min) (la 210°C/2,16 kg) și un conținut de 96% L-lactidă și 4% izomer D. Masa moleculară medie gravimetrică determinată prin GPC a fost de 4475 kDa;

- Chitosan (CS) (Aldrich) cu masă moleculară medie = 400000 Da, grad de de acetilare (DD) = 68%;

- Uleiul de argan: ulei de argan extra virgin obținut prin presare la rece, extras din semințele arborelui de argan (Argania spinosa). Fără adaosuri;

- Uleiul de cuișoare: obținut din muguri florali uscați de Syzygium aromaticum.

Procedeul de obținere a unor noi compozite stratificate sub formă de filme cu proprietăți antioxidante și antimicrobiene pe bază de poliesteri, chitosan și uleiuri vegetale pentru ambalarea alimentelor, conform invenției, constă în aceea că filmele de PLA cu o grosime de 0,3 ± 0,05 mm s-au obținut prin presarea granulelor cu o presă Carver la 175°C (2 min pre-topire și 2 min presare la 240 bar). înainte de activare în plasma rece, au fost spălate cu etanol și apoi uscate. Filmele de PLA sau PHB obținute, care sunt transparente și au o grosime de aproximativ 25 pm au fost expuse la acțiunea plasmei reci de de azot de frecvență înaltă (1,3 MHz) cu puterea sursei 100 W și o presiune de 0,4 mbar. Pe suprafața tratată în plasmă a filmelor se depune prin electrofilare chitosan în care s-au încapsulat diferite uleiuri vegetale.

Instalația de electrofilare constă dintr-o sursă de înaltă tensiune continuă (0...30 kV), platan rotitor metalic și o seringă orientată cu acul perpendicular pe acesta. Tensiunea înaltă este aplicată între platanul metalic și acul seringii. Soluțiile de chitosan/ulei din seringă sunt împinse afară cu debit constant. Pe colectorul metalic rotator se montează substratul de poliester biodegradabil expus în prealabil în plasmă.

Parametrii utilizați în procesul de electrofilare/electropulverizare (pentru toate probele) au fost:

- intensitatea câmpului electric 10 kV/cm;

- debit 1,2 μΙ/min; (atât pentru acul interior, cât și pentru acul exterior);

- timp de depunere 30 min.

Soluțiile de chitosan 1,5% cu masa moleculară mare (CSH) au fost preparate în amestec 9/1 acid acetic glacial/apă distilată. Soluțiile de ulei vegetale 1,5 wt% au fost preparate în acid acetic glacial. Prin acul exterior s-a injectat chitosan, iar prin acul interior s-a

RO 131883 Β1 injectat uleiul vegetal. Prin metoda coaxială de etectrofilare/electropulverizare s-au obținut 1 straturi omogene de fire și particule de chitosan ce încapsulează (conțin) ulei vegetal, material obținut fiind o compozită stratificată. 3

Pentru materialele obținute s-au determinat următoarele proprietăți:

- morfologia, diametrul și mărimea particulelor/firelor prin metode microscopice; 5

- proprietățile antibacteriene/antioxidante și antifungice.

Metode de investigație 1

Microscopia electronică de baleiaj (SEM): s-a utilizat un microscop QUANTA200.

Microscopie electronică prin transmisie (TEM): s-a utilizat un microscop Hitachi High- 9 Tech HT7700 (tensiune de accelerare 100 kV).

Testele antimicrobiene au fost efectuate în conformitate cu metodele standard ISO 11 16649-2 SR/2007-Microbiologia produselor alimentare și animale. Protocolul experimental pentru testarea eficienței antimicrobiane împotriva Escherichia coli, Salmonella typhimurium, 13 și Listeria monocytogenes constă în următoarele etape: sterilizarea mostrelor; contaminare cu bacterii de cultură ATCC; inoculare și incubare efectuată 24 și 48 h la 44°C; identificarea 15 germenilor țintă. Sterilizarea probelor a fost făcută într-o autoclavă la 110°C, 0,5 bar timp de 20 min. 17

Identificarea germenilor țintă: următoarele metode standardizate ale procedurilor bacteriologice au fost utilizate în conformitate cu standardele în vigoare: SR ISO 16649- coli 19 Escherichia', metoda orizontală pentru b-glucuronidase - Escherichia coli pozitivă cuantificarea - partea 2: numărarea coloniilor la 44°C folosind 5-brom-4-clor-3-indolil beta-D-glucuronid 21 conform Minerale Modified Glutamat bulion (Cat. 1,365) producerea coloniilor albastre sau verde-albastre pe agar glucuronid; SR ISO 11290 monocytogenes EN-monocytogenes; SR 23 EN ISO 6579/2003/AC/2004/AC/2006, Amd.l: 2007 - Salmonella sp.

Prin testele antifungice s-a testat efectul probelor acoperite la suprafața de contact 25 a acestora cu trei ciperci: Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Penicillium corylophilum CBMF1 și Fusarium graminearum G87. Ciupercile au fost crescute în mediu PDA timp de 27

7...9 zile și depozitate la 25°C. Suspensia de pori a fost obținută în condiții aseptice și apoi colectate de pe suprafața coloniilor. Mediul de cultură a fost preparat conform protocolului, 29 sterilizat și turnat în vase Petri. După solidificare, acesta a fost inoculat cu 2 pl de suspensie de spori în patru puncte din vasul Petri. Probele au fost apoi aplicate în contact cu sporii. 31 Vasele Petri au fost apoi izolate cu parafină și incubate 25°C timp de 7 zile. Rezultatele au fost exprimate ca număr de spori aflați pe suprafața în contact cu proba exprimată ca procent 33 din numărul de spori care nu au fost în contact cu proba (rata de inhibiție).

Activitatea antioxidantă: activitatea antioxidantă a nanofirelor a fost măsurată utilizând 35 metoda de evaluare a inhibare a radicalilor liberi cu ajutorul 2,2-difenil-1 -pieriIhidrazii (DPPH) (metoda DPPH). în prezența probelor, s-a măsurat descreșterea absorbantei la 517 nm. 37

Se prezintă, în continuare, două exemple de realizare ale invenției, utilizând ca substrat poliester degradabil PLA, iar ca agenți bioactivi chitosanul cu masa moleculară mare 39 (agentul electrofilabil) în combinație cu uleiul de cuișoare respectiv uleiul de argan (agentul ne-electrofilabil). Filmele de PLA s-au obținut prin presarea din topitură la presiune de timp 41 de 5 min.

Exemplele descrise în continuare se bazează pe rezultatele prezentate în fig. 1 ...3 43 și în tabel:

- fig. 1 reprezintă imagini SEM (a) și TEM (b, c, d) ale probelor PLA/Chitosan cu masa 45 moleculară mare/cuișoare.

- fig. 2 reprezintă activitatea antioxidantă a probelor PLA/Chitosan cu masa 47 moleculară mare/cuișoare.

- fig. 3 reprezintă imagini SEM (a) și TEM (b, c, d) ale probelor PLA/Chitosan cu masa 49 moleculară mare/argan.

RO 131883 Β1

Ί

Exemplul 1

PLA/ulei de cuișoare

Pe colector se montează filmul de PLA obținut prin presarea din topitură la 175°C (2 min pre-topire și 2 min presare la 240 bar) care este transparent și are o grosime de 25 pm și este tratat în plasma de azot.

Se prepară soluții de 1,5% CSH în amestec 9/1 acid acetic glacial/apă distilată și de ulei de cuișoare 1,5 wt% în acid acetic glacial cu care se încarcă seringile de la pompa 1, respectiv 2. Prin acul exterior s-a injectat soluția de chitosan în acid acetic, iar prin acul interior s-a injectat soluția de ulei (cuișoare sau argan). Colectorul se rotește cu o viteza de 30 rpm. Se pornesc cele două pompe care trimit soluțiile prin acul exterior și respectiv interior cu un debit constant de 1,2 pl/min timp de 30 min.

Prin metoda de electrofilare/electropulverizare s-au obținut pe filmele PLA plasate pe colectorul metalic o acoperire cu un diametru de 12...15 cm, grosimea stratului depus este de aproximativ 200 nm, ce constă din fire și particule de chitosan ce încapsulează (conțin) ulei de cuișoare.

Filmul de PLA acoperit cu nanostructuri încapsulate de ulei de cuișoare în chitosan se investighează prin SEM și TEM și se testează pentru activitatea antioxidantă, antibacteriană și antifungică.

Nanofibrele au un diametru mediu de 400 nm, iar particulele, de 250 nm, și formează împreună o meșă relativ poroasă care acoperă uniform suprafața. Testele antioxidante indică o activitate antiradicalică de 80% (după 70 h), cele antifungice de peste 95%, iar activitatea antibacteriană de peste 80%. Aceste valori sunt superioare celor imprimate de chitosan (tabel).

Imaginile SEM evidențiază o morfologie de tip fibre/particule. Aceasta se datorează viscozității mari a chitosanului, ceea ce duce la o mai bună întrepătrundere a lanțurilor moleculare în cazul acestor probe. Este cunoscut faptul că, pentru a obține nanofibre utilizând procedeul de electrofilare/electropulverizare, este necesar un anumit grad de întrepătrundere a lanțurilor macromoleculare în soluția electropulverizată [Suresh L. Shenoy; W. Douglas Bates, Harry L. Frisch, Gary E. Wnek, Role of chain entanglements on fiber formation during electrospinning of polymer solutions: good solvent, non-specificpolymer-polymerinteraction limit, Polymer46 3372-3384 (2005)]. Imaginile TEM evidențiază o morfologie mai fină decât imaginile SEM pentru toate probele. Precum și nanofibre cu diametre mai mici decât cele vizibile în imaginile SEM. De asemenea, se evidențiază existența particulelor foarte fine (de ordinul 100 nm). Imaginile TEM evidențiază, de asemenea, o morfologie de tip beads-into-fiber/beads-into-string cu particule de ulei încapsulate din loc în loc în interiorul fibrei de chitosan. între nodurile conținând particulele de ulei nu există decât chitosan simplu.

Rezultatele testelor antibacteriene pentru probele PLA/Chitosan cu Masă Moleculară Mare/Cuișoare și PLA/Chitosan cu Masă Moleculară Mare/Argan

E. coli	Listeria monocytogenes	Salmonela typhimurium
24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h
PLA/Chitosan cu Masă Moleculară Mare
10	53	16	58	35	71
PLA/Chitosan cu Masă Moleculară Mare/Argan
49	82	47	100	55	94
PLA/Chitosan cu Masă Moleculară Mare/Cuișoare
53	78	53	100	65	90

RO 131883 Β1

Rezultatele testelor pentru activitatea antioxidantă: 1

S-a determinat și reprezentat grafic pentru soluția martor DPPH: A_Dpp_H(t)/A_Dp_PH(t_init)= = absorbanța soluției de DPPH (martor) la momentul la care s-a făcut măsurătoarea (ca 3 fracție din absorbantă la momentul începerii experimentului), iar pentru probele PLA, PLA/CH/N₂ și PLA/CH/Clove/N₂:[A_DPPH(t) - A_SAMPLE(t)]/A_DPPH(t) în care A_DPPH(t) = absorbanța 5 soluției de DPPH (martor) la momentul la care s-a făcut măsurătoarea, A_SAMPLE(t) = absorbanța probei la momentul la care s-a făcut măsurătoarea. 7

Se constată că activitatea antioxidantă a filmelor acoperite cu amestecul chitosan cu masă moleculară mare/cuișoare este mai mare decât activitatea antioxidantă a filmelor 9 acoperite numai cu chitosan cu masă moleculară mare precum și, de asemenea, mai mare decât a filmelor neacoperite. 11

Astfel, avantajele formulărilor pe bază de ulei încapsulat în chitosan sunt:

- îmbunătățirea proprietăților antibacteriene prin utilizarea combinației chitosan/ulei 13 esențial sau obținut prin presare la rece;

- adăugarea de proprietăți antioxidante/antifungice provenind de la uleiul încapsulat; 15

- de asemenea, este de așteptat o creștere a stabilității în timp a uleiului încapsulat împreună cu o eliberare mai lentă a acestuia.17

Exemplul 2

PLA/ulei de argan19

Se efectuează conform exemplului 1, cu deosebirea ca în loc de ulei de cuișoare se utilizează ulei de argan dizolvat în cloroform.21

Filmul de PLA acoperit cu nanostructuri încapsulate de ulei de cuișoare în chitosan se investighează prin SEM și TEM și se testează pentru activitatea antioxidantă, antibac- 23 teriană și antifungică.

Nanofibrele au un diametru mediu de 360 nm, iar particulele, de 220 nm, și formează 25 împreună o meșă relativ poroasă care acoperă uniform suprafața. Testele antifungice indică o activitate de peste 95%, iar activitatea antibacteriană de peste 50%. Aceste valori sunt 27 superioare celor imprimate numai de chitosan.

Și în acest caz, imaginile SEM evidențiază o morfologie de tip fibre/particule pentru 29 probele conținând chitosan cu masă moleculară mare. Aceasta se datorează viscozității mai mari a chitosanului ceea ce duce la o mai bună înterpătrundere a lanțurilor moleculare în 31 cazul acestor probe. Imaginile TEM evidențiază o morfologie similară cu cea a probelor conținând ulei de cuișoare, și anume morfologie de tip beads-into-fiber/beads-into-string cu 33 particule de ulei încapsulate din loc în loc în interiorul fibrei de chitosan. între nodurile conținând particulele de ulei nu există decât chitosan simplu. 35

Claims (2)

1 Revendicări

3 1. Compozit bioactiv stratificat, antibacterian, antifungic, antioxidant, pe bază de acid polilactic și chitosan, caracterizat prin aceea că este constituit din 90...99,9% acid polilactic,

5 0,05...5% chitosan și 0,05...5% ulei vegetal ales dintre uleiul de argan și uleiul de cuișoare.

2. Procedeu de obținere de filme pe bază de compozit bioactiv definit în revendicarea

Ί 1, caracterizat prin aceea că, într-o primă etapă, se activează filmul de acid polilactic prin tratare în plasmă de azot la o frecvență de 1,3 MHz, o putere de 100 W și o presiune de

9 lucru de 0,4 mbar, urmată de expunere la aer, iar în a doua etapă, filmul activat se acoperă propriu-zis prin electrofilare/electropulverizare coaxială la o intensitate a câmpului electric 11 de 10 kV/cm cu un debit de 1,2 μΙ/min, timp de 30 min, cu o soluție de chitosan de concentrație 1,5% în greutate în acid acetic glacial și cu o soluție din elementul activ ne-electrofilabil 13 de ulei vegetal 1,5% în cloroform sau acid acetic, ales dintre uleiul de argan și uleiul de cuișoare, din care se obține un compozit stratificat stabil, cu activitate antimicrobiană, antifun15 gică și antioxidantă.